Summary
Флуоресценция жизни визуализации мониторов, количественно и отличает агрегации тенденции белков в жизни, старение, и подчеркнул C. elegans модели болезни.
Abstract
Амилоидные фибрилки связаны с рядом нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Гентингтона, Паркинсона или болезнь Альцгеймера. Эти амилоидные фибриллы могут секвестировать эндогенные метастабильные белки, а также компоненты сети протеостаза (PN) и тем самым усугубить неправильное сворачивание белка в клетке. Существует ограниченное количество инструментов для оценки процесса амилоидных белков в животном. Мы представляем протокол для флуоресценции жизни микроскопии (FLIM), что позволяет контролировать, а также количественноать амилоидной фибрилизации в конкретных клетках, таких как нейроны, в неинвазивной образом и с прогрессированием старения и при возмущении PN. FLIM не зависит от уровня экспрессии фторофора и позволяет анализпроцесса агрегации без каких-либо дальнейших окрашивания или отбеливания. Флюорофоры угасают, когда они находятся в непосредственной близости от амилоидных структур, что приводит к снижению срока службы флуоресценции. Закалка напрямую коррелирует с агрегацией амилоидного белка. FLIM является универсальным методом, который может быть применен для сравнения процесса фибрилизации различных амилоидных белков, экологических стимулов, или генетических фонов in vivo в неинвазивной манере.
Introduction
Агрегация белка происходит как при старении, так и при заболеваниях. Пути, которые приводят к образованию и осаждению крупных амилоидов или аморфных включений трудно следовать и их кинетика также сложно разгадать. Белки могут неправильно сложиться из-за внутренних мутаций в их последовательности кодирования, как и в случае генетических заболеваний. Белки также неправильно, потому что протеостаз сети (PN), что держит их растворимыми и правильно сложены нарушается, как это происходит во время старения. PN включает в себя молекулярные сопровождающие и машины деградации и отвечает за биогенез, складные, торговые и деградации белков1.
C. elegans стала моделью для изучения старения и болезней из-за его короткой продолжительности жизни, изогенной природы и простоты генетических манипуляций. Было создано несколько трансгенных штаммов C. elegans, которые выражают белки, вызывающие болезни человека, в уязвимых тканях. Важно отметить, что многие штаммы, содержащие агрегации подверженных белков резюме отличительной чертой амилоидных расстройств, формирование крупных включений. Благодаря прозрачному телу C. elegans, эти агрегаты могут быть визуализированы in vivo, неинвазивно и неразрушительно2. Генерация любого белка, представляющих интерес (POI) в синтезе с фторфором позволяет исследовать его местоположение, торговлю людьми, сеть взаимодействия и общую судьбу.
Мы представляем протокол для мониторинга агрегации болезнетворных белков в жизни и старения C. elegans с помощью флуоресценции визуализации микроскопии (FLIM). FLIM является мощным методом, основанным на жизни фторфора, а не его спектры выбросов. Срок службы (тау, ) определяется как среднее время, требуемое фотоном для распада от возбужденного состояния обратно в его наземное состояние. Срок службы данной молекулы рассчитывается с помощью метода временной домены учета одного фотона (TCSPC). В TCSPC-FLIM функция флуоресцентного распада получается путем захватывающих флюорофора с короткими, высокочастотными лазерными импульсами и измерения времени прибытия испускаемого фотона на детектор по отношению к импульсам. При сканировании образца для каждого пикселя создается трехмерный массив данных: массив содержит информацию о распределении фотонов в их x,y пространственных координатах и кривой временного распада. Таким образом, данный образец становится картой жизней, раскрывающей информацию о структуре белка, связывании и окружающей среде3,,4. Каждый флуоресцентный белок обладает внутренней и точно определенной продолжительности жизни, как правило, в несколько наносекунд (нс), в зависимости от его физиохимических свойств. Важно отметить, что срок службы флюорофора не зависит от его концентрации, флуоресцентной интенсивности и методологии визуализации. Тем не менее, в биологической системе, это может быть влияние экологических факторов, таких как рН, температура, концентрации ионов, насыщение кислородом, и его партнеров взаимодействия. Сроки службы также чувствительны к внутренним структурным изменениям и ориентации. Слияние фторофора с POI приводит к изменению в его жизни и, следовательно, информация о поведении слитого белка. Когда фторофор окружен или инкапсулирован в плотно связанной среде, такой как антипараллельные бета-листы амилоидной структуры, он теряет энергию нерадиационно, процесс, известный как закалка5. Утоления фторофора приводит к сокращению его очевидной жизни. Когда растворимый, срок службы белка будет оставаться ближе к его первоначальной, более высокой стоимости. В отличие от этого, когда белок начинает агрегироваться, его срок службы неизбежно перейдет к более низкому значению6,,7. Таким образом, становится возможным контролировать склонность к агрегации любого амилоидного белка в разном возрасте в живых C. elegans.
Здесь мы описываем протокол для анализа агрегации белка синтеза, состоящего из различных полиглютамин (CAG, No) тянется (No40, No 44, и No 85). Мы иллюстрируем, как этот метод может быть применен в равной степени к различным флуоророромам, таким как циановый флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и мономерный красный флуоресцентный белок (mRFP); и во всех тканях C. elegans, включая нейроны, мышцы и кишечник. Кроме того, в контексте протеостаза, FLIM является очень полезным инструментом для наблюдения за изменениями при истощении молекулярных сопровождающих. Сбив ая расшатывание одного из ключевых молекулярных сопровождающих, белок теплового шока 1(hsp-1),с помощью РНК-интерференции производит преждевременное искажение белков. Увеличение нагрузки агрегации в результате старения, болезни или дефицита сопровождающих, затем измеряется как снижение продолжительности жизни флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синхронизация C. elegans
- Синхронизируйте C. elegans либо с помощью щелочной гипохлоритной обработки раствора, либо с помощью простого откладывания яйцеклеток в течение 4 ч при 20 градусах По цельсии8.
- Выращивайте и поддерживайте нематоды при 20 градусах по Цельсию на пластинах роста нематод (NGM), посеянных с помощью OP50 E. coli в соответствии со стандартными процедурами9. Возраст нематод до желаемой стадии развития или день.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, молодые взрослые изображены на 4-й день и старые нематоды изображены на 8-й день жизни.
2. РНК-опосредованный нокдаун сопровождающего оборудования через кормление
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните нокдаун белка теплового шока 1(hsp-1) сопровождающего путем кормления соответствующего вектора РНК нематодами10. Плазмида hsp-1 RNAi была получена из библиотеки Ahringer (клон ID: F26D10.3).
- Расти HT115 (DE3) E. coli выражая hsp-1 РНК-1 РНК плазмид для 6 ч на ночь в Лурия Бертани (LB) среды, содержащей 50 мкг /мл ампициллин.
- Приготовьте свежие агарные пластины NGM, содержащие изопропил-Д-1-тиогалактопиранозид (IPTG; 1 мМ) и ампициллин (25 мкг/мл) и семена с бактериями hsp-1 РНК. Оставьте тарелки высохнуть и вызвать при комнатной температуре в течение 1-3 дней.
- Поместите синхронизированные яйца на тарелку siRNA и оставьте люк, или место gravid нематод и позволяют откладывать яйца в течение 4 ч при 20 градусах Цельсия, прежде чем удалить. Выращивайте нематоды до желаемого возраста или стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Второе поколение нематод может представить более сильный фенотип нокдауна. Протокол siRNA и описанные здесь условия являются общими и адаптированы к hsp1. РНК-интерференция через siRNA конкретного клона/гена должна быть установлена и оптимизирована конечным пользователем. Важно отметить, что не все siRNA имеют одинаковую эффективность, и поэтому рекомендуется проверить эффективность нокдауна путем количественной обратной транскрипции цепной реакции (RT-qPCR) или западной подись.
3. Подготовка слайдов микроскопии
- В день визуализации начните с подготовки слайдов изображений. Растопить агарозу в ddH2O при концентрации 3% (w/v) и немного остыть.
- Вырежьте кончик наконечника пипетки 1 мл и примите примерно 200 л расплавленной агарозы. Пипетка агароуз на чистую стеклянную горку и сразу же поместите второй на вершине, избегая образования любых пузырьков. Оставьте высохнуть и аккуратно снимите верхнюю стеклянную горку. Результатом является стеклянная горка с ровной поверхностью агарозы, где будут расположены нематоды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый слайд будет использоваться для изображения между 5-10 нематод. Слайды могут быть подготовлены и храниться в течение нескольких часов в humified поле, чтобы предотвратить агарозу от высыхания.
4. Установка нематод на микроскопии слайды
ПРИМЕЧАНИЕ: FLIM требует, чтобы нематод были обездвижены. Выполните этот шаг после установки изображений (например, микроскопы, лазеры, детекторы) будет готово к использованию.
- Используя платиновый выбор проволоки, место нематод желаемого возраста на свежие unseeded пластины и дайте им ползать, чтобы удалить избыток бактерий OP50 из их тела.
- Приготовьте обезболеватое соединение (азид натрия или левамизол) для обездвиживания нематод. Держите 500 мМ NaN3 в темноте при 4 градусах Цельсия и разбавьте в свежем ddH2O до конечной концентрации 250 мМ. При использовании левамизола разбавьте 20 мМ бульона до 2 мМ рабочего раствора в ddH2O.
ВНИМАНИЕ: Азид натрия (NaN3) является высокотоксичным. Используйте перчатки и защитные очки и работайте под вентилируемым капюшоном. - Работая под стереомикроскопом, поместите 10 л капли анестетика на агарозную площадку и аккуратно перенесите в нее 5-10 нематод. Используйте наконечник ресниц, чтобы отделить нематод. Держите их близко друг к другу, но не касаясь, чтобы обеспечить более легкую локализацию нематод во время приобретения изображения.
- Тщательно наложить нематод с крышкой. Проведите измерения в течение 1 ч после монтажа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба анестезии в конечном итоге убить C. elegans. Нематоды должны быть полностью неподвижными во время визуализации, так как карта жизни записывается с каждого пикселя. Любое движение параметров x,y предотвращает чтение жизни в том же возбужденном пикселе.
5. Приобретение данных FLIM
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе срок службы фторофора приобретается с помощью метода TCSPC. FLIM требует импульса света, который будет генерироваться лазером с установленной скоростью и постоянной скоростью повторения. Скорость повторения варьируется в зависимости от типа лазера и должна быть известна пользователю. Пожизненные измерения достигаются детекторами и электронным оборудованием, установленным рядом с обычным микроскопом. В этом протоколе, измерения выполняются на трех различных лазерных сканирования конфокальных микроскопов с детекторами и программное обеспечение, предоставляемые двумя различными компаниями(Таблица материалов) для приобретения mRFP, CFP, и YFP жизни, соответственно. Убедитесь, что правильные фильтры выбросов / возбуждения на месте и свести к минимуму любой фон или мониторинг подсветки перед запуском. Перед началом любого эксперимента установите фотостабильность выбранного фторофора. Если фторофор отключит в течение короткого времени в нематод тканях, он не подходит для измерений FLIM в C. elegans.
- Откройте программное обеспечение для приобретения FLIM. Программное обеспечение FLIM также позволяет управлять конфокальный микроскоп. Найдите вкладку/кнопку, чтобы можно было включить выходы детектора и нажмите на выводы включить.
- Приобретите функцию реакции инструмента (IRF), которая описывает точность синхронизации инструментальной установки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен предпочтительно перед монтажом нематод.- При наличии, удалите фильтры возбуждения/выброса.
- Поместите пустой покрывало над целью и найдите ее поверхность. Запись рассеяния сигнала, полученного от крышки как минимум 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение нескольких наносекунд программное обеспечение приобретения может автоматически оценивать сдвиг IRF. Приобретение IRF всегда рекомендуется.
- Поместите горку с установленными C. elegans на сцене. Использование 10-раз увеличенного объектива в режиме передачи и локализовать положение нематод на слайде.
- Удалите слайд, переключите цель на объектив увеличения 63x и нанесите требуемую среду погружения (например, масло). Замените горку на сцене и локализуйте нематоды.
- Найдите Pinhole Manager на программном обеспечении для приобретения и откройте его для максимального. Начните сканирование образца, выберите интересуемую область (например, головка, верхняя часть тела) и сосредоточьтесь на максимальной плоскости проекции.
- Мониторинг частоты лазерного импульса и трех других значений, присутствующих на интерфейсе программного обеспечения: Постоянный дискриминатор фракции (CFD), Время к амплитуде (TAC), и Аналог-к-цифровой конвертер (ADC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер должен иметь максимальный ворота 1 х 108 одного фотона рассчитывает. Это число представляет собой максимальное количество фотонов, поставляемых лазером. CFD предоставляет информацию о получении одного фотонный импульс со ссылкой на лазерный импульс детектором. Это значение должно быть примерно 1 х 105. TAC различает время обнаружения одного фотона и следующий лазерный импульс. Наконец, ADC преобразует напряжение TAC в сигнал памяти11. CFD, TAC и ADC должны иметь одинаковые значения, чтобы гарантировать, что фотоны, испускаемые флюорофором, не теряются. Правильная оценка этих параметров гарантирует, что достаточно фотонов собирается для создания точной карты жизни. - На интерфейсе программного обеспечения FLIM просмотрите количество обнаруженных фотонов: значение ADC должно быть между 1 x 104 и 1 x 105. При необходимости сместите фокус на другую плоскость или увеличьте мощность лазера для сбора большего количества фотонов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, количество записанных фотонов в секунду не должно превышать 1% от частоты повторения лазера. - В панели меню выберите вкладку для настройки параметров приобретения. Выберите синхронизацию сканирования, чтобы обеспечить обнаружение одного фотона.
- Установите приобретение на фиксированное количество времени или фиксированное количество фотонов. Например, приобрести кривую распада жизни в течение 2 минут или до тех пор, пока один пиксель не достигнет количества фотонов в 2000 одиночных событий. Нажмите Начать, чтобы начать приобретение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные фторофоры потребует различных возбуждения и выбросов лазеров и фильтров. В соответствии с яркостью образца, лазерная мощность также может быть скорректирована, что не будет мешать жизни. В этих протоколах используются следующие параметры возбуждения/выбросов: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Импульсный двухсотливый фотонный лазер был использован для измерений CFP с использованием ex800/em440 нм. Количество времени и количество фотонов, необходимое для приобретения карты FLIM, должно быть эмпирически установлено для каждой установки и каждой экспериментальной цели.
6. Анализ данных FLIM с использованием программного обеспечения FLIMfit
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ данных с помощью программного инструмента FLIMfit, разработанного в Имперском колледжеЛондона 12 (см. рисунок 1).
- Откройте программное обеспечение и импортируйте файлы данных FLIM через файл Загрузите данные FLIM. Загрузите все образцы от одного состояния, даже если получены в разных сеансах и из разных биологических повторов.
- При необходимости отведать один нематод из любой фотографии FLIM через сегментацию Менеджер сегментации. Перетащите инструмент обрезки вокруг области интереса, пока он не выделен. После завершения, нажмите OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация должна быть сделана для всех изображений. - Выберите небольшой регион, где появляется изображение C. elegans на основе интенсивности(рисунок 1, Стрелки 1). Кривая распада этой области появится в большом окне распада на правой стороне интерфейса(рисунок 1, Стрелка 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Распад может отображаться линейно или logarithmically. - Установите правильные параметры для экстраполирования срока службы с помощью алгоритма программного обеспечения, описанного в шагах 6.5-6.8.
- На вкладке данных (рисунок 1, Стрелка 3):
- Установите произвольное интегрированное минимальное значение, чтобы исключить любые пиксели, которые слишком тусклые, чтобы произвести хорошую посадку. В зависимости от образца C. elegans это значение варьируется от 40-300. Ввод различных значений до удовлетворительного предварительного просмотра не будет достигнут.
- Выберите номер Time Min и Time Max, чтобы ограничить сигнал FLIM этими значениями. Все события, которые появляются до и после этого порога, будут исключены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для анализа mRFP, события до 800 ps и после 4000 ps были исключены. Эти значения зависят от продолжительности жизни флюорофора и должны определяться конечным пользователем. - Не изменяйте предустановленные графы/Фотон 1.
- Ввешай частоту повторения,в МГц, лазера, использованного во время приобретения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для текущего протокола, различные лазеры были использованы с различными показателями повторения. Два фотона лазера, используемых для приобретения CFP жизни обладает скоростью повторения 80 МГц, для YFP лазер повторяется на 40 МГц, а для mRFP значение 78,01 МГц. Эти значения были введены в FLIMfit в соответствии с проанализированным образцом. - Ввечёте значение Gate Max, чтобы исключить все насыщенные пиксели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерений продолжительности жизни в C. elegans, это значение устанавливается для любого большого числа (например, 1 х 108).
- На вкладке Lifetime выберите глобальную примерку для использования (например, примерка с пикселем). См. Рисунок 1, Стрелка 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пиксель-мудрый фиттинг будет производить распада установлены на каждом отдельном пикселе. Установка по образу и образу подобию создаст глобальную установку каждого отдельного изображения и отобразит одно значение жизни на изображение. Глобально-мудрый фиттинг будет производить одну установку по всему набору данных. Для всех изображений предусмотрено единое значение продолжительности жизни. - Не изменяйте другой параметр, за исключением Но. Exp выбор, если известно, что выбранный распад флуоресценции является многоэкспоненциальным и экспонатов более одной жизни.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе эта функция была использована для расчета продолжительности жизни двухэкспопоненциального фторофора CFP. - Загрузите IRF через меню IRF: IRF Нагрузка IRF. Для оценки смены IRF выберите IRF Оценка IRF Shift. Набор значений будет автоматически отображаться на вкладке IRF. Как только это установлено, не изменяйте никаких других параметров этой вкладки.
- После установки всех параметров нажмите Fit Dataset (рисунок 1, Стрелка 5). Алгоритм будет производить подгонку кривой распада и устанавливать значение продолжительности жизни для каждого изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В результате подходят, подчеркнул в синей линии, должны перекрываться со всеми событиями. Хорошая подгонка получена, когда все события выровнены вдоль припадка. - Нажмите на вкладку Параметры (рисунок 1, Стрелка 6), расположенная в правом верхнем виде меню интерфейса программного обеспечения, и выберите Статистику: w_mean (взвешенное среднее) и убедитесь, что значение chi2 максимально приближено к 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: chi2 близко к одному обеспечивает точность пригонки. Таким образом, значение продолжительности жизни выбранного изображения раскрывается как tau_1. - Экспорт любой информации, представляющих интерес: Файл Экспорт Интенсивность Изображения / Fit Результат Таблица / Изображения / Гистограммы. Сохраните параметры данных, используемые для расчета продолжительности жизни: Файл Сохранение настроек данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые параметры будут сохранены для дальнейшего анализа выбранных образцов.
7. Графические представления данных FLIM
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки, собранные из различных образцов, могут быть визуально представлены различными способами. Выберите для обозначения значений продолжительности жизни в наносекундах или пикосекундах.
- Показать качество подгонки и точность кривой, экспортируя кривую распада непосредственно из FLIMfit.
- Представлять распределение фотонов путем построения частоты количества фотонов по сравнению со значением продолжительности жизни в гистограмме.
- Наконец, для статистического сравнения, при сравнении двух или более образцов, место значения продолжительности жизни плюс стандартное отклонение среднего в графике рассеивания участка бар. Выполняйте любой желаемый статистический анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол показывает, как точно контролировать формирование агрегированных видов в живых C. elegans,как во время его естественного старения и при воздействии стресса. Мы отобрали четыре различных штамма трансгенных нематод, выражающих полиглутамин белки либо 40 ", 44" или 85 "повторов. Эти белки синтезируются в различных тканях и были слиты с различными флюорофорами. Штаммы C. elegans либо выражали 40-mRFP в мышцах стенки тела (m'40-RFP), q40-CFP в нервной системе (n'40-CFP), либо q44-YFP или Q85-YFP в кишечнике (i'44-YFP и i'85-YFP)13. Чтобы проиллюстрировать, как старение способствует агрегации, мы собрали срок службы этих штаммов полиэ в молодых нематод, на 4-й день жизни, и старые нематоды, на 8-й день. Чтобы показать последствия дефицита в PN, мы выполнили нокдаун hsp-1 в m'40-RFP и штаммов n'40.
После того, как значения продолжительности жизни были экстраполированы с помощью программного обеспечения FLIMfit, полученные данные показали явное сокращение срока службы любой из построек поли, когда агрегировались из-за либо глутаминовой нагрузки, старения или стресса. FLIM различал растворимые фракции белка и агрегированные виды, и их переход, записывая сдвиг в их жизни.
На 4-й день, m'40-RFP отображается средняя продолжительность флуоресценции 1,69 нч(Рисунок 2). При старении, более агрегированные виды возникли, появляясь как низкий уровень жизни очагов в жизни изображения и смещения гистограммы на сокращение продолжительности жизни(Рисунок 2A). Путем построения средней флуоресценции жизни каждого приобретенного изображения в течение возраста нематод значительное сокращение продолжительности жизни флуоресценции, и, следовательно, накопление агрегированных видов, стал видимым (Рисунок 2B). Способность сворачивать протеина PN уменьшила после дня 4 жизни в C. elegans14 и связанных с агрегацией протеинов далее misfolded для того чтобы сгруппировать в амилоидные и аморфные агрегаты. Помимо PN, внутренняя агрегация склонности определенного белка сыграли важную роль в прогрессировании совокупного образования. Это было проанализировано путем сравнения поведения i'44-YFP и i'85-YFP. Более длинний й-стрейч i'85 был более склонен к агрегации и демонстрировал флуоресценцию жизни сдвиг в гистограмме уже на 4-й день жизни(Рисунок 3A). В самом деле, на 4-й день, образование очагов наблюдалось для i'85, в то время как все еще отсутствует в i'44. Однако при старении, i'44 также проявлял образование очагов и, таким образом, уменьшал срок службы флуоресценции. Так как i'85 уже выставлены агрегаты в раннем взрослом возрасте прогрессирование агрегации на старение было менее выраженным, но значительным (Рисунок 3B). Наконец, мы не обнаружили образования очагов и не уменьшили срок службы флуоресценции в штамме n'40-CFP(рисунок 4A). Для этого штамма, были только тонкие, незначительные изменения в среднем флуоресценции жизни на старение (Рисунок 4B), потенциально из-за нейронов менее восприимчивы по еще неизвестным причинам.
Сбив ая чсп-1 представляет собой проблему для PN из м-40 и n-40, выражающих нематод. РНК-опосредовано истощение hsp-1 привело к значительному увеличению агрегации(рисунок 5 и рисунок 6). 40- в мышцах стенки тела, как правило, образуют небольшое количество крупных очагов, окруженных неагрегированным материалом. Это привело к двум различимым пикам в гистограммах (около 1,7 нс и 1,4 нс, см. Рисунок 5А). В возрасте и РНК лечение нематод показали сильное увеличение в низкий пик жизни в конечном счете, уменьшая средний срок службы флуоресценции(рисунок 5B). По сравнению с этим бифазам поведения в 40 фунтов в мышцах, нейрональные No 40 отображается более разнообразное поведение агрегации. Мы не могли напрямую соотнести образование очагов с агрегацией, как в мышечном напряжении экспрессии(рисунок 6А). Поскольку FLIM предлагает возможность оценить степень агрегации, гистограммы показали, что не было четкого пика, но широкое распространение флуоресценции жизней, указывая на сложный состав различных олигомеров и высшего порядка агрегатов. Тем не менее, общая степень агрегации может быть оценена путем построения среднего срока службы флуоресценции(рисунок 6B), показывая, что hsp-1 нокдаун привел к увеличению агрегации.
Важно отметить, что срок службы фторофоров, свободных от партнера по слиянию и вне биологической системы, был выше. Поскольку срок службы зависит в первую очередь от окружающей среды, небольшое сокращение срока службы YFP и RFP уже было заметно в тканях C. elegans. Поэтому важно, чтобы получить срок службы растворимых POI в нематод в качестве подходящего контроля. Сравнение между растворимым фракцией с более высоким сроком службы и агрегированной фракцией с более низким сроком службы может быть сделано. Здесь снижение продолжительности жизни коррелирует с образованием видимых очагов в мышечных и кишечных клетках. Тем не менее, доля фоци не продемонстрировала никакого снижения продолжительности жизни флуоресценции (см. Рисунок 2 и Рисунок 3, белые стрелки). Эта функция показывает, как только часть конструкции синтеза может быть агрегирована в определенной пространственно-временной точке, а также наличие и наличие несвязанного белка. Более сложный сценарий возник в результате исследования штамма нейронов No40-CFP. CFP внутренне обладает двумя различными флуоресценции жизни. Хотя CFP является идеальным флюорофором для рецензирования энергии Фюрстера (FRET)15 измерений, в сочетании с YFP, не рекомендуется использовать его для мониторинга формирования агрегатов в C. elegans.
Рисунок 1: Скриншот программного интерфейса FLIMFit. Скриншот программного обеспечения, используемого для расчета продолжительности жизни флуоресценции. Окно изображает интерфейс после того, как параметры были определены как описанные в тексте, и вычисление продолжительности жизни было выполнено. Пронумерованные стрелки относятся к определенным шагам в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Флуоресценция жизни мышечной 40-RFP уменьшается с возрастом. (A) Представитель карты C. elegans, выражающие мышечную 40-RFP на 4-й день или день 8 жизни, порожденных FLIMfit. Флуоресценция жизни, интенсивность флуоресценции, и слияние изображения обоих предоставляются. Шкала баров 25 мкм. Гистограммы показывают распределение измеренных сроков жизни для всех проанализированных нематод, разделенных на 100 категорий. (B) Бар участков, показывающих взвешенные средние жизни флуоресценции всех проанализированных животных на день 4 или 8 день жизни, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Флуоресценция жизни кишечника No 44-YFP и кишечного No 85-YFP снизилась с возрастом. (A) Представитель карты C. elegans, выражающие кишечные No 44-YFP или кишечных No 85-YFP на 4-й день или день 8 жизни, порожденных FLIMfit. Флуоресценция жизни, интенсивность флуоресценции, и слияние изображения обоих предоставляются. Шкала баров 25 мкм. Гистограммы показывают распределение измеренных сроков жизни для всех проанализированных нематод, разделенных на 100 категорий. (B) Бар участков, показывающих взвешенные средние жизни флуоресценции всех проанализированных животных на день 4 или 8 день жизни, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Флуоресценция жизни нейронов No 40-CFP не меняется с возрастом. (A) Представитель карты C. elegans, выражающие нейронные 40-CFP на 4-й день или день 8 жизни, порожденных FLIMfit. Флуоресценция жизни, интенсивность флуоресценции, и слияние изображения обоих предоставляются (вторая жизнь, No 2, указывается во всех образцах). Шкала баров 25 мкм. Гистограммы показывают распределение измеренных сроков жизни для всех проанализированных нематод, разделенных на 100 категорий. (B) Бар участков, показывающих взвешенные средние жизни флуоресценции всех проанализированных животных на день 4 или 8 день жизни, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Флуоресценция жизни мышечной 40-RFP снизилась после нокдауна hsp-1. (A) Представитель карты C. elegans, выражающие мышечную 40-RFP на 4-й день или день 8 жизни, порожденных FLIMfit. Отображается слияние карты продолжительности жизни и интенсивности флуоресценции. Для обеих временных точек показаны нематоды, которые росли на бактериях, выражающих пустой вектор (контроль) или бактерии, выражающие конструкцию hsp-1 RNAi. Шкала баров 25 мкм. Гистограммы показывают распределение измеренных сроков жизни для всех проанализированных нематод, разделенных на 100 категорий. (B) Бар участков, показывающих взвешенные средние жизни флуоресценции всех проанализированных животных на день 4 или 8 день жизни, с контролем или hsp-1 РНК, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Флуоресценция жизни нейронов No 40-CFP снизилась после нокдауна hsp-1. (A) Представитель карты C. elegans, выражающие нейронные 40-CFP на 4-й день жизни, порожденных FLIMfit. Отображается слияние карты продолжительности жизни и интенсивности флуоресценции. Нематоды показаны были выращены на бактериях, выражающих пустой вектор (контроль) или бактерий, выражающих hsp-1 РНК конструкции. Шкала баров 25 мкм. Гистограммы показывают распределение измеренных сроков жизни для всех проанализированных нематод, разделенных на 100 категорий. (B) Бар участков, показывающих взвешенные средние жизни флуоресценции всех проанализированных животных на 4-й день, с контролем РНК или hsp-1 РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь протокол описывает метод на основе микроскопии для выявления агрегированных видов в модели системы C. elegans. FLIM может точно охарактеризовать наличие как агрегированных, так и растворимых видов, слитых с фторфором, путем измерения их распада флуоресценции. Когда термоядерный белок начинает агрегировать свой зарегистрированный средний срок службы, он смещается от более высокого к более низкому значению16. Склонность к агрегации может быть выведена падением в жизни: чем ниже срок службы, тем выше присутствие агрегированных белковых видов в системе. Таким образом, становится возможным следить за воздействием старения, болезни или нарушения PN на склонность к агрегации любого белка.
Чтобы подчеркнуть универсальность метода, наши результаты ясно показали, что FLIM может определить изменения в структуре различных построек поли, независимо от ткани или фторфора. Важно отметить, что FLIM уже успешно применяется в характеристике других подверженных агрегации белков в C. elegans,таких как S-synuclein17. Кроме того, становится возможным применять любой фактор стресса к C. elegans и следить за развертыванием и агрегированием любого POI. Осмотический, металлоионный, редокс или химический стресс могут способствовать токсическому дисбалансу, который может успешно контролироваться в C. elegans, использующих FLIM. Обратное также может быть возможным: задержка в агрегации или даже дезагрегирование из-за присутствия полезных соединений или повышение PN, может привести к спасению белка и последующее увеличение продолжительности жизни.
FLIM широко используется для мониторинга изменений в жизни любого вещества в широком спектре дисциплин от химии до биологии рака18 до медицинской диагностики, но некоторые ограничения остаются. Основной проблемой является фотостабильность фторофоров. Поскольку FLIM требует записи большого количества фотонов, фотоотбеление уменьшает количество собранных фотонов и может изменить результирующую кривую распада. Кроме того, особенно в системе нематод, если интенсивность самого флюорофора не является достаточно высокой для достаточного количества фотонов, которые будут собраны, требуется более высокое возбуждение, что приводит к более быстрому фотоотбелеванию и ненадежной кривой распада. Наконец, техника требует сложного и дорогостоящего оборудования в качестве дополнения к уже существующим системам микроскопии, с одним критическим элементом является чувствительность детекторов19.
И наоборот, одним из главных преимуществ расчета продолжительности жизни флюорофора и его синтеза белка является то, что он предоставляет информацию о различных фракциях одного и того же фторофорно-белкового комплекса в различных состояниях взаимодействий в окружающей среде, независимо от его в значительной степени неизвестной концентрации. FLIM может быть использован также для измерения продолжительности жизни в любой фазе, газ, жидкость, или твердые и в любой среде или организме, которые могут быть нормально изображения, от клеток до организмов, и органеллы для обездвиженных, очищенных белков20. Методы микроскопии обычно опираются на устойчивое состояние изображения флуоресцентно помеченного белка. В отличие от методов устойчивого состояния, FLIM может разрешить изменения в связывании, составе и конформации биологического субстрата. Для исследования подверженных агрегации белков, наличие больших флуоресцентных включений или очагов можно легко отобразить, но они представляют собой только статический, основанный на интенсивности снимок3. В случае агрегированных видов, визуализированные очаги также могут вводить в заблуждение, так как высокая концентрация фторофора не обязательно приводит к сильному образованию амилоидов. Через FLIM вместо этого можно отличить растворимый от нерастворимого материала. Наконец, для любого исследования становится полезным получить как измерения на основе интенсивности, так и параллельные измерения продолжительности жизни. В дополняемости этих методов микроскопии лежит их сила.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Напряжение мышц-40-mRFP, предоставляемое CGC, которое финансируется NiH Управлением научно-исследовательских инфраструктурных программ (P40 OD010440). Нейрон-40-CFP был добрым подарком лаборатории Моримото. Мы признаем DFG (KI-1988/5-1 в JK, NeuroCure PhD стипендий по NeuroCure кластера передового опыта в MLP), EMBO (краткосрочные стипендии для MLP) и компании биологов (путешествия гранты CG и MLP) для финансирования. Мы также признаем, что центр расширенной световой микроскопии в Центре молекулярной медицины Макса Дельбрюка в Берлине предоставляет установку для изображения, построенного YFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
