Summary
这种方法可以使用基于渗透冲击的简单协议和最小器官破坏矩阵的离子洗涤剂灌注, 使复杂的固体器官去极化。它包括一种新的人的心脏在加压袋内的去电磁化技术, 并实时监测流动动力学和细胞碎片流出。
Abstract
终末期心力衰竭患者的最终解决方案是器官移植。但供体心脏是有限的, 免疫抑制是必需的, 并且拒绝可能发生。创建一个功能性的、自体的生物人工心脏可以解决这些挑战。由脚手架和细胞组成的心脏的生物制造是一种选择。一个天然的支架与组织特异性组成以及微观和宏观架构可以获得通过去细胞化的心脏从人类或大型动物, 如猪。去光化包括在保持3d 细胞外基质和血管的同时冲洗细胞碎片, 并允许在以后的时间点进行 "纤维素化"。利用我们的新发现, 复杂器官的灌注解离是可能的, 我们开发了一种更 "生理" 的方法, 通过将非可移植的人的心脏放置在一个加压袋, 在一个倒置的方向, 在可控压力下。使用加压袋的目的是在主动脉瓣上产生压力梯度, 以保持其关闭状态, 并改善心肌灌注。在去室去光化过程中同时评估流动动力学和细胞碎片清除, 使我们能够监测流体流入和碎片流出, 从而产生一个脚手架, 可用于简单的心脏修复 (例如, 作为一个补丁或阀支架) 或作为全器官脚手架。
Introduction
心力衰竭导致患者死亡率高。终末期心力衰竭的最终治疗方案是同种异体移植。然而, 由于供体器官短缺, 移植的等待列表很长, 患者面临着从终身免疫抑制到慢性器官排斥1,2的移植后障碍。生物工程功能性心脏通过用病人自己的细胞重新填充去细胞化的人类大小的心脏, 可以绕过这些障碍3。
"工程" 心脏的一个重要步骤是创建一个脚手架, 具有适当的血管和实质结构、组成和功能, 以指导所交付细胞的排列和组织。在适当的框架存在的情况下, 在脚手架上播种的细胞应能识别环境, 并作为该器官的一部分发挥预期的功能。在我们看来, 去细胞外基质 (decm) 包括理想支架的必要特性。
通过利用内在血管, 可以通过前置或逆行灌注4来去除细胞成分, 同时保留微妙的三维细胞外基质和血管 2, 5,6,7。功能血管在生物工程全器官中就像在体内一样, 对营养分配和废物清除都很重要。冠状动脉灌注去细胞减少已被证明是有效的创造去细胞化的心脏从大鼠4,或猪4,7, 9, 10,11 12, 13,和人类5,7, 14,15,16。然而, 阀门、心房和其他 "薄" 区域的完整性可能会受到影响。
用压力控制7、9、10、11、12或输液流量控制13 ,17和来自人类捐献者使用压力控制5,7, 14,15。人类供体心脏去细胞化发生在4-8 内, 压力控制在 0-100毫米汞柱,垂直方向5、15、16或16天以上, 压力控制在60毫米汞柱14.在压力控制的前去室化条件下, 主动脉瓣的能力对保持主动脉根部冠状动脉灌注效率和稳定压力起着至关重要的作用。我们以前的工作表明, 心脏的方向影响其冠状动脉灌注效率在脱肺过程中, 因此在最后9的脚手架完整性.
作为我们以前工作的延续 9, 我们引入了一个新的概念, 其中一个心包样袋添加, 以提高全心去渗。我们描述了人类心脏被放置在加压袋内的去细胞化, 反向定向, 主动脉根部的压力控制在120毫米汞柱。该协议包括监测整个去室化过程中的流动剖面和流出介质的收集, 以评估冠状动脉灌注效率和细胞碎片清除。然后进行生化检测, 以测试该方法的有效性。
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Protocol
所有实验都遵循了德克萨斯心脏研究所的道德委员会准则。
1. 器官准备
注: 与德克萨斯州 (http://www.lifegift.org) 的非营利器官采购组织 life赠送组织合作, 在获得批准的情况下, 捐赠了不适合移植的人的心脏进行研究。
- 为了获得心脏, 静脉注射 30, 000 u 肝素到心脏。安全地缝合主动脉中的心绞痛插管, 并附加一条夹紧灌注线。穿孔下腔静脉 (ivc) 排出右心。切开左上肺静脉或左心房附属物, 以排出心脏的左腔。
- 注入1升心绞痛或肝素化盐水。解剖主动脉弓分支、上腔静脉 (svc) 和其他肺静脉, 从任何血管或周围组织附着释放心脏。将良好的肝素心脏浸入冰盐溶液中。
- 检查捐赠的人类心脏 (前后,图 1)。将心脏放在解剖托盘上, 检查是否有任何结构损伤或解剖畸形。如果肝和/或肺被采购移植, 心脏可能存在一个短的下腔静脉和/或没有左心房后壁。
- 对可能的缺陷进行内部检查-房间隔缺损 (asd)、室间隔缺损 (vsd) 或瓣膜 (主动脉、肺、二尖瓣、三尖瓣) 畸形。
- 如果存在间隔缺损, 请使用适当的缝合线进行校正 (图 2a, 2A)。通过肺动脉 (pa) 流出浊度测量, 需要对间隔缺损进行矫正, 以监测脱髓的进展。隔膜缺损的矫正消除左到右分流, 因此, 从 pa 流出代表从冠状动脉循环流出通过冠状窦。
- 配体上腔和下腔静脉与2-0 丝缝合 (图 2c)。
- 将主动脉 (aoo) 从主 pa (图 2d) 中解剖, 以便随后的插管。
- 根据容器的直径将连接器插入 ao 和 pa (图 3), 并用2-0 丝线固定连接器 (图 4a)。
- 使用肺静脉孔之一, 通过左心房 (图 4b) 和向左心室 (lv) 插入导管线 (图 3)。
- 将输液线连接到放置在 o 中的连接器, 将流出线连接到 pa 中的连接器 (图 3)。
- 将准备好的心脏放入一个倒置方向 (倒置) 的聚酯袋中。
- 将带心脏的眼袋放入灌注容器中, 然后合上盖子 (图 4c)。
- 将每条线路连接到橡胶塞子中的各个端口 (根据容器的直径), 并将其插入灌注容器的盖子, 以密封聚酯袋 (图4c 和图 5b)。
- 在蒸馏水中完美使用1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) (136 mm ncl、2.7 mm kcl、10 mm na 2 hpo4和 1.8 mm kh kh2 po 4, ph 7.4), 通过橡胶塞子的输液口验证从 pa 和线路流出的情况插入 lv。
- 使用这种流动来清洁器官的任何残留的血液痕迹在血管。如果未观察到流量, 请拧紧连接线, 因为它们可能松动。
2. 系统设置和器官去电磁化程序
- 将生物反应器组装在垂直方向上放置 (图 5)。灌注系统包括个人电脑 (pc)、比例积分导数 (pid) 控制器、用于 o 输液的蠕动泵、灌注生物反应器、lv 灌注保留压力头容器 (带底部的2l 吸气瓶)和蠕动泵, 从压力头容器中排出多余的液体, 并从 pa 中收集流出的液体。
- 在橡胶隔膜中, 将输液线、压力头线、pa-流出线和生物反应器排水线连接到放置在灌注生物反应器顶部的橡胶盖表面端口 (图 5a)。
- 在主动脉根部测量的120毫米汞柱恒压下解吸心脏。在整个去电磁化过程中, lv 的平均压力应在14-18 毫米汞柱范围内。
- 解压心脏如下: 高渗溶液 4小时 (500 mm ncl), 低渗溶液 2小时 (20 mm ncl), 120 h 十二烷基硫酸钠 (1% sds) 溶液, 用 1x pbs 120 升进行最后清洗 (图 6a)。
- 在恒压控制下对心脏进行解码 (120 毫米汞柱)。注入到 o 的流量与心脏有关, 高渗溶液平均为 98.06±16.22 mlmmmp, 低渗溶液为 76.14±7.90 mL/min, sds 为 151.50±5.76 mL/min, pbs 为 18.24±710 ml/min。每种试剂的总消耗量相平均为高渗溶液 2336±5.70 l, 低渗溶液为 9.13±1.26 l。
- 将 1% sds (每克心脏重量1升) 的最终60升循环到 sds 灌注结束。图 6a显示了去净化过程的时间表, 为数据收集引出了终点: 在去净化过程中, 流量监测 (o 和 pa) 和压力头流出收集 (pa 和非 pa)。
- 由于 svc 和 ivc 是结扎的, 因此可以合理地假定, 从 pa 收集的所有液体都是实际冠状动脉灌注的结果 (图 5b)。通过将注入溶液的流量直接划分为 o:
冠状动脉灌注效率 =
(%)。 - 通过在透明的底部96孔板中加载200μl 和在280纳米的读数吸收率, 对从 pa 和 lv 获得的香水和注入的溶液一式两份进行对比分析。在尝试不同的值后根据经验选择的吸收值被发现给出了最佳的归一化值。
- 以清洁注入试剂的浊度为对照。流出物的浊度表示细胞碎片的冲洗, 并可在去室化过程中作为过程的跟踪工具立即量化。
- 在用 1x pbs 的 10 l 进行最后洗涤时, 加入500毫升的无菌中和2.1% 过氧乙酸溶液, 用 10n naoh 中和, 从而在 pbs 中产生0.1% 的过氧乙酸溶液 (v/v)。使用此解决方案对脚手架进行消毒。
(%)。3. 对去病毒心的评价
注: 去病毒化后, 代表性心脏将用于冠状动脉造影成像和生化检测。
- 对具有代表性的去细胞化的人的心脏进行冠状动脉造影, 以检查冠状动脉血管的内酯性。简要而言, 使用荧光镜, 图像去光去光后, 通过冠状动脉造影剂在主冠状动脉和左冠状动脉注射造影剂。
- 解剖脱细胞的心脏, 从19个区域获取样本, 以评估脱氮组织中剩余的脱氧核糖核酸 (dna)、糖胺多糖 (gag) 和 sds 水平。将心脏底部从心室中取出, 并将心室解剖为4个相等的部分 (图 6c)。将每个部分分为前、后右心室 (rv)、前、后室和室间隔 (ivs)。包含先端的组织被分解成 lv 和 rv 进行取样。
- 切割 dna、gag 和 sds 检测的组织样本 (约15毫克湿重)。
- 在65°c 下消化 1 m naoh 样品 3小时, 提取双链 dna (dsdna), 并使用 10倍 tris-edta (te) 缓冲液和 1 m 盐酸 (hcl) 将 ph 值调整为7。
- 使用具有小腿胸腺标准的 dsdna 检测试剂盒对 dsDNA 进行定量 (见材料表)。使用荧光微板读取器 (在 480 nm 处激发, 在 520 nm 处发射), 一式两份地读取样品。通过比较每个组织中的 dsdna 浓度和尸体中的 dsdna 浓度 (% 尸体), 计算去细胞化心脏中残留 dsdna 的百分比。
- 在65°c 下, 通过在木瓜蛋白酶萃取溶液中消化组织样本 (0.2 m 磷酸钠缓冲液与 edta 二钠、半胱氨酸 hcl、醋酸钠和木瓜蛋白酶) 在3小时内获得硫化 gag。使用糖胺多糖检测试剂盒测量 gag 含量 (一式两份)。
- 用于在加热真空中测定 sds 并测量干重的冻干样品。在每个干燥样品中加入200μl 超纯水, 并进行均质化, 将剩余的 sds 提取到溶液中。将此 sds 溶液与氯仿和亚甲蓝溶液混合 (12 毫克亚甲蓝, 1 升 0.01 m hcl)。sds 将通过与亚甲蓝染料结合在有机层中分离。
- 使用荧光微板读取器, 阅读吸收率 (655 nm) 的标准和样品一式两份, 以计算剩余的 sds。将此 sds 值归一化到组织干重。
- 利用非线性光学显微镜 (nlom) 从人体心脏的厚区域 (即lv、rv 和隔膜) 采集的图像样本, 以确认去细胞化后的细胞去除。nlom 设置在我们以前的出版物18、19、20中详细介绍。nlom 使我们能够通过双光子荧光 (tpf) 和第二谐波产生 (shg) 通道对细胞、弹性蛋白、胶原蛋白和肌球蛋白纤维进行成像, 而无需使用任何外源染色或染料21。
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Representative Results
在120毫米汞柱的恒压下, 经过7天的主动脉前灌注去细胞化, 人的心脏变成了半透明 (图 6b)。心脏被严重解剖成19个部分进行生化 (dna、gag 和 sds) 分析 (图 6c), 以评估最终脱病毒产物。
在整个去电磁化过程中, 不同溶液的输液流量随压力保持不变而变化。当灌注溶液从高渗变为低渗溶液时, 进入 o 的流量 (图 7a) 逐渐从9668±23.54 下降到 805±12.41 mlmin (16.64)。相比之下, 当灌注溶液从低渗转变为 sds 时, 流量从71.68±10.63 上升到1010.61 ±14.40 mlmin (54.31)。在 sds 灌注过程中, 输液流量在110±14.40 和 176.31±44.0 mL/min 之间波动。pa 的流出率 (图 7b) 最初显示了类似的趋势 (图 7B)。然而, 1% sds 灌注过程中的流出率从35.77±9.07 下降到 27.08±4.09 mlm/min, 利用冠状动脉灌注效率评价主动脉瓣通畅程度及类似趋势。随着时间的推移, 不同的试剂通过血管灌注, 效率降低 (图 7c)。在 1x pbs 清洗的第一个小时, 灌注效率恢复到原来的预低血压溶液值 (在 1-h pbs 时为 28.39±3.61%, 而在 1 h 低渗时为 31.02±7.16%)。高渗溶液、低渗溶液、1% sds 和 1x pbs 的平均冠状动脉灌注效率分别为46.08±9.89%、28.08±7.12%、25.70±5.30% 和 28.39±3.61% (图 7d)。
由于同时收集了 pa 和 lv 的流出物, 因此可以通过在280纳米的光谱吸收率 (图 8A) 比较其碎片含量 (图 8a)。在各溶液的灌注过程中, pa 和 lv 废水的浊度随时间减小;然而, 与在最初灌注期间从 lv 观察到的浊度相比, pa 的浊度表现出了更突然的颜色变化。从高渗溶液切换到低渗溶液后, pa 流出的浊度从11±0.03 变为 1.40±0.07 (增加 21.73), lv 从1.13±0.05 变为 1.240±0.07 (增长 9.73)。在 1% sds 灌注的第一个小时, pa 的浊度从1.17±0.04 上升到 2.77±0.15 (13.7.75%), lv 废水的浊度从1.11±0.04 变为 1.75±0.26 (增加 136.75)。利用双链酸 (bca) 蛋白法测定流出样品中蛋白质浓度时, 评价了流出浊度与细胞碎片冲洗之间的相关性。6例人心脏去室化的结果表明, 蛋白质浓度与出水浊度呈线性关系, r2 = 0.95 (图 8c)。
完成全心去细胞化后, 冠状动脉造影证实保持完整的冠状动脉血管 (图 9)。在去细胞化的人心脏确认细胞去除中, 对厚区 (即rv、lv 和隔膜) 的心肌层进行非线性光学成像, 因为在 tpf 通道中没有观察到细胞存在 (图 10)。具有自身荧光的细胞 (即心肌细胞或心肌成纤维细胞) 可以通过其椭圆形和拉长的形状在 tpf 通道中很容易地识别出来。为确保去室化过程和细胞碎片清除的有效性, 将去细胞化的人的心脏进一步纳入19个区域 (图 6c), 以量化这些区域剩余的 dna、硫化 gag 和 sds 的水平。所有地区的 dna 都不到尸体心脏的10%。右心房 (相对于尸体为 8.39-10.38) 和左心房 (5.11-7.60) 的 dna 最高 (图 11a)。
图 1: 器官采购机构的尸体人的心脏.尸体的前、后部、前、后部、前、行、前、前、、、、、、前、、、、、、、前观、前观下腔静脉和部分右心房缺失, 如在虚线区域观察到的那样。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 检查隔膜和/或瓣膜解剖异常。(a)检查是否存在卵圆孔专利 (pfo) (右心房和左心房之间的通信)。(b)以连续的方式使用5-0 聚丙烯缝合线来关闭 pfo。(c)右心房是关闭与运行缝合5-0 聚丙烯。(d)主肺动脉通过钝性解剖远离上升主动脉。fo: 卵圆孔;pa: 肺动脉;奥: 主动脉。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 输液生物反应器的成分.去电磁化系统由(a) 4个端口的橡胶帽组成;(b)与肺动脉相连的流出线 (pa);(c, f)连接器与 luer 锁用于 pa 和主动脉 (aoo), (d)插入线为左心室 (lv), (e)输液线连接到主动脉, (g)聚酯袋, 和(h)灌注容器。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 人体心脏插管和输液生物反应器总成.(a)心脏的前视图显示肺动脉 (pa) 和主动脉 (aoo) 单独插管。(b)心脏后视显示插管, 通过肺静脉 (pv) 指向左心室 (lv)。(c)人工心脏在输液生物反应器组装后。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 带压力头的倒置定向去电磁化系统设置.(a)完整的去净化系统由: 计算机、比例积分-导数 (pid) 控制器、泵、生物反应器和收集肺动脉 (pa) 和左心室 (lv) 废水的水库组成。奥: 主动脉。箭头指示流动方向。(b)灌注生物反应器内人为心脏设置的示意图及脱光过程中灌注-废水的相关流动路径。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 人的心脏去电化过程和去电积后检查的示意图表示.(a)去军事化程序示意图。(b)心脏去细胞化的前部和后部检查。(c)将人的心脏分成四个横截面 (a 节至 d 节) 进行生化分析。人体心脏的着色是由残留的脂褐素沉积引起的。着色通常表现在心室内表面或心外膜与心肌之间的边界。洛杉矶: 左心房;ra: 右心房;左心室;rv: 右心室;蚂蚁: 前;后: 后部;超强: 高渗;催眠药: 低渗;sds: 十二烷基硫酸钠;pbs: 磷酸盐缓冲盐水。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 去电化过程中的延时流动动力学。(a)术中脱髓化溶液注入主动脉的流量。(b)去细胞化过程中 pa 废水的流量。(c)去细胞利亚化过程中冠状动脉灌注效率。(d)不同溶液/试剂灌注过程中的平均冠状动脉灌注效率。n = 6。数据代表平均± sem. pa: 肺动脉;超强: 高渗;催眠药: 低渗;sds: 十二烷基硫酸钠;pbs: 磷酸盐缓冲盐水;sem: 均值的标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 去细胞化过程中的延时细胞碎片冲洗.(a)从 pa 和非 pa (左心室) 流出媒体。(b) 280 纳米浊度测量结果。(c)蛋白质浓度与浊度之间存在线性关系。n = 6 颗人类心脏。控制是干净的去渗化溶液。数据代表平均± sem. pa: 肺动脉;超强: 高渗;催眠药: 低渗;sds: 十二烷基硫酸钠;sem: 均值的标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 9: 心脏去室的冠状动脉造影证实去室术后血管通畅.请点击这里查看此图的较大版本.
图 10: 利用非线性光学显微镜从尸体和去细胞化心肌中获得的图像显示, 在去细胞化过程中, 没有具有椭圆形或拉长形状形态的细胞 (即心肌细胞或心肌成纤维细胞) 的预感lv、rv 和隔膜。左心室;rv: 右心室;tpf: 两个光子荧光;shg: 二次谐波产生。有些心肌细胞是用箭表示的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 11: 生化测定结果.(a)在去细胞化的组织中, 相对于尸体心脏的剩余 dna。(b)在去细胞化组织中, 相对于尸体心脏的剩余 gag。(c)在去细胞化组织中保留 sds。n = 6 颗人类心脏。数据表示平均值±sem. la: 左心房;ra: 右心房;左心室;rv: 右心室;蚂蚁: 前;后: 后部;sds: 十二烷基硫酸钠;sem: 均值的标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.
| 方法 | 专业版 | con |
| 常规直立朗多夫灌注 | ·在去细胞利亚化过程中, 易于访问心脏进行修复 | ·由于心脏重量, 主动脉过度紧张 |
| ·恒压控制下 sds 灌注过程中的高输液流量 | ||
| ·sds 灌注过程中冠状动脉灌注效率低 | ||
| ·主动脉-肺动脉在插管结扎线以上的部分可脱水易被污染 | ||
| 倒置的 langendorff 灌注在加压袋内 | ·最大限度地减少因心脏重量而对主动脉施加的压力 | ·如果需要修复, 就很难进入心脏。 |
| ·恒压控制下 sds 灌注过程中输液流量低 | ||
| ·sds 灌注过程中冠状动脉灌注效率的提高 | ||
| ·由于整个心脏被淹没/水合, 任何组织都不会干涸。 |
表 1: 使用传统的直立灌注与加压袋内倒置朗多夫灌注的全心去渗的利弊总结。
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Discussion
据我们所知, 这是首次报告在加压袋内的人的心脏倒置去病毒化, 并对流速和细胞碎片清除进行延时监测。心包状袋在整个去渗过程中保持心脏方向稳定。与传统的直立朗根多夫灌注解离方法9相比, 将整个心脏浸入眼袋内可防止脱水, 并最大限度地减少主动脉 (从心脏重量) 上的过度拉伤.这反过来又保持了主动脉瓣的能力。
为了实现最大的去渗效率, 冠状动脉血管阻力必须较低, 以确保充分和一致的液体灌注整个心肌。在使用逆行灌注的全心去渗模型中, 液体在心室中积聚并升高心室内的压力, 进而增加冠状动脉血管阻力并限制液体的流动。即使主动脉瓣是完整的, 心室腔充满继发于生理泄漏, 并反过来压缩心室壁。
我们在加压袋内对心脏进行去渗的技术旨在缓解这一问题, 提高去细胞化效率。在整个去体化过程中, 主动脉根部的压力为120毫米汞柱, 袋中的压力为14毫米汞柱。这些压力值非常接近生理范围 (主动脉中的80-120 毫米汞柱, 左心室舒张终压 22的15毫米汞柱)。据 murthy等人说.23、心肌血流率从 0.61 ~ 1.10 mllmin g 不等, 人的心脏重量为 24,25约 245 ~ 308 克;因此, 生理冠状动脉血流率约为 149.45 ~ 338.80 mL/min, 但取决于心脏重量。我们从 pa 流出的速度从20到 50 mL/min 不等, 这低于生理冠状动脉流量的值, 可能是由两种不同的情况造成的: 1) 向心脏产生水肿的溶液的输注, 也有正常的解剖将冠状动脉系统引流到左心室腔;2) 当去电磁化发生时, 液体也会因为其渗透性的自然增加而通过去细胞化壁丢失.这种压差可以防止容器塌陷, 并使它们能够保持专利。此外, 该系统在相对解剖条件下保持心脏, 而不压缩心肌壁, 这将增加冠状动脉血管阻力, 并损害血管内循环的去室化解决方案。人的心脏输液流量分布 (图 7a) 与我们在猪心脏9倒置去渗中观察到的非常相似, 在低渗灌注过程中发生的输液流量最低, 并略有增加。在 1% sds 灌注过程中发生的流速 (1101±14.40 mL/min 至 176.31±403 mL/min)。我们在 1% sds 灌注过程中的输液流量 (平均 value=151.50±3.71 mL/min) 与 guyette 等人报告的人心脏去细胞化流量相当, 甚至更低.14然而, 我们的方法是用120毫米汞柱的压力控制, 他们的方法使用60毫米汞柱。灌注压力的这种差异表明主动脉瓣关闭在我们的技术中具有卓越的有效性, 因为较低的输液流量可以保持较高的压力。另一种可能是, 冠状动脉抵抗的增加是由于在眼袋内施加了14毫米汞柱压力。此外, 与倒猪心脏去渗相比, 我们的心脏方法显示出类似的下降趋势 (~ 30%,图 7c, 7C), 从超甲到低渗溶液变化 (~ 10% 倒置方向 9与 1-2%在直立方向)。然而, 这种新的方法可以保持冠状动脉灌注效率在 sds 灌注与溶液灌注相当, 从而显得优于我们以前的样本反演方法。表 1列出了传统的直立灌注与加压袋内倒置 langendorff 灌注的利弊。
除流量外, 流出浊度监测可能是评价去电磁化进展和效率的另一个有用工具。在去电磁化过程中, 来自 pa 的废水的浊度高于非 pa 场地的废水的浊度 (图 8b)。这表明, 大多数的灌注溶液都是通过血管进行的, 以实现 "适当" 的去细胞化。然而, 要做到这一点, 必须解决以下问题: 腔内分流, 或主动脉瓣通畅。因此, 需要仔细和细致的检查, 以防止失败的方法, 由于解剖不合格。整个心脏去电化过程的浊度剖面 (图 8b) 显示出类似的趋势, 如前面所示, 在不同的灌注器的初始过渡期内突然浊度变化9。
去细胞化组织的一个主要目标是能够用细胞重新填充它们, 并实现高细胞附着、增殖、成熟和功能。我们的脱细胞组织已成功地在各种应用 26,27, 其中组织成功地纤维素, 并实现较低的血栓形成性。在我们对去细胞化的人的心脏进行生化分析时, 我们评估了19个不同组织厚度的区域。去细胞化组织中的 dna 和 sds 各不相同, 在左右心房获得的数值最高。这可能是由心脏的方向在倒置的配置, 其中细胞碎片被困在底部的袋或外部压力减少流量。灌注去光依赖于未受损的心脏结构, 包括完整的冠状体和支流。由于这些器官是从多器官捐献者那里获得的, 这些心脏通常有很大一部分心房被切除。在准备这些器官和修复心房壁的过程中, 这些地区的灌溉中断, 危及去室化溶液的流动。在非灌注心脏去细胞化方面, 其他研究小组报告了与尸体心脏相比, 大鼠28、猪29、30 和人类31的剩余 dna 为2-6。然而, 他们在去细胞化协议中使用了冻融28、29、30、酶29、30 和血清31,这可能会对 ecm 造成的损害程度超过我们基于灌注的技术。制定适当解决这些限制的方法至关重要。
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Disclosures
泰勒博士是 miromatrix 医疗公司的创始人和股东。这种关系是根据明尼苏达大学和德州心脏研究所的利益冲突政策管理的;其他作者没有利益冲突可以披露。
Acknowledgments
这项研究得到了休斯敦捐赠赠款和德州新兴技术基金的支持。作者感谢器官采购机构 life赠送, inc. 和捐献者的家人使这项研究成为可能。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
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