Summary
荧光寿命成像监测器，定量和区分蛋白质在生活、衰老和压力的C.elegans疾病模型中的聚集趋势。
Abstract
淀粉样纤维与一些神经退行性疾病有关，如亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症或阿尔茨海默氏症。这些淀粉样蛋白纤维能隔离内源性转移稳定蛋白以及蛋白酶网络（PN）的成分，从而加剧细胞中的蛋白质错折叠。可用于评估动物体内淀粉样蛋白聚集过程的工具数量有限。我们提出了荧光寿命显微镜（FLIM）的协议，允许监测和定量特定细胞（如神经元）中的淀粉样蛋白纤维化，以非侵入性的方式，随着老化的进展和扰动PN。FLIM 独立于荧光道的表达水平，能够分析聚合过程，而无需任何进一步的染色或漂白。当荧光波在淀粉样结构附近时，荧光波会发出淬火，从而导致荧光寿命的缩短。淬火与淀粉样蛋白的聚合直接相关。FLIM 是一种多功能技术，可应用于以非侵入性方式比较不同淀粉样蛋白、环境刺激或体内遗传背景的纤维化过程。
Introduction
蛋白质聚集发生在衰老和疾病。导致大型淀粉样蛋白或非晶体内含物形成和沉积的路径难以遵循，它们的动力学同样难以解开。蛋白质可能由于编码序列中的内在突变而错折叠，如遗传疾病。蛋白质也折叠不当，因为保持蛋白质解病网络（PN）保持其可溶性和正确折叠是受损的，就像老化期间一样。PN包括分子护护和降解机，负责蛋白质的生物成因、折叠、贩运和降解1。
由于寿命短、等源性以及易于遗传操作，Elegans已成为研究衰老和疾病的模型。几种在脆弱组织中表达人类致病蛋白质的C.elegans转基因菌株已经产生。重要的是，许多含有容易聚集的蛋白质的菌株重述淀粉样蛋白紊乱的特征，即大内含物的形成。多亏了C.elegans的透明身体，这些骨料可以在体内、非侵入性和非破坏性2中可视化。与氟磷融合产生任何感兴趣的蛋白质 （POI） 可以调查其位置、贩运、交互网络和一般命运。
我们通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）来监测生命和衰老C.elegans中致病蛋白的聚集情况。FLIM 是一种基于荧光素寿命的强大技术，而不是其发射光谱。生存期（tau，*）定义为光子从兴奋状态衰减到其接地状态所需的平均时间。给定分子的寿命使用时间相关单光子计数 （TCSPC） 的时域技术计算。在TCSPC-FLIM中，荧光衰减功能是通过用短、高频激光脉冲刺激荧光光，并测量发射的光子到达时间到探测器的脉冲。扫描样本时，会为每个像素创建一个三维数据数组：数组包括有关光子在其x、y空间坐标及其时间衰减曲线中的分布的信息。因此，给定的样本成为揭示蛋白质结构、结合和环境信息,的终身图。每个荧光蛋白都有内在和精确定义的寿命，通常只有几纳秒（ns），取决于其物理化学性质。重要的是，荧光磷的寿命与其浓度、荧光强度和成像方法无关。然而，在生物系统中，它受到环境因素的影响，如pH、温度、电子浓度、氧饱和度及其相互作用伙伴。使用寿命对内部结构变化和方向也十分敏感。将荧光磷与POI融合会导致其寿命发生变化，从而提供有关融合蛋白行为的信息。当荧光波被包围或封装在紧密结合的环境中，如淀粉样蛋白结构的反平行β片时，它非辐射性地失去能量，这个过程称为淬火5。荧光道的淬火导致其明显寿命缩短。当可溶性时，蛋白质的寿命将更接近其原始、更高的价值。相反，当蛋白质开始聚集时，其寿命将不可避免地转移到较低的值66，7。7因此，在活的C.elegans的不同年龄监测任何淀粉样蛋白的聚集倾向成为可能。
在这里，我们描述了一种协议，用于分析融合蛋白的聚合，该蛋白包含不同的多谷氨酰胺（CAG，Q）拉伸（Q40、Q44和Q85）。我们说明了该技术如何同样应用于不同的荧光蛋白，如青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和单体红荧光蛋白（mRFP）;和在C.elegans的所有组织中，包括神经元、肌肉和肠道。此外，在蛋白酶的上下文中，FLIM是观察分子护工消耗时变化的非常有用的工具。通过RNA干扰击倒关键分子伴之一，热休克蛋白1（hsp-1）会产生蛋白质过早的误折叠。由于老化、疾病或陪护器不足而增加的聚合载荷，然后作为荧光寿命的缩短来衡量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. 埃勒甘的同步
- 通过碱性次氯酸盐溶液处理或通过简单的卵子在20°C8下铺4小时，同步C.elegans。
- 根据标准程序9，在用OP50大肠杆菌种子的线虫生长介质（NGM）板上生长并保持线虫在20°C。将线虫老化到所需的发育阶段或一天。
注意：在这个协议中，年轻人在第4天被成像，旧线虫在生命的第8天被成像。
2. RNAi 通过喂食对伴郎机械进行敲击
注：通过将相应的RNAi载体喂给线虫10，对热冲击蛋白1（hsp-1）的伴子进行击倒。hsp-1 RNAi 质粒是从 Ahringer 库（克隆 ID：F26D10.3）获得的。
- 生长HT115 （DE3）大肠杆菌，在 Luria Bertani （LB） 介质中，在含有 50 μg/mL 氨基霉素的介质中，将hsp-1 RNAi 质粒表达 6 小时到过夜。
- 准备含有同丙基β-D-1-硫酰氨基（IPTG;1 mM）和氨基霉素（25微克/米L）和含有hsp-1 RNAi细菌的种子的新鲜NGM agar板。将板晾干，并在室温下诱导 1-3 天。
- 将同步的卵子放在siRNA板上，然后离开孵化，或放置肉汁线虫，允许在20°C下产卵4小时，然后再取出。长线虫，直到所需的年龄或阶段。
注：第二代线虫可能呈现更强烈的击倒表型。此处描述的 siRNA 协议和条件是一般性的，并适应hsp1。通过特定克隆/基因的siRNA的RNA干扰需要由最终用户建立和优化。需要注意的是，并非所有siRNA都具有相同的效率，因此建议通过定量反向转录聚合酶链反应（RT-qPCR）或西式斑点进行定量定量测试击倒的功效。
3. 准备显微镜幻灯片
- 在成像当天，首先准备成像幻灯片。在 ddH2O 中熔化琼脂，浓度为 3%（w/v），稍稍冷却。
- 切掉 1 mL 移液器尖端的尖端，取大约 200 μL 的熔融琼脂。将阿加松移到干净的玻璃滑道上，并立即将第二个滑道放在顶部，避免形成任何气泡。待干燥并轻轻取下顶部玻璃滑块。结果是一个玻璃幻灯片与均匀的琼脂表面，线虫将被定位。
注：每张幻灯片将用于在 5-10 线线之间成像。幻灯片可以准备和储存几个小时在一个腐殖质的盒子，以防止琼脂干涸。
4. 将线虫安装到显微镜幻灯片上
注：FLIM要求线虫被固定。一旦成像设置（例如显微镜、激光器、探测器）可供使用，即可执行此步骤。
- 使用铂线采摘，将所需年龄的线虫放在一个新的非种子板上，让他们爬行，从他们体内去除多余的OP50细菌。
- 准备麻醉化合物（氧化钠或列维索）以固定线虫。在 4 °C 的暗中保持 500 mM NaN3库存，并在新鲜的 ddH2O 中稀释至最终浓度为 250 mM。如果使用 levamisole，在 ddH2O 中将 20 mM 库存稀释为 2 mM 工作溶液。
注意：氧化钠（NaN3）是剧毒的。使用手套和防护眼镜，在通风罩下工作。 - 在立体显微镜下工作，将10μL的麻醉化合物滴放在琼脂垫上，轻轻将5-10线虫转移到其中。使用睫毛尖端分隔线虫。将它们紧密地放在一起，但不接触，以便在图像采集期间更轻松地定位线虫。
- 小心地用盖玻片覆盖线线。安装后在 1 小时内进行测量。
注：两种麻醉剂最终将杀死C.埃勒根。线虫在成像过程中必须完全不可移动，因为生存期的地图是从每个像素记录的。x、y参数的任何移动都阻止在同一激发像素下读取生存期。
5. 获取 FLIM 数据
注：在此协议中，氟磷的寿命通过时域 TCSPC 方法获得。FLIM 要求激光以一组和恒定的重复率生成光脉冲。重复率因激光类型而异，用户需要知道。使用传统显微镜安装的探测器和电子设备可实现终身测量。在该协议中，测量在三个不同的激光扫描共聚焦显微镜上进行测量，分别由两个不同的公司（材料表）提供探测器和软件，用于获取mRFP、CFP和YFP寿命。检查正确的发射/激励滤镜是否到位，并在启动前最小化任何背景或监控背光。在开始任何实验之前，确定所选荧光波的光稳定性。如果荧光磷在线虫组织内在短时间内漂白，则不适合在C.elegans中进行FLIM测量。
- 打开 FLIM 获取软件。FLIM 软件还允许控制共聚焦显微镜。找到选项卡/按钮以启用探测器的输出，然后按"启用输出"。
- 获取仪器响应功能 （IRF），该功能描述了仪器装置的时序精度。
注：在安装线虫之前，最好执行此步骤。- 如果可用，请拆下激励/发射过滤器。
- 将空盖玻片放在目标上方并查找其表面。记录从盖玻片获得的散射信号至少 30 s。
注：对于几纳秒的使用寿命，采集软件可以自动估计 IRF 偏移。始终建议获取 IRF。
- 将带有安装的 C. elegans 的幻灯片放在舞台上。在传输模式下使用 10 倍放大镜，并本地化滑道上的线虫位置。
- 拆下幻灯片，将目标切换到 63 倍放大镜，并应用所需的浸入介质（例如机油）。替换舞台上的幻灯片并本地化线虫。
- 在采集软件上找到针孔管理器，并将其打开至最大值。开始扫描样本，选择感兴趣的区域（例如头部、上半身），并专注于其最大投影平面。
- 监控激光脉冲速率和软件接口上存在的三个其他值：恒定分数鉴别器（CFD）、振幅时间（TAC） 和模拟到数字转换器（ADC）。
注： 激光的最大门应为 1 x 108单个光子计数。此数字表示激光提供的光子的最大数量。CFD 提供有关通过探测器参考激光脉冲接收单个光子脉冲的信息。此值应约为 1 x 105。TAC 区分检测到一个光子的时间和下一个激光脉冲。最后，ADC将TAC电压转换为可存储器信号11。CFD、TAC 和 ADC 都应具有类似的值，以确保氟磷发出的光子不会丢失。正确评估这些参数可确保收集足够的光子以创建准确的生存期贴图。 - 在 FLIM 软件的界面上，预览检测到的光子数量：ADC 值应介于 1 x 104和 1 x 105 之间。如有必要，将焦点转移到不同的平面上，或增加激光功率以收集更多的光子。
注：通常，每秒记录的光子数量不应超过激光重复率的 1%。 - 在菜单栏中，选择选项卡以设置采集参数。选择扫描同步以允许单光子检测。
- 将采集设置为固定的时间量或固定数量的光子。例如，获取生存期衰减曲线 2 分钟，或直到单个像素达到 2，000 个单个事件的光子计数。按"开始"开始采集。
注：不同的荧光源需要不同的激励和发射激光器和过滤器。根据样品的亮度，激光功率也可以调整，不会干扰寿命。这些协议使用以下激励/发射设置：YFP ex500/em520-50 nm，mRFP ex561/em580-620 nm。使用 ex800/em440 nm 进行 CFP 测量时使用了脉冲双光子激光器。需要为每个设置和每个实验目的建立获取 FLIM 地图所需的时间和光子计数量。
6. 使用 FLIMfit 软件分析 FLIM 数据
注：使用伦敦帝国学院12开发的 FLIMfit 软件工具进行数据分析（参见图 1）。
- 打开软件并通过文件导入 FLIM 数据文件 |加载 FLIM 数据。加载一个条件中的所有样品，即使在不同的会话和从不同的生物重复获得。
- 如有必要，通过分割从任何 FLIM 图片中分割单个线虫|分段管理器。围绕感兴趣区域拖动裁剪工具，直到突出显示。完成后，按"确定"。
注：必须对所有图像进行分割。 - 选择出现C. elegans基于强度的图像的小区域（图 1，箭头 1）。该区域衰减曲线将显示在界面右侧的大衰变窗口中（图 1，箭头 2）。
注： 衰减可以线性显示或以对数方式显示。 - 设置正确的参数，以便通过软件的算法推断生存期，如步骤 6.5-6.8 中所述。
- 在"数据"选项卡上（图 1，箭头 3）：
- 设置任意的"集成最小值"以排除任何太暗而无法产生良好拟合的像素。根据C. elegans样本，此值从 40-300 不等。输入不同的值，直到达到令人满意的预览。
- 选择时间最小值和时间最大值，将 FLIM 信号限制为这些值。将排除在此阈值之前和之后出现的所有事件。
注：例如，对于 mRFP 的分析，排除了 800 ps 之前和 4，000 ps 之后的事件。这些值取决于荧光器的生存期，需要由最终用户确定。 - 请勿更改预设的计数/光子1。
- 输入采集过程中使用的激光的重复率（以MHz为单位）。
注：对于目前的协议，使用不同的激光器与不同的重复率。用于采集CFP寿命的两个光子激光具有80兆赫的重复率，YFP激光在40兆赫时重复，mRFP的重复率为78.01 MHz。根据分析的样本，这些值被输入到FLIMfit中。 - 输入门最大值以排除所有饱和像素。
注： 对于C. elegans的生命周期测量，此值设置为任何大数（例如，1 x 108）。
- 在"生存期"选项卡上，选择要使用的全局拟合件（例如，像素拟合）。参见图 1，箭头 4。
注：像素拟合将产生贴切到每个单个像素。图像拟合将生成每个单个图像的全局拟合，并显示每个图像的单个生存期值。全局拟合将在整个数据集中生成单个拟合。为所有图像提供单个生存期值。 - 除No.如果已知所选荧光衰变是多指数的，并且表现出超过一个寿命，则 Exp 选择。
注：在本协议中，此函数用于计算双指数 CFP 荧光磷的使用寿命。 - 通过 IRF 菜单上传 IRF： IRF |负载 IRF.要估计 IRF 移位，请选择IRF |估计 IRF 移位。IRF选项卡上将自动显示一组值。建立此选项后，不要更改此选项卡的任何其他参数。
- 设置所有参数后，按"拟合数据集"（图 1，箭头 5）。该算法将生成适合衰减曲线的算法，并为每个图像建立生存期值。
注： 生成的拟合（以蓝线突出显示）应与所有事件重叠。当所有事件沿配合对齐时，获得良好的配合。 - 单击位于软件界面右上角菜单中的参数选项卡（图 1，箭头 6），然后选择"统计：w_mean（加权平均值）并检查chi2值是否尽可能接近 1。
注： 接近一个的 chi2可确保配合的准确性。因此，所选图像的生存期值以tau_1的形式显示。 - 导出任何感兴趣的信息：文件 |导出强度图像/拟合结果表/图像/直方图。保存用于计算生存期的数据设置：文件|保存数据设置。
注： 所使用的参数将被保存，以便将来分析所选样本。
7. FLIM 数据的图形表示
注： 从不同样本收集的生存期可以以不同的方式直观地表示。选择该选择以纳秒或 pco 秒表示生存期值。
- 通过直接从 FLIMfit 导出衰变曲线来显示拟合的质量和曲线的精度。
- 通过在直方图中绘制光子计数的频率和生存值来表示光子的分布。
- 最后，为了进行统计比较，如果比较两个或多个样本，则在散点图条图中放置生存值加上平均值的标准差。执行任何所需的统计分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议展示了如何准确监测在生物的C.elegan人中聚合物种的形成，无论是在自然老化期间还是在承受压力时。我们选择了四种不同的转基因线虫菌株，用于表达40Q、44Q或85Q重复的多谷氨酰胺蛋白。这些蛋白质在不同的组织中合成，并融合到不同的荧光波中。C. elegans菌株要么在体壁肌肉 （mQ40-RFP） 中表示 Q40-mRFP，在神经系统（nQ40-CFP）中表达 Q40-CFP，要么在肠道中 Q44-YFP 或 Q85-YFP（iQ44-YFP 和 iQ85-YFP）13。为了说明衰老如何促进聚合，我们收集了年轻线虫的这些多Q菌株的终生，在生命的第4天，和老线虫，在第8天。为了显示 PN 缺陷的影响，我们在 mQ40-RFP 和 nQ40 菌株中进行了hsp-1的击倒。
一旦通过 FLIMfit 软件推断寿命值，获得的数据显示，由于谷氨酰胺负载、老化或应力，聚合时，任何聚Q构造的生命周期明显减少。FLIM通过记录其寿命的变化，区分可溶性蛋白质分数和聚合物种及其过渡。
在第 4 天，mQ40-RFP 的平均荧光寿命为 1.69 ns（图 2）。老化后，出现更聚合的物种，在生命图像中显示为低寿命的foci，并将直方图转移到寿命缩短（图2A）。通过绘制线虫年龄内每个获得的图像的平均荧光寿命，荧光寿命显著缩短，因此聚合物种的积累变得可见（图2B）。PN的蛋白质折叠能力在C.elegans14生命的第4天后下降，而容易聚集的蛋白质进一步被误折叠成淀粉样蛋白和非晶态骨料。除PN外，某种蛋白质的内在聚合倾向在聚集形成的进展中起着重要的作用。通过比较iQ44-YFP和iQ85-YFP的行为来分析这一点。iQ85的较长Q拉伸更容易聚集，并且在生命的第4天已经出现荧光寿命变化（图3A）。事实上，在第4天，为iQ85观测到foci形成，而在iQ44中仍然不存在。然而，当老化时，iQ44也表现出foci形成，从而减少荧光寿命。由于iQ85在成年早期就已经显示出聚合体，因此在衰老时聚合的进展不太明显，但显著性（图3B）。最后，我们没有检测到在nQ40-CFP应变中形成，也没有减少荧光寿命（图4A）。对于这种菌株，在老化时平均荧光寿命只有细微的、非显著的变化（图4B），这可能是由于神经元由于未知的原因不太容易受到影响。
击倒hsp-1对 mQ40 和 nQ40 表示线虫的 PN 提出了挑战。RNAi 介导的hsp-1损耗导致聚合显著增加（图 5和图6）。Q40表示在体壁肌肉往往形成少量的大皮，周围非聚合物质。这导致直方图中出现两个可区分的峰值（约 1.7 ns 和 1.4 ns，参见图 5A）。老年人和RNAi治疗线虫在低寿命峰值中表现出强劲增长，最终减少了平均荧光寿命（图5B）。与肌肉中Q40的这种双相行为相比，神经元Q40表现出更加多样化的聚集行为。我们不能直接关联foci形成与聚合，如在肌肉表达应变（图6A）。由于FLIM提供了一个评估聚合程度的机会，直方图显示，没有明显的峰值，但荧光寿命的广泛分布，指向不同寡聚物和高阶聚合的复杂组成。尽管如此，通过绘制平均荧光寿命（图6 B），可以评估聚合的总体程度（图6B），表明hsp-1的击倒导致了聚合的提升。
需要注意的是，无聚变伙伴和生物系统外部的氟脑生物的使用寿命更高。由于生命周期主要受其环境影响，因此在 C. elegans组织中，YFP 和 RFP 的寿命略有缩短。因此，重要的是获得可溶性POI在线虫内的使用寿命作为适当的控制。然后，可以比较寿命较高的可溶性分数和寿命较低的聚合分数。在这里，寿命的减少与肌肉和肠道细胞内可见肌的形成有关。尽管如此，一小部分的烟叶没有减少荧光寿命（参见图2和图3，白色箭头）。此功能突出显示了如何在特定时空点聚合融合构造的一部分，以及未绑定蛋白质的存在和可用性。神经元Q40-CFP菌株的调查出现了更复杂的情况。CFP本质上拥有两种独特的荧光寿命。虽然 CFP 是 Fürster 共振能量转移 （FRET）15测量的理想荧光波，结合 YFP，不建议将其用于监测C. elegans中的聚合体形成。
图 1：FLIMFit 软件界面的屏幕截图。用于计算荧光寿命的软件的屏幕截图。窗口描述在文本中定义设置并执行生存期计算后接口。编号箭头是指协议中的特定步骤。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：肌肉Q40-RFP的荧光寿命随年龄下降。（A） 代表地图的C. elegans表达肌肉 Q40-RFP 在生命的第 4 天或第 8 天由 FLIMfit 生成。提供荧光寿命、荧光强度和两者合并的图像。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图分别显示生命第 4 天或第 8 天所有分析动物的加权平均荧光寿命。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：肠道Q44-YFP和肠道Q85-YFP的荧光寿命随年龄下降。（A） 代表地图的C. elegans表达肠道Q44-YFP或肠道Q85-YFP在生命的第4天或第8天由FLIMfit产生。提供荧光寿命、荧光强度和两者合并的图像。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图分别显示生命第 4 天或第 8 天所有分析动物的加权平均荧光寿命。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：神经元Q40-CFP的荧光寿命不随年龄变化而变化。（A）代表的 C. elegans表达神经元 Q40-CFP 在 FLIMfit 生成的生命的第 4 天或第 8 天。提供荧光寿命、荧光强度和两者合并的图像（所有样本中都指示第二个生存期 +2）。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图分别显示生命第 4 天或第 8 天所有分析动物的加权平均荧光寿命。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：肌肉Q40-RFP的荧光寿命在hsp-1击倒后减少。（A） 代表地图的C. elegans表达肌肉 Q40-RFP 在生命的第 4 天或第 8 天由 FLIMfit 生成。将显示荧光寿命和强度图的合并。在这两个时间点，线虫生长在细菌表示一个空载体（控制）或细菌表示hsp-1RNAi构造。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图分别显示生命第 4 天或第 8 天所有分析动物的加权平均荧光寿命，分别具有对照或hsp-1 RNAi。请点击此处查看此图形的较大版本。
图6：神经元Q40-CFP的荧光寿命在hsp-1下击后减少。（A）代表的 C. elegans表达神经元 Q40-CFP 在 FLIMfit 生成的生命的第 4 天。将显示荧光寿命和强度图的合并。显示的线虫生长在表达空载体（控制）的细菌或表达hsp-1 RNAi构造的细菌上。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图显示所有被分析动物在第 4 天的加权平均荧光寿命，控制 RNAi 或hsp-1 RNAi。请点击此处查看此图形的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
此处介绍的协议描述了一种基于显微镜的技术，用于识别C. elegans模型系统中的聚合物种。FLIM可以通过测量荧光寿命衰变，准确描述融合到荧光磷的聚合和可溶性物种的存在。当融合蛋白开始聚合其记录的平均寿命将从更高值转移到较低的值16。然后，聚合的倾向可以通过寿命的下降来推断：寿命越低，系统中聚合蛋白物种的存在就越高。因此，有可能跟随PN的老化、疾病或损伤对任何蛋白质的聚集倾向的影响。
为了突出该技术的多功能性，我们的结果表明，FLIM 能够识别各种聚Q结构的结构变化，而不管组织或荧光波。重要的是，FLIM已经成功地应用于C.elegans中其他容易聚集的蛋白质的表征，如β-核核素17。此外，可以将任何应力因子应用于C. elegans，并遵循任何 POI 的展开和聚合。渗透、金属电、氧化还原或化学应力都可促进毒性失衡，在使用FLIM的C.elegans中可以成功地监测这些不平衡。反过来也是可能的：由于存在有益化合物或增强PN而延迟聚合甚至分解，可能导致蛋白质的抢救，并随之延长寿命。
FLIM被广泛用于监测从化学到癌症生物学18到医学诊断等广泛学科中任何物质的寿命变化，但仍存在一些局限性。一个主要问题是荧光波的光稳定性。由于 FLIM 需要记录大量光子，光漂白会减少收集的光子数量，并可以更改由此产生的衰变曲线。此外，特别是在线虫系统中，如果荧光虫本身的强度不够高，不足以收集足够的光子，则需要更高的激发力，从而加快光漂白和不可靠的衰变曲线。最后，该技术需要先进和昂贵的设备作为先前存在的显微镜系统的附加组件，其中一个关键要素是探测器19的灵敏度。
相反，计算氟磷及其融合蛋白寿命的主要优点之一是，它提供了关于同一氟磷蛋白复合物不同馏分的信息，其环境中的相互作用状态不同，而不管其浓度基本未知。FLIM 还可用于测量任何相、气体、液体或固体以及任何可以正常成像的介质或有机体的寿命，从细胞到生物体，以及细胞器到固定、纯化的蛋白质20。显微镜技术通常依赖于荧光标记蛋白的稳定状态成像。与稳定状态技术不同，FLIM 可以解决生物基材的结合、组成和构象变化。对于研究容易聚集的蛋白质，大型荧光内含物或foci的存在可以很容易地成像，但这些仅代表静态的、基于强度的快照3。就聚合物种而言，可视化的foci也可能具有误导性，因为高浓度的荧光磷不一定导致强淀粉样蛋白的形成。通过FLIM，可以区分可溶性材料和不溶性材料。最后，获得基于强度的测量和平行寿命测量对任何调查都是有益的。在这些显微镜技术的互补性中，它们的强度在于它们的力量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
由国家卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助的CGC提供的肌肉-Q40-mRFP菌株。神经元Q40-CFP是森本实验室的一种礼物。我们承认DFG（KI-1988/5-1到JK，神经Cure博士奖学金由神经Cure卓越集群到MLP），EMBO（短期奖学金MLP）和生物学家公司（旅行赠款CG和MLP）为资助。我们还感谢柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的高级光显微镜成像设施，该设施为图像 YFP 结构提供了设置。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
