Summary
الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي شبكات من الحمض النووي، الهستونات والبروتينات العدلة. على الرغم من أن المكون من الاستجابة المناعية الفطرية، وتورط المستجدة في المناعة الذاتية وتجلط الدم. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل العدلات الكلاب وتقدير من المستجدة باستخدام فحص صفيحة مضان.
Introduction
وهناك أكثر من 70 مليون الكلاب الاليفة في الولايات المتحدة وحدها 1. كأعضاء أسرة الكرام، هذه الحيوانات غالبا ما تلقي الرعاية الطبية خفض الحافة. على قدم المساواة لأنهم مشاركة بيئتنا، يمكن أن الكلاب أن تساعد في فهم المرضية والعلاج من الأمراض التي تصيب البشر 1. ومع ذلك، ما إذا كانت ترجمة الاكتشافات في الطب البشري في العلاجات البيطرية أو العكس بالعكس، فمن المهم أن تميز الاختلافات الأنواع حتى في أنظمة الحفظ للغاية تماما مثل الاستجابة المناعية الفطرية. وتشمل الأمثلة على الاختلافات بين الكلاب ونظام المناعة الفطري البشري العالي التعبير CD4 على العدلات الكلب 2. غياب homolog الوظيفي للاستشعار فلاجيلين حشوية IPAF في الكلاب 3 والتعبير عن هجين كاسباس 1/4 في الحيوانات آكلة اللحوم (4).
الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي عنصر المكتشفة حديثا نسبيا من مناعة فطرية 5. المستجدة هي شبكةالصورة من الحمض النووي والبروتينات النووية والحبيبية صدر ردا على مجموعة واسعة من التهابات أو المعدية المحفزات 6. وقد أثبتت يشبه الهياكل NET عبر العديد من الأنواع بما في ذلك الدجاج 7، 8 الأسماك والرخويات 9 و 10 acoelomates، ولكن هناك اختلافات الأنواع. على سبيل المثال، العدلات الفئران تستجيب ببطء أكثر للمؤثرات NETosis من العدلات الإنسان، وتشكل المستجدة أقل منتشر 11. وهناك مجموعة كبيرة من الأدلة من الأنواع المتعددة التي المستجدة إيقاع الميكروبات، وأكثر إثارة للجدل يمكن أن تشارك مباشرة في قتل مسببات الأمراض 12،13. ومع ذلك، مكونات NET أيضا تعزيز تلف الأنسجة، وتشجيع تخثر الدم ويكون بمثابة مستضدات الذاتية 14،15. قد تختلف التوازن بين الآثار المفيدة والضارة للالمستجدة بين الأمراض المختلفة والأنواع المختلفة، مما يدل على أنه من المهم للتحقيق المستجدة في كل من الأنواع وحالة من الفائدة.
نحن هناوصف بروتوكول بسيط لإحداث وقياس الافراج عن المستجدة التي كتبها العدلات الكلاب. هذه الطريقة مشابهة لتلك المستخدمة لعزل العدلات 16 و حمل NETosis في الأنواع الأخرى، ولكن الظروف مثل تركيز ناهض وفترة حضانة وقد تم تحسين لالعدلات الكلاب. كما تم وصف مماثل NET الكمي الحمض النووي الإفراج فحص في الأنواع الأخرى ولكن الطريقة المعروضة هنا هو الأمثل أيضا للكلاب 8،17،18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب بإذن الأخلاقي من لجنة جامعة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام ولاية أيوا.
مجموعة 1. الدم
- رسم 9 مل من الدم من الصافن، وريد رأسي أو الوداجي مباشرة إلى تخثر (على سبيل المثال، ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 1.8 ملغم ك 2 EDTA / ملليتر دم) vacutainers، أو إلى حقنة مع نقل على الفور إلى أنابيب الدم التي تحتوي على EDTA. لفة بلطف أو عكس أنابيب الدم لضمان خلط كافية من الدم ومكافحة تجلط الدم.
2. العدلات عزل
- في أنبوب مخروطي 50 مل، مزيج الدم مع حجم مساو من درجة حرارة الغرفة المعقمة 3٪ ديكستران-500 (تتكون في 0.9٪ محلول ملحي) من خلال انعكاس لطيف. ترك واقفا منتصبا ل18-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل القش الملونة الطبقة العليا إلى أنبوب جديد حتى لم يعد من الممكن جمعها دون تلوث طبقة حمراء أقل. كريات الدم الحمراء في اله أنبوب الأصلي يمكن التخلص منها.
- أجهزة الطرد المركزي لطاف في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. رسم الخروج وتجاهل طاف. يدويا إعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل درجة حرارة الغرفة معقمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). لاحظ أن vortexing للا ينبغي أن تستخدم لإعادة تعليق العدلات في أي مرحلة من مراحل هذا البروتوكول. رسم يدويا قبالة، بدلا من صب قبالة supernatants ويوصى أيضا في جميع أنحاء بروتوكول لتعظيم العائد الخلية.
- إضافة 10 مل من محلول فصل الخلية polysucrose درجة حرارة الغرفة ودياتريزوات الصوديوم (على سبيل المثال، Histopaque 1077) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. طبقة بعناية الحل التي تحتوي على خلية على حل فصل الخلية. لاحظ أن استخدام حل فصل الخلايا التي لم معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة قد يقلل العائد الخلية.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع قبالة الفرامل.
- كما العدلات هي في أدنى طبقة من التدرج، ورسم الخروج وتجاهل uppeص 3 طبقات، تتألف من طبقة العليا من البلازما والصفائح الدموية، والشريط الأبيض الضيقة للخلايا وحيدة النواة وطبقة واضحة من متوسطة الكثافة التدرج.
- ليز أي الكريات الحمراء المتبقية، وإعادة تعليق بيليه العدلات في 10 مل من الماء درجة حرارة الغرفة.
- بعد 30 ثانية، واستعادة تحظرب بإضافة 10 مل من معقم درجة حرارة الغرفة 1.8٪ كلوريد الصوديوم وتخلط بواسطة قلب لطيف.
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. رسم قبالة طاف وتجاهل.
- إذا كان بيليه لا تزال حمراء، كرر الخطوة تحلل. إذا كان بيليه الأبيض (أو إذا كان قد تم إجراء تحلل مرتين)، بلطف اعادة تعليق الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة.
- عد الخلايا باستخدام عداد الآلي أو عدادة الكريات. غلة النموذجية هي 10 على الأقل 6 خلايا لكل مليلتر من الدم.
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. رسم قبالة طاف وتجاهل.
- إعادة تعليق الخلايا إلى التركيز المطلوب في العقيمة درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. فوص فحص الحمض النووي إطلاق وصف في الباب 2، و resuspend في 5 × 10 6 خلايا لكل مل.
- إذا رغبت في ذلك، ونقل كمية صغيرة من الخلايا مباشرة أو باستخدام cytocentrifuge إلى شريحة زجاجية. تسمح للخلايا حتى يجف وصمة عار يستخدم التثبيت وتلطيخ السريعة عدة وفقا لتصنع "تعليمات. إذا كانت العزلة العدلات ناجحة، عندما فحصها تحت المجهر يجب أن يكون 95٪ على الأقل من الخلايا الأنوية المحببة (العدلات، الخلايا القاعدية، الحمضات) مع التلوث كرات الدم الحمراء الحد الأدنى.
3. الحمض النووي الإصدار الفحص
- إعداد مقايسة إطلاق الحمض النووي مباشرة بعد العزلة العدلة.
- إذا تكتل خلية موجود على فحص المحلول بواسطة المجهر الضوئي، وتمرير تعليق الخلية من خلال 70 ميكرون تصفية عقيمة عقيمة على الفور قبل إعداد الفحص.
- إلى كل بئر اختبار العقيمة 96 لوحة جيدا، إضافة 5 × 10 4 خلايا / جيد. ناهض وروزويل بارك مذكرةالريال معهد-1640 (RPMI) وسيط وبدون الفينول الأحمر وتستكمل مع 0.5٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين إلى الحجم النهائي من 100-200 ميكرولتر. تشمل اثنين على الأقل من الآبار فارغة في ناهض الذي يتم استبدال المحلول العدلة من حجم مساو من برنامج تلفزيوني. لاحظ أن إنشاء الآبار فارغة لكل ناهض المهم في استبعاد تلوث الحمض النووي من ناهض أو تدخل من قبل ناهض مع مقايسة مضان.
- احتضان عند 39 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون (4٪).
- إضافة منبهات بتركيزات المطلوبة وخلية منفذة صبغ الحمض النووي. ملاحظة سوف تختلف بين مختلف الأصباغ الحمض النووي تركيز الأمثل للخلية الصبغة غير منفذة. ينبغي أن تدرج غير حفز ضوابط التي يتم استبدال منبهات التي كتبها حجم مساو من وسائل الإعلام في كل تجربة.
ملاحظة: من المستحسن أن تخفف منبهات في كميات مماثلة من مستنبت للحفاظ على ظروف ثابتة بين الآبار. أحجام جيدا النهائية من 200 ووقد استخدمت ل بنجاح وإذا تم تغيير هذا، وأيضا كميات ينبغي أن تظل مطابقة لجميع الشروط؛ # 181. يمكن استخدام Phorbol-12-ميريستيت-13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) (تركيز النهائي ≥0.1 ميكرومتر) أو الصفيحات تفعيل عامل (القوات الجوية الباكستانية) (تركيز النهائي ≥31 ميكرومتر) كما الضوابط الإيجابية. وينبغي قياس منبهات على الأقل في مكررة. - احتضان عند 39 درجة مئوية. قياس مضان باستخدام قارئ صفيحة بعد 2 ساعة أو على فترات المطلوب. لاحظ أن الفترات الزمنية المثلى سوف تختلف مع منبهات المستخدمة.
ملاحظة: الطول الموجي يعتمد على الصبغة المستخدمة. - طرح مضان فارغة قبل احتساب متوسط مضان.
- للسماح للمقارنة بين الأفراد وبين لوحات، وحساب تغيير أضعاف في مضان بقسمة متوسط مضان من الآبار يحفزه على مضان يعني من الآبار غير حفز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، يجب أن يكون هناك تغيير أضعاف القوي في مضان بعد تحفيز العدلات مع الضوابط الإيجابية، سلطة النقد الفلسطينية والقوات الجوية الباكستانية. كما هو موضح في الشكل 1B، وتحفيز العدلات الكلاب مع 31 ميكرومتر القوات الجوية الباكستانية ل1 النتائج ساعة في زيادة 4.0 أضعاف متوسط في مضان مقارنة مع الخلايا غير حفز (المدى 2،0-5،8، ن = 5 الكلاب) 18. سلطة النقد الفلسطينية عند 0.1 ميكرومتر (الشكل 1A) هو أبطأ ناهض الذي لا يؤدي إلى زيادة في مضان حتى 2 ساعة ولكن في نهاية المطاف تنتج زيادة مماثلة أضعاف في مضان (يعني: 3.3، ومجموعة 1،36-5،4، ن = 5 الكلاب) 18. وعلى الرغم من تباطؤ حركية لها، وهناك مزايا لسلطة النقد الفلسطينية كوسيلة لمراقبة إيجابية: أنها غير مكلفة نسبيا مقارنة مع تركيزات عالية من القوات الجوية الباكستانية وكان قد تم استخدامها على نطاق واسع في الفئران والدراسات الإنسانية.
مضان من الأصباغ الحمض النووي ليست الصورةpecific لتشكيل NET لأنها سوف يحدث أيضا إذا كان هناك موت الخلايا عن طريق آليات أخرى أو إذا تم الملوثة الكواشف مع الحمض النووي. كما هو مبين في الشكل 2، وإعداد LPS التجاري إنتاج مضان عالية جدا في حالة عدم وجود العدلات، ويفترض بسبب التلوث مع الحمض النووي للبكتيريا. مؤكدا تشكيل NET من خلال وسائل أخرى مثل المناعي ويوصى.
الشكل 1: سلطة النقد الفلسطينية والقوات الجوية الباكستانية زيادة مضان خلية بردة صبغ الحمض النووي مع حركية مختلفة وتحفيز العدلات مع 0.1 ميكرومتر سلطة النقد الفلسطينية (A) أو 31 ميكرومتر القوات الجوية الباكستانية (B) في وجود خلية كتيمة صبغ الحمض النووي. وقد تم قياس مضان على فترات كل ساعة والتغيير أضعاف في مضان من خلايا حفز مقارنة مع الخلايا غير حفز المحسوبة. زيادة مضاند بشكل كبير بين 1 و 2 ساعة لسلطة النقد الفلسطينية (المتكررة التدابير في اتجاه واحد أنوفا تليها متعددة تي الاختبارات مع التصحيح بونفيروني، وتعدد ص المعدل = 0.04؛ أشرطة الخطأ يعني ± الخطأ المعياري لل5 أفراد)، ولكن قد استقر بالفعل للقوات الجوية الباكستانية من قبل 1 ساعة. تم تعديل هذا الرقم من جيفري يو، وآخرون الكلاب يلقي المستجدة جدا: العدلات الكلاب الفخاخ خارج الخلية في الصحة وفقر الدم الانحلالي المناعي بوساطة. الطب البيطري المناعة والباثولوجيا المناعية، 168 (3-4)، 262-8، دوى: 10.1016 / j.vetimm.2015.10.014 (2015) 18 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: آبار فارغة مهمة لاستبعاد احتمال حدوث تلوث الحمض النووي أو تدخل من قبل ناهض مصدر تجاري من LPS.وأضيف إلى الآبار التي تحتوي على ديكي RPMI. تغيير أضعاف كبير في مضان مقارنة مع الآبار التي تحتوي على العدلات غير حفز تشير تلوث ناهض مع الحمض النووي للبكتيريا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فحص الحمض النووي الإفراج قدم هو فحص للقياس بسهولة للالحمض النووي خارج الخلية. تم تعديل طريقة من تقنيات مشابهة تستخدم لتقييم تشكيل NET في الأنواع الأخرى، ولكن تم تغيير السرعات الطرد المركزي، وتركيزات ناهض وحضانة مرات لتحسين طريقة للاستخدام مع العدلات الكلاب 8،17،18. يمكن إجراء تعديلات مماثلة على التكيف مع طريقة لأنواع أخرى. الفحص غير واضحة وغير مكلفة بالمقارنة مع الطرق الأخرى لقياس NETosis مثل التدفق الخلوي أو تحليل الصور. الطريقة أيضا لا يتطلب الأجسام المضادة ضد مكونات NET، لذلك يعتبر مثاليا للاستخدام في الكلاب الذين المنتجة تجاريا، التحقق من صحة الأنواع المتفاعلة الأجسام المضادة وغالبا ما تكون غير متوفرة.
فإن القيود الرئيسية من هذه الطريقة لعدم وجود خصوصية الأصباغ الحمض النووي خلايا كتيمة لتشكيل NET. هذه الأصباغ أيضا إدخال الخلايا الميتة والموت، والحمض النووي تربط ويتألق. وبالتالي، فلوريداuorescence ليس محددا لتشكيل NET. ينصح بشدة استخدام تقنيات أخرى (على سبيل المثال، المناعي) بالتوازي مع مقايسة الكمي لتأكيد بصريا منبهات وتحملها تشكيل NET بدلا من الأشكال الأخرى للموت الخلايا. الفحص يمكن أيضا أن يستخدم بمثابة فحص فحص عام لموت الخلايا، على سبيل المثال كوسيلة لقياس السمية الخلوية خارج الحي.
بروتوكول بسيط، ولكن هناك خطوات الحرجة اللازمة لضمان النجاح. أولا، كما ورد في البروتوكول، لتجنب فقدان الخلية المفرطة خلال العزلة العدلة من المهم أن supernatants يتم رسمها خارج مع ماصة بدلا من التخلص منها عن طريق عكس الأنابيب. ثانيا، نجاح الفحص يعتمد على الخلايا السيطرة غير حفز المتبقية في دولة قابلة للحياة ويستريح في جميع أنحاء الحضانة. العدلات يمكن أن تصبح تفعيلها في أي مرحلة خلال بروتوكول ينبغي إيلاء اهتمام دقيق جدا لارضحي ر جمع الدمechnique وتجنب التعامل مع الصدمة (على سبيل المثال، vortexing ل) خلال العزلة العدلة. ومن المهم أيضا أن نتذكر أن العدلات لها عمر محدود جدا من التأخير في عزل الخلايا أو إعداد مقايسة ينبغي تجنب 19. إذا حاولت الحضانة لفترات طويلة مع منبهات، ينبغي تأكيد صلاحية الخلايا غير حفز خلال هذه الفترة الزمنية.
كما هو مبين في الشكل رقم 1، وهناك تباين كبير بين الكلاب في استجابتها لمنبهات NET. ومع ذلك، يجب أن يكون الفحص ثابت معقول بين مكررات من نفس الحيوان، مع اختلاف داخل فحص من 9٪ على أساس 10 مكررة 18. إذا كانت هناك اختلافات كبيرة بين مكررات، تكتل خلية من المرجح أن يكون مسؤولا. وتشمل التدابير الرامية إلى الحد من تراكمها خلية الحفاظ على الخلايا في برنامج تلفزيوني بدلا من التي تحتوي على الكالسيوم المخزن المؤقت قبل إلى إنشاء فحص الحمض النووي، وعلاج الخلايا بلطف في جميع أنحاء العزلة، وتصفية الأسهم خليةتعليق قبل خلايا الطلاء.
إذا اتبعت هذه الخطوات، يسمح هذا البروتوكول الكمي لتشكيل NET ردا على مجموعة واسعة من الظروف التجريبية ومنبهات. ويمكن لهذه الدراسات تعميق فهمنا للدور المستجدة في صحة الكلاب والمرض. على سبيل المثال، وهذا الأسلوب يسمح بالمقارنة الإفراج NET بين الكلاب صحية و الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية المثبطة للمناعة أو التي NETosis قد تنخفض قيمتها أو المحسنة. بدلا من ذلك، عندما جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى مثل المناعي، وفحص يمكن استخدامها لتحديد مستقبلات الرواية قادرة على حمل NETosis ومثبطات جديدة من NETosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
