Summary
L'imaging a vita di fluorescenza monitora, quantifica e distingue le tendenze di aggregazione delle proteine nei modelli di malattia di C. elegans viventi, invecchiamento e stressati.
Abstract
Le fibrille amiloidi sono associate a una serie di malattie neurodegenerative come la Malattia di Huntington, Parkinson o Alzheimer. Queste fibrille amiloidi possono seprussiane le proteine metastabili endogene così come i componenti della rete proteostasi (PN) e quindi esacerbare il ripiegamento mistribosco proteico nella cellula. Ci sono un numero limitato di strumenti disponibili per valutare il processo di aggregazione delle proteine amiloidi all'interno di un animale. Presentiamo un protocollo per la microscopia a vita di fluorescenza (FLIM) che consente il monitoraggio e la quantificazione della fibrillazione amiloide in cellule specifiche, come i neuroni, in modo non invasivo e con la progressione dell'invecchiamento e il PN. FLIM è indipendente dai livelli di espressione del fluoroforo e consente un'analisi del processo di aggregazione senza ulteriori colorazioni o sbiancamenti. I fluorofori vengono spenti quando si trovano nelle immediate vicinanze di strutture amiloidi, il che si traduce in una diminuzione della durata della fluorescenza. Lo spegnimento è direttamente correlato all'aggregazione della proteina amiloide. FLIM è una tecnica versatile che può essere applicata per confrontare il processo di fibrilizzazione di diverse proteine amiloidi, stimoli ambientali o background genetici in vivo in modo non invasivo.
Introduction
L'aggregazione proteica si verifica sia nell'invecchiamento che nella malattia. I percorsi che portano alla formazione e alla deposizione di grandi amiloidi o inclusioni amorfosi sono difficili da seguire e la loro cinetica è altrettanto difficile da svelare. Le proteine possono misfold a causa di mutazioni intrinseche all'interno delle loro sequenze di codifica, come nel caso delle malattie genetiche. Le proteine si piegano male perché la rete proteostasi (PN) che le mantiene solubili e piegate correttamente è compromessa, come accade durante l'invecchiamento. Il PN comprende chaperones molecolari e macchine per degradazione ed è responsabile della biogenesi, del ripiegamento, del traffico e della degradazione delle proteine1.
C. elegans è emerso come un modello per studiare l'invecchiamento e la malattia a causa della sua breve durata di vita, della natura isogenica e della facilità di manipolazione genetica. Sono stati creati diversi ceppi transgenici C. elegans che esprimono proteine che causano malattie umane nei tessuti vulnerabili. È importante sottolineare che molti ceppi contenenti proteine soggette ad aggregazione riassumono il segno distintivo dei disturbi amiloidi, la formazione di grandi inclusioni. Grazie al corpo trasparente di C. elegans, questi aggregati possono essere visualizzati in vivo, in modo non invasivo e non distruttivo2. Generare qualsiasi proteina di interesse (POI) in fusione con un fluoroforo permette di indagare i suoi luoghi, il traffico, la rete di interazione e il destino generale.
Vi presentiamo un protocollo per monitorare l'aggregazione di proteine che causano malattie nel vivere e nell'invecchiamento C. elegans tramite microscopia imaging a vita di fluorescenza (FLIM). FLIM è una tecnica potente basata sulla durata di un fluoroforo, piuttosto che sui suoi spettri di emissione. La durata (tau, ) è definita come il tempo medio richiesto da un fotone per decadere dal suo stato eccitato al suo stato di terra. La durata di una determinata molecola viene calcolata con la tecnica del dominio temporale del conteggio dei singoli fotoni (TCSPC). In TCSPC-FLIM, la funzione di decadimento fluorescente si ottiene entusiasmando il fluoroforo con impulsi laser brevi e ad alta frequenza e misurando gli orari di arrivo del fotone emesso in un rilevatore rispetto agli impulsi. Durante la scansione di un campione, viene creato un array di dati tridimensionale per ogni pixel: l'array include informazioni sulla distribuzione dei fotoni nelle coordinate spaziali x,y e la loro curva di decadimento temporale. Un dato campione diventa quindi una mappa di vite che rivelano informazioni sulla struttura, il legame e l'ambiente3,,4. Ogni proteina fluorescente possiede una durata intrinseca e definita con precisione, di solito di pochi nanosecondi (ns), a seconda delle sue proprietà fisiochimiche. È importante sottolineare che la durata di un fluoroforo è indipendente dalla sua concentrazione, dall'intensità fluorescente e dalla metodologia di imaging. Tuttavia, all'interno di un sistema biologico, può essere influenzato da fattori ambientali come pH, temperatura, concentrazioni di ioni, saturazione di ossigeno e suoi partner di interazione. Le durate sono anche sensibili ai cambiamenti strutturali interni e all'orientamento. Fondere un fluoroforo a un POI si traduce in un cambiamento nel suo ciclo di vita e di conseguenza informazioni sul comportamento della proteina fusa. Quando un fluoroforo è circondato o incapsulato in un ambiente strettamente legato, come i fogli beta antiparalleli di una struttura amiloide, perde energia in modo non radiodiativo, un processo noto come spegnimento5. Il cinto del fluoroforo comporta un accorciamento della sua vita apparente. Quando è solubile, la vita di una proteina rimarrà più vicina al suo valore originale e più alto. Al contrario, quando una proteina inizia ad aggregarsi, la sua durata si sposterà inevitabilmente su un valore inferiore6,7. Pertanto, diventa possibile monitorare la propensione di aggregazione di qualsiasi proteina che forma amiloidi in diverse età nel vivere C. elegans.
Qui descriviamo un protocollo per analizzare l'aggregazione di una proteina di fusione che comprende diversi tratti di poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 e Q85). Illustreremo come la tecnica possa essere applicata ugualmente a diversi fluorofori, come la proteina cianescente (CFP), la proteina fluorescente gialla (YFP) e la proteina fluorescente rosso monomerica (mRFP); e in tutti i tessuti di C. elegans, compresi i neuroni, i muscoli e l'intestino. Inoltre, nel contesto della proteostasi, FLIM è uno strumento molto utile per osservare i cambiamenti in seguito all'esaurimento degli chaperoni molecolari. Abbattere uno degli chaperoni molecolari chiave, la proteina da shock termico 1 (hsp-1), tramite l'interferenza dell'RNA produce un ripiegamento errato delle proteine. L'aumento del carico di aggregazione a causa dell'invecchiamento, della malattia o degli accompagnatori carenti carenti, viene quindi misurato come diminuzione della durata della fluorescenza.
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Protocol
1. Sincronizzazione di C. elegans
- Sincronizzare C. elegans tramite il trattamento della soluzione di ipoclore alcalina o tramite semplice deposizione delle uova per 4 h a 20.
- Coltivare e mantenere i nematodi a 20 gradi centigradi sulle piastre del mezzo di crescita dei nematodi (NGM) seminate con OP50 E. coli secondo le procedure standard9. Età i nematodi fino alla fase di sviluppo desiderata o giorno.
NOTA: In questo protocollo, i giovani adulti sono immagini il giorno 4 e vecchi nematodi sono immagine il giorno 8 della vita.
2. Knockdown di macchine chaperone mediato dall'RNAi tramite alimentazione
NOTA: Eseguire il knockdown della proteina di shock termico 1 (hsp-1) chaperone alimentando il vettore RNAi corrispondente ai nematodi10. Il plasmide hsp-1 RNAi è stato ottenuto dalla libreria Ahringer (ID clone: F26D10.3).
- Coltivare il mezzo HT115 (DE3) E. coli esprimendo il plasmide hsp-1 RNAi per 6 h a una notte a Luria Bertani (LB) contenente 50 ampicillina .
- Preparare piastre fresche di agar NGM contenenti isopropilio z-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) e ancanto (25 g/mL) e semi con i batteri hsp-1 RNAi. Lasciare asciugare le piastre e indurre a temperatura ambiente per 1-3 giorni.
- Posizionare le uova sincronizzate su una piastra di siRNA e lasciare schiudere, o posizionare i nematodi gravidi e lasciare deporre le uova per 4 h a 20 gradi centigradi prima di rimuovere. Coltivare i nematodi fino all'età o allo stadio desiderato.
NOTA: La seconda generazione di nematodi potrebbe presentare un fenotipo più forte del knockdown. Il protocollo e le condizioni del siRNA qui descritti sono generali e adattati a hsp1. L'interferenza dell'RNA tramite siRNA di un clone/gene specifico deve essere stabilita e ottimizzata dall'utente finale. È importante notare che non tutti i siRNA hanno la stessa efficienza, ed è quindi consigliabile testare l'efficacia del knockdown per quantificazione mediante reazione quantitativa della capacità inversa di trascrizione polimerasi (RT-qPCR) o blot occidentale.
3. Preparazione dei vetrini di microscopia
- Il giorno dell'imaging, iniziare preparando i vetrini di imaging. Sciogliere l'agarose in ddH2O ad una concentrazione del 3% (w/v) e lasciare raffreddare leggermente.
- Tagliare la punta di una punta di pipetta da 1 mL e prendere circa 200 l di agarose fuse. Pipette l'agarose su uno scivolo di vetro pulito e immediatamente posizionarne un secondo in cima, evitando la formazione di eventuali bolle. Lasciare asciugare e rimuovere delicatamente lo scivolo superiore di vetro. Il risultato è uno scivolo di vetro con una superficie uniforme dove saranno posizionati i nematodi.
NOTA: ogni diapositiva verrà utilizzata per l'immagine compresa tra 5-10 nematodi. I vetrini possono essere preparati e conservati per alcune ore in una scatola umorificata per evitare che l'agarose si secchi.
4. Montaggio di nematodi su vetrini di microscopia
NOTA: FLIM richiede che i nematodi siano immobilizzati. Eseguire questo passaggio una volta che la configurazione dell'imaging (ad esempio, microscopi, laser, rilevatori) è pronta per l'uso.
- Utilizzando un plettro di filo di platino, posizionare i nematodi dell'età desiderata su una piastra fresca non seminata e lasciarli strisciare per rimuovere i batteri OP50 in eccesso dai loro corpi.
- Preparare il composto anestetico (azide di sodio o levamisole) per immobilizzare il nematode. Tenere uno stock di 500 mM NaN3 al buio a 4 gradi centigradi e diluire in ddH2O a una concentrazione finale di 250 mM. Se si utilizza levamisole, diluire una soluzione di lavoro da 20 mm a 2 mM in ddH2O.
AVVISO: L'azide di sodio (NaN3)è altamente tossico. Utilizzare guanti e occhiali protettivi e lavorare sotto un cappuccio ventilato. - Lavorando sotto uno stereoscopio, mettere una goccia di 10 - l di composto anestetico su un pad di agarose e trasferire delicatamente 5-10 nematodi in esso. Utilizzare una punta delle ciglia per separare i nematodi. Tenerli vicini ma non toccarli per facilitare la localizzazione dei nematodi durante l'acquisizione dell'immagine.
- Sovrapporre con cura i nematodi con un coverslip. Prendere le misure entro 1 h dopo il montaggio.
NOTA: Entrambi gli anestetici alla fine uccideranno C. elegans. I nematodi devono essere completamente immobili durante l'imaging, perché la mappa della durata viene registrata da ogni pixel. Qualsiasi movimento dei parametri x,y impedisce la lettura della durata nello stesso pixel eccitato.
5. Acquisizione di dati FLIM
NOTA: In questo protocollo, la durata del fluoroforo viene acquisita tramite il metodo TCSPC del dominio temporale. FLIM richiede che il laser generi un impulso di luce a un set e una velocità di ripetizione costante. Il tasso di ripetizione varia a seconda del tipo di laser e deve essere conosciuto dall'utente. Le misurazioni a vita vengono ottenute mediante rilevatori e apparecchiature elettroniche installate insieme a un microscopio convenzionale. In questo protocollo, le misurazioni vengono eseguite su tre diversi microscopi confocali di scansione laser con rilevatori e software forniti da due diverse società (Table of Materials) rispettivamente per l'acquisizione di mRFP, CFP e YFP. Verificare che i filtri corretti di emissione/eccitazione siano in posizione e ridurre al minimo qualsiasi retroilluminazione di sfondo o monitor prima di iniziare. Prima di iniziare qualsiasi esperimento, stabilire la fotostabilità del fluoroforo scelto. Se la sbiancatura del fluoroforo entro un breve periodo di tempo all'interno dei tessuti nematodi, non è adatta per le misurazioni FLIM in C. elegans.
- Aprire il software di acquisizione FLIM. Il software FLIM permette anche il controllo del microscopio confocale. Individuare la scheda/pulsante per consentire l'abilitazione degli output del rilevatore e premere Abilita output.
- Acquisire la funzione di risposta dello strumento (IRF), che descrive la precisione di temporizzazione della configurazione strumentale.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito preferibilmente prima di montare i nematodi.- Se disponibile, rimuovere i filtri di eccitazione/emissione.
- Posizionare un coperchio vuoto sopra l'obiettivo e trovare la sua superficie. Registrare il segnale scatter ottenuto dalla coverslip per un minimo di 30 s.
NOTA: per durate di diversi nanosecondi, il software di acquisizione può stimare automaticamente il turno IRF. L'acquisizione di un IRF è sempre consigliata.
- Posizionare il vetrino con i C. elegan montati sul palco. Utilizzando un obiettivo di ingrandimento 10x in modalità di trasmissione e localizzare la posizione dei nematodi sulla diapositiva.
- Rimuovere la diapositiva, passare l'obiettivo a una lente di ingrandimento 63x e applicare il mezzo di immersione richiesto (ad esempio, olio). Sostituire la diapositiva sullo stage e localizzare i nematodi.
- Individuare Pinhole Manager sul software di acquisizione e aprirlo al massimo. Avviare la scansione del campione, selezionare una regione di interesse (ad esempio, testa, parte superiore del corpo) e concentrarsi sul piano di proiezione massimo.
- Monitorare la frequenza dell'impulso laser e gli altri tre valori presenti sull'interfaccia del software: Il discriminatore di frazione costante (CFD), il Time-to-Amplitude (TAC) e il convertitore analogo-digitale (ADC).
NOTA: Il laser deve avere un cancello massimo di 1 x 108 conteggi di fotoni singoli. Questo numero rappresenta il numero massimo di fotoni forniti dal laser. Il CFD fornisce informazioni sulla ricezione del singolo impulso fotonico in riferimento all'impulso laser da parte del rilevatore. Questo valore deve essere approssimativamente 1 x 105. Il TAC discrimina tra il momento in cui è stato rilevato un fotone e il successivo impulso laser. Infine, l'ADC converte la tensione TAC in un segnale di memoria recuperabile11. Il CFD, il TAC e l'ADC dovrebbero avere tutti valori simili per garantire che i fotoni emessi dal fluoroforo non vengano persi. Una valutazione corretta di questi parametri garantisce la raccolta di un numero sufficiente di fotoni per creare una mappa a vita accurata. - Sull'interfaccia del software FLIM, visualizzare in anteprima il numero di fotoni rilevati: il valore ADC deve essere compreso tra 1 x 104 e 1 x 105. Se necessario, spostare la messa a fuoco su un piano diverso o aumentare la potenza del laser per raccogliere più fotoni.
NOTA: In generale, il numero di fotoni registrati al secondo non deve superare l'1% del tasso di ripetizione del laser. - Nella barra dei menu, selezionare la scheda per impostare i parametri di acquisizione. Selezionare Scansione sincronizzazione in per consentire il rilevamento di singoli fotoni.
- Impostare l'acquisizione su un determinato periodo di tempo o su un numero fisso di fotoni. Ad esempio, acquisire una curva di decadimento a vita per 2 min o fino a quando un singolo pixel raggiunge un numero di fotoni di 2.000 eventi singoli. Premere Start per avviare l'acquisizione.
NOTA: diversi fluorofori richiederanno diversi laser e filtri di eccitazione ed emissione. A seconda della luminosità del campione, la potenza del laser può anche essere regolata, che non interferirà con la durata. Questi protocolli utilizzano le seguenti impostazioni di eccitazione/emissione: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Un laser a due fotoni pulsato è stato impiegato per le misurazioni CFP utilizzando ex800/em440 nm. La quantità di tempo e il numero di fotoni necessari per l'acquisizione di una mappa FLIM dovrà essere stabilito empiricamente per ogni configurazione e ogni scopo sperimentale.
6. Analisi dei dati FLIM utilizzando il software FLIMfit
NOTA: eseguire l'analisi dei dati utilizzando lo strumento software FLIMfit sviluppato presso l'Imperial College London12 (vedere La Figura 1).
- Aprire il software e importare i file di dati FLIM tramite File Caricarei dati FLIM . Caricare tutti i campioni da una condizione, anche se ottenuti in sessioni diverse e da diverse ripetizioni biologiche.
- Se necessario, segmentare un singolo nematodo da qualsiasi immagine DiLIM tramite Segmentazione. Gestione segmentazione. Trascinare lo strumento di ritaglio intorno all'area di interesse finché non viene evidenziato. Una volta completato, premere OK.
NOTA: la segmentazione deve essere eseguita per tutte le immagini. - Selezionare una piccola area in cui viene visualizzata l'immagine basata sull'intensità di un C. elegans (Figura 1, Frecce 1). La curva di decadimento di tale regione verrà visualizzata nella grande finestra di decadimento sul lato destro dell'interfaccia (Figura 1, Freccia 2).
NOTA: il decadimento può essere visualizzato in modo lineatico o logaritmico. - Impostare i parametri corretti per estrapolare la durata tramite l'algoritmo del software come descritto nei passaggi 6.5-6.8.
- Nella scheda Dati (Figura 1, Freccia 3):
- Impostare un valore minimo integrato arbitrario per escludere tutti i pixel troppo dim per produrre una buona vestibilità. A seconda del campione C. elegans, questo valore varia da 40 a 300. Immettere valori diversi fino a ottenere un'anteprima soddisfacente.
- Selezionare un numero di tempo massimo e un numero massimo di tempo per limitare il segnale FLIM a questi valori. Tutti gli eventi che appaiono prima e dopo questa soglia saranno esclusi.
NOTA: Ad esempio, per l'analisi di mRFP, gli eventi precedenti a 800 ps e dopo 4.000 ps sono stati esclusi. Questi valori dipendono dalla durata del fluoroforo e devono essere determinati dall'utente finale. - Non modificare il predefinito Conteggi/Fotone di 1.
- Inserisci la frequenza di ripetizione, in MHz, del laser utilizzato durante l'acquisizione.
NOTA: Per il protocollo corrente, sono stati utilizzati diversi laser con vari tassi di ripetizione. Il laser a due fotoni utilizzato per l'acquisizione di vite CFP possiede una velocità di ripetizione di 80 MHz, per YFP il laser si ripete a 40 MHz, e per mRFP il valore è di 78,01 MHz. Questi valori sono stati immessi in FLIMfit in base al campione analizzato. - Immettere un valore Gate Max per escludere tutti i pixel saturi.
NOTA: per le misurazioni a vita in C. elegans, questo valore è impostato su un numero qualsiasi (ad esempio, 1 x 108).
- Nella scheda Durata, selezionare un raccordo globale da utilizzare (ad esempio, un raccordo per pixel). Vedere Figura 1, freccia 4.
NOTA: Un raccordo per pixel produrrà un decadimento adattato a ogni singolo pixel. Un raccordo per elemento di immagine produrrà un raccordo globale di ogni singola immagine e visualizzerà un singolo valore di durata per immagine. Un adattamento per livello globale produrrà un singolo adattamento nell'intero set di dati. Viene fornito un singolo valore di durata per tutte le immagini. - Non modificare nessun altro parametro, ad eccezione del valore Nr. Exp selezione se è noto che il decadimento della fluorescenza scelto è multiesponenziale e presenta più di una sola vita.
NOTA: Nel presente protocollo, questa funzione è stata utilizzata per calcolare la durata del fluoroforo CFP biesponenziale. - Caricare l'IRF tramite il menu IRF: IRF Carica IRF. Per stimare il turno IRF, selezionare IRF Stimare Spostamento IRF. Nella scheda IRF verrà visualizzato automaticamente un insieme di valori. Una volta stabilito questo, non modificare altri parametri di questa scheda.
- Una volta impostati tutti i parametri, premere Adatta dataset (Figura 1, Freccia 5). L'algoritmo produrrà un adattamento per la curva di decadimento e stabilirà un valore di durata per ogni immagine.
NOTA: l'adattamento risultante, evidenziato in una linea blu, deve sovrapporsi a tutti gli eventi. Una buona vestibilità si ottiene quando tutti gli eventi sono allineati lungo la vestibilità. - Fare clic sulla scheda Parametri (Figura 1, Freccia 6), che si trova nei menu in alto a destra dell'interfaccia del software e selezionare Statistico: w_mean (media ponderata) e verificare che il valore chi2 sia il più vicino possibile a 1.
NOTA: Un chi2 vicino a uno garantisce l'accuratezza della vestibilità. Il valore della durata dell'immagine selezionata viene quindi rivelato come tau_1. - Esportare tutte le informazioni di interesse: File Esporta immagini di intensità/Adatta tabella risultati/Immagini/Istogrammi. Salvare le impostazioni dei dati utilizzate per calcolare la durata: File Salva impostazioni dati.
NOTA: i parametri utilizzati verranno salvati per l'analisi futura dei campioni selezionati.
7. Rappresentazioni grafiche dei dati FLIM
NOTA: le durate raccolte da campioni diversi possono essere rappresentate visivamente in vari modi. Selezionare questa opzione per indicare i valori di durata in nanosecondi o picosecondi.
- Mostrare la qualità della vestibilità e la precisione della curva esportando la curva di decadimento direttamente da FLIMfit.
- Rappresenta la distribuzione dei fotoni tracciando la frequenza del numero di fotoni rispetto al valore della durata in un istogramma.
- Infine, per il confronto statistico, se si confrontano due o più campioni, posizionare i valori di durata più la deviazione standard della media in un grafico a barre del grafico a dispersione. Eseguire qualsiasi analisi statistica desiderata.
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Representative Results
Il protocollo mostra come monitorare con precisione la formazione di specie aggregate nei C. elegan viventi,sia durante il suo invecchiamento naturale che quando sottoposto a stress. Abbiamo selezionato quattro diversi ceppi di nematodi transgenici che esprimono proteine della poliglutamina di 40Q, 44Q o 85Q. Queste proteine sono sintetizzate in tessuti diversi e sono state fuse a diversi fluorofori. I ceppi C. elegans espresso Q40-mRFP nei muscoli della parete del corpo (mQ40-RFP), Q40-CFP nel sistema nervoso (nQ40-CFP), e Q44-YFP o Q85-YFP nell'intestino (iQ44-YFP e iQ85-YFP)13. Per illustrare come l'invecchiamento promuove l'aggregazione, abbiamo raccolto la durata di questi ceppi di poliQ in giovani nematodi, al giorno 4 della vita, e vecchi nematodi, al giorno 8. Per mostrare gli effetti di una carenza nel PN, abbiamo eseguito un knockdown di hsp-1 nel mQ40-RFP e nei ceppi nQ40.
Una volta che i valori di durata sono stati estrapolati tramite il software FLIMfit, i dati ottenuti hanno mostrato una chiara riduzione della durata di uno qualsiasi dei costrutti poliQ quando aggregati a causa del carico di glutammina, dell'invecchiamento o dello stress. FLIM distingueva tra la frazione proteica solubile e le specie aggregate, e la loro transizione, registrando un cambiamento nella loro vita.
Al giorno 4, mQ40-RFP visualizzava una durata media di fluorescenza di 1,69 ns (Figura 2). Al momento dell'invecchiamento, sono sorte specie più aggregate, che appaiono come foci a vita bassa nelle immagini a vita e spostano l'istogramma a vite ridotte (Figura 2A). Tracciando la durata media della fluorescenza di ogni immagine acquisita nel corso dell'età dei nematodi è diventata visibile una significativa riduzione della durata della fluorescenza, e quindi l'accumulo di specie aggregate (Figura 2B). La capacità di piegatura delle proteine del PN è diminuita dopo il giorno 4 della vita in C. elegans14 e le proteine soggette ad aggregazione ulteriormente piegate erroneamente per raggrupparsi in aggregati amiloidi e amorfi. A parte il PN, la propensione di aggregazione intrinseca di una certa proteina ha svolto un ruolo importante nella progressione della formazione aggregata. Questo è stato analizzato confrontando il comportamento di iQ44-YFP e iQ85-YFP. Il più lungo Q-stretch del iQ85 era più incline all'aggregazione ed ha mostrato un cambiamento di durata di fluorescenza nell'istogramma già al giorno 4 della vita (Figura 3A). Infatti, al giorno 4, la formazione di foci è stata osservata per iQ85, mentre ancora assente in iQ44. Al momento dell'invecchiamento, tuttavia, iQ44 ha anche mostrato la formazione di foci e quindi una ridotta durata di fluorescenza. Poiché iQ85 già mostrava aggregati nella prima età adulta, la progressione dell'aggregazione all'invecchiamento era meno pronunciata, ma significativa (Figura 3B). Infine, non abbiamo rilevato la formazione di foci né la diminuzione della durata della fluorescenza nel ceppo nQ40-CFP (Figura 4A). Per questo ceppo, ci sono stati solo sottili, cambiamenti non significativi alla durata media della fluorescenza al momento dell'invecchiamento (Figura 4B), potenzialmente a causa dei neuroni essendo meno suscettibili per motivi ancora sconosciuti.
Abbattere hsp-1 rappresenta una sfida per il PN di mQ40 e nQ40 che esprime nematodi. L'esaurimento mediato dall'RNAi di hsp-1 ha portato ad un aumento significativo dell'aggregazione (Figura 5 e Figura 6). Q40 espresso nei muscoli della parete del corpo tendeva a formare un piccolo numero di grandi foci circondati da materiale non aggregato. Ciò ha comportato due picchi distinguibili negli istogrammi (circa 1,7 ns e 1,4 ns, vedere Figura 5A). I nematodi trattati invecchiati e RNAi hanno mostrato un forte aumento del picco di vita bassa diminuendo in ultima analisi la durata media della fluorescenza (Figura 5B). Rispetto a questo comportamento bifasico del Q40 nei muscoli, il Q40 neuronale mostrava un comportamento di aggregazione più diversificato. Non potevamo correlare direttamente la formazione di foci con l'aggregazione come nel ceppo di espressionemuscolare( Figura 6A). Poiché FLIM offre l'opportunità di valutare il grado di aggregazione, gli istogrammi hanno rivelato che non c'era un picco distinto, ma una distribuzione diffusa delle durate di fluorescenza, indicando una composizione complessa di oligomeri diversi e aggregati di ordine superiore. Tuttavia, il grado complessivo di aggregazione potrebbe essere valutato tracciando la durata media della fluorescenza (Figura 6B), dimostrando che il knockdown hsp-1 ha portato a un incremento dell'aggregazione.
È importante notare che la durata dei fluorofori, liberi da un partner di fusione e al di fuori di un sistema biologico, era più alta. Poiché la durata è influenzata principalmente dal suo ambiente, una leggera riduzione della durata di YFP e RFP era già evidente all'interno dei tessuti di C. elegans. È quindi importante ottenere la durata del POI solubile all'interno del nematode come controllo adeguato. È quindi possibile effettuare un confronto tra la frazione solubile con una durata più elevata e una frazione aggregata con una durata inferiore. Qui, la diminuzione della vita correlata con la formazione di foci visibili all'interno delle cellule muscolari e intestinali. Ancora, una frazione di foci non ha mostrato alcuna diminuzione della durata di fluorescenza (vedere Figura 2 e Figura 3, frecce bianche). Questa caratteristica evidenzia come solo una parte del costrutto di fusione possa essere aggregata in un particolare punto spatiotemporale e la presenza e la disponibilità di proteine non legate. Uno scenario più complesso è nato dallo studio del ceppo neuronale Q40-CFP. La PCP possiede intrinsecamente due diverse vite di fluorescenza. Mentre CFP è un fluorophore ideale per il trasferimento di energia di risonanza di F ,rster (FRET)15 misurazioni, in combinazione con YFP, non è consigliabile impiegarlo per monitorare la formazione di aggregati in C. elegans.
Figura 1: Schermata dell'interfaccia software FLIMFit. Screenshot del software utilizzato per calcolare le durate di fluorescenza. La finestra illustra l'interfaccia dopo che le impostazioni sono state definite come descritto nel testo e viene eseguito il calcolo delle durate. Le frecce numerate si riferiscono a passaggi specifici all'interno del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le durate di fluorescenza del muscoloD Q40-RFP sono diminuite con l'età. (A) Mappe rappresentative di C. elegans che esprimono la muscolosa Q40-RFP il giorno 4 o il giorno 8 della vita generata da FLIMfit. Le durate di fluorescenza, l'intensità della fluorescenza e un'immagine fusa di entrambi sono forniti. Le barre di scala: 25 anni. (B) Grafici a barre che mostrano le durate medi ponderate della fluorescenza di tutti gli animali analizzati rispettivamente al giorno 4 o all'ottavo giorno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le durate di fluorescenza intestinali Q44-YFP e intestinali Q85-YFP sono diminuite con l'età. (A) Mappe rappresentative di C. elegans che esprimono Q44-YFP intestinali o intestinale Q85-YFP il giorno 4 o il giorno 8 della vita generato da FLIMfit. Le durate di fluorescenza, l'intensità della fluorescenza e un'immagine fusa di entrambi sono forniti. Le barre di scala: 25 anni. (B) Grafici a barre che mostrano le durate medi ponderate della fluorescenza di tutti gli animali analizzati rispettivamente al giorno 4 o all'ottavo giorno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La durata della fluorescenza del neuronale Q40-CFP non è cambiata con l'età. (A) Mappe rappresentative di C. elegans che esprimono il neuronalQ40-CFP il giorno 4 o il giorno 8 della vita generata da FLIMfit. La durata della fluorescenza, l'intensità della fluorescenza e un'immagine fusa di entrambi sono forniti (la seconda durata, il secondo ciclo di vita, è indicato in tutti i campioni). Le barre di scala: 25 anni. (B) Grafici a barre che mostrano le durate medi ponderate della fluorescenza di tutti gli animali analizzati rispettivamente al giorno 4 o all'ottavo giorno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Le durate di fluorescenza del muscoloq Q40-RFP sono diminuite al knockdown di hsp-1. (A) Mappe rappresentative di C. elegans che esprimono la muscolosa Q40-RFP il giorno 4 o il giorno 8 della vita generata da FLIMfit. Viene visualizzata un'unione della mappa di durata e intensità della fluorescenza. Per entrambi i punti temporali, vengono mostrati i nematodi che sono cresciuti sui batteri che esprimono un vettore vuoto (controllo) o sui batteri che esprimono il costrutto rnAi hsp-1. Le barre di scala: 25 anni. (B) Grafici a barre che mostrano le durate medie a fluorescenza ponderate di tutti gli animali analizzati il giorno 4 o l'ottavo giorno della vita, rispettivamente con controllo o hsp-1 RNAi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Le durate di fluorescenza del neuronale Q40-CFP sono diminuite al momento del knockdown di hsp-1. (A) Mappe rappresentative di C. elegans che esprimono il neuronalq Q40-CFP nel giorno 4 della vita generata da FLIMfit. Viene visualizzata un'unione della mappa di durata e intensità della fluorescenza. I nematodi mostrati sono stati coltivati su batteri che esprimono un vettore vuoto (controllo) o batteri che esprimono il costrutto RNAi hsp-1. Le barre di scala: 25 anni. (B) Grafici a barre che mostrano la durata media della fluorescenza ponderata di tutti gli animali analizzati il giorno 4, con RNAi di controllo o rnAi hsp-1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui presentato descrive una tecnica basata sulla microscopia per identificare le specie aggregate nel sistema modello C. elegans. FLIM può caratterizzare con precisione la presenza di specie aggregate e solubili fuse in un fluoroforo attraverso la misurazione dei loro decadimenti di durata della fluorescenza. Quando una proteina di fusione inizia ad aggregare la sua durata media registrata passerà da un valore superiore a un valore più bassodi 16. La propensione all'aggregazione può quindi essere dedotta dal calo della vita: minore è la durata, maggiore è la presenza di specie proteiche aggregate nel sistema. Di seguito, diventa possibile seguire gli effetti dell'invecchiamento, della malattia o della compromissione di PN sulla propensione di aggregazione di qualsiasi proteina.
Per evidenziare la versatilità della tecnica, i nostri risultati hanno mostrato chiaramente che FLIM poteva identificare i cambiamenti nella struttura dei vari costrutti poliQ, indipendentemente dal tessuto o dal fluoroforo. È importante sottolineare che il FLIM è già stato applicato con successo nella caratterizzazione di altre proteine soggette ad aggregazione all'interno di C. elegans, come la sy-synuclein17. Inoltre, diventa possibile applicare qualsiasi fattore di sollecitazione a C. elegans e seguire lo svolgimento e l'aggregazione di qualsiasi POI. Lo stress osmotico, metallico, redox o chimico può tutti promuovere squilibri tossici che possono essere monitorati con successo in C. elegans che impiegano FLIM. Il contrario potrebbe anche essere possibile: un ritardo nell'aggregazione o addirittura nella disaggregazione a causa della presenza di composti benefici o dell'aumento del PN, può provocare un salvataggio della proteina e un conseguente aumento della durata.
FLIM è stato ampiamente impiegato per monitorare i cambiamenti nel corso della vita di qualsiasi sostanza in una vasta gamma di discipline dalla chimica alla biologia del cancro18 alla diagnostica medica, ma rimangono alcune limitazioni. Un problema principale è la fotostabilità dei fluorofori. Poiché FLIM richiede la registrazione di un gran numero di fotoni, la fotobleaching riduce il numero di fotoni raccolti e può modificare la curva di decadimento risultante. Inoltre, soprattutto all'interno del sistema nematode, se l'intensità del fluoroforo stesso non è sufficientemente alta da raccogliere abbastanza fotoni, è necessaria un'eccitazione più elevata, che porta a un fotosbiancamento più rapido e a una curva di decadimento inaffidabile. Infine, la tecnica richiede attrezzature sofisticate e costose come componenti aggiuntivi per i sistemi di microscopia preesistenti, con un elemento critico è la sensibilità dei rivelatori19.
Al contrario, uno dei principali vantaggi di calcolare la durata di un fluoroforo e la sua proteina di fusione è che fornisce informazioni su diverse frazioni dello stesso complesso di proteine fluoroforo-proteine in diversi stati di interazioni all'interno del suo ambiente, indipendentemente dalla sua concentrazione in gran parte sconosciuta. Il FLIM può essere utilizzato anche per misurare la durata in qualsiasi fase, gas, liquido o solido e in qualsiasi mezzo o organismo che può essere normalmente immaginato, dalle cellule agli organismi, e orgelli alle proteine immobilizzate e purificate20. Le tecniche di microscopia di solito si basano sull'imaging a stato costante di una proteina fluorescente. A differenza delle tecniche a stato costante, FLIM può risolvere i cambiamenti nel legame, composizione, e conformazione di un substrato biologico. Per studiare le proteine soggette ad aggregazione, la presenza di grandi inclusioni fluorescenti o foci può essere facilmente immaginata, ma queste rappresentano solo un'istantanea statica basata sull'intensità3 . Nel caso delle specie aggregate, i foci visualizzati possono anche essere fuorvianti, in quanto un'alta concentrazione di fluoroforo non comporta necessariamente una forte formazione di amiloidi. Attraverso FLIM è invece possibile distinguere materiale solubile da materiale insolubile. Infine, diventa utile per qualsiasi indagine ottenere sia le misurazioni basate sull'intensità che la misurazione parallela della durata. All'interno della complementarità di queste tecniche di microscopia sta la loro forza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il ceppo muscolare-Q40-mRFP fornito dal CGC, che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Il neuronale-Q40-CFP era un dono gentile del Morimoto Lab. Riconosciamo il DFG (KI-1988/5-1 a JK, la borsa di studio NeuroCure PhD del Cluster di Eccellenza NeuroCure a MLP), l'EMBO (Short term fellowship to MLP) e la Società dei Biologi (travel grants to CG and MLP) per il finanziamento. Riconosciamo anche l'impianto di imaging Advanced Light Microscopy presso il Centro Max Delbràck per la Medicina Molecolare di Berlino, per aver fornito la configurazione per l'immagine dei costrutti YFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
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