Summary
Floresan yaşam boyu görüntüleme, proteinlerin yaşam, yaşlanma ve stresli C. elegans hastalık modellerinde toplama eğilimlerini ölçer, ölçer ve ayırt eder.
Abstract
Amiloid fibrils Huntington gibi nörodejeneratif hastalıkların bir dizi ile ilişkilidir, Parkinson, veya Alzheimer hastalığı. Bu amiloid fibrils endojen metastabil proteinlerin yanı sıra proteostaz ağı bileşenleri (PN) sequester ve bu nedenle hücrede protein misfolding şiddetlendirebilir. Bir hayvan içinde amiloid proteinlerin toplama sürecini değerlendirmek için araçlar sınırlı sayıda vardır. Floresan yaşam boyu mikroskopi (FLIM) için nöronlar gibi belirli hücrelerde amiloid fibrilizasyonun izlenmesine ve ölçülmesine olanak tanıyan bir protokol sayılarak, yaşlanmanın ilerlemesi ve PN. FLIM florofor ifade düzeylerinden bağımsızdır ve daha fazla boyama veya ağartma olmadan toplama işleminin analizini sağlar. Florofororlar amiloid yapıların yakın çevresinde olduklarında söndürülürler, bu da floresan ömrün azalmasına neden olur. Söndürme doğrudan amiloid proteininin agregasyonu ile ilişkilidir. FLIM, farklı amiloid proteinlerin fibrilizasyon sürecini karşılaştırmak için uygulanabilen çok yönlü bir tekniktir, çevresel uyaranlar, ya da in vivo genetik arka planlar non-invaziv bir şekilde.
Introduction
Protein toplama hem yaşlanma da hem de hastalıkta görülür. Büyük amiloidlerin veya amorf inklütiflerin oluşumuna ve birikmesine yol açan yolları takip etmek zordur ve kinetiklerinin çözülmesi de benzer şekilde zordur. Proteinler genetik hastalıklarda olduğu gibi kodlama sekanslarındaki içsel mutasyonlara bağlı olarak yanlış katlanabilirler. Proteinler de yanlış çünkü proteostaz ağ (PN) onları çözünür ve düzgün katlanmış tutar bozulmuş, yaşlanma sırasında olur. PN moleküler şaperonlar ve bozulma makineleri içerir ve biyogenez sorumludur, katlama, ticareti, ve proteinlerin bozulması1.
C. elegans kısa ömrü nedeniyle yaşlanma ve hastalık çalışma modeli olarak ortaya çıkmıştır, izojenik doğa, ve genetik manipülasyon kolaylığı. Hassas dokularda insan hastalığına neden olan proteinleri ifade eden çeşitli C. elegans transgenik suşları oluşturulmuştur. Daha da önemlisi, agregasyona eğilimli proteinler içeren suşların çoğu amiloid bozukluklarının damgasını, büyük inklütiflerin oluşumunu özetler. C. elegans 'şeffaf vücut sayesinde, bu agregalar invivo görselleştirilmiş olabilir, noninvaziv ve nondestructively2. Bir florofor ile füzyon ilgi herhangi bir protein (POI) üreten yerleri, kaçakçılık, etkileşim ağı ve genel kaderi araştırmak için izin verir.
Floresan yaşam boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) ile yaşayan ve yaşlanan C. elegans'de hastalığa neden olan proteinlerin toplanması nın izlenmesi için bir protokol sokulmaktadır. FLIM, emisyon spektrumlarından ziyade florofor ömrüne dayanan güçlü bir tekniktir. Yaşam süresi (tau, τ) bir fotonun heyecanlı durumundan yer durumuna geri çürümek için gerekli ortalama süre olarak tanımlanır. Belirli bir molekülün ömrü zaman-ilişkili tek foton sayma (TCSPC) zaman-etki alanı tekniği ile hesaplanır. TCSPC-FLIM'de floresan bozunma fonksiyonu, kısa, yüksek frekanslı lazer darbeleri ile floroforheyecan verici ve yayılan fotonun varış sürelerinin darbelerle ilgili olarak bir dedektöre göre ölçülmesi ile elde edilir. Bir örnek tararken, her piksel için üç boyutlu bir veri dizisi oluşturulur: dizi, x,y uzamsal koordinatlarındaki fotonların dağılımı ve zamansal bozunma eğrisi hakkında bilgiler içerir. Bu nedenle verilen bir örnek, proteinin yapısı, bağlanması ve çevre3,4. Her floresan protein, genellikle birkaç nanosaniye (ns) olan, fiziksel özelliklerine bağlı olarak içsel ve tam olarak tanımlanmış bir yaşam süresine sahiptir. Daha da önemlisi, bir florofor ömrü konsantrasyonu, floresan yoğunluğu ve görüntüleme metodolojisi bağımsızdır. Ancak, biyolojik bir sistem içinde, pH, sıcaklık, iyon konsantrasyonları, oksijen doygunluğu ve etkileşim ortakları gibi çevresel faktörlerden etkilenebilir. Yaşam ömürleri iç yapısal değişikliklere ve oryantasyona karşı da hassastır. Bir poi için bir florofor eritme ömrü nde bir değişiklik ve dolayısıyla erimiş proteinin davranışı hakkında bilgi sonuçlanır. Bir florofor, amiloid yapının antiparalel beta sayfaları gibi sıkıca bağlanmış bir ortamda çevrili veya kapsüllendiğinde, 5.5 Florofor un söndürülme, görünür ömrünün kısalmasıyla sonuçlanır. Çözündüğünde, bir proteinin ömrü orijinal, daha yüksek değerine daha yakın kalır. Buna karşılık, bir protein toplambaşlar, ömrü kaçınılmaz olarak daha düşük birdeğerekayacak 6,7. Bu nedenle, yaşayan C. elegansfarklı yaşlarda herhangi bir amiloid oluşturan proteinin toplama eğilimini izlemek mümkün olur.
Burada farklı poliglutamin (CAG, Q) uzanır (Q40, Q44 ve Q85) oluşan bir füzyon proteininin agregasyon analiz etmek için bir protokol açıklar. Tekniğin siyan floresan protein (CFP), sarı floresan protein (YFP) ve monomerik kırmızı floresan protein (mRFP) gibi farklı floroforlara nasıl eşit olarak uygulanabileceğini gösteriyoruz; ve C. eleganstüm dokularda , nöronlar da dahil olmak üzere, kaslar, ve bağırsak. Ayrıca, proteostaz bağlamında, FLIM moleküler şaperonların tükenmesi üzerine değişiklikleri gözlemlemek için çok yararlı bir araçtır. RNA girişim yoluyla önemli moleküler şaperon, ısı şok proteini 1(hsp-1)yıkmak proteinlerin erken yanlış bağlanmasına neden olur. Yaşlanma, hastalık veya eksik şaperonların bir sonucu olarak toplama yükündeki artış, daha sonra floresan yaşam süresinde bir azalma olarak ölçülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. eleganların senkronizasyonu
- Senkronize C. elegans ya alkali nhipoklorit çözeltisi tedavisi ile ya da basit yumurtlama yoluyla 4 saat 20 °C8.
- Standart prosedürlere göre OP50 E. coli ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM)plakalarıüzerinde 20 °C'de nematodyetiştirin ve bakımını yap. Yaş nematodlar istenilen gelişim aşaması veya güne kadar.
NOT: Bu protokolde genç yetişkinler 4.
2. RNAi aracılı refakat makineleri besleme yoluyla nakavt
NOT: Nematodlar10ilgili RNAi vektörbe besleyerek ısı şok proteini 1(hsp-1) şaperon knockdown gerçekleştirin. HSP-1 RNAi plazmidahringer kütüphanesinden elde edildi (klon kimliği: F26D10.3).
- 50 g/mL ampisilin içeren Luria Bertani (LB) ortamında 6 saat boyunca hsp-1 RNAi plazmidini ifade eden HT115 (DE3) E. coli'yi büyütün.
- İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) ve ampisilin (25 g/mL) içeren taze NGM agar plakaları ve hsp-1 RNAi bakterisi ile tohum hazırlayın. Tabakları kurumaya bırakın ve oda sıcaklığında 1-3 gün bekletin.
- Senkronize yumurtaları bir siRNA plakasına yerleştirin ve yumurtadan çıkmaya bırakın veya gravid nematodları yerleştirin ve çıkarmadan önce 20 °C'de 4 saat yumurtlayın. İstenilen yaş veya aşamaya kadar nematodlar büyümek.
NOT: İkinci nesil nematodlar nakavtın daha güçlü bir fenotipini ortaya çıkabilir. Burada açıklanan siRNA protokolü ve koşulları geneldir ve hsp1'euyarlanmıştır. Belirli bir klonun/genin siRNA ile RNA girişimlerinin son kullanıcı tarafından kurulması ve optimize edilmesi gerekir. Tüm siRNA'nın aynı verime sahip olmadığını ve bu nedenle de kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) veya Batı lekeleri ile darbenin etkinliğini nicel olarak test edilmesi tavsiye edilir.
3. Mikroskopi slaytlarının hazırlanması
- Görüntüleme gününde, görüntüleme slaytları hazırlayarak başlayın. % 3 (w / v) bir konsantrasyonda ddH2O eriyen agarose ve biraz soğumaya bırakın.
- 1 mL pipet ucunu kesin ve yaklaşık 200 μL erimiş agarose alın. Pipet temiz bir cam slayt üzerine agarose ve hemen üstüne ikinci bir yerleştirin, herhangi bir kabarcıkoluşumukaçınarak. Kurumaya bırakın ve üst teki cam kaydırağı nazikçe çıkarın. Sonuç nematodlar konumlandırılmış olacak eşit bir agarose yüzeyi ile bir cam slayt.
NOT: Her slayt 5-10 nematodlar arasında görüntü için kullanılacaktır. Slaytlar, agarose'un kurumasını önlemek için humified bir kutuda birkaç saat hazırlanabilir ve saklanabilir.
4. Nematodların mikroskopi slaytlarına montajı
NOT: FLIM nematodların hareketsiz hale getirilmesigerekir. Görüntüleme kurulumu (örn. mikroskoplar, lazerler, dedektörler) kullanıma hazır olduğunda bu adımı gerçekleştirin.
- Platin tel pick kullanarak, taze tohumsuz plaka üzerine istenilen yaş nematodları yerleştirin ve onları vücutlarından fazla OP50 bakteri kaldırmak için tarama izin.
- Nematod'u hareketsiz hale getirmek için anestezik bileşiği (sodyum azitveya levamisole) hazırlayın. 500 mM NaN3 stoğunu 4 °C'de karanlıkta tutun ve taze ddH2O'da 250 mM'lik son konsantrasyona seyreltin. Levamisole kullanıyorsanız, ddH2O'da 20 mM'lik bir stoğu 2 mM çalışma çözeltisine seyreltin.
DİkKAT: Sodyum azit (NaN3)son derece zehirlidir. Eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ve havalandırmalı bir başlık altında çalışın. - Stereomikroskop altında çalışarak, bir agarose ped üzerine 10 μL'lik bir anestezik bileşiği yerleştirin ve 5-10 nematod'u yavaşça içine aktarın. Nematodları ayırmak için kirpik ucu kullanın. Görüntü edinimi sırasında nematodların daha kolay yerelleştirilmesine olanak sağlamak için onları birbirine yakın tutun, ancak dokunmadan tutun.
- Dikkatle bir coverslip ile nematodlar bindirme. Montajdan sonra 1 saat içinde ölçümler alın.
NOT: Her iki anestezi sonunda C. elegansöldürecek . Nematodlar görüntüleme sırasında tamamen hareketsiz olmalıdır, çünkü yaşam süresinin haritası her pikselden kaydedilir. x,y parametrelerinin herhangi bir hareketi aynı heyecanlı pikselde ömür boyu okunmasını engeller.
5. FLIM verilerinin elde edilmesi
NOT: Bu protokolde florofor ömrü zaman alan TCSPC yöntemi ile elde edilir. FLIM bir dizi ve sabit tekrarlama hızında lazer tarafından oluşturulacak bir ışık darbesi gerektirir. Tekrarlama oranı lazer türüne göre değişir ve kullanıcı tarafından bilinmesi gerekir. Ömür boyu ölçümler, konvansiyonel mikroskopun yanına monte edilen dedektörler ve elektronik ekipmanlar la gerçekleştirilir. Bu protokolde, mRFP, CFP ve YFP ömürlerinin elde edilmesi için iki farklı şirket(Malzeme Tablosu)tarafından sağlanan dedektörler ve yazılımlarla üç farklı lazer tarama konfokal mikroskopüzerinde ölçümler yapılmaktadır. Emisyon/uyarma doğru filtreler yerinde olup olmadığını kontrol edin ve başlamadan önce herhangi bir arka plan veya monitör arka ışık en aza indirmek. Herhangi bir deneye başlamadan önce, seçilen florofor fotostabilitesi kurmak. Florofor nematod dokuları içinde kısa bir süre içinde beyazlıyorsa, C. elegans'taFLIM ölçümleri için uygun değildir.
- FLIM satın alma yazılımını açın. FLIM yazılımı aynı zamanda konfokal mikroskobun kontrolünü de sağlar. Dedektörün çıktılarının etkinleştirilmesiiçin sekmeyi/düğmeyi bulun ve Çıkışları Etkinleştir'ebasın.
- Enstrümantal kurulumun zamanlama hassasiyetini açıklayan enstrüman yanıt işlevini (IRF) edinin.
NOT: Bu adım nematodları monte etmeden önce tercihen yapılmalıdır.- Varsa, uyarma/emisyon filtrelerini çıkarın.
- Hedefin üzerine boş bir kapak kaydırıcını yerleştirin ve yüzeyini bulun. Kapak tan elde edilen dağılım sinyalini en az 30 s olarak kaydedin.
NOT: Birkaç nanosaniyelik ömürler boyunca, satın alma yazılımı Otomatik olarak IRF kaydırma tahmin edebilirsiniz. Bir IRF edinme her zaman önerilir.
- Slaytı monte edilmiş C. elegans ile sahneye yerleştirin. Şanzıman modunda 10x büyütme lensi kullanmak ve slayttaki nematodların konumunu yerelleştirin.
- Slaytı çıkarın, hedefi 63x büyütme merceği ile değiştirin ve gerekli daldırma ortamını (örn. yağ) uygulayın. Sahnedeki slaytı değiştirin ve nematodları yerelleştirin.
- Satın alma yazılımında Pinhole Yöneticisi'ni bulun ve Maksimum'aaçın. Numuneyi taramaya başlayın, ilgi çekici bir bölge seçin (örn. kafa, üst gövde) ve maksimum projeksiyon düzlemine odaklanın.
- Lazer darbe hızını ve yazılımın arabiriminde bulunan diğer üç değeri izleyin: Sabit Kesir Ayırıcı (CFD), Zaman-To-Genlik (TAC) ve Analog-to-Dijital Dönüştürücü (ADC).
NOT: Lazer 1 x 108 tek foton sayısı maksimum kapısı olmalıdır. Bu sayı lazer tarafından sağlanan en fazla foton sayısını temsil eder. CFD dedektör tarafından lazer darbe referans tek foton darbe alınması hakkında bilgi sağlar. Bu değer kabaca 1 x 105olmalıdır. TAC, bir fotonun tespit edildiği zaman ile bir sonraki lazer darbesi arasında ayrım yapıyor. Son olarak, ADC, TAC voltajını storable bellek sinyaline dönüştürür11. CFD, TAC ve ADC, florofor tarafından yayılan fotonların kaybolmamasını sağlamak için benzer değerlere sahip olmalıdır. Bu parametrelerin doğru değerlendirilmesi, doğru bir yaşam boyu haritası oluşturmak için yeterli sayıda foton toplanmasını sağlar. - FLIM yazılımının arabiriminde, algılanan fotonların sayısını önizleme: ADC değeri 1 x 104 ve 1 x 105arasında olmalıdır. Gerekirse, farklı bir düzlemde odak kayması veya daha fazla foton toplamak için lazer gücünü artırmak.
NOT: Genel olarak, saniyede kaydedilen foton sayısı lazerin tekrarlama oranının %1'ini geçmemelidir. - Menü çubuğunda, edinme parametrelerini ayarlamak için sekmeyi seçin. Tek bir foton algılamasına izin vermek için scan eşitle'yi seçin.
- Edinmeyi sabit bir zaman miktarına veya sabit sayıda fotona ayarlayın. Örneğin, 2 dakika boyunca veya tek bir piksel 2.000 tek olaydan oluşan bir foton sayısına ulaşana kadar ömür boyu çürüme eğrisi edinin. Satın almaya başlamak için Başlat'a basın.
NOT: Farklı floroforlar farklı uyarma ve emisyon lazerleri ve filtreler igerektirecektir. Örneğin parlaklığına göre lazer gücü de ayarlanabilir, bu da kullanım ömrünü etkilemez. Bu protokoller aşağıdaki uyarma/emisyon ayarlarını kullanır: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Ex800/em440 nm kullanılarak CFP ölçümleri için darbeli iki foton lazer kullanılmıştır. Bir FLIM haritasının edinimi için gereken süre ve foton sayısının her kurulum ve her deneysel amaç için ampirik olarak belirlenmesi gerekir.
6. FLIMfit yazılımı kullanılarak FLIM verilerinin analizi
NOT: Imperial College London12'de geliştirilen FLIMfit yazılım aracını kullanarak veri analizi yapın (Bkz. Şekil 1).
- Dosya üzerinden yazılım açın ve FLIM veri dosyalarını içe aktarma | FLIM Verilerini Yükleyin. Farklı seanslarda ve farklı biyolojik tekrarlardan elde edilebilse bile, tüm numuneleri tek bir koşuldan yükleyin.
- Gerekirse, Segmentasyon üzerinden herhangi bir FLIM resimden tek bir nematod segment | Segmentasyon Yöneticisi. Kırpma aracını vurgulanana kadar ilgi alanının etrafına sürükleyin. Tamamlandıktan sonra Tamam'abasın.
NOT: Tüm görüntüler için segmentasyon yapılmalıdır. - C. elegans'ın yoğunluk tabanlı görüntüsünün göründüğü küçük bir bölge seçin(Şekil 1, Oklar 1). Bu bölgenin bozunma eğrisi arabirimin sağ tarafındaki büyük bozunma penceresinde görünür(Şekil 1, Ok 2).
NOT: Bozunma doğrusal veya logaritma tiksintisi olarak görüntülenebilir. - 6.5-6.8 adımlarında açıklandığı gibi, yazılımın algoritması aracılığıyla kullanım ömrünü tahmin etmek için doğru parametreleri ayarlayın.
- Veri sekmesinde (Şekil 1, Ok 3):
- İyi bir uyum sağlamak için çok loş pikselleri hariç tutmak için rasgele bir Tümleşik Minimum değer ayarlayın. C. elegans örneğine bağlı olarak bu değer 40-300 arasında değişir. Tatmin edici bir önizleme elde edilene kadar farklı değerler girişi.
- FLIM sinyalini bu değerlerle sınırlamak için bir Time Min ve Time Max numarasını seçin. Bu eşikten önce ve sonra görünen tüm olaylar hariç tutulur.
NOT: Örneğin, mRFP analizi için, 800 ps önce ve 4.000 ps sonra olaylar hariç tutuldu. Bu değerler floroforun ömrüne bağlıdır ve son kullanıcı tarafından belirlenmelidir. - Önceden ayarlanmış Counts/Photon 1'i değiştirmeyin.
- Satın alma sırasında kullanılan lazerin MHz cinsinden TekrarLama Oranınıgirdi.
NOT: Mevcut protokol için farklı lazerler çeşitli tekrarlama oranları ile kullanılmıştır. CFP yaşam sürelerinin elde edilmesinde kullanılan iki foton lazer, 80 MHz tekrarlama oranına sahip, YFP için lazer 40 MHz'de tekrarlanır ve mRFP için değeri 78,01 MHz'dir. Bu değerler analiz edilen örneğe göre FLIMfit'e girilmiştir. - Tüm doymuş pikselleri hariç tutmak için Bir Gate Max değeri giriş kurun.
NOT: C. elegansyaşam boyu ölçümler için, bu değer herhangi bir büyük sayı (örneğin, 1 x 108)olarak ayarlanır.
- Ömür Boyu sekmesinde, kullanılacak genel bir montaj (örn. piksel açısından uygun bir montaj) seçin. Bkz. Şekil 1, Ok 4.
NOT: Piksel açısından bir montaj, her bir piksele monte edilmiş bir bozunma üretir. Görüntü açısından bir montaj, her bir görüntünün küresel bir şekilde takılması sağlar ve görüntü başına tek bir ömür boyu değer görüntüler. Küresel-bilge uydurma tüm veri seti boyunca tek bir uydurma üretecektir. Tüm görüntüler için tek bir yaşam boyu değer sağlanır. - No dışında başka bir parametre değiştirmeyin. Exp seçimi seçilen floresan çürüme multikonsonential olduğu ve tek bir ömürden daha fazla sergiler olduğu biliniyorsa.
NOT: Bu protokolde, bu işlev biexponential CFP florofor ömürleri hesaplamak için kullanılmıştır. - IRF menüsü üzerinden IRF yükleyin: IRF | Yük IRF. IRF değişimini tahmin etmek için IRF | Tahmin IRF Shift. IRF sekmesinde bir değer kümesi otomatik olarak görünür. Bu kurulduktan sonra, bu sekmenin diğer parametrelerini değiştirmeyin.
- Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, Fit Dataset (Şekil 1, Ok 5) tuşuna basın. Algoritma bozunma eğrisi için bir uyum üretecek ve her görüntü için bir ömür boyu değer oluşturacak.
NOT: Mavi bir çizgide vurgulanan ortaya çıkan sığması, tüm olaylarla çakışmalıdır. Tüm olaylar uyum boyunca hizalandığında iyi bir uyum elde edilir. - Yazılımın arabiriminin sağ üst menülerinde bulunan Parametreler sekmesini(Şekil 1, Ok 6) tıklatın ve İstatistik'i seçin: w_mean (ağırlıklı ortalama) ve chi2 değerinin mümkün olduğunca yakın olup olmadığını 1'e kontrol edin.
NOT: Bir yakın bir chi2 uyum doğruluğunu sağlar. Böylece seçilen görüntünün yaşam boyu değeri tau_1olarak ortaya edilir. - İlgi ni çeken herhangi bir bilgiyi dışa aktarma: Dosya | İhracat Yoğunluk Görüntüler / Fit Sonuç Tablosu / Görüntüler / Histogramlar. Kullanım ömrünü hesaplamak için kullanılan veri ayarlarını kaydetme: Dosya | Veri Ayarlarını Kaydet.
NOT: Kullanılan parametreler, seçili örneklerin gelecekteki analizi için kaydedilir.
7. FLIM verilerinin grafik gösterimleri
NOT: Farklı örneklerden toplanan yaşam ömürleri görsel olarak çeşitli şekillerde temsil edilebilir. Nanosaniye veya pikosaniye cinsinden yaşam boyu değerlerini belirtmek için seçin.
- Çürüme eğrisini doğrudan FLIMfit'ten dışa aktararak eğrinin kalitesini ve doğruluğunu gösterin.
- Foton sayısının sıklığını histogramdaki yaşam boyu değerine göre çizerek fotonların dağılımını temsil edin.
- Son olarak, istatistiksel karşılaştırma için, iki veya daha fazla örneği karşılaştırıyorsanız, yaşam boyu değerleri artı bir dağılım çizimi çubuğu grafiğine ortalamanın standart sapması yerleştirin. İstenilen istatistiksel analizleri yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol, hem doğal yaşlanma sırasında hem de strese maruz kaldığında, yaşayan C. elegans'tatoplanan türlerin oluşumunun nasıl doğru bir şekilde izlendiğini göstermektedir. 40Q, 44Q veya 85Q tekrarpoliglutamin proteinlerini ifade eden dört farklı transgenik nematod suşları seçtik. Bu proteinler farklı dokularda sentezlenir ve farklı floroforlara kaynaşır. C. elegans suşları ya vücut duvarı kaslarında Q40-mRFP ifade (mQ40-RFP), Sinir sisteminde Q40-CFP (nQ40-CFP), ve ya Q44-YFP veya Q85-YFP bağırsakta (iQ44-YFP ve iQ85-YFP)13. Yaşlanmanın toplanmayı nasıl desteklediğini göstermek için, bu polyQ suşlarının yaşam ömrünü genç nematodlarda, yaşamın 4. PN'deki bir eksikliğin etkilerini göstermek için mQ40-RFP ve nQ40 suşlarında hsp-1'in yıkılmasını gerçekleştirdik.
Yaşam boyu değerleri FLIMfit yazılımı ile ekstrapolated edildikten sonra, elde edilen veriler ya glutamin yükü, yaşlanma, ya da stres nedeniyle toplandığında polyQ yapılarının herhangi birinin ömründe belirgin bir azalma gösterdi. FLIM çözünür protein fraksiyonu ve birleştirilmiş türler arasında ayrım ve geçiş, yaşamlarında bir kayma kaydederek.
4. günde, mQ40-RFP ortalama floresan ömrü 1,69 ns olarak gösterilmiştir(Şekil 2). Yaşlanma üzerine, daha fazla birleştirilmiş türler ortaya çıktı, yaşam boyu görüntülerde düşük yaşam boyu fosi olarak ortaya çıkan ve histogramı azaltılmış yaşam sürelerine kaydırArak(Şekil 2A). Nematodların yaşı boyunca edinilmiş her görüntünün ortalama floresan ömrünü çizerek floresan ömründe önemli bir azalma ve dolayısıyla birleştirilmiş türlerin birikimi görünür hale geldi(Şekil 2B). PN protein katlama kapasitesi C. elegans14 yaşamın 4 gün sonra azaldı ve amiloid ve amorf agregalar halinde kümelemek için daha da yanlış agregasyon eğilimli proteinler. PN dışında, belirli bir proteinin içsel agregasyon propensities agrega oluşumunun ilerlemesinde önemli bir rol oynadı. Bu iQ44-YFP ve iQ85-YFP'nin davranışları karşılaştırılarak analiz edilmiştir. iQ85'in uzun Q-stretch'i agregasyona daha yatkındı ve yaşamın 4. gününde histogramda floresan ömür boyu değişim sergiledi(Şekil 3A). Aslında, 4. günde, iQ85 için foci oluşumu gözlendi, iQ44 hala yok iken. Yaşlanma üzerine, ancak, iQ44 da fosi oluşumu ve böylece azaltılmış floresan ömrü sergiledi. IQ85 zaten erken erişkinlikta agregasyon gösteren çünkü yaşlanma üzerine toplama ilerlemesi daha az belirgin, henüz önemli (Şekil 3B). Son olarak, nQ40-CFP suşunda fosi oluşumunu tespit etmedik ve floresan ömrünü nQ40-CFP'de azaltayapmadık (Şekil 4A). Bu tür için, yaşlanma üzerine ortalama floresan ömrü sadece ince, önemsiz değişiklikler vardı(Şekil 4B), potansiyel olarak nöronların henüz bilinmeyen nedenlerle daha az duyarlı olması nedeniyle.
HSP-1'in yıkılması, nematodları ifade eden mQ40 ve nQ40'ın PN'si için bir sorun teşkil eder. HSP-1'in RNAi aracılı tükenmesi agregasyonda önemli bir artışa yol açmıştır(Şekil 5 ve Şekil 6). Q40 vücut duvarı kasları ifade büyük fosi nonaggregated malzeme ile çevrili az sayıda oluşturmak eğilimindedir. Bu histogramlarda iki ayırt edilebilir zirveile sonuçlandı (yaklaşık 1.7 ns ve 1.4 ns, Bkz. Şekil 5A). Yaşlı ve RNAi tedavi nematodlar düşük yaşam boyu pik sonuçta ortalama floresan ömrü azalan güçlü bir artış gösterdi(Şekil 5B). Kaslarda Q40 bu biphasik davranış ile karşılaştırıldığında, nöronal Q40 daha çeşitli bir toplama davranışı gösterdi. Kas ekspresyonu suşlarında olduğu gibi fosi oluşumunu doğrudan toplama ile ilişkilendiremedik (Şekil 6A). FLIM toplama derecesini değerlendirmek için bir fırsat sunduğu için, histogramlar farklı bir tepe ama floresan yaşamları yaygın bir dağılım olduğunu ortaya koymuştur, farklı oligomerler ve yüksek sıra agregalar karmaşık bir bileşimi işaret. Yine de, toplam ın toplam derecesi ortalama floresan ömrü çizilerek değerlendirilebilir(Şekil 6B), hsp-1 nakavtının toplamada bir artışa yol açtığını gösterir.
Bir füzyon ortağından ve biyolojik sistemin dışında olmayan floroforların ömrünün daha yüksek olduğunu belirtmek önemlidir. Yaşam süresi öncelikle ortamından etkilendiği için, C. elegans dokularında YFP ve RFP'nin kullanım ömründe hafif bir azalma fark edildi. Bu nedenle uygun bir kontrol olarak nematod içinde çözünen İçN'nin ömrünü elde etmek önemlidir. Daha yüksek bir yaşam süresi ile çözünür fraksiyonu ve daha düşük bir ömür ile toplu fraksiyonu arasında bir karşılaştırma daha sonra yapılabilir. Burada, yaşam boyu azalma kas ve bağırsak hücreleri içinde görünür foci oluşumu ile ilişkili. Yine de, fosi bir kısmını floresan ömrü hiçbir azalma sergiledi (Şekil 2 ve Şekil 3, beyaz oklar bakınız). Bu özellik, füzyon yapısının sadece bir kısmının belirli bir spatiotemporal noktada nasıl toplanmış olabileceğini ve bağlı olmayan proteinin varlığını ve kullanılabilirliğini vurgular. Daha karmaşık bir senaryo nöronal Q40-CFP zorlanma soruşturma ortaya çıktı. CFP özünde iki farklı floresan ömrüne sahip. CFP Förster rezonans enerji transferi için ideal bir florofor iken (FRET)15 ölçümler, YFP ile birlikte, C. elegansagregaoluşumunu izlemek için istihdam etmek tavsiye edilmez.
Şekil 1: FLIMFit yazılım arabiriminin ekran görüntüsü. Floresan yaşam sürelerini hesaplamak için kullanılan yazılımın ekran görüntüsü. Pencere, ayarlar metinde açıklandığı gibi tanımlandıktan sonra arabirimi gösterir ve yaşam sürelerinin hesaplanması gerçekleştirilir. Numaralı oklar protokol içindeki belirli adımlara başvurur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kas Q40-RFP floresan yaşamları yaşla birlikte azalmıştır. (A) FLIMfit tarafından üretilen yaşamın 4. gün veya 8.gününde kaslı Q40-RFP'yi ifade eden C. elegans'ın temsili haritaları. Floresan yaşam ları, floresan yoğunluğu ve her ikisinin birleştirilmiş görüntüsü sağlanır. Ölçek çubukları = 25 μm. Histogramlar, analiz edilen tüm nematodlar için ölçülen yaşam sürelerinin dağılımını gösterir. (B) Bar, sırasıyla yaşamın 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İntekosun lösyan ömrü intestinal Q44-YFP ve intestinal Q85-YFP yaşla birlikte azalmıştır. (A) FLIMfit tarafından üretilen yaşamın 4. gün veya 8 gününde intestinal Q44-YFP veya intestinal Q85-YFP'yi ifade eden C. elegans'ın temsili haritaları. Floresan yaşam ları, floresan yoğunluğu ve her ikisinin birleştirilmiş görüntüsü sağlanır. Ölçek çubukları = 25 μm. Histogramlar, analiz edilen tüm nematodlar için ölçülen yaşam sürelerinin dağılımını gösterir. (B) Bar, sırasıyla yaşamın 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nöronal Q40-CFP'nin floresan ömürleri yaşla birlikte değişmedi. (A) C. elegans FLIMfit tarafından üretilen yaşamın 4. Floresan yaşam ları, floresan yoğunluğu ve her ikisinin birleştirilmiş görüntüsü sağlanır (ikinci yaşam süresi, τ2, tüm örneklerde gösterilir). Ölçek çubukları = 25 μm. Histogramlar, analiz edilen tüm nematodlar için ölçülen yaşam sürelerinin dağılımını gösterir. (B) Bar, sırasıyla yaşamın 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kas Q40-RFP floresan ömürleri hsp-1nakavt üzerine azaldı . (A) FLIMfit tarafından üretilen yaşamın 4. gün veya 8.gününde kaslı Q40-RFP'yi ifade eden C. elegans'ın temsili haritaları. Floresan ömrü ve yoğunluk haritasının birleştirilmesi görüntülenir. Her iki zaman puanı için de boş bir vektörü (kontrolü) ifade eden bakteriler üzerinde büyüyen nematodlar veya hsp-1 RNAi yapısını ifade eden bakteriler gösterilir. Ölçek çubukları = 25 μm. Histogramlar, analiz edilen tüm nematodlar için ölçülen yaşam sürelerinin dağılımını gösterir. (B) Bar, sırasıyla kontrol veya hsp-1 RNAi ile yaşamın 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Nöronal Q40-CFP floresan yaşamları hsp-1nakavt üzerine azaldı . (A) C. elegans FLIMfit tarafından üretilen yaşamın 4. Floresan ömrü ve yoğunluk haritasının birleştirilmesi görüntülenir. Gösterilen nematodlar boş bir vektörü (kontrol) veya hsp-1 RNAi yapısını ifade eden bakteriler üzerinde yetiştiler. Ölçek çubukları = 25 μm. Histogramlar, analiz edilen tüm nematodlar için ölçülen yaşam sürelerinin dağılımını gösterir. (B) Kontrol RNAi veya hsp-1 RNAi ile, 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol, C. elegans model sistemindeki birleştirilmiş türleri tanımlamak için mikroskopi tabanlı bir tekniği tanımlar. FLIM, floresan yaşam larındaki çürümelerinin ölçümü yoluyla bir florofora kaynaşmış hem birakadar hem de çözünen türlerin varlığını doğru bir şekilde karakterize edebilir. Bir füzyon proteini toplama başladığında, kayıtlı ortalama ömrü daha yüksek bir değerden daha düşük bir değere kayacaktır16. Toplama eğilimi daha sonra ömür boyu düşüş tarafından çıkarılabilir: düşük ömür, sistemde toplanan protein türlerinin varlığı daha yüksek. Bu nedenle, herhangi bir proteinin toplama eğilimi üzerinde yaşlanma, hastalık veya PN bozulması etkilerini takip etmek mümkün olur.
Tekniğin çok yönlülüğünü vurgulamak için, sonuçlarımız FLIM'in doku veya floroforne bakılmaksızın çeşitli polyQ yapılarının yapısındaki değişiklikleri tanımlayabileceğini açıkça göstermiştir. Daha da önemlisi, FLIM zaten başarıyla C. elegansiçinde diğer toplama eğilimli proteinlerin karakterizasyonu uygulanmıştır , α-synuclein gibi17. Ayrıca, C. elegans herhangi bir stres faktörü uygulamak ve herhangi bir PoI açılmak ve toplama takip etmek mümkün olur. Osmotik, metal-iyon, redoks veya kimyasal stres, FLIM kullanan C. elegans'ta başarılı bir şekilde izlenebilen toksik dengesizlikleri teşvik edebilir. Tersi de mümkün olabilir: yararlı bileşiklerin varlığı veya PN artırılması nedeniyle toplama ve hatta ayrışma bir gecikme, protein kurtarma ve bunun sonucunda ömür boyu artış neden olabilir.
FLIM yaygın kimya kanser biyolojisi18 tıbbi tanı için disiplinlerin geniş bir yelpazede herhangi bir maddenin yaşam boyu değişiklikleri izlemek için istihdam edilmiştir, ancak bazı sınırlamalar kalır. Ana sorun floroforların fotostabilitesidir. FLIM çok sayıda fotonun kaydını gerektirdiğinden, fotobeyaztma toplanan foton sayısını azaltır ve ortaya çıkan çürüme eğrisini değiştirebilir. Ayrıca, özellikle nematod sistemi içinde, florofor kendisi yeterince fotonların toplanması için yeterince yüksek değilse, daha yüksek bir uyarma gereklidir, hızlı fotobeyazrlama ve güvenilmez bir çürüme eğrisi yol. Son olarak, teknik önceden varolan mikroskopi sistemlerine eklentiler olarak sofistike ve pahalı ekipman gerektirir, bir kritik eleman dedektörlerin hassasiyeti olmak19.
Buna karşılık, bir florofor ve füzyon proteininin yaşam süresini hesaplamanın en önemli avantajlarından biri, büyük ölçüde bilinmeyen konsantrasyonuna bakılmaksızın, çevresi içindeki çeşitli etkileşim durumlarında aynı florofor-protein kompleksinin farklı fraksiyonları hakkında bilgi sağlamasıdır. FLIM ayrıca herhangi bir faz, gaz, sıvı veya katı ve normalde görüntülenebilir herhangi bir ortam veya organizmada yaşam ölçmek için kullanılabilir, hücrelerden organizmalara, ve organeller immobilize, saflaştırılmış proteinler20. Mikroskopi teknikleri genellikle floresan etiketli bir proteinin sabit durum görüntülemesi üzerine dayanır. Sabit durum tekniklerinin aksine, FLIM biyolojik bir substrat bağlama, bileşim ve konformasyondaki değişiklikleri çözebilir. Toplama eğilimli proteinleri araştırmak için, büyük floresan inklüetlerin veya fokların varlığı kolayca görüntülenebilir, ancak bunlar yalnızca statik, yoğunluk tabanlı bir anlık görüntü3'ütemsil eder. Birleştirilmiş türler söz konusu olduğunda, yüksek florofor konsantrasyonu güçlü amiloid oluşumuna yol oluşturmadığı için, görselleştirilmiş fosi de yanıltıcı olabilir. FLIM ile çözünür maddeden çözünür ayırt etmek mümkündür. Son olarak, hem yoğunluk tabanlı ölçümleri hem de paralel yaşam boyu ölçümü elde etmek herhangi bir araştırma için yararlı olur. Bu mikroskopi tekniklerinin tamamlayıcılığı içinde onların gücü yatıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanan kas-Q40-mRFP suşu. Nöronal-Q40-CFP Morimoto Lab bir tür hediye oldu. Biz DFG (KI-1988/5-1 JK, NeuroCure Doktora Bursu MLP için Mükemmellik NeuroCure Küme tarafından), EMBO (MLP kısa vadeli burs) ve Biyologlar Şirketi (CG ve MLP seyahat hibe) finansman için kabul. Ayrıca, YFP'nin inşalarının görüntülenmesi için kurulum sağlamak için Berlin'deki Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi'ndeki Gelişmiş Işık Mikroskobu görüntüleme tesisini de kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
