Summary
Neutrofile ekstracellulære fælder (net) er netværk af DNA, histoner og neutrofile proteiner. Selv om en del af den medfødte immunreaktion, er NET impliceret i autoimmunitet og trombose. Denne protokol beskriver en enkel fremgangsmåde til hunde neutrofil isolering og kvantificering af NET bruger mikroplade fluorescens-assay.
Introduction
Der er over 70 mio hunde i USA alene en. Som værdsatte familiemedlemmer, disse dyr ofte modtager banebrydende lægehjælp. Lige så fordi de deler vores miljø, kan hunde give indsigt i patogenesen og behandling af sygdomme hos mennesker en. Men hvorvidt oversætte opdagelser i humanmedicin i veterinære behandlinger eller omvendt, er det vigtigt at grundigt karakterisere artsvariationer selv i stærkt konserverede systemer såsom det medfødte immunreaktion. Eksempler på forskelle mellem hunde og menneskers medfødte immunsystem omfatter høj ekspression CD4 på hund neutrofiler 2; fraværet af en funktionel homolog af den cytoplasmatiske flagellin sensor IPAF hos hunde 3 og ekspressionen af en caspase 1/4 hybrid i kødædere 4.
Neutrofile ekstracellulære fælder (net) er en relativt nylig opdaget komponent af medfødte immunitet 5. NET er netværks af DNA, nukleare og kornede proteiner frigivet som reaktion på en bred vifte af inflammatoriske eller infektiøse stimuli 6. NET-lignende strukturer er blevet påvist på tværs af mange arter, herunder kyllinger 7, fisk 8, bløddyr 9 og acoelomates 10, men der er artsvariationer. For eksempel murine neutrofiler reagere langsommere til NETosis stimuli end humane neutrofiler, og danner mindre diffuse NET 11. Der er en stor mængde dokumentation fra flere arter, som NET indeslutter mikrober, og mere kontroversielt kan være direkte involveret i drab patogener 12,13. Men NET komponenter også øge vævsskader, fremme trombose og fungere som autoantigener 14,15. Balancen mellem de gavnlige og skadelige virkninger af NET kan variere mellem forskellige sygdomme og forskellige arter, hvilket tyder på at det er vigtigt at undersøge NET både i beskaffenhed og tilstand af interesse.
Her er vibeskrive en enkel protokol til at fremkalde og måle frigivelse af NET med hunde neutrofiler. Denne metode svarer til dem, der anvendes til at isolere neutrofiler 16 og inducere NETosis i andre arter, men forhold såsom agonist koncentration og inkubationstid er blevet optimeret til hunde neutrofiler. En lignende NET kvantificering DNA frigivelsesassay er også blevet beskrevet i andre arter men metoden præsenteres her er også optimeret til hunde 8,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført med etisk tilladelse fra Iowa State University Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Blodprøvetagning
- Tegn 9 ml blod fra en vena, cefal eller halsvenen direkte i antikoagulant (f.eks ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml blod) vakuumbeholdere, eller i en sprøjte med øjeblikkelig overførsel til EDTA-holdige blod rør. Forsigtigt rulle eller invertsukker blodet rør til at sikre tilstrækkelig blanding af blod og antikoagulant.
2. Neutrofil Isolation
- I et 50 ml konisk rør, blandes blod med et lige volumen sterilt stuetemperatur 3% dextran-500 (fremstillet i 0,9% sterilt saltvand) ved forsigtig inversion. Lad stå oprejst 18-20 minutter ved stuetemperatur. Overfør stråfarvet øvre lag til et frisk rør, indtil det ikke længere kan opsamles uden kontaminering fra den nedre røde lag. Erythrocytterne i the oprindelige rør kan kasseres.
- Centrifugeres supernatanten ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C. Tegn off og kassér supernatanten. Manuelt genopslæmmes cellepelleten i 10 ml stuetemperatur sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Bemærk, at vortex-bør ikke bruges til at re-suspendere neutrofiler på noget tidspunkt i denne protokol. Manuel aftapning, snarere end at hælde off supernatanter anbefales også hele protokollen for at maksimere celle udbytte.
- Tilsæt 10 ml af en rumtemperatur polysucrose og natrium diatrizoat celleseparation løsning (f.eks Histopaque 1077) til en 50 ml konisk rør. lag forsigtigt celleholdige opløsning over cellen adskillelse opløsning. Bemærk, at brug celleseparation løsning, som ikke har opnået stuetemperatur kan reducere celleudbytte.
- Centrifuger ved 300 x g i 30 minutter ved stuetemperatur med bremsen.
- Da neutrofiler er i det nederste lag af gradienten, tegne off og kassér upper 3 lag, der består af et øvre lag af plasma og blodplader, en smal hvid bånd af mononukleære celler og en klar lag af densitetsgradient-medium.
- For at lysere eventuelle resterende erythrocytter, re-suspendere neutrofile pellet i 10 ml vand ved stuetemperatur.
- Efter 30 sek, gendanne tonicitet ved at tilsætte 10 ml sterilt stuetemperatur 1,8% natriumchlorid og bland ved forsigtig inversion.
- Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tegn off supernatanten og kassér.
- Hvis pelleten er stadig rød, gentag lysistrinnet. Hvis pelleten er hvid (eller hvis lysis allerede er blevet udført to gange), forsigtigt genopslæmme cellerne i 10 ml sterilt PBS.
- Tæl celler under anvendelse af en automatiseret tæller eller et hæmocytometer. Typiske udbytter er mindst 10 6 celler pr ml blod.
- Centrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tegn off supernatanten og kassér.
- Resuspender celler til den ønskede koncentration i steril stuetemperatur PBS. for DNA release assay beskrevet i afsnit 2, resuspender på 5 x 10 6 celler pr.
- Om ønsket overfører et lille volumen af celler direkte eller ved hjælp af en cytocentrifuge til et objektglas. Tillad celler til at tørre og pletten med en hurtig fiksering og farvning kit ifølge producentens anvisninger. Hvis neutrofil isolation har været vellykket, når de undersøges under mikroskop mindst 95% af kerneholdige celler bør være granulocytter (neutrofiler, basofiler, eosinofiler) med minimal erythrocyt kontaminering.
3. DNA frigivelsesassay
- Opsæt DNA release assay umiddelbart efter neutrofil isolation.
- Hvis celle sammenklumpning er til stede på en undersøgelse af stamopløsningen ved lysmikroskopi, passerer cellesuspensionen gennem et sterilt 70 um sterilt filter umiddelbart før opsætning af analysen.
- Til hver brønd af en steril 96 brønds plade, tilsættes 5 x 10 4 celler / brønd; agonist og Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) medium uden phenolrødt og suppleret med 0,5% varmeinaktiveret føtalt kalveserum til et endeligt volumen på 100-200 ml. Omfatte mindst to tomme brønde pr agonist, hvori neutrofil stamopløsningen er erstattet med det samme volumen PBS. Bemærk, at opsætning af tomme brønde for hver agonist er vigtigt at udelukke DNA forurening af agonist eller indblanding fra agonist med fluorescens-analysen.
- Inkuber ved 39 ° C i 30 minutter i en carbondioxid (4%) inkubator.
- Tilføj agonister ved ønskede koncentrationer og en celleimpermeabelt nukleinsyre farvestof. Bemærk den optimale koncentration af celleimpermeabelt farvestof vil variere mellem forskellige nucleinsyre-farvestoffer. Ikke-stimulerede kontroller, hvor agonister er erstattet med et tilsvarende volumen af medier bør medtages i hvert forsøg.
BEMÆRK: Det er ønskeligt at fortynde agonister i lignende mængder dyrkningsmedium at opretholde ensartede vilkår mellem brønde. Afsluttende brøndvolumener af 200 &# 181; l er blevet anvendt med succes, og hvis dette er ændret, godt mængder bør forblive ens for alle forhold. Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (slutkoncentration ≥0.1 uM) eller blodpladeaktiverende faktor (PAF) (slutkoncentration ≥31 uM) kan anvendes som positive kontroller. Agonister bør måles i hvert fald i to eksemplarer. - Inkuber ved 39 ° C. Mål fluorescens under anvendelse af en mikropladelæser efter 2 timer eller med ønskede intervaller. Bemærk at optimale tidsintervaller vil variere med agonister, der anvendes.
BEMÆRK: Bølgelængde vil afhænge af farvestof anvendes. - Træk blank fluorescens før beregningen middelværdi fluorescens.
- For at tillade sammenligning mellem individer og mellem pladerne beregnes en fold ændring i fluorescens ved at dividere den gennemsnitlige fluorescens af stimulerede brønde med den gennemsnitlige fluorescens af ikke-stimulerede brønde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol, bør der være en stærk fold ændring i fluorescens efter stimulering neutrofiler med de positive kontroller, PMA og PAF. Som illustreret i figur 1B, stimulering af hunde neutrofiler med 31 pM PAF i 1 time resulterer i en gennemsnitlig 4,0-fold stigning i fluorescens sammenlignet med ikke-stimulerede celler (interval 2,0-5,8, n = 5 hunde) 18. PMA 0.1 pM (figur 1A) er en langsommere agonist, der ikke resulterer i en stigning i fluorescens indtil 2 timer, men i sidste ende frembringer en tilsvarende stigning fold i fluorescens (gennemsnit: 3,3, interval fra 1,36 til 5,4, n = 5 hunde) 18. Trods den langsommere kinetik, der er fordele ved PMA som en positiv kontrol: det er relativt billigt sammenlignet med høje koncentrationer af PAF og det har været meget anvendt i murine og humane studier.
Fluorescens af nukleinsyre farvestoffer er ikke sPECIFIKKE for NET dannelse, da det også vil opstå, hvis der er celledød ved andre mekanismer eller hvis reagenser er forurenet med DNA. Som vist i figur 2, et kommercielt LPS frembragt meget høj fluorescens i fravær af neutrofiler, formodentlig på grund af forurening med bakterielt DNA. anbefales bekræfter NET dannelse gennem andre metoder såsom immunfluorescens.
Figur 1: PMA og PAF stigning fluorescens af en celle uigennemtrængeligt nukleinsyre farvestof med forskellige kinetik Neutrofiler blev stimuleret med 0,1 uM PMA (A) eller 31 pM PAF (B) i nærvær af cellen impermeable nukleinsyre farvestof.. Fluorescens blev målt hver time og gange ændring i fluorescens af stimulerede celler sammenlignet med ikke-stimulerede celler beregnet. Fluorescens stigningd betydeligt mellem 1 og 2 timer til PMA (gentaget foranstaltninger envejs ANOVA efterfulgt af flere t-test med Bonferroni korrektion, mangfoldighed justerede p = 0,04; fejl barer er middelværdier ± standardafvigelsen for 5 personer), men havde allerede plateaued for PAF ved 1 time. Dette tal er blevet ændret fra Jeffery U, et al Dogs støbte NET også:. Canine neutrofile ekstracellulære fælder i sundhed og immun-medieret hæmolytisk anæmi. Veterinær Immunologi og Immunopathology, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10,1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Blanke brønde er vigtigt at udelukke DNA forurening eller indblanding fra agonist En kommerciel kilde til LPS.blev tilsat til acellulære brønde indeholdende RPMI. En stor fold ændring i fluorescens i forhold til brønde, der indeholder ikke-stimulerede neutrofiler tyder forurening af agonist med bakteriel DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA frigivelsesassay fremlagt er en let kvantificerbar assay for ekstracellulært DNA. Metoden blev tilpasset fra lignende teknikker anvendes til at vurdere NET dannelse i andre arter, men centrifugeringshastigheder, agonist koncentrationer og inkuberingstider er blevet ændret for at optimere metoden til anvendelse med hunde neutrofiler 8,17,18. Lignende justeringer kan foretages for at tilpasse fremgangsmåden til andre arter. Assayet er ligetil og billig sammenlignet med andre metoder til måling NETosis såsom flowcytometri eller billedanalyse. Metoden også kræver ikke antistoffer mod NET komponenter, så er ideel til brug i hunde for hvem kommercielt, validerede arter-reaktive antistoffer er ofte utilgængelige.
Den største begrænsning ved metoden er den manglende specificitet celle-uigennemtrængeligt nukleinsyre farvestoffer til NET formation. Disse farvestoffer også indtaste døde og døende celler, binder DNA og fluorescerer. Derfor fluorescence er ikke specifikke for NET formation. Anvendelse af andre teknikker (f.eks immunofluorescens) parallelt med den kvantitative analyse til visuelt bekræfte agonister fremkalde NET dannelse frem for andre former for celledød anbefales kraftigt. Assayet kan også potentielt anvendes som en generel screening assay for celledød, for eksempel som et middel til at kvantificere cytotoksicitet ex vivo.
Protokollen er enkel, men der er kritiske trin, der er nødvendige for at sikre succes. For det første, som anført i protokollen, for at undgå for store tab celle under neutrofile isolation, er det vigtigt, at supernatanter trækkes ud med en pipette i stedet kasseret ved at vende rørene. For det andet succes assayet beror på de ikke-stimulerede kontrolceller forbliver i en levedygtig og hviletilstand hele inkubationen. Neutrofiler kan blive aktiveret på noget tidspunkt i løbet af protokollen skal betales så meget opmærksom på atraumatisk blodindsamling technique og undgå traumatisk håndtering (f.eks vortexbehandling) under neutrofil isolation. Det er også vigtigt at huske, at neutrofiler har en begrænset levetid, så bør undgås forsinkelse i at isolere celler eller opsætning af analysen 19. Hvis forsøges forlænget inkubation med agonister, bør levedygtigheden af de ikke-stimulerede celler løbet af denne periode blive bekræftet.
Som vist i figur 1, er der betydelig variation mellem hunde i deres svar på NET-agonister. Imidlertid bør assayet være rimeligt overensstemmende mellem replikater fra det samme dyr, med en intra-assay variation på 9% baseret på 10 duplikerer 18. Hvis der er store variationer mellem gentagelser, celle sammenklumpning sandsynligvis ansvarlig. Foranstaltninger til at reducere celle sammenklumpning omfatter opretholde celler i PBS i stedet for en calcium indeholder buffer før opsætning af DNA-analysen, behandle celler blidt gennem isolation, og filtrering cellen lagersuspension før udpladning celler.
Hvis følges disse trin, denne protokol tillader kvantificering af NET-dannelse som reaktion på en lang række eksperimentelle betingelser og agonister. Sådanne undersøgelser kan uddybe vores forståelse af den rolle, NET til hunde sundhed og sygdom. For eksempel denne teknik tillader sammenligning af NET frigivelse mellem raske hunde og dem med immunosuppressive eller autoimmune sygdomme, hvor NETosis kan være værdiforringet eller forbedrede. Alternativt, når de kombineres med andre teknikker, såsom immunfluorescens, assayet kan anvendes til at identificere hidtil ukendte agonister stand til at inducere NETosis og hidtil ukendte inhibitorer af NETosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D.
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
