Method Article

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

DOI:

10.3791/61004

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March 27th, 2020

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1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

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Fluoreszenzlebensdauer Bildgebung überwacht, quantifiziert und unterscheidet die Aggregationstendenzen von Proteinen in lebenden, Alterung, und gestressten C. elegans Krankheitsmodelle.

Abstract

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Amyloidfibrillen sind mit einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie Huntington, Parkinson oder Alzheimer verbunden. Diese Amyloidfibrillen können endogene metastabile Proteine sowie Komponenten des Proteostase-Netzwerks (PN) sequestrieren und dadurch die Proteinfehlfaltung in der Zelle verschlimmern. Es gibt eine begrenzte Anzahl von Werkzeugen zur Verfügung, um den Aggregationsprozess von Amyloidproteinen innerhalb eines Tieres zu bewerten. Wir präsentieren ein Protokoll für die Fluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (FLIM), das die Überwachung und Quantifizierung der Amyloidfibrille in bestimmten Zellen, wie Neuronen, auf nichtinvasive Weise und mit dem Fortschreiten des Alterns und bei PN. FLIM ist unabhängig von den Expressionsniveaus des Fluorophors und ermöglicht eine Analyse des Aggregationsprozesses ohne weitere Färbung oder Bleichen. Fluorophore werden abgeschreckt, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe von Amyloidstrukturen befinden, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer führt. Die Abschreckung korreliert direkt mit der Aggregation des Amyloidproteins. FLIM ist eine vielseitige Technik, die angewendet werden kann, um den Fibrillenprozess verschiedener Amyloidproteine, Umweltreize oder genetische Hintergründe in vivo auf nicht-invasive Weise zu vergleichen.

Introduction

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Proteinaggregation tritt sowohl im Alter als auch bei Krankheiten auf. Die Wege, die zur Bildung und Ablagerung von großen Amyloiden oder amorphen Einschlüssen führen, sind schwer zu folgen und ihre Kinetik ist ähnlich schwierig zu entwirren. Proteine können sich aufgrund intrinsischer Mutationen in ihren Codierungssequenzen falsch falten, wie im Falle genetischer Krankheiten. Proteine verrenken sich auch, weil das Proteostase-Netzwerk (PN), das sie löslich und richtig gefaltet hält, beeinträchtigt wird, wie es während des Alterns geschieht. Das PN umfasst molekulare Chaperones und Abbaumaschinen und ist verantwortlich für die Biogenese, Faltung, den Handel und den Ab....

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Protocol

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1. Synchronisation von C. elegans

  1. Synchronisieren Sie C. elegans entweder über alkalische Hypochloritlösung oder über einfache Eiablage für 4 h bei 20 °C8.
  2. Nematoden bei 20 °C anbauen und pflegen auf Nematoden-Wachstumsmediumplatten (NGM), die mit OP50 E. coli nach Standardverfahrengesätsind 9 . Altern Sie die Nematoden bis zum gewünschten Entwicklungsstadium oder Tag.
    HINWEIS: In diesem Protokoll werden junge Erwachsene am 4. Tag und alte Nematoden am 8. Tag des Lebens abgebildet.

2. RNAi-vermittelter Knockdown von Chaperon-Maschinen über ....

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Results

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Das Protokoll zeigt, wie die Bildung von aggregierten Arten in lebenden C. elegansgenau überwacht werden kann, sowohl während seiner natürlichen Alterung als auch bei Stress. Wir wählten vier verschiedene Stämme von transgenen Nematoden aus, die Polyglutaminproteine von 40Q, 44Q oder 85Q Wiederholungen exdrücken. Diese Proteine werden in verschiedenen Geweben synthetisiert und zu verschiedenen Fluorophoren verschmolzen. Die C. elegans-Stämme exprimieren entweder Q40-mRFP.......

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Discussion

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Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine mikroskopiebasierte Technik zur Identifizierung aggregierter Arten im C. elegans-Modellsystem. FLIM kann das Vorhandensein sowohl aggregierter als auch löslicher Arten, die zu einem Fluorophor verschmolzen sind, durch Messung ihrer Fluoreszenz-Lebensdauer-Zerfalle genau charakterisieren. Wenn ein Fusionsprotein beginnt, seine aufgezeichnete durchschnittliche Lebensdauer zu aggregieren, verschiebt sich es von einem höheren auf einen niedrigeren Wert

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Der Muskel-Q40-mRFP-Stamm des CGC, der vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Das neuronale-Q40-CFP war ein freundliches Geschenk des Morimoto Lab. Wir würdigen die DFG (KI-1988/5-1 bis JK, NeuroCure PhD Fellowship des NeuroCure Cluster of Excellence to MLP), EMBO (Kurzzeitstipendium an MLP) und das Unternehmen der Biologen (Reisestipendien an CG und MLP) für die Förderung. Wir würdigen auch die Advanced Light Microscopy Imaging Facility am Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, für die Bereitstellung der Einrichtung, um die YFP-Konstrukte abzubilden.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM-Komponente
Ahringer Library hsp-1 siRNASource BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antibiotikum
B& H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Akquisitionssoftware
B& H SPC830-SPC BildBecker & Hickl GmbHFLIM Akquisitionssoftware
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM component
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPFreundliches Geschenk von Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPFreundliches Geschenk von Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFPFreundliches Geschenk von Morimoto Lab
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Deckgläser
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGMontierung Stereomikroskop
Leica TCS SP5Leica Camera AGKonfokalmikroskop
LevamisolhydrochloridAppliChem GmbHA4341Anästhetikum
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM Akquisitionssoftware
NatriumazidCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1Anästhetikum
NatriumchloridCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM-Komponente
Standard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Objektträger
Universal AgaroseBio & Sell GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGKonfokales Mikroskop
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGKonfokales Mikroskop

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

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Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

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