Summary
Neutrofila extracellulära fällor (NET) är nätverk av DNA, histoner och neutrofila proteiner. Även om en komponent av den medfödda immunsvar, är nät inblandade i autoimmunitet och trombos. Detta protokoll beskriver en enkel metod för canine neutrofil isolering och kvantifiering av NET med användning av en mikroplattfluorescensanalys.
Introduction
Det finns över 70 miljoner hundar i USA enbart en. Som värderas familjemedlemmar, ofta dessa djur mottar framkant sjukvård. Lika eftersom de delar vår miljö, kan hundar ge insikter i patogenesen och behandlingen av sjukdomar hos människor 1. Men om översätta upptäckter inom humanmedicinen i veterinärbehandlingar eller vice versa, är det viktigt att noggrant karakterisera arter variationer även i starkt konserverade system som det medfödda immunförsvaret. Exempel på skillnader mellan hund och människa medfödda immunsystemet inkluderar hög expression CD4 på hund neutrofiler 2; frånvaro av en funktionell homolog av den cytoplasmatiska flagellin sensorn IPAF hos hundar 3 och uttryckningen av en kaspas 04/01 hybrid i köttätare 4.
Neutrofila extracellulära fällor (NET) är en relativt nyligen upptäckt komponent av medfödd immunitet 5. NET är nätverkss av DNA, nukleära och granulära proteiner som frisätts som svar på ett brett spektrum av inflammatoriska eller infektiösa stimuli 6. Nätliknande strukturer har visats i många arter, inklusive kycklingar 7, fisk 8, blötdjur 9 och acoelomates 10, men det finns variationer arter. Till exempel murina neutrofiler reagerar långsammare på NETosis stimuli än humana neutrofiler och bilda mindre diffusa NET 11. Det finns en stor mängd bevis från flera arter som NET innesluter mikrober, och mer kontroversiellt kan vara direkt involverad i att döda patogener 12,13. Men NET komponenter ökar också vävnadsskada, främja trombos och fungera som autoantigen 14,15. Balansen mellan de positiva och negativa effekter av NET kan variera mellan olika sjukdomar och olika arter, vilket tyder på att det är viktigt att undersöka NET både i arter och tillstånd av intresse.
Här vibeskriva ett enkelt protokoll för att inducera och mäta frisättningen av NET med hund neutrofiler. Denna metod liknar de som används för att isolera neutrofiler 16 och inducerar NETosis i andra arter, men tillstånd såsom agonistkoncentration och inkubationstid har optimerats för hund neutrofiler. En liknande NET kvantifiering DNA frisättningsanalys har även beskrivits i andra arter, men metoden som presenteras här är också optimerad för hundar 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes med etiskt tillstånd från Iowa State University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Blood Collection
- Rita 9 ml blod från en vena, cefalisk eller halsvenen direkt i antikoaguleringsmedel (t.ex. etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml blod) Vacutainers, eller i en spruta med omedelbar överföring till EDTA-innehållande blodrören. Försiktigt rulla eller invertera blodrören för att säkerställa tillräcklig blandning av blod och antikoagulant.
2. Neutrofil Isolering
- I ett 50 ml koniskt rör, blanda blod med en lika stor volym steril rumstemperatur 3% dextran-500 (som består i 0,9% steril saltlösning) genom försiktig inversion. Låt stå upprätt i 18-20 minuter vid rumstemperatur. Överför halmfärgade övre skiktet till ett nytt rör tills den inte längre kan samlas in utan förorening av den nedre röda lagret. De erytrocyter i the ursprungliga röret kan kasseras.
- Centrifugera supernatanten vid 500 xg under 10 min vid 4 ° C. Dra bort och kassera supernatanten. Manuellt återsuspendera cellpelleten i 10 ml rumstemperatur steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Observera att virvelbildning ska inte användas för att återsuspendera neutrofiler i alla skeden av detta protokoll. Manuellt dra av, snarare än att hälla bort supernatanter rekommenderas också hela protokollet för att maximera cellutbytet.
- Tillsätt 10 ml av en rumstemperatur polysackaros och natrium diatrizoat cellseparationslösning (t.ex. Histopaque 1077) till en 50 ml koniska rör. skikt noggrant cellinnehållande lösningen under cellseparations lösning. Observera att användning av cellseparationslösning som inte har jämvikt vid rumstemperatur kan minska cellutbyte.
- Centrifugera vid 300 xg under 30 min vid rumstemperatur med bromsen av.
- Eftersom neutrofiler är i det understa lagret av gradienten, dra bort och kassera upper 3 skikt, som består av ett övre skikt av plasma och blodplättar, ett smalt vitt band av mononukleära celler och ett klart skikt av densitetsgradienten medium.
- Att lysera eventuella återstående erytrocyter, återsuspendera den neutrofila pelleten i 10 ml rumstempererat vatten.
- Efter 30 sekunder, åter tonicitet genom tillsats av 10 ml steril rumstemperatur 1,8% natriumklorid och blanda genom att vända försiktigt.
- Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Rita av vätskan och kasta.
- Om pellets är fortfarande rött, upprepa lys steg. Om pelleten är vit (eller om lys redan har utförts två gånger), försiktigt återsuspendera cellerna i 10 ml steril PBS.
- Räkna celler med användning av en automatiserad räknare eller en hemocytometer. Typiska utbyten är minst 10 6 celler per ml blod.
- Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Rita av vätskan och kasta.
- Återsuspendera cellerna till den önskade koncentrationen i steril rumstemperatur PBS. for DNA frisättningsanalysen som beskrivs i avsnitt 2, resuspendera vid 5 x 10 6 celler per ml.
- Om så önskas, överföra en liten volym av celler direkt eller med användning av en cytocentrifug till en glasskiva. Låt cellerna att torka och fläcken med hjälp av en snabb fixering och färgningskit enligt tillverkarens instruktioner. Om neutrofila isolering har varit framgångsrik, när de undersöks i mikroskop åtminstone 95% av kärnförsedda celler bör vara granulocyter (neutrofiler, basofiler, eosinofiler) med minimal förorening erytrocyt.
3. DNA-frisättningsanalys
- Ställ in DNA frisättningsanalysen omedelbart efter neutrofil isolering.
- Om cell klumpar är närvarande vid undersökning av stamlösningen genom ljusmikroskop, passera cellsuspensionen genom en steril 70 um sterilt filter omedelbart före inrättandet av analysen.
- Till varje testbrunn av en steril 96-brunnsplatta, tillsätt 5 x 10 4 celler / brunn; agonist och Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) medium utan fenolrött, kompletterad med 0,5% värmeinaktiverat fetalt kalvserum till en slutlig volym av 100 till 200 | j, l. Omfatta minst två tomma brunnar per agonist, i vilken den neutrofila förrådslösningen är ersatt med en lika stor volym PBS. Observera att inrätta tomma brunnar för varje agonist är viktigt att utesluta DNA kontaminering av agonisten eller störningar av agonisten med fluorescensanalysen.
- Inkubera vid 39 ° C under 30 minuter i en koldioxid (4%) inkubator.
- Lägg agonister vid önskade koncentrationer och en cell ogenomtränglig nukleinsyra färgämne. Notera den optimala koncentrationen av cell ogenomträngligt färgämne kommer att variera mellan olika nukleinsyra-färgämnen. Icke-stimulerade kontroller där agonister ersättas med en lika stor volym av media bör inkluderas i varje experiment.
OBS: Det är önskvärt att späda agonister i liknande volymer av odlingsmedium för att bibehålla konsekventa förhållanden mellan brunnarna. Slutliga brunnsvolymer av 200 &# 181; l har använts framgångsrikt och om detta förändras, väl volymer bör förbli desamma för alla förhållanden. Forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (slutkoncentration ≥0.1 iM) eller blodplättsaktiverande faktor (PAF) (slutkoncentration ≥31 iM) kan användas som positiva kontroller. Agonister bör mätas minst två gånger. - Inkubera vid 39 ° C. Mät fluorescens med hjälp av en mikroplattläsare efter 2 timmar eller vid önskade intervall. Notera att optimala tidsintervall varierar med agonister som används.
OBS: Våglängd kommer att bero på färgämnet som används. - Subtrahera tomma fluorescens vid beräkningen av medelvärdet fluorescens.
- För att möjliggöra jämförelser mellan individer och mellan plattorna, beräkna en faldig förändring i fluorescens genom att dividera den genomsnittliga fluorescens stimulerade brunnarna genom medelvärdet fluorescens av icke-stimulerade brunnar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll, bör det finnas en stark faldig förändring i fluorescens efter att stimulera neutrofiler med positiva kontroller, PMA och PAF. Som visas i figur 1B, stimulering av hund neutrofiler med 31 iM PAF under 1 timme resulterar i en genomsnittlig 4,0-faldig ökning i fluorescens jämfört med icke-stimulerade celler (intervall 2,0-5,8, n = 5 hundar) 18. PMA på 0,1 pm (Figur 1A) är en långsammare agonist som inte resulterar i en ökning av fluorescens till 2 h men i slutändan ger en liknande ökning veck i fluorescens (medelvärde: 3,3, intervall 1,36-5,4, n = 5 hundar) 18. Trots sina långsammare kinetik, det finns fördelar med att PMA som en positiv kontroll: det är relativt billigt jämfört med höga koncentrationer av PAF och den har använts i stor utsträckning i murina och humanstudier.
Fluorescens av nukleinsyra färgämnen är inte specifika för NET bildning eftersom det kommer också uppstå om det finns celldöd genom andra mekanismer eller om reagenser är förorenade med DNA. Såsom visas i figur 2, ett kommersiellt LPS beredning produceras mycket hög fluorescens i frånvaro av neutrofiler, förmodligen beroende på kontaminering med bakteriellt DNA. Bekräftar NET bildning genom andra metoder såsom immunofluorescens rekommenderas.
Figur 1: PMA och PAF ökning fluorescens av en cell ogenomträngligt nukleinsyra färgämne med olika kinetik Neutrofiler stimulerades med 0,1 pM PMA (A) eller 31 | iM PAF (B) i närvaro av cellen impermeabla nukleinsyra färgämne.. Fluorescensen mättes med en timmes intervall och den faldig förändring i fluorescens av stimulerade celler jämfört med icke-stimulerade celler beräknas. fluorescensökningd avsevärt mellan 1 och 2 h för PMA (upprepade mätningar envägs ANOVA följt av flera t-test med Bonferroni korrigering, mångfald justerade p = 0,04; felstaplar är medelvärden ± standardfel för 5 personer), men hade redan planade för PAF genom 1 tim. Denna siffra har ändrats från Jeffery U et al Hundar Kastnät också. Canine neutrofila extracellulära fällor i hälsa och immunmedierad hemolytisk anemi. Veterinär Immunology och Immunopathology, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10,1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Blanka brunnar är viktigt att utesluta DNA kontaminering eller störningar av agonisten En kommersiell källa till LPS.sattes till acellulära brunnar innehållande RPMI. En stor faldig förändring i fluorescens jämfört med brunnar som innehåller icke-stimulerade neutrofiler antyder förorening av agonist med bakteriellt DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analys DNA frisättning presenteras är en lätt kvantifierbart analys för extracellulärt DNA. Metoden anpassades från liknande tekniker används för att bedöma NET bildning i andra arter, men centrifugeringshastigheter, agonist koncentrationer och inkubationstider har ändrats för att optimera metoden för användning med canine neutrofiler 8,17,18. Liknande justeringar kan göras för att anpassa metoden för andra arter. Analysen är enkel och billig i jämförelse med andra metoder för att mäta NETosis såsom flödescytometri eller bildanalys. Metoden kräver inte heller antikroppar mot NET komponenter, så är idealisk för användning på hundar för vilka kommersiellt producerade, validerade arter-reaktiva antikroppar är ofta saknas.
Den huvudsakliga begränsningen för metoden är bristen på specificitet hos celltäta nukleinsyra färgämnen för NET bildning. Dessa färgämnen anger också döda och döende celler, binder DNA och fluorescerar. Därför, fluorescence är inte specifik för NET bildning. Användning av andra tekniker (t.ex. immunofluorescens) parallellt med den kvantitativa analysen att bekräfta visuellt agonister inducerar NET bildningen snarare än andra former av celldöd rekommenderas starkt. Analysen kan också potentiellt användas som en allmän screening-analys för celldöd, t ex som ett medel för att kvantifiera cytotoxicitet ex vivo.
Protokollet är enkel, men det finns viktiga åtgärder som är nödvändiga för att säkerställa framgång. För det första, som noteras i protokollet, för att undvika överdriven cellförlust under neutrofil isolering är det viktigt att supernatanter dras bort med en pipett i stället kastas genom att vända rören. För det andra, framgång av analysen förlitar sig på de icke-stimulerade kontrollceller som finns kvar i en livskraftig och vilande tillstånd under hela inkubationen. Neutrofiler kan bli aktiverad i något skede under protokollet så noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt atraumatisk bloduppsamlings technique och undvika traumatisk hantering (t.ex. vortex) under neutrofila isolering. Det är också viktigt att komma ihåg att neutrofiler har en begränsad livslängd så försening i att isolera celler eller inrätta analysen bör undvikas 19. Om förlängd inkubation med agonister försöker bör livskraften hos de icke-stimulerade celler under denna tidsperiod bekräftas.
Som visas i figur 1, det finns betydande skillnader mellan hundar i sitt svar på NET-agonister. Dock bör analysen vara någorlunda konsekvent mellan replikat från samma djur, med en intra-assay variation av 9% baserat på 10 dubbletter 18. Om det finns stora variationer mellan replikat, är cell klumpar sannolikt ansvarig. Åtgärder för att minska cellklumpning innefattar att upprätthålla celler i PBS snarare än en kalciuminnehållande buffert före inrättandet av DNA-analysen, behandla celler försiktigt under isolering och filtrering av cell lagersuspensionen före utstrykning av celler.
Om dessa steg följs, ger detta protokoll kvantifiering av NET bildning som svar på ett brett spektrum av experimentella betingelser och agonister. Sådana studier kan fördjupa vår förståelse av den roll som NET i hund hälsa och sjukdom. Till exempel ger denna teknik jämförelsen av nettofrigör mellan friska hundar och de med immunosuppressiva eller autoimmuna sjukdomar där NETosis kan försämras eller förbättras. Alternativt när den kombineras med andra tekniker såsom immunofluorescens, analysen kan användas för att identifiera nya agonister med förmåga att inducera NETosis och nya inhibitorer av NETosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D.
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
