Summary
Nötrofil dışı tuzaklar (NET) DNA, histon ve nötrofil proteinlerin ağlardır. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir bileşeni olmasına rağmen, ağ otoimmün ve tromboz implike edilmiştir. Bu protokol, köpek nötrofil izolasyon ve bir mikroplaka flüoresans deneyi kullanılarak NET'ler ölçümü için basit bir yöntem tarif eder.
Introduction
70 milyon evcil köpekler 1 yalnız ABD'de bulunmaktadır. Değerli aile üyeleri olarak, bu hayvanlar genellikle kenar tıbbi bakım kesim alırsınız. Onlar bizim ortamı paylaşmak Eşit, çünkü köpekler insan hastalıkları 1 patogenezinde ve tedavisinde içgörü sağlayabilir. Ancak, veterinerlik uygulamaları ya da tam tersi olarak insan tıbbında keşifler çeviri olup, iyice gibi doğuştan gelen bağışıklık yanıtı bile yüksek ölçüde korunmuş sistemlerde türleri varyasyonları karakterize etmek için önemlidir. Köpek ve insan doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki farklar örnekleri köpek nötrofil 2 yüksek ifade CD4 arasında; Köpeklerde 3 sitoplazmik flagellin sensörü IPAF fonksiyonel homolog olmaması ve etobur 4 bir kaspaz 1/4 melez ifadesi.
Nötrofil dışı tuzaklar (NET) doğuştan gelen bağışıklık 5 nispeten yeni keşfedilen bileşenidir. NET'ler ağı vardırenflamatuar veya enfeksiyöz uyaranlara 6 geniş bir tepki olarak serbest DNA çekirdek ve granül proteinleri s. NET benzeri yapılar tavuk 7, balık 8, yumuşakçalar 9 ve 10 acoelomates dahil olmak üzere birçok türler arasında gösterilmiştir, ancak tür farklılıklar vardır. Örneğin, kemirgen nötrofiller, insan nötrofillerinden daha NETosis uyaranlara yanıt daha yavaş ve daha az yaygın NET'leri 11 oluşturur. NET'ler doğrudan patojenleri 12,13 öldürme dahil olabilir daha tartışmalı mikropları yakalamak ve çoklu türlerden kanıt büyük bir gövde var. Ancak, NET bileşenleri de, doku hasarına geliştirmek 14,15 Otoantijenler olarak trombozu ve hareket teşvik. NET'ler yararlı ve zararlı etkilerini arasındaki denge tür ve ilgi durumda her iki NET'leri araştırılması önemlidir öne farklı hastalıklar ve farklı türler arasında değişebilir.
buradauyaran ve köpek nötrofiller tarafından NET'ler salınımını ölçmek için basit bir protokol açıklar. Bu yöntem, nötrofil 16 izole etmek ve diğer türlerde NETosis uyarılması için kullanılanlara benzer, ancak bu tür agonist konsantrasyonunun ve kuluçkalama süresi gibi koşullar, Kanin nötrofiller için optimize edilmiştir. Benzer bir .NET miktar DNA salma tahlili diğer türlerde de tarif edilmiştir, ancak burada sunulan yöntem köpeklerde 8,17,18 için optimize edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Iowa State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu etik izni ile yapıldı.
1. Kan Toplama
- Şirketinden antikoagülan bir safen, baş ya da boyun damarından kan 9 ml çizin (örneğin, etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1.8 mg K 2 EDTA / ml kan) vacutainers veya EDTA içeren kan tüplerine anında transfer bir şırınga içine. Yavaşça rulo veya kan ve anti-koagülan yeterince karışmasını sağlamak için, kan tüpler ters.
2. Nötrofil İzolasyon
- 50 ml'lik konik bir tüp içinde, steril, oda sıcaklığında eşit hacimde kan karışımı% 3 özenli bir şekilde ters tarafından dekstran-500 (% 0.9 steril tuzlu su içinde oluşan). Oda sıcaklığında 18-20 dakika süreyle dik ayakta bırakın. artık düşük kırmızı katmanı tarafından kontaminasyon olmadan toplanabilir kadar yeni bir tüp saman renkli üst katman aktarın. th eritrositlerE orijinal tüp atılabilir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 500 xg'de süpernatant santrifüjleyin. kapalı çizin ve supernatant atın. El ile 10 mi oda sıcaklığında steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde hücre pelletini yeniden askıya. bu vorteksleme Bu protokolün her aşamasında yeniden askıya nötrofiller için kullanılmamalıdır edin. El ile yerine aynı zamanda hücre verimi en üst düzeye çıkarmak için protokol boyunca tavsiye edilir süpernatantlar dökülen daha kapalı çizim.
- 50 ml konik tüp, oda sıcaklığındaki bir polisükroz ve sodyum Diatrizoate hücre ayırma çözeltisi (ör Histopaque 1077) 10 ml ilave edilir. Dikkatle hücre ayırma çözümü üzerinde hücre içeren çözüm katmanı. Hücre sayısını azaltabilir, oda sıcaklığına gelmesi olmadığını kullanılarak hücre ayırma çözeltisi edin.
- Fren kapalı olarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
- Nötrofiller degrade en alt tabakada olduğu gibi, kapalı çizmek ve uppe atmakplazma ve trombositler, tek çekirdekli bir hücre beyaz dar bant ve yoğunluk gradyan ortamının açık bir tabakanın bir üst tabaka oluşur R3 tabakalar.
- Kalan, eritrositleri lizise uğratmak için, oda sıcaklığında 10 ml su nötrofil pelet yeniden askıya.
- 30 saniye sonra, steril oda sıcaklığında% 1.8 sodyum klorür, 10 ml ekleyerek tonikliğinin geri ve yumuşak ters çevirerek karıştırın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. süpernatant çizin ve atın.
- pelet hala kırmızı ise, parçalama adımı tekrarlayın. Pelet beyaz (veya lizis zaten iki kez gerçekleştirilmiştir halinde), yavaşça steril PBS, 10 ml hücrelerin yeniden askıya edin.
- otomatik bir sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Tipik verim kan ml'si başına en az 10 6 hücre vardır.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. süpernatant çizin ve atın.
- steril oda sıcaklığı PBS içinde istenen konsantrasyona hücrelerin yeniden askıya. for DNA salınım testi ml başına 5 x 10 6 hücre, 2. bölümde tekrar süspansiyon nitelendirdi.
- Arzu edildiği takdirde, hücrelerin küçük bir hacmi ile doğrudan transferi veya cam slayt, bir sitosantrifüj kullanılmıştır. Hücreler kuru ve leke ", üretici talimatlarına göre hızlı bir sabitleme ve boyama kiti kullanılarak izin verin. mikroskop altında incelendiğinde, nötrofil izolasyonu, başarılı ise çekirdekli hücrelerin en az% 95 oranında en az eritrosit bulaşma ile granülositler (nötrofiller, bazofiller, eozinofiller) olmalıdır.
3. DNA Salım Deneyi
- nötrofil izolasyon hemen sonra, DNA salım deneyi ayarlayın.
- Hücre topaklanma ışık mikroskobu ile stok solüsyon muayenesinde varsa, hemen tahlil kurmadan önce steril 70 mikron steril filtre ile hücre süspansiyonu geçmektedir.
- Steril 96 oyuklu plakanın her bir test kuyucuğuna, 5 x 10 4 hücre / çukur ekleyin; Agonist ve Roswell Park Notfenol kırmızı ve 100-200 ul son hacim olması için% 0.5 ısıyla inaktive edilmiş cenin dana serumu ile takviye edilmiş olmayan arteryel Enstitüsü 1640 (RPMI) ortamında. nötrofil stok çözeltisi PBS eşit hacimde ile ikame edildiği agonist en az iki Boş kaplar içerir. Her agonist için boş kuyu kurma floresan deneyi ile agonist tarafından agonisti veya parazit DNA kontaminasyonu dışlanması önemli olduğunu unutmayın.
- bir karbon dioksit (% 4) kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca 39 ° C'de inkübe edin.
- istenen konsantrasyonlar ve hücre geçirmeyen bir nükleik asit boyası agonistler ekleyin. farklı nükleik asit boyaları arasında değişecektir hücre geçirmeyen boyanın optimal konsantrasyonunu edin. agonistleri ortamın eşit hacimde ile ikame edildiği, uyarılmamış kontrol her deneyde dahil edilmelidir.
NOT: Bu kuyu arasında tutarlı koşulları sağlamak için kültür ortamı içindeki hacim agonistleri seyreltilmesi tercih edilir. 200 nihai oyuk hacimleri &# 181; l başarıyla kullanılmaktadır ve bu değişmiş ise, iyi hacimleri tüm koşullar için aynı kalmalıdır. Forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) (nihai konsantrasyon ≥0.1 uM) ya da platelet aktive edici faktör (PAF) (nihai konsantrasyon ≥31 uM) ve pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Agonistler iki kez, en azından ölçülmelidir. - 39 ° C'de inkübe edin. 2 saat sonra veya arzu edilen aralıklarda bir mikroplaka okuyucusu kullanılarak floresan ölçülür. Optimum zaman aralığı kullanılan agonistler ile değişecektir unutmayın.
NOT: Dalga boyu istihdam boya bağlıdır. - ortalama floresan hesaplamadan önce boş floresan çıkarın.
- bireyler arasında ve plakalar arasında karşılaştırma sağlamak için, uyarılmamış kuyuların ortalama fluoresans ile uyarılmış kuyuların ortalama floresan bölünmesiyle floresansta bir katlama değişimi hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak, pozitif kontroller, PMA ve PAF ile nötrofilleri stimüle sonra floresan kuvvetli bir kat değişiklik olması gerekir. Uyarılmamış hücrelere (dağılım 2,0-5,8, s = 5 köpek) 18 ile karşılaştırıldığında floresanstaki ortalama 4.0 kat bir artış ile 1 saat sonuçlar için 31 uM PAF Şekil 1B, köpek nötrofillerin uyarılması gösterildiği gibi. 0.1 uM (Şekil 1A) PMA 2 saat kadar floresansta bir artışa neden olmayan bir yavaş agonistidir ama sonuçta benzer bir kat floresanstaki artış sağlar (ortalama 3.3 aralığı 1,36-5,4, s = 5 köpek) 18. Bu PAF yüksek konsantrasyonlarda ile karşılaştırıldığında nispeten pahalı olmayan ve yaygın kemirgen ve insan çalışmalarında kullanılmıştır: Bunu yavaş kinetik rağmen PMA avantajları bir pozitif kontrol olarak bulunmaktadır.
Nükleik asit Boyaların flüoresan s değildirhücre ölümü için diğer mekanizmalar tarafından sağlandığı takdirde, reaktif DNA ile kontamine, file oluşumu için pecific de oluşabilir gibi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, ticari bir LPS hazırlanması tahminen bakteriyel DNA ile kirlenme, nötrofillerin yokluğunda yüksek floresan üretti. Böyle immunfloresan gibi diğer yöntemlerle NET oluşumu doğrulayan tavsiye edilir.
Şekil 1: PMA ve farklı kinetik sahip bir cep geçirimsiz bir nükleik asit boya PAF artış floresans Nötrofiller, hücre geçirmeyen nükleik asit boya varlığında 0.1 uM PMA (A) ya da 31 uM PAF (B) ile uyarıldı.. Floresans saatlik aralıklarla ve hesaplanan uyarılmamış hücrelere kıyasla uyarılmış hücrelerin floresans kat değişiklik ölçülmüştür. Floresan artışıd anlamlı PMA için saat 1 ila 2 (tekrarlayan ölçümler Bonferroni düzeltmesi ile birden t-testi, çokluk düzeltilmiş p = 0.04, ardından tek yönlü ANOVA; hata çubukları 5 bireyler için standart hata ortalama ±) ama zaten tarafından PAF için plato vardı 1 saat. . Köpek nötrofil hücre dışı tuzaklar sağlık ve immün aracılı hemolitik anemi: Bu rakam ark çok Köpekler döküm NET'ler, Jeffery U modifiye edilmiştir. Veteriner Immunology and Immunopathology, 168 (3-4), 262-8, doi:. 10,1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Boş kuyu agonist DNA kontaminasyonu veya parazit ekarte için önemli olan LPS bir ticari kaynağı.RPMI ihtiva eden hücresel olmayan oyuklara ilave edildi. Olmayan uyarılan nötrofil içeren kuyu ile karşılaştırıldığında floresan bir büyük kat değişiklik bakteriyel DNA ile agonist kirlenmesini göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sunulan DNA salınım testi dışı DNA için bir kolaylıkla ölçülebilir testtir. Yöntem, diğer türlerdeki NET oluşumunu değerlendirmek için kullanılan benzer teknikler uyarlanmıştır ancak santrifüj hızları agonist konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri köpek nötrofil 8,17,18 ile kullanım için bir yöntem optimize etmek için değiştirildi. Benzer düzenlemeler, diğer türler için bir yöntem adapte yapılabilir. deney gibi akış sitometrisi veya görüntü analizi gibi NETosis ölçmek için kullanılan diğer yöntemlere kıyasla basit ve ucuzdur. Yöntem aynı zamanda, ticari olarak üretilen kime doğrulanmış türe reaktif antikorlar, genellikle kullanılamaz için çok köpeklerde kullanım için idealdir, .NET bileşenlerine karşı antikor gerektirmez.
yöntemin başlıca sınırlaması NET oluşumu için hücre geçirmeyen nükleik asit boyaların özgüllük olmamasıdır. Bu boyalar da ölü ve ölmekte olan hücrelerin, bağlama DNA girin ve floresan. Bu nedenle, FLuorescence NET oluşumu için spesifik değildir. Görsel agonistleri hücre ölümü diğer formları yerine NET oluşumuna sebep onaylamak için niceliksel testi ile paralel olarak diğer tekniklerle (örneğin, immünofloresan) kullanılması önemle tavsiye edilir. Tahlil, aynı zamanda, potansiyel sitotoksisite ex vivo olarak hesaplanması için bir araç olarak, örneğin, hücre ölümü için genel bir tarama deneyi olarak kullanılabilir.
protokol basit, ama başarısını sağlamak için gerekli kritik adımlar vardır. protokolüne İlk olarak, süpernatanlar bir pipetle çekilir yerine tüpler ters çevrilerek atılır önemlidir nötrofil izolasyonu sırasında aşırı hücre kaybını önlemek için. İkinci olarak, deneyi başarılı inkübasyon sırasında uygulanabilir ve dinlenme durumunda kalan Uyarılmamış kontrol hücreleri kullanır. Nötrofiller çok dikkatli dikkat atravmatik kan toplama t dikkat edilmelidir protokol sırasında herhangi bir aşamada devreye hale gelebilirechnique ve nötrofil izolasyonu sırasında travmatik kullanım (örneğin, vorteks) kaçınarak. Tahlil hücrelerini izole veya kurma gecikmesi 19 kaçınılmalıdır böylece nötrofillerin sınırlı bir ömrü vardır hatırlamak da önemlidir. agonistler ile uzun süreli kuluçkaya bırakma girişimi ise, bu süre içinde, uyarılmamış hücrelerin yaşayabilirliği doğrulanmalıdır.
Şekil 1 'de gösterildiği gibi, .NET, bunların agonistlere karşı yanıt olarak köpekler arasında önemli farklılıklar vardır. Bununla birlikte, deney 10 18 çiftleri göre% 9 analiz içi varyasyon ile aynı hayvandan çoğaltır oldukça tutarlı olmalıdır. çoğaltır arasında büyük farklılıklar varsa, hücre topaklanma olasılıkla sorumludur. Hücre topaklanma azaltmak için önlemler yerine önce nazikçe izolasyon boyunca hücrelerin tedavi, DNA testi kurma ve hücre stok filtreleme tampon içeren bir kalsiyum daha PBS hücrelerin bakımını içerirhücreleri kaplama önce süspansiyon.
Bu adımlar takip edilirse, bu protokol, deney koşulları ve agonistlerinin geniş bir tepki olarak .NET oluşumunun ölçümü sağlar. Bu tür çalışmalar köpek sağlık ve hastalık NET'ler rolü anlayışımızı derinleştirmek yapabilirsiniz. Örneğin, bu teknik, sağlıklı köpek ve NETosis azalmış ya da artmış edilebildiği bağışıklık bastırıcı ya da bağışıklık hastalıkları olanlar arasındaki net serbest karşılaştırılmasına olanak sağlar. Bu, bağışıklık ve diğer teknikler ile kombine edildiğinde, alternatif olarak, deney NETosis ve NETosis yeni çıkan inhibitörlerini indükleyebilen yeni agonistlerini tanımlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D.
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
