Summary
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.
Introduction
Es gibt mehr als 70 Millionen Hunde allein in den USA 1. Wie bewertet Familienmitglieder, oft sind diese Tiere erhalten Schneiden medizinische Versorgung Rand. Ebenso , weil sie unsere Umwelt teilen, können Hunde geben Einblicke in die Pathogenese und Behandlung menschlicher Krankheiten 1. Doch ob Entdeckungen in der Humanmedizin in tierärztliche Behandlungen oder umgekehrt zu übersetzen, ist es wichtig, gründlich Spezies Variationen charakterisieren auch in hochkonservierten Systeme wie die angeborene Immunantwort. Beispiele für Unterschiede zwischen dem Eckzahn und menschlichen angeborenen Immunsystems sind die hohe Expression CD4 auf Hund Neutrophilen 2; das Fehlen eines funktionellen Homolog des zytoplasmatischen Flagellin Sensor IPAF in dogs 3 und die Expression eines Caspase 1/4 Hybrid in Fleischfressern 4.
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind eine relativ kürzlich entdeckte Komponente der angeborenen Immunität 5. NETs sind Netzwerks von DNA, nukleare und granular Proteine in Reaktion auf eine Vielzahl von entzündlichen oder infektiösen Reizen 6 freigegeben. Netzartige Strukturen wurden in vielen Spezies , einschließlich Hühner 7 gezeigt Fisch 8, 9 und Mollusken acoelomates 10, aber es gibt Speziesvariationen. Zum Beispiel reagieren Maus - Neutrophilen langsamer NETosis Stimuli als menschliche Neutrophilen und bilden weniger diffuse NETs 11. Es gibt einen großen Körper von Beweismitteln aus mehreren Arten , die NETs entrap Mikroben und umstrittener direkt bei der Abtötung von Krankheitserregern 12,13 beteiligt sein können. NET - Komponenten auch Gewebeschäden jedoch verbessern, Thrombose und Tat fördern als 14,15 Autoantigene. Die Balance zwischen den nützlichen und schädlichen Wirkungen von NETs können zwischen verschiedenen Krankheiten und verschiedenen Arten variieren, was darauf hindeutet, ist es wichtig, NETs zu untersuchen, sowohl in der Art und Zustand von Interesse.
Hier sind wirbeschreiben ein einfaches Protokoll für die Induktion und die Freisetzung von NETs durch Hunde- Neutrophilen zu messen. Dieses Verfahren ist ähnlich zu denjenigen verwendet , um Neutrophile 16 und induzieren NETosis in anderen Arten, aber die Bedingungen , wie beispielsweise Agonist - Konzentration und Inkubationszeit isolieren haben canine Neutrophilen optimiert. Eine ähnliche NET Quantifizierung DNA - Freisetzungstest wurde auch bei anderen Spezies beschrieben worden , aber das hier vorgestellte Verfahren ist auch für Hunde 8,17,18 optimiert.
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Protocol
Alle Versuche wurden mit ethischen Erlaubnis von der Iowa State University Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt.
1. Blutentnahme
- Zeichnen 9 ml Blut aus einer Vena, cephalica oder Halsvene direkt in Antikoagulans (zB Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml Blut) Vacutainer oder in eine Spritze mit sofortiger Transfer zu EDTA-haltige Blutröhrchen. Sanft rollen oder die Blutröhrchen invertieren eine ausreichende Durchmischung des Blutes und der Antikoagulans zu gewährleisten.
2. Neutrophilen-Isolation
- In einem 50 ml konischen Röhrchen, mischen Blut mit einem gleichen Volumen von sterilen Raumtemperatur 3% Dextran-500 (hergestellt in 0,9% steriler Kochsalzlösung) durch vorsichtiges Umdrehen. Lassen Sie aufrecht für 18-20 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Übertragen die strohfarbene obere Schicht in ein frisches Röhrchen, bis es nicht mehr ohne Verunreinigung durch die untere rote Schicht gesammelt werden kann. Die Erythrozyten in the kann original Rohr verworfen werden.
- Zentrifuge den Überstand bei 500 xg für 10 min bei 4 ° C. Absaugen und den Überstand verwerfen. das Zellpellet in 10 ml Raumtemperatur steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) manuell erneut zu suspendieren. Beachten Sie, dass Verwirbelung sollte zu keinem Zeitpunkt dieses Protokolls zu resuspendieren Neutrophilen verwendet werden. Manuelles Abziehen, anstatt Stände Abgießen auch im gesamten Protokoll wird empfohlen Zellausbeute zu maximieren.
- 10 ml einer bei Raumtemperatur Polysaccharose und Natriumdiatrizoat Zelltrennungslösung (zB Histopaque 1077) zu einem 50 ml konischen Röhrchen. Schicht sorgfältig die Zellen enthaltende Lösung über die Zelltrennlösung. Man beachte, dass unter Verwendung von Zelltrennungslösung, die auf Raumtemperatur äquilibriert nicht hat, kann Zellausbeute reduzieren.
- Zentrifuge bei 300 × g für 30 min bei Raumtemperatur mit der Bremse ab.
- Als Neutrophilen in der untersten Schicht des Gradienten sind, abtrennen und verwerfen die upper 3 Schichten, bestehend aus einer oberen Schicht aus Plasma und Blutplättchen, einen schmalen weißen Band von mononukleären Zellen und eine klare Schicht der Dichtegradientenmedium.
- alle verbleibenden Erythrozyten, resuspendieren die Neutrophilen-Pellet in 10 ml Wasser bei Raumtemperatur zu lysieren.
- Nach 30 Sekunden wieder her Tonus von 10 ml sterilem Raumtemperatur 1,8% Natriumchlorid-Zugabe und durch vorsichtiges Umdrehen mischen.
- Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Zeichnen Sie den Überstand ab und verwerfen.
- Wenn das Pellet noch rot ist, wiederholen Sie den Lyseschritts. Wenn das Pellet weiß (oder, wenn die Lyse bereits zweimal durchgeführt worden ist), vorsichtig resuspendieren Zellen in 10 ml sterilem PBS.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zähler oder einer Zählkammer. Typische Ausbeuten sind mindestens 10 6 Zellen pro ml Blut.
- Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Zeichnen Sie den Überstand ab und verwerfen.
- Resuspendieren Zellen auf die gewünschte Konzentration in steriler PBS Raumtemperatur. for die DNA - Freisetzungstest in Abschnitt 2, resuspendieren bei 5 x 10 6 Zellen pro ml beschrieben.
- Falls gewünscht, Transfer direkt ein kleines Volumen von Zellen oder eine Zytozentrifuge auf einem Glasobjektträger verwendet wird. Zellen erlauben zu trocknen und zu Flecken eine rasche Fixierung und Färbung Kit gemäß den Herstellern 'Anweisungen. Wenn der Neutrophil Isolation erfolgreich, wenn sie unter dem Mikroskop bei mindestens 95% der kernhaltigen Zellen untersucht, sollte Granulozyten (Neutrophile, Basophile, Eosinophile) mit minimaler Erythrozytenkontamination sein.
3. DNA-Freisetzungstest
- Stellen Sie die DNA-Freisetzungstest unmittelbar nach Neutrophilen Isolierung auf.
- Wenn die Zelle Verklumpung auf Prüfung der Stammlösung durch Lichtmikroskopie vorhanden ist, übergeben Sie die Zellsuspension durch ein steriles 70 & mgr; m Sterilfilter unmittelbar vor dem Test einrichten.
- Zu jedem Test gut einer sterilen 96 - Well - Platte, fügen Sie 5 x 10 4 Zellen / Vertiefung; Agonisten und Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) Medium ohne Phenolrot und mit 0,5% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum auf ein Endvolumen von 100-200 & mgr; l ergänzt. Fügen Sie mindestens zwei leere Wells pro Agonist, in dem die Neutrophilen-Stammlösung mit einem gleichen Volumen von PBS ersetzt. Beachten Sie, dass die Einrichtung leere Vertiefungen für jede Agonist in Ausschluss DNA-Kontamination des Agonisten oder Störungen durch den Agonisten mit dem Fluoreszenztest wichtig ist.
- für 30 min in einem Kohlendioxid (4%) Inkubator bei 39 ° C inkubieren.
- In Agonisten bei gewünschten Konzentrationen und einer Zelle undurchlässige Farbstoff Nukleinsäure. Notieren Sie sich die optimale Konzentration von Zelle undurchlässige Farbstoff zwischen verschiedenen Nukleinsäure Farbstoffe variieren. Nicht-stimulierte Kontrollen, in denen Agonisten von einem gleichen Volumen an Medium ersetzt werden sollten in jedem Experiment eingeschlossen werden.
HINWEIS: Es ist wünschenswert, Agonisten in ähnlichen Volumina Kulturmedium zu verdünnen, konsistente Bedingungen zwischen Vertiefungen zu halten. Schluss gut Volumen von 200 &# 181; l wurden erfolgreich und wenn dies geändert wird, auch Volumina sollten identisch bleiben für alle Bedingungen. Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) (Endkonzentration ≥0.1 uM) oder Platelet Activating Factor (PAF) (Endkonzentration ≥31 uM) kann als positive Kontrollen verwendet werden. -Agonisten Sollten mindestens doppelt gemessen werden. - Inkubieren bei 39 ° C. Messen Sie Fluoreszenz eines Mikrotiterplattenmessgeräts nach 2 Stunden oder in gewünschten Intervallen verwenden. Beachten Sie, dass optimale Zeitintervalle verwendet Agonisten variieren.
HINWEIS: Wellenlänge wird auf Farbstoff abhängig beschäftigt. - Subtrahiert leere Fluoreszenz vor mittlere Fluoreszenz zu berechnen.
- Damit Vergleich zwischen Individuen und zwischen den Platten, berechnen eine Falte Veränderung der Fluoreszenz durch die mittlere Fluoreszenz der stimulierten Vertiefungen durch die mittlere Fluoreszenz von nicht-stimulierten Vertiefungen geteilt wird.
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Protokolls, sollte es eine starke fache Veränderung der Fluoreszenz sein, nachdem Neutrophilen mit den positiven Kontrollen, PMA und PAF stimulieren. Wie dargestellt in 1B, die Stimulation der canine Neutrophilen mit 31 uM PAF für 1 Stunde ergibt sich eine mittlere 4,0-fache Erhöhung der Fluoreszenz im Vergleich zu nicht-stimulierten Zellen (Bereich 2,0 bis 5,8, n = 5 Hunde) 18. PMA bei 0,1 uM (Figur 1A) ist ein langsamer Agonist, der nicht bis 2 h in einer Erhöhung der Fluoreszenz führt, erzeugt aber letztlich eine ähnliche fache Erhöhung der Fluoreszenz (Mittelwert: 3,3, Bereich 1,36 bis 5,4, n = 5 Hunde) 18. Trotz seiner langsameren Kinetik, gibt es Vorteile für PMA als positive Kontrolle: es ist relativ preiswert im Vergleich mit hohen Konzentrationen von PAF und es in murinen und humanen Studien wurde weit verbreitet.
Die Fluoreszenz von Nukleinsäure-Farbstoffe ist nicht specific für NET Bildung, wie es wird auch auftreten, wenn es den Zelltod durch andere Mechanismen ist oder wenn Reagenzien mit DNA kontaminiert. Wie in 2 gezeigt, ist eine kommerzielle Präparation LPS sehr hohe Fluoreszenz in Abwesenheit von Neutrophilen erzeugt, was vermutlich auf eine Kontamination mit Bakterien - DNA. NET Bildung durch andere Verfahren, wie Immunfluoreszenz bestätigt wird empfohlen.
Abbildung 1: PMA und PAF Erhöhung Fluoreszenz einer Zelle undurchlässigen Farbstoff Nukleinsäure mit unterschiedlichen Kinetiken Neutrophilen mit 0,1 & mgr; M PMA stimuliert wurden (A) oder 31 uM PAF (B) in Gegenwart der Zelle impermeable Nukleinsäure - Farbstoff.. Fluoreszenz wurde in stündlichen Intervallen und der Falte Veränderung der Fluoreszenz von stimulierten Zellen im Vergleich zu nicht-stimulierten Zellen berechnet gemessen. Fluoreszenzerhöhungd signifikant zwischen 1 und 2 Stunden für PMA (wiederholte Messungen eine Strecke mit einem mit einer Korrektur des Bonferroni mehrere t-Tests gefolgt ANOVA Vielzahl bereinigtes p = 0,04; Fehlerbalken für 5 Personen Mittelwert ± Standardabweichung) sind aber schon für PAF plateaued durch 1 Std. Diese Zahl wurde von Jeffery U modifiziert, et al Hunde Guss NETs zu. Canine Neutrophilen extrazellulären Fallen in den Bereichen Gesundheit und immunvermittelte hämolytische Anämie. Veterinary Immunologie und Immunpathologie, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Blank Brunnen sind wichtig , durch den Agonisten DNA - Kontamination oder Störungen auszuschließen Eine kommerzielle Quelle von LPS.enthaltenden RPMI zu azellulären Vertiefungen zugegeben. Eine große fache Veränderung der Fluoreszenz im Vergleich mit Vertiefungen nicht-stimulierten Neutrophilen enthält , schlägt Kontamination des Agonisten mit bakterieller DNA. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die DNA-Freisetzungstest vorgestellt, ist ein leicht quantifizierbare Assay für die extrazelluläre DNA. Die Methode wurde von ähnlichen Techniken angepasst verwendeten NET Bildung in anderen Spezies zu bewerten, aber Zentrifugation Geschwindigkeiten Agonist - Konzentrationen und Inkubationszeiten verändert wurden 8,17,18 das Verfahren zur Verwendung mit canine Neutrophilen zu optimieren. Ähnliche Anpassungen könnten die Verfahren für andere Arten angepasst werden. Der Test ist einfach und kostengünstig im Vergleich zu anderen Verfahren zur NETosis wie Durchflusszytometrie oder Bildanalyse gemessen werden. Das Verfahren erfordert auch keine Antikörper gegen NET-Komponenten, so ist ideal für den Einsatz bei Hunden, für die kommerziell hergestellten, validierte Spezies reaktive Antikörper oft nicht verfügbar sind.
Die Haupteinschränkung des Verfahrens ist der Mangel an Spezifität der Zell impermeable Nukleinsäurefarbstoffe für NET-Bildung. Diese Farbstoffe geben auch tote und sterbende Zellen, binden DNA und fluoresziert. Daher fluorescence ist für NET Bildung nicht spezifisch. Verwendung von anderen Techniken (beispielsweise Immunofluoreszenz) parallel mit dem quantitativen Assay visuell zu bestätigen Agonisten NET Bildung induzieren eher als andere Formen von Zelltod wird dringend empfohlen. Der Assay kann gegebenenfalls auch als allgemeine Screening - Assay für Zelltod verwendet werden, beispielsweise als ein Mittel zur Quantifizierung der Zytotoxizität ex vivo.
Das Protokoll ist einfach, aber es gibt kritischen Schritte notwendig Erfolg sicherzustellen. Erstens in dem Protokoll, wie erwähnt, die exzessive Zellverlust während der Neutrophilen Isolation zu vermeiden, ist es wichtig, dass Überstände werden mit einer Pipette abgezogen, anstatt verworfen durch Rohre zu invertieren. Zweitens Erfolg des Assays beruht auf der nicht-stimulierten Kontrollzellen in einem lebensfähigen und Ruhezustand in der gesamten Inkubation verbleiben. Neutrophile können während des Protokoll so Aufmerksamkeit zu jedem Zeitpunkt aktiviert werden sollten atraumatische Blutentnahme t zu zahlenechnik und traumatische Behandlung zu vermeiden (zB Verwirbelung) während der Neutrophilen - Isolation. Es ist auch wichtig , daran zu erinnern , dass Neutrophile eine begrenzte Lebensdauer haben , so Verzögerung in Zellen zu isolieren oder die Assay - Einrichtung sollte 19 vermieden werden. Wenn längerer Inkubation mit Agonisten versucht wird, die Lebensfähigkeit der nicht-stimulierten Zellen in diesem Zeitraum sollte bestätigt werden.
Wie in Abbildung 1 gezeigt, gibt es erhebliche Unterschiede zwischen den Hunden in ihrer Reaktion auf NET - Agonisten. Jedoch sollte der Assay zwischen Replikaten von demselben Tier, mit einer Intra-Assay - Variation von 9% maßen konsistent sein , basierend auf 10 dupliziert 18. Wenn es große Unterschiede zwischen den Replikaten, ist Zelle Verklumpung wahrscheinlich verantwortlich. Maßnahmen Zelle Verklumpung, pflegen die Zellen in PBS anstelle eines calciumhaltigen Puffer vor dem Einrichten der DNA-Test, der Behandlung von Zellen sanft im gesamten Isolation und Filtern der Zelle Lager zu reduzierenSuspension vor der Zellen Plattierung.
Wenn diese Schritte ausgeführt werden, ermöglicht dieses Protokoll Quantifizierung von NET Bildung als Reaktion auf einen weiten Bereich von experimentellen Bedingungen und Agonisten. Solche Untersuchungen können unser Verständnis der Rolle von NETs in der Hunde Gesundheit und Krankheit zu vertiefen. Zum Beispiel ermöglicht diese Technik den Vergleich der Freisetzung NET zwischen gesunden Hunden und solche mit immunsuppressiven oder Autoimmunerkrankungen, bei denen NETosis beeinträchtigt oder verbessert werden kann. neue Agonisten zu identifizieren induzieren kann NETosis und neuartige Inhibitoren der NETosis Alternativ kann, wenn mit anderen Techniken, wie Immunfluoreszenz kombiniert wird, kann der Assay verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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