Summary
Нейтрофильных внеклеточные ловушки (НРТ) представляют собой сети ДНК, гистонов и нейтрофильных белков. Хотя компонент врожденного иммунного ответа, Сетки замешан в аутоиммунной реакции и тромбоза. Этот протокол описывает простой метод собачьего выделения нейтрофилов и количественного НЭО с использованием анализа микропланшет флуоресценции.
Introduction
Есть более 70 миллионов домашних собак только в США 1. Как уважаемых членов семьи, эти животные часто получают ультрасовременную медицинскую помощь. В равной степени , потому что они разделяют нашу окружающую среду, собаки могут дать представление о патогенезе и лечении заболеваний человека 1. Тем не менее, является ли перевод открытий в медицине человека в ветеринарным обработкам, или наоборот, важно тщательно охарактеризовать его видовые разновидности, даже в высоко консервативны системах, таких, как врожденной иммунной реакции. Примеры различий между клыка и врожденной иммунной системы человека , включают в себя высокий уровень экспрессии CD4 на собачьих нейтрофилы 2; отсутствие функционального гомолога цитоплазматической датчика флагеллином IPAF у собак 3 и экспрессия каспазы 1/4 гибрид в плотоядным 4.
Нейтрофильных внеклеточные ловушки (НРТ) являются сравнительно недавно обнаруженный компонент врожденного иммунитета 5. Сетки сетьс ДНК, ядерные и гранулированных белки , высвобождаемые в ответ на широкий круг воспалительного или инфекционного раздражители 6. NET-подобные структуры были продемонстрированы во многих видов , включая кур 7, 8 рыб, моллюсков 9 и acoelomates 10, но существуют различия видов. Например, мышиные нейтрофилы реагируют более медленно , чем NETosis раздражители нейтрофилов человека, и образуют диффузные менее 11 сетей не . Существует большое количество доказательств из нескольких видов , которые НРТ взбитых микробов, и более спорно , могут быть непосредственно вовлечены в убийство патогены 12,13. Тем не менее, NET компоненты также увеличивают повреждения тканей, способствуют тромбообразованию и выступать в качестве аутоантигенов 14,15. Баланс между желательными и пагубные последствия сеток может варьироваться от различных заболеваний и различных видов, предполагая, что важно исследовать как в сетей не от вида и состояния интереса.
Мы тутописывают простой протокол для индукции и измерения высвобождения НЭО на собачьих нейтрофилов. Этот метод аналогичен тем , которые используются для изоляции нейтрофилы 16 и индуцируют NETosis у других видов, но условия , такие как повышенная концентрация агониста и времени инкубации были оптимизированы для собачьих нейтрофилах. Похожая NET анализа высвобождения Количественное ДНК также была описана у других видов , но метод , представленный здесь также оптимизирован для собак 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились с этической разрешения Iowa Государственного комитета университета Институциональная уходу и использованию животных.
Коллекция 1. Кровь
- Draw 9 мл крови из подкожных, головными или яремную вену непосредственно в антикоагулянта (например, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1,8 мг K 2 ЭДТА / мл крови) vacutainers, или в шприц с немедленным переходом на ЭДТА пробирки , содержащие крови. Осторожно катить или инвертировать трубки крови, чтобы обеспечить адекватное перемешивание крови и антикоагулянта.
2. Нейтрофильная Изоляция
- В коническую пробирку емкостью 50 мл, перемешать кровь с равным объемом стерильного комнатной температуры 3% декстрана-500 (составил в 0,9% стерильного солевого раствора) путем осторожного переворачивания. Оставьте стоять в вертикальном положении в течение 18-20 мин при комнатной температуре. Перенести соломенного цвета верхний слой в свежую пробирку, пока он больше не может быть собрана без загрязнения нижнего красного слоя. Эритроциты в тысе оригинальная трубка может быть отброшен.
- Центрифуга супернатант при 500g в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Откачать и отбросить супернатант. Вручную повторно приостанавливать осадок клеток в 10 мл при комнатной температуре стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS). Обратите внимание, что вортексе не следует использовать для ресуспендируйте нейтрофилы на любой стадии этого протокола. Вручную оттягивая, а не заливкой от супернатантов также рекомендуется по всему протоколу для максимального выхода клеток.
- Добавляют 10 мл раствора дл разделени клеток при комнатной температуре polysucrose и диатризоат натрия (например, Histopaque 1077) в 50 мл коническую пробирку. Тщательно слой клеточной раствора, содержащего над раствором дл разделени клеток. Обратите внимание, что использование раствора разделения клеток, которые не доведены до комнатной температуры может привести к снижению выхода клеток.
- Центрифуга при 300 х г в течение 30 мин при комнатной температуре с тормозным выключенном.
- Поскольку нейтрофилы находятся в самом нижнем слое градиента, оттянуть и отбросить uppeR 3 слоя, состоящие из верхнего слоя плазмы и тромбоцитов, узкой белой полосой мононуклеарных клеток и прозрачный слой градиента плотности среды.
- Для лизиса оставшихся эритроцитов, повторно приостановить нейтрофилов осадок в 10 мл воды комнатной температуры.
- После того, как 30 секунд, восстановление тоничность путем добавления 10 мл стерильной при комнатной температуре 1,8% натрия хлорида и перемешать аккуратным переворачиванием.
- Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Откачать супернатант и выбросьте.
- Если осадок все еще красный, повторите шаг лизиса. Если осадок белого цвета (или если лизис уже выполнена дважды), осторожно повторно приостанавливать клеток в 10 мл стерильной PBS.
- Граф клеток с использованием автоматизированного счетчика или гемоцитометра. Типичные выходы по меньшей мере , 10 6 клеток на мл крови.
- Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Откачать супернатант и выбросьте.
- Повторное приостановить клетки до требуемой концентрации в стерильном PBS при комнатной температуре. Foг анализ высвобождения ДНК описано в разделе 2, ресуспендируют в 5 × 10 6 клеток на мл.
- При желании передать небольшой объем клеток непосредственно или с помощью цитоцентрифуге на предметное стекло. Разрешить клетки и высушить пятно с помощью быстрой фиксации и окрашивания комплект в соответствии с инструкциями изготовителей ". Если изоляция нейтрофильный была успешной, при ближайшем рассмотрении под микроскопом по крайней мере, 95% ядерных клеток должны быть гранулоциты (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы) с минимальным загрязнением эритроцита.
3. Анализ ДНК-релиз
- Настройка анализа высвобождения ДНК сразу после выделения нейтрофилов.
- Если клетка слипания присутствует на рассмотрении исходного раствора с помощью световой микроскопии, проходят клеточной суспензии через стерильный 70 мкм стерильный фильтр непосредственно перед установкой анализа.
- Для каждой тестируемой лунки стерильного 96 - луночного планшета, добавляют 5 х 10 4 клеток / лунку; агонист и Roswell Park Memoриал институт-1640 (RPMI) среде без фенола красного и дополненной 0,5% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка до конечного объема 100-200 мкл. Включите по крайней мере две пустые лунки за агонистом, в котором нейтрофилы маточный раствор заменено равным объемом PBS. Обратите внимание, что создание пустых лунок для каждого агониста имеет важное значение в исключает загрязнение ДНК агониста или вмешательства со стороны агониста с флуоресцентного анализа.
- Инкубируют при 39 ° С в течение 30 мин в диоксид углерода (4%) инкубаторе.
- Добавить агонисты в желаемых концентрациях и клетки непроницаема красителя нуклеиновых кислот. Обратите внимание на оптимальную концентрацию клеток непроницаемой краситель будет варьироваться между различными красителями нуклеиновых кислот. Нестимулированных средства управления, в которых агонисты заменены равным объемом средств массовой информации должны быть включены в каждом эксперименте.
Примечание: Желательно, чтобы разбавить агонистами в аналогичных объемах культуральной среды для поддержания постоянных условий между скважинами. Окончательные объемы лунка 200 &# 181; л, были успешно использованы, и если это будет изменено, а объемы должны оставаться одинаковыми для всех условий. Форболовыми-12-миристат-13-ацетата (РМА) (конечная концентрация ≥0.1 мкМ) или фактор активации тромбоцитов (ФАТ) (конечная концентрация ≥31 мкМ) может быть использован в качестве положительного контроля. Агонисты должны измеряться по меньшей мере, в двух экземплярах. - Инкубируют при 39 ° С. Измерение флюоресценции с использованием микропланшет-ридера через 2 часа или в требуемых интервалах. Следует отметить, что оптимальные интервалы времени будут меняться в зависимости от используемых агонистов.
Примечание: Длина волны будет зависеть от красителя, используемого. - Вычтите пустой флуоресценции до расчета средней флуоресценции.
- Для того, чтобы провести сравнение между отдельными людьми, так и между пластинами, вычислить кратное изменение флуоресценции путем деления средней флуоресценции стимулированных скважин средней флуоресценции нестимулированных скважин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При использовании этого протокола, должно быть сильное изменение раза в флуоресценции после того, как стимулирующее нейтрофилы с положительным контролем, РМА и PAF. Как показано на рисунке 1В, стимуляция собачьих нейтрофилов с 31 мкМ СУП для 1 результатов ч в среднем 4,0-кратное увеличение флуоресценции по сравнению с нестимулированных клеток (диапазон 2.0-5.8, п = 5 собак) 18. РМА при 0,1 мкМ (Фигура 1А) представляет собой медленный агонист , который не приводит к увеличению флуоресценции до 2 часов , но в конечном счете , приводит аналогичное кратное увеличение флуоресценции ( в среднем 3,3, диапазон 1.36-5.4, п = 5 собак) 18. Несмотря на более медленной кинетикой, есть преимущества для РМА в качестве положительного контроля: оно является относительно недорогим по сравнению с высокими концентрациями PAF и он широко используется в мышиных и человеческих исследований.
Флуоресценция красителей нуклеиновых кислот не specific для NET формирования, поскольку она также будет иметь место, если есть гибель клеток с помощью других механизмов, или если реагенты загрязнены ДНК. Как показано на рисунке 2, коммерческий препарат LPS , произведенный очень высокую флуоресценцию при отсутствии нейтрофилы, предположительно из - за загрязнения бактериальной ДНК. Подтверждая NET образование с помощью других методов, таких как иммунофлюоресценции рекомендуется.
Рисунок 1: РМА и СУП увеличение флуоресценции клеточного непроницаемой красителя нуклеиновых кислот с различной кинетикой нейтрофилы стимулировали 0,1 мкМ PMA (А) или 31 мкМ PAF (В) в присутствии клеток непроницаема красителя с нуклеиновой кислотой.. Измеряют флуоресценцию с часовыми интервалами и складчатой изменении флуоресценции стимулированных клеток по сравнению с не-стимулированных клеток, вычисленных. увеличение флуоресценцииd значительно от 1 до 2 ч для PMA (повторных измерений в одну сторону ANOVA с последующим несколькими т-тестов с коррекцией Бонферрони, кратности скорректированной р = 0,04; столбики ошибок представляют собой среднее ± стандартная ошибка для 5 человек) , но уже стабилизировался для СУП 1 ч. Эта цифра была изменена от Jeffery U и др Собаки литые НРТ тоже: Собачий. Нейтрофильные внеклеточные ловушки в здоровье и иммуноопосредованной гемолитической анемии. Ветеринарная иммунология и иммунопатологии, 168 (3-4), 262-8, DOI:. 10,1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Пустые скважины имеют важное значение , чтобы исключить загрязнение ДНК или помехи агониста Коммерческий источник LPS.был добавлен в бесклеточных лунках, содержащих RPMI. Большое изменение раза в флуоресценции по сравнению с колодцами , содержащими не стимулировало нейтрофилы предполагает загрязнение агониста с бактериальной ДНК. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ ДНК-релиз представлен представляет собой легко поддаются количественной оценке для анализа внеклеточной ДНК. Этот метод был адаптирован из подобных методов , используемых для оценки NET формирование у других видов, но скорость центрифугирования агонист концентрации и времени инкубации были изменены , чтобы оптимизировать метод для использования с собачьими нейтрофилы 8,17,18. Аналогичные корректировки могут быть сделаны, чтобы приспособить метод для других видов. Анализ прост и недорог по сравнению с другими методами измерения NETosis таких как поточной цитометрии или анализа изображений. Способ также не требует антител против NET компонентов, поэтому идеально подходит для использования у собак, для которых производятся в промышленных масштабах, валидированные виды реагирующих антител часто отсутствуют.
Основным недостатком метода является отсутствие специфичности клеточных непроницаемой красителей нуклеиновых кислот для формирования NET. Эти красители также входят мертвые и умирающие клетки, связывают ДНК и флуоресцирует. Поэтому, флuorescence не является специфическим для NET формирования. Использование других методов (например, иммунофлюоресценции) параллельно с количественным анализом , чтобы визуально подтвердить агонисты вызывающие образование NET , а не других форм клеточной смерти настоятельно рекомендуется. Анализ может также потенциально быть использованы в качестве общего скрининг - анализа гибели клеток, например , в качестве средства количественной оценки цитотоксичности исключая виво.
Протокол является простым, но есть критические шаги, необходимые для достижения успеха. Во-первых, как было отмечено в протоколе, чтобы избежать чрезмерных потерь клеток в процессе выделения нейтрофилов, важно, чтобы супернатанты отсасывают с помощью пипетки, а не отбрасываются переворачиванием пробирки. Во-вторых, успех анализа опирается на нестимулированных контрольных клеток, оставшихся в жизнеспособном состоянии покоя и на протяжении инкубации. Нейтрофилы могут активироваться на любой стадии протокола так большое внимание следует выплачиваемой атравматической сбора крови тechnique и избегая травматический обработки (например, вортексе) в процессе выделения нейтрофилов. Кроме того , важно помнить , что нейтрофилы имеют ограниченный срок службы , так задержка выделения клеток или установки анализа следует избегать 19. Если длительной инкубации с агонистами попытка, жизнеспособность нестимулированных клеток в течение этого периода времени должны быть подтверждены.
Как показано на рисунке 1, существуют значительные различия между собаками в их реакции на NET агонистов. Тем не менее, этот анализ должен быть разумно согласуются между повторами из того же животного, с вариацией внутри пробы на 9% в расчете на 10 дублирует 18. Если существуют большие различия между повторами, клеточная слипания, вероятно, отвечает. Меры по снижению клеточного образования комков включают поддержание клеток в PBS, а не кальция, содержащего буфер до создания анализа ДНК, обработки клеток осторожно по всей изоляции, и фильтрование клеток запассуспензию перед металлизации клеток.
Если эти шаги выполняются, этот протокол позволяет количественно оценить NET формирования в ответ на широком диапазоне экспериментальных условий и агонистов. Такие исследования могут углубить наше понимание роли НЭО в собачьем здоровье и болезни. Например, эта методика позволяет проводить сравнение между NET выпуска здоровых собак и тех, с иммуносупрессивных или аутоиммунных заболеваний, при которых NETosis может быть ослаблена или усиленных. В качестве альтернативы, когда в сочетании с другими методами, такими как иммунофлуоресценции, анализ может быть использован для идентификации агонистов новых, способных индуцировать NETosis и новым ингибиторам NETosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D.
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
