Summary
armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.
Introduction
Há mais de 70 milhões de cães de estimação nos EUA sozinho 1. Como membros da família valorizados, estes animais muitas vezes recebem corte cuidados médicos borda. Igualmente porque partilham o nosso ambiente, os cães podem fornecer insights sobre a patogênese e tratamento da doença humana 1. No entanto, se a tradução descobertas na medicina humana em tratamentos veterinários, ou vice-versa, é importante caracterizar completamente as variações das espécies, mesmo em sistemas altamente conservadas, tal como a resposta imune inata. Exemplos de diferenças entre o canino e sistema imune inato humano incluem a alta expressão de CD4 no cão neutrófilos 2; a ausência de um homólogo funcional do sensor de flagelina citoplasmática IPAF em cães e 3 a expressão de um híbrido da caspase 1/4 em carnívoros 4.
Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são um componente relativamente recentemente descoberta da imunidade inata 5. As redes são de redes de ADN proteínas, nuclear e granular liberados em resposta a uma ampla gama de estímulos inflamatórios ou infecciosos 6. Estruturas de tipo rede foram demonstradas em muitas espécies, incluindo galinhas 7, peixes, moluscos 8 9 e acoelomates 10, mas há variações de espécies. Por exemplo, os neutrófilos murino respondem mais lentamente a estímulos NETosis do que os neutrófilos humanos, e formam NET menos difusa 11. Há um grande corpo de evidências a partir de várias espécies que as redes aprisionam micróbios, e mais controversa pode ser diretamente envolvidos na eliminação de agentes patogénicos 12,13. No entanto, os componentes NET também melhorar danos nos tecidos, promover a trombose e agir como auto-antígenos 14,15. O equilíbrio entre os efeitos benéficos e deletérios da NET podem variar entre diferentes doenças e espécies diferentes, o que sugere que é importante investigar NET, tanto em espécie e condição de interesse.
Aqui nósdescrevem um protocolo simples para induzir e medir a libertação de redes por neutrófilos canino. Este método é semelhante às utilizadas para isolar os neutrófilos 16 e induzir NETosis em outras espécies, mas as condições, tais como a concentração de agonista e tempo de incubação foram optimizados para os neutrófilos canino. Um ensaio de libertação de uma rede similar quantificação do ADN foi também descrita em outras espécies, mas o método aqui apresentado é também optimizado para cães 8,17,18.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados com permissão ética do Comitê Animal Care Universidade Institucional e Use o Estado de Iowa.
Coleção 1. Sangue
- Desenhar 9 ml de sangue de uma veia safena, cefálica ou jugular directamente em anticoagulante (por exemplo, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1,8 mg de K 2 EDTA / ml sangue) VACUTAINERS, ou para uma seringa com a transferência imediata para tubos de sangue contendo EDTA. Delicadamente rolar ou inverter os tubos de sangue para assegurar a mistura adequada de sangue e anti-coagulante.
2. neutrófilos Isolamento
- Em um tubo cónico de 50 mL, misturar o sangue com um volume igual de temperatura ambiente estéril de 3% de dextrano-500 (preparado em 0,9% de solução salina estéril) por inversão suave. Deixar de pé por 18-20 minutos à temperatura ambiente. Transferir a camada superior cor de palha para um tubo fresco, até que já não pode ser recolhido sem contaminação pela camada inferior vermelho. Os eritrócitos no the tubo original pode ser descartada.
- Centrifuga-se o sobrenadante a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Tirar e descartar o sobrenadante. Manualmente re-suspender o sedimento celular em 10 ml temperatura ambiente fosfato estéril tamponado salino (PBS). Note-se que vórtice não deve ser utilizado para re-suspender neutrófilos em qualquer fase deste protocolo. desenho manualmente fora, em vez de decantar os sobrenadantes também é recomendado durante todo o protocolo para maximizar o rendimento celular.
- Adicionar 10 ml de uma solução de separação de células polissacarose temperatura ambiente e diatrizoato de sódio (por exemplo, de Histopaque 1077) para um tubo de 50 ml. Cuidadosamente camada a solução contendo as células através da solução de separação de células. Note-se que usando uma solução de separação de células que não atingir a temperatura ambiente podem reduzir a colheita de células.
- Centrifugar a 300 xg durante 30 min à temperatura ambiente com o freio.
- Como os neutrófilos estão na camada mais baixa do gradiente, desenhar e descartar a uppeR 3 camadas, composto por uma camada superior de plaquetas e de plasma, uma banda branca estreita de células mononucleares e uma camada transparente de meio de gradiente de densidade.
- Para lisar quaisquer eritrócitos restantes, re-suspender o sedimento de neutrófilos em 10 ml de água à temperatura ambiente.
- Após 30 segundos, restaurar a tonicidade pela adição de 10 ml de temperatura ambiente cloreto de sódio esterilizada 1,8% e misturar por inversão suave.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Empate fora o sobrenadante e descartar.
- Se o pellet é ainda vermelho, repita a etapa de lise. Se o sedimento é branco (ou se a lise já foi realizado duas vezes), as células suavemente re-suspensão em 10 ml de PBS estéril.
- Contagem de células utilizando um contador automático ou um hemocitômetro. Os rendimentos típicos são de pelo menos 10 6 culas por ml de sangue.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Empate fora o sobrenadante e descartar.
- células na concentração desejada em PBS estéril temperatura ambiente re-suspender. for o ensaio de liberação de DNA descrita na secção 2, ressuspender em 5 x 10 6 células por ml.
- Se desejado, transferir um pequeno volume das células directamente ou usando um citocentrífuga a uma lâmina de vidro. Permitir que as células para secar e mancha usando um kit de fixação e coloração rápida de acordo com a fabrica 'instruções. Se o isolamento de neutrófilos tenha sido bem sucedida, quando examinado sob o microscópio, pelo menos, 95% de células nucleadas deve ser granulócitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos) com contaminação por eritrócitos mínima.
3. DNA Ensaio de Libertação
- Configure o ensaio de liberação de DNA imediatamente após o isolamento dos neutrófilos.
- Se aglutinação celular está presente na análise da solução de reserva por microscopia de luz, passar a suspensão de células através de um filtro estéril de 70? M estéril imediatamente antes de montar o ensaio.
- Para cada poço de teste de uma placa de 96 poços estéreis, adicionam-se 5 x 10 4 células / poço; agonista e Memo Roswell Parkrial Instituto-1640 (RPMI) meio sem vermelho de fenol e suplementado com soro fetal de vitelo inactivado por calor a 0,5% para um volume final de 100-200 mL. Incluem, pelo menos, dois poços em branco por agonista em que a solução de estoque de neutrófilos é substituído por um volume igual de PBS. Note-se que a criação de poços em branco para cada agonista é importante para descartar a contaminação do DNA do agonista ou interferência pelo agonista com o ensaio de fluorescência.
- Incubar a 39 ° C durante 30 min, num incubador de dióxido de carbono (4%).
- Adicionar agonistas em concentrações desejadas e um corante ácido nucleico celular impermeável. Note-se a concentração óptima de corante impermeável células irá variar entre diferentes corantes ácidos nucleicos. Controlos não-estimulada em que agonistas são substituídos por um volume igual de meio devem ser incluídos em cada experiência.
NOTA: É desejável diluir agonistas em volumes semelhantes de meio de cultura para manter as condições consistentes entre poços. volumes bem final de 200 &# 181; G têm sido usados com sucesso e, se esta for alterada, bem volumes devem permanecer idêntica para todas as condições. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (concentração final ≥0.1 uM) ou factor activador de plaquetas (PAF) (concentração final ≥31 uM) podem ser utilizadas como controlos positivos. Agonistas devem ser medidos pelo menos em duplicado. - Incubar a 39 ° C. Medir a fluorescência utilizando um leitor de microplacas, após 2 horas ou em intervalos desejados. Note-se que os intervalos de tempo óptimos vão variar com agonistas utilizados.
NOTA: Comprimento de onda dependerá do corante empregado. - Subtrair fluorescência em branco antes de calcular fluorescência média.
- Para permitir a comparação entre indivíduos e entre as placas, calcular uma mudança na fluorescência vezes dividindo a fluorescência média de poços estimulados por a fluorescência média de poços não estimuladas.
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Representative Results
Usando este protocolo, não deve haver uma mudança forte dobra na fluorescência após estimulação de neutrófilos com os controlos positivos, PMA e PAF. Como ilustrado na Figura 1B, a estimulação de neutrófilos caninos com 31 uM de PAF 1 para resultados de RH num aumento significativo 4,0 vezes na fluorescência em comparação com células não estimuladas (intervalo 2,0-5,8, n = 5) 18 cães. PMA a 0,1 uM (Figura 1A) é um agonista mais lento, que não resulta em um aumento na fluorescência até 2 horas, em última instância, mas produz um aumento semelhante vezes na fluorescência (média: 3,3, gama 1,36-5,4, n = 5 cães) 18. Apesar das suas cinéticas mais lentas, há vantagens em PMA como um controlo positivo: é relativamente barato em comparação com altas concentrações de PAF e isto tem sido amplamente utilizado em estudos murinos e humanos.
A fluorescência dos corantes de ácido nucleico não é SESPECÍFICOS para a formação de líquido, como também ocorrerá se não é a morte da célula por outros mecanismos ou se os reagentes estão contaminados com ADN. Como mostrado na Figura 2, uma preparação comercial de LPS produzida muito elevado de fluorescência na ausência de neutrófilos, presumivelmente devido a contaminação com DNA bacteriano. Confirmando a formação de líquido, através de outros métodos tais como a imunof luorescência é recomendado.
Figura 1: PMA e PAF aumento de fluorescência de um corante ácido nucleico impermeável células com diferentes cinéticas Os neutrófilos foram estimulados com 0,1 ^ M de PMA (A) ou de 31 uM de PAF (B) na presença do corante ácido nucleico celular impermeável.. A fluorescência foi medida a intervalos de uma hora e a mudança vezes na fluorescência das células estimuladas em comparação com células não estimuladas calculados. aumento de fluorescênciad significativamente entre 1 e 2 horas, para a PMA (repetido medidas one-way ANOVA seguido por vários testes t com correção de Bonferroni, p ajustado multiplicidade = 0,04; barras de erro são ± erro padrão da média para 5 pessoas), mas já tinha estabilizado para PAF por 1 hr. Este valor foi modificado a partir de Jeffery L, et al Cães elenco NET também:. Neutrófilos Canine armadilhas extracelulares na saúde e na anemia hemolítica imunomediada. Imunologia Veterinária e Imunopatologia, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: poços em branco são importantes para impedir a contaminação de DNA ou interferência pelo agonista Uma fonte comercial de LPS.foi adicionado às cavidades contendo meio RPMI acelulares. Uma grande mudança vezes na fluorescência em comparação com os poços contendo neutrófilos não estimuladas sugere a contaminação do agonista com DNA bacteriano. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O ensaio de libertação de ADN apresentadas é um ensaio prontamente quantificável para ADN extracelular. O método foi adaptado de técnicas semelhantes utilizadas para avaliar a formação de NET em outras espécies, mas as velocidades de centrifugação, as concentrações de agonista e os tempos de incubação foram alteradas para optimizar o processo para uso com neutrófilos canino 8,17,18. ajustes similares poderiam ser feitas para adaptar o método para outras espécies. O ensaio é simples e barato quando comparado com outros métodos para medir NETosis, tais como a análise de citometria de fluxo ou imagem. O método também não necessita de anticorpos contra componentes do líquido, de modo é ideal para utilização em cães para os quais produzida comercialmente, espécies reactivas validados-anticorpos são frequentemente indisponível.
A principal limitação do método é a falta de especificidade de corantes de ácido nucleico de células impermeável para a formação de rede. Estes corantes também entrar nas células mortos e moribundos, DNA ligam e fluorescência. Portanto, FLuorescência não é específico para a formação NET. A utilização de outras técnicas (por exemplo, imunof luorescência) em paralelo com o ensaio quantitativo para confirmar visualmente são agonistas induzindo a formação de líquido e não a outras formas de morte celular é fortemente recomendado. O ensaio pode também potencialmente ser utilizada como um ensaio de rastreio geral para a morte celular, por exemplo, como um meio de quantificar a citotoxicidade ex vivo.
O protocolo é simples, mas há passos críticos necessários para garantir o sucesso. Em primeiro lugar, tal como referido no protocolo, para evitar a perda excessiva de células durante o isolamento de neutrófilos, é importante que os sobrenadantes são retirados com uma pipeta em vez de descartados, invertendo os tubos. Em segundo lugar, o sucesso do ensaio baseia-se nas células de controlo não estimuladas restantes num estado viável e de repouso ao longo da incubação. Neutrófilos pode tornar-se activado em qualquer fase durante o protocolo de atenção tão cuidadosa deve ser dada à coleta de sangue atraumática technique e evitando manipulação traumática (por exemplo, agitação em vórtex) durante o isolamento dos neutrófilos. Também é importante lembrar que os neutrófilos têm uma duração limitada de modo atraso no isolamento de células ou a criação de ensaio deve ser evitado 19. Se a incubação prolongada com agonistas é tentada, a viabilidade das células não estimuladas ao longo deste período de tempo deve ser confirmada.
Como mostrado na Figura 1, há uma considerável variação entre os cães na sua resposta a agonistas líquidas. No entanto, o ensaio deve ser razoavelmente consistente entre as repetições do mesmo animal, com uma variação intra-ensaio de 9% com base em 10 de 18 duplica. Se existem grandes variações entre repetições, aglutinação celular é provavelmente responsável. Medidas para reduzir a aglomeração de células incluem a manutenção de células em PBS em vez de um de cálcio contendo tampão antes de configurar o ensaio de DNA, tratamento de células suavemente ao longo isolamento, e filtrando o estoque de célulassuspensão de células antes do plaqueamento.
Se estes passos forem seguidos, este protocolo permite a quantificação da formação de NET em resposta a uma vasta gama de condições experimentais e agonistas. Esses estudos podem aprofundar nossa compreensão do papel das redes na saúde canina e doença. Por exemplo, esta técnica permite a comparação de liberação NET entre cães saudáveis e aqueles com doenças imunossupressoras ou auto-imunes em que NETosis possam ser prejudicados ou melhorados. Alternativamente, quando combinada com outras técnicas tais como a imunof luorescência, o ensaio pode ser utilizado para identificar novos agonistas capazes de induzir NETosis e novos inibidores de NETosis.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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