Summary
الفلورسينس مدى الحياة وشاشات التصوير، والقياس الكمي ويميز الميول التجميع من البروتينات في المعيشة، والشيخوخة، وشدد نماذج مرض C. elegans.
Abstract
ترتبط الفيبريات الأميلويد مع عدد من الأمراض العصبية مثل هنتنغتون, باركنسون, أو مرض الزهايمر. هذه الفيبريات اميلويد يمكن عزل البروتينات الذاتية ميتاستابل وكذلك مكونات شبكة البروتوستاس (PN) وبالتالي تفاقم البروتين misfolding في الخلية. هناك عدد محدود من الأدوات المتاحة لتقييم عملية تجميع البروتينات الأميلويد داخل الحيوان. نحن نقدم بروتوكولا للميكروسكوبية مدى الحياة الفلورية (FLIM) التي تسمح رصد وكذلك التحديد الكمي للفيبريلية اميلويد في خلايا محددة، مثل الخلايا العصبية، بطريقة غير الغازية ومع تطور الشيخوخة وعند اضطراب PN. FLIM مستقلة عن مستويات التعبير من الفلوروفور وتمكن من تحليل عملية التجميع دون أي مزيد من تلطيخ أو التبييض. يتم إخماد الفلورفور عندما تكون في محيط قريب من الهياكل الأميلويد، مما يؤدي إلى انخفاض عمر الفلورسينس. يرتبط الترويم بشكل مباشر بتجميع بروتين الأميلويد. FLIM هو تقنية متعددة الاستخدامات التي يمكن تطبيقها لمقارنة عملية الفيبريلة من البروتينات الأميلويد مختلفة، والمحفزات البيئية، أو الخلفيات الوراثية في الجسم الحي بطريقة غير الغازية.
Introduction
يحدث تجميع البروتين في كل من الشيخوخة والمرض. من الصعب اتباع المسارات التي تؤدي إلى تكوين وترسب الأميلويدات الكبيرة أو التضمينات غير المتبلور وحركية لها هي بالمثل صعبة للكشف. البروتينات يمكن أن تسيء بسبب الطفرات الجوهرية داخل تسلسل الترميز الخاصة بهم، كما هو الحال في الأمراض الوراثية. البروتينات أيضا يخطئ لأن شبكة البروتوستاس (PN) التي تبقيها قابلة للذوبان ومطوية بشكل صحيح هو ضعف، كما يحدث أثناء الشيخوخة. تتضمن PN المرافقالجزيئية وآلات التحلل وهي مسؤولة عن النشأة الحيوية وللطي والاتجار وتدهور البروتينات1.
C. ظهرت elegans كنموذج لدراسة الشيخوخة والمرض بسبب عمرها القصير، والطبيعة التسببية، وسهولة التلاعب الجيني. وقد تم إنشاء العديد من سلالات C. elegans المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات المسببة للأمراض البشرية في الأنسجة الضعيفة. الأهم من ذلك، العديد من السلالات التي تحتوي على البروتينات المعرضة للتجميع تلخيص السمة المميزة للاضطرابات اميلويد، وتشكيل إدراجات كبيرة. بفضل الجسم C. elegans 'شفافة، يمكن تصور هذه المجاميع في الجسم2الحي، غير الغازية وغير هدام2 . توليد أي بروتين من الفائدة (POI) في الانصهار مع الفلوروفور يسمح للتحقيق في مواقعها، والاتجار، وشبكة التفاعل، ومصير عام.
نحن نقدم بروتوكولا لرصد تجميع البروتينات المسببة للأمراض في المعيشة والشيخوخة C. elegans عن طريق الفلورسينس التصوير مدى الحياة المجهر (FLIM). FLIM هو تقنية قوية تقوم على عمر الفلوروفور ، بدلا من أطياف الانبعاثات. يتم تعريف العمر (تاو، و) على أنه متوسط الوقت المطلوب من قبل فوتون للاضمحلال من حالته اتحمس مرة أخرى إلى حالته الأرضية. يتم حساب عمر جزيء معين باستخدام تقنية المجال الزمني لعد الفوتون الواحد المرتبط بالوقت (TCSPC). في TCSPC-FLIM ، يتم الحصول على وظيفة تسوس الفلورسنت عن طريق إثارة الفلوروفور مع نبضات ليزر قصيرة عالية التردد وقياس أوقات وصول الفوتون المنبعثة إلى كاشف فيما يتعلق بالنبضات. عند مسح عينة، يتم إنشاء صفيف بيانات ثلاثي الأبعاد لكل بكسل: يتضمن الصفيف معلومات حول توزيع الفوتونات في إحداثياتها المكانية x y ومنحنى الاضمحلال الزمني. وبالتالي تصبح عينة معينة خريطة لأعمار الكشف عن المعلومات عن بنية البروتين، ملزمة، والبيئة3،4. كل بروتين الفلورسنت تمتلك حياة جوهرية ومحددة بدقة، وعادة من بضع نانو ثانية (ns)، تعتمد على خصائصه physiochemical. الأهم من ذلك ، فإن عمر الفلوروفور مستقل عن تركيزه ، وكثافة الفلورسنت ، ومنهجية التصوير. ومع ذلك ، داخل النظام البيولوجي ، يمكن أن تتأثر بالعوامل البيئية مثل درجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، وتركيزات الأيون ، وتشبع الأكسجين ، وشركاء التفاعل. العمر حساس أيضا ً للتغيرات الهيكلية الداخلية والتوجه. دمج الفلوروفور إلى POI يؤدي إلى تغيير في حياته وبالتالي معلومات عن سلوك البروتين المنصهر. عندما يتم إحاطة الفلوروفور أو تغليفها في بيئة مقيدة بإحكام ، مثل أوراق بيتا المضادة للمتوازية لبنية اميلويد ، فإنها تفقد الطاقة بشكل غير إشعاعي ، وهي عملية تعرف باسم إخماد5. يروي من الفلوروفور النتائج في تقصير حياتها واضحة. عندما تكون قابلة للذوبان، فإن عمر البروتين سيبقى أقرب إلى قيمته الأصلية الأعلى. في المقابل، عندما يبدأ البروتين في التجميع، فإن عمره سينتقل حتماإلى قيمة أقل6،7. لذلك ، يصبح من الممكن مراقبة الميل التجميعي لأي بروتين تشكيل اميلويد في أعمار مختلفة في C. elegansالحية.
هنا نصف بروتوكول لتحليل تجميع بروتين الانصهار تتألف من مختلف البوليغلوتامين (CAG، Q) تمتد (Q40، Q44، وQ85). نحن نوضح كيف يمكن تطبيق هذه التقنية بالتساوي على الفلورفور، مثل بروتين الفلورسنت السماوي (CFP)، والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) وبروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي (mRFP)؛ وفي جميع أنسجة C. elegans، بما في ذلك الخلايا العصبية والعضلات والأمعاء. وعلاوة على ذلك، في سياق البروتوستاس، FLIM هو أداة مفيدة جدا لمراقبة التغيرات عند استنفاد المرافقالجزيئية. هدم واحدة من المرافقالجزيئية الرئيسية، والبروتين صدمة الحرارة 1(hsp-1)،عن طريق تدخل الجيش الملكي النيبالي تنتج misfolding المبكر من البروتينات. ثم يتم قياس الزيادة في الحمل التجميعي نتيجة للشيخوخة أو المرض أو المرافقين الناقصين كانخفاض في عمر الفلورسينس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تزامن C. elegans
- مزامنة C. elegans إما عن طريق معالجة محلول هيبوكلوريت القلوية أو عن طريق وضع البيض بسيطة لمدة 4 ساعة في 20 درجة مئوية8.
- تنمو والحفاظ على الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية على المتوسطة نمو النيماتودا (NGM) لوحات المصنفة مع OP50 E. القولونية وفقا للإجراءات القياسية9. عمر الديدان الخيطية حتى مرحلة النمو المطلوبة أو اليوم.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم صورة الشباب في اليوم 4 ويتم صورة الديدان الخيطية القديمة في اليوم 8 من الحياة.
2. RNAi بوساطة ضربة قاضية من آلات المرافق عن طريق التغذية
ملاحظة: تنفيذ ضربة قاضية من البروتين صدمة الحرارة 1(hsp-1)المرافق عن طريق تغذية متجه RNAi المقابلة إلى الديدان الخيطية10. تم الحصول على hsp-1 RNAi plasmid من مكتبة Ahringer (معرف استنساخ: F26D10.3).
- تنمو HT115 (DE3) E. القولونية التعبير عن hsp-1 RNAi plasmid لمدة 6 ساعة إلى بين عشية وضحاها في لوريا برداني (LB) المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين.
- إعداد لوحات جديدة NGM الأجار تحتوي على isopropyl α-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) والأمبير (25 ميكروغرام / مل) والبذور مع hsp-1 بكتيريا RNAI. ترك لوحات لتجف والحث في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-3 أيام.
- ضع البيض المتزامن على طبق سرنا واتركه ليفقس، أو ضع الديدان الخيطية المبشرة واسمح بوضع البيض لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية قبل إزالته. تنمو الديدان الخيطية حتى العمر المطلوب أو المرحلة.
ملاحظة: قد يقدم الجيل الثاني من الديدان الخيطية نمط اقوى من الضربة القاضية. بروتوكول siRNA والشروط الموصوفة هنا عامة ومكيفة مع hsp1. تدخل الحمض النووي الريبي عبر siRNA من استنساخ محددة / الجينات يحتاج إلى إنشاء وتحسين من قبل المستخدم النهائي. من المهم أن نلاحظ أن ليس كل siRNA لديها نفس الكفاءة، ولذلك فمن المستحسن لاختبار فعالية الضربة القاضية عن طريق القياس الكمي إما عن طريق رد فعل سلسلة البوليميراز النسخ العكسي الكمي (RT-qPCR) أو لطخة الغربية.
3. إعداد الشرائح المجهرية
- في يوم التصوير، ابدأ بإعداد شرائح التصوير. تذوب agarose في DdH2O بتركيز 3٪ (ث / v) والسماح لتبرد قليلا.
- قطع غيض من 1 مل تلميح ماصة واتخاذ ما يقرب من 200 ميكرولتر من agarose الذائبة. Pipette agarose على شريحة زجاجية نظيفة ووضع على الفور ثانية واحدة على القمة ، وتجنب تشكيل أي فقاعات. يترك ليجف وإزالة بلطف الشريحة الزجاجية العلوية. والنتيجة هي شريحة زجاجية مع سطح أغاروز حتى حيث سيتم وضع الديدان الخيطية.
ملاحظة: سيتم استخدام كل شريحة للصورة بين 5-10 نيماتودا. يمكن إعداد الشرائح وتخزينها لبضع ساعات في صندوق مهاز لمنع الاغاروز من الجفاف.
4. تصاعد الديدان الخيطية على شرائح المجهر
ملاحظة: FLIM يتطلب الديدان الخيطية ليتم شلحركتها. قم بإجراء هذه الخطوة بمجرد أن يكون إعداد التصوير (على سبيل المثال، المجاهر والليزر وأجهزة الكشف) جاهزًا للاستخدام.
- باستخدام اختيار سلك البلاتين، ضع الديدان الخيطية من العمر المطلوب على لوحة جديدة غير مبذر والسماح لهم الزحف لإزالة البكتيريا OP50 الزائدة من أجسادهم.
- إعداد مركب مخدر (أزيد الصوديوم أو ليفاميسيلي) لشل النيماتودا. الحفاظ على 500 mM NN3 الأسهم في الظلام في 4 درجة مئوية وتمييع في ddH2O الطازجة إلى تركيز نهائي من 250 mM. إذا كان استخدام levamisole، تمييع مخزون 20 mM إلى 2 mM حل العمل في ddH2O.
تنبيه: أزيد الصوديوم (NaN3)شديد السمية. استخدام القفازات والنظارات الواقية والعمل تحت غطاء محرك السيارة التهوية. - العمل تحت ستيريوميكرور، وضع قطرة 10 ميكرولتر من مركب مخدر على وسادة agarose ونقل بلطف 5-10 الديدان الخيطية في ذلك. استخدم طرف رمش لفصل الديدان الخيطية. الاحتفاظ بها قريبة من بعضها البعض ولكن لا تلمس للسماح لترجمة أسهل من الديدان الخيطية أثناء الحصول على الصورة.
- تراكب بعناية الديدان الخيطية مع غطاء. اتخاذ القياسات في غضون 1 ساعة بعد تركيبها.
ملاحظة: كل التخدير سوف تقتل في نهاية المطاف C. elegans. يجب أن تكون الديدان الخيطية غير متحركة تمامًا أثناء التصوير، لأنه يتم تسجيل خريطة العمر من كل بكسل. أي حركة من المعلمات س، y يمنع قراءة العمر في نفس بكسل متحمس.
5- الحصول على بيانات FLIM
ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم الحصول على عمر الفلوروفور عبر أسلوب TCSPC المجال الزمني. FLIM يتطلب نبض الضوء التي يتم إنشاؤها بواسطة الليزر بمعدل تكرار مجموعة وثابتة. يختلف معدل التكرار وفقًا لنوع الليزر ويجب أن يكون معروفًا من قبل المستخدم. يتم تحقيق قياسات مدى الحياة عن طريق أجهزة الكشف والمعدات الإلكترونية المثبتة جنبا إلى جنب مع المجهر التقليدي. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء القياسات على ثلاثة مجاهر مختلفة للمسح الضوئي بالليزر مع أجهزة الكشف والبرامج المقدمة من قبل شركتين مختلفتين(جدول المواد)للحصول على حياة mRFP و CFP و YFP ، على التوالي. تأكد من وجود المرشحات الصحيحة للانبعاثات / الإثارة وتقليل أي خلفية أو إضاءة خلفية قبل البدء. قبل البدء في أي تجربة، قم بإنشاء الاستقرار الضوئي للفلوعور المختار. إذا كان الفلوروفور يبيض في غضون فترة قصيرة داخل أنسجة النيماتودا، فإنه ليس مناسبا لقياسات FLIM في C. elegans.
- افتح برنامج الاستحواذ FLIM. برنامج FLIM يسمح أيضا السيطرة على المجهر البؤري. حدد موقع علامة التبويب/الزر للسماح بتمكين مخرجات الكاشف واضغط على تمكين المخرجات.
- الحصول على وظيفة استجابة الصك (IRF)، الذي يصف دقة توقيت الإعداد مفيدة.
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة ويفضل قبل تركيب الديدان الخيطية.- إذا كان متوفراً، قم بإزالة فلاتر الإثارة/الانبعاثات.
- ضع غطاء فارغ فوق الهدف وابحث عن سطحه. سجل إشارة التشتت التي تم الحصول عليها من قسيمة الغطاء لمدة لا تقل عن 30 s.
ملاحظة: لأعمار عدة نانو ثانية، يمكن لبرنامج الاستحواذ تلقائياً تقدير التحول IRF. يوصى دائمًا بالحصول على IRF.
- ضع الشريحة مع C. elegans المركبة على المسرح. باستخدام عدسة التكبير 10x في وضع الإرسال وتوطين موضع الديدان الخيطية على الشريحة.
- قم بإزالة الشريحة، وقم بتبديل الهدف إلى عدسة تكبير 63 x، وقم بتطبيق وسيط الغمر المطلوب (على سبيل المثال، الزيت). استبدال الشريحة على المسرح وتوطين الديدان الخيطية.
- تحديد موقع مدير الثقب على برنامج الاستحواذ وفتحه إلى الحد الأقصى. ابدأ بمسح العينة، وحدد منطقة ذات أهمية (على سبيل المثال، الرأس، الجزء العلوي من الجسم)، وركز على مستوى الإسقاط الأقصى.
- مراقبة معدل نبض الليزر والقيم الثلاث الأخرى الموجودة على واجهة البرنامج: الكسر الثابت التمييزي (CFD) ، الوقت إلى السعة (TAC) ، والمحول التماثلي إلى الرقمي (ADC).
ملاحظة: يجب أن يكون ليزر بوابة الحد الأقصى من 1 × 108 عدد الفوتون واحد. يمثل هذا الرقم الحد الأقصى لعدد الفوتون التي يوفرها الليزر. توفر CFD معلومات عن استلام نبض الفوتون الواحد في إشارة إلى نبض الليزر بواسطة الكاشف. يجب أن تكون هذه القيمة تقريبا1 × 105. وTAC يميز بين الوقت الذي تم الكشف عن فوتون واحد ونبض الليزر المقبل. وأخيراً، يقوم ADC بتحويل جهد TAC إلى إشارة ذاكرة قابلة للذاكرة11. يجب أن يكون لدى CFD و TAC و ADC قيم مماثلة لضمان عدم فقدان الفوتونات المنبعثة من الفلوروفور. يضمن التقييم الصحيح لهذه المعلمات أنه يتم جمع عدد كافٍ من الفوتون لإنشاء خريطة دقيقة مدى الحياة. - على واجهة برنامج FLIM، معاينة عدد الفوتونات التي تم اكتشافها: يجب أن تكون قيمة ADC بين 1 × 104 و 1 × 105. إذا لزم الأمر، قم بتحويل التركيز على مستوى مختلف أو زيادة قوة الليزر لجمع المزيد من الفوتونات.
ملاحظة: بشكل عام، يجب ألا يتجاوز عدد الفوتون المسجلة في الثانية 1% من معدل تكرار الليزر. - في شريط القوائم، حدد علامة التبويب لتعيين معلمات الاستحواذ. حدد مزامنة الفحص للسماح باكتشاف فوتون واحد.
- تعيين الاستحواذ إلى مقدار محدد من الوقت أو عدد ثابت من الفوتون. على سبيل المثال، الحصول على منحنى تسوس مدى الحياة لمدة 2 دقيقة أو حتى يصل بكسل واحد عدد الفوتون من 2000 حدث واحد. اضغط على البدء لبدء الاستحواذ.
ملاحظة: سوف تتطلب الفلوروفوريات المختلفة إثارة مختلفة وأشعة الليزر الانبعاثات والمرشحات. وفقا لسطوع العينة، يمكن أيضا أن يتم تعديل قوة الليزر، والتي لن تتداخل مع العمر. تستخدم هذه البروتوكولات إعدادات الإثارة/الانبعاثات التالية: YFP ex500/em520-50 نانومتر، mRFP ex561/em580-620 نانومتر. تم استخدام ليزر فوتون ين نبضي لقياسات CFP باستخدام ex800/em440 نانومتر. وسيلزم تحديد مقدار الوقت وعدد الفوتونات اللازمة للحصول على خريطة FLIM تجريبيا لكل إعداد وكل غرض تجريبي.
6. تحليل بيانات FLIM باستخدام برنامج FLIMfit
ملاحظة: إجراء تحليل البيانات باستخدام أداة برنامج FLIMfit التي تم تطويرها في إمبريال كوليدج لندن12 (انظر الشكل 1).
- فتح البرنامج واستيراد ملفات بيانات FLIM عبر ملف | تحميل بيانات FLIM. تحميل جميع العينات من شرط واحد، حتى لو تم الحصول عليها في جلسات مختلفة ومن تكرار البيولوجية المختلفة.
- إذا لزم الأمر، قم بتجزئة النيماتودة الواحدة من أي صورة FLIM عبر التقسيم | مدير التقسيم. اسحب أداة الاقتصاص حول المنطقة ذات الاهتمام حتى يتم تمييزها. بمجرد الانتهاء، اضغط موافق.
ملاحظة: يجب إجراء تجزئة لكافة الصور. - حدد منطقة صغيرة تظهر فيها الصورة المستندة إلى الكثافة لـ C. elegans (الشكل 1، الأسهم 1). سيظهر منحنى الاضمحلال في تلك المنطقة في نافذة الاضمحلال الكبيرة على الجانب الأيمن من الواجهة(الشكل 1، السهم 2).
ملاحظة: يمكن عرض الاضمحلال خطياً أو لوغاريثيميسياً. - تعيين المعلمات الصحيحة لاستقراء العمر عبر خوارزمية البرنامج كما هو موضح في الخطوات 6.5-6.8.
- في علامة التبويب البيانات (الشكل 1، السهم 3):
- تعيين قيمة دنيا متكاملة عشوائية لاستبعاد أي وحدات بكسل باهتة جداً لإنتاج تناسب جيد. اعتمادا على عينة C. elegans هذه القيمة تختلف من 40-300. إدخال قيم مختلفة حتى يتم تحقيق معاينة مرضية.
- حدد الحد الأدنى للوقت ورقم الحد الأقصى للوقت للحد من إشارة FLIM إلى هذه القيم. سيتم استبعاد كافة الأحداث التي تظهر قبل وبعد هذه العتبة.
ملاحظة: على سبيل المثال، لتحليل mRFP، تم استبعاد الأحداث قبل 800 ps وبعد 4,000 ps. تعتمد هذه القيم على عمر الفلوروفور وتحتاج إلى تحديدها من قبل المستخدم النهائي. - لا تقم بتغيير التهم /الفوتون المحددة مسبقًا من 1.
- إدخال معدل التكرار، في MHz ، من الليزر المستخدمأثناء الاستحواذ.
ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول الحالي، تم استخدام أشعة الليزر المختلفة مع معدلات تكرار مختلفة. اثنين من الليزر الفوتون المستخدمة للحصول على أعمار CFP تمتلك معدل تكرار 80 ميغاهرتز، لYFP الليزر يكرر في 40 ميغاهرتز، وبالنسبة لmRFP القيمة هي 78.01 ميغاهرتز. تم إدخال هذه القيم في FLIMfit وفقًا للعينة التي تم تحليلها. - إدخال قيمة Gate Max لاستبعاد كافة وحدات البكسل المشبعة.
ملاحظة: بالنسبة للقياسات مدى الحياة في C. elegans، يتم تعيين هذه القيمة إلى أي عدد كبير (على سبيل المثال ، 1 × 108).
- في علامة التبويب مدى الحياة، حدد تركيبًا عموميًا لاستخدامه (على سبيل المثال، تركيب بكسل). انظر الشكل 1، السهم 4.
ملاحظة: سوف ينتج تركيب بكسل الحكمة تسوس تركيبها على كل بكسل على حدة. سوف ينتج تركيب الصورة الحكيمة تركيبًا عالميًا لكل صورة على حدة ويعرض قيمة عمر واحدة لكل صورة. وسوف ينتج تركيب عالمي الحكمة تركيب واحد عبر مجموعة البيانات بأكملها. يتم توفير قيمة عمر واحد لكافة الصور. - لا تقم بتغيير أي معلمة أخرى باستثناء لا. اختيار إكسب إذا كان من المعروف أن تسوس الفلورسينس المختار هو متعدد الأسي ويعرض أكثر من عمر واحد.
ملاحظة: في البروتوكول الحالي، تم استخدام هذه الدالة لحساب أعمار فلوروفور CFP الأسي. - تحميل IRF عبر قائمة IRF: IRF | تحميل IRF. لتقدير التحول IRF، حدد IRF | تقدير IRF التحول. ستظهر مجموعة من القيم تلقائيًا في علامة التبويب IRF. بمجرد تأسيس هذا، لا تقم بتغيير أية معلمات أخرى من علامة التبويب هذه.
- بمجرد تعيين جميع المعلمات، اضغط على مجموعة بيانات Fit (الشكل 1، السهم 5). سوف تنتج الخوارزمية تناسب منحنى الاضمحلال وإنشاء قيمة مدى الحياة لكل صورة.
ملاحظة: يجب أن تتداخل الملاءمة الناتجة، المميزة في خط أزرق، مع كافة الأحداث. يتم الحصول على تناسب جيد عندما يتم محاذاة كافة الأحداث على طول تناسب. - انقر فوق علامة التبويب المعلمات (الشكل 1، السهم 6) ، الموجود ضمن القوائم اليمنى العليا من واجهة البرنامج ، وحدد إحصائية: w_mean (المتوسط المرجح) وتحقق من أن قيمة chi2 أقرب ما يمكن إلى 1.
ملاحظة: يضمن chi2 القريب من واحد دقة تناسب. وبالتالي يتم الكشف عن قيمة عمر الصورة المحددة كما tau_1. - تصدير أي معلومات ذات أهمية: ملف | تصدير كثافة الصور / تناسب جدول النتيجة / صور / الرسوم البيانية. حفظ إعدادات البيانات المستخدمة لحساب العمر: ملف | حفظ إعدادات البيانات.
ملاحظة: سيتم حفظ المعلمات المستخدمة للتحليل المستقبلي للعينات المحددة.
7. التمثيلات الرسومية لبيانات FLIM
ملاحظة: يمكن تمثيل الأعمار التي تم جمعها من عينات مختلفة بصرياً بطرق مختلفة. حدد للدلالة على قيم العمر إما بالنانو ثانية أو بيكوثانية.
- إظهار نوعية تناسب ودقة منحنى عن طريق تصدير منحنى الاضمحلال مباشرة من FLIMfit.
- تمثيل توزيع الفوتوانات عن طريق رسم تردد عدد الفوتون مقابل قيمة العمر في الرسم البياني.
- وأخيراً، للمقارنة الإحصائية، إذا قارنت عينتين أو أكثر، ضع قيم العمر بالإضافة إلى الانحراف المعياري للمتوسط في رسم بياني شريطي مبعثر. إجراء أي تحليل إحصائي مطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح البروتوكول كيفية مراقبة تكوين الأنواع المجمعة بدقة في C. elegansالحية ، سواء أثناء شيخوختها الطبيعية أو عند تعرضها للإجهاد. اخترنا أربع سلالات مختلفة من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن بروتينات البولي غلوتامين إما 40Q، 44Q، أو يكرر 85Q. يتم تصنيع هذه البروتينات في أنسجة مختلفة وتم دمجها في الفلوروفوريات المختلفة. وسلالات C. elegans إما أعرب Q40-mRFP في عضلات جدار الجسم (mQ40-RFP), Q40-CFP في الجهاز العصبي (nQ40-CFP), وإما Q44-YFP أو Q85-YFP في الأمعاء (iQ44-YFP و iQ85-YFP)13. لتوضيح كيف أن الشيخوخة تعزز التجميع ، جمعنا عمر هذه السلالات متعددة الحلقات في الديدان الخيطية الشابة ، في اليوم 4 من الحياة ، والديدان الخيطية القديمة ، في اليوم 8. لإظهار آثار نقص في PN، قمنا بإجراء ضربة قاضية من hsp-1 في mQ40-RFP وسلالات nQ40.
بمجرد استقراء قيم العمر عبر برنامج FLIMfit ، أظهرت البيانات التي تم الحصول عليها انخفاضًا واضحًا في عمر أي من بنيات polyQ عند تجميعها إما بسبب حمل الجلوتامين أو الشيخوخة أو الإجهاد. ميّز توّج ّه FLIM بين الكسر البروتيني ّ القابل للذوبان والأنواع المُجمّعة، وانتقالها، من خلال تسجيل تحوّل في حياتهم.
في اليوم 4، mQ40-RFP عرض متوسط عمر الفلورسينس من 1.69 ns(الشكل 2). عند الشيخوخة ، نشأت أنواع أكثر مجمعة ، تظهر كبؤر منخفضة مدى الحياة في صور العمر وتحول الرسم البياني إلى أعمار مخفضة(الشكل 2A). من خلال رسم متوسط عمر الفلورسينس لكل صورة مكتسبة فوق عمر الديدان الخيطية انخفاض كبير في عمر الفلورسينس ، وبالتالي تراكم الأنواع المجمعة ، أصبح مرئيًا(الشكل 2B). انخفضت قدرة طي البروتين من PN بعد اليوم 4 من الحياة في C. elegans14 والبروتينات المعرضة للتجميع مزيد من أضعاف إلى التجمع إلى مجاميع اميلويد وغير متبلور. وبصرف النظر عن PN، لعبت ميول التجميع الجوهرية لبروتين معين دورا هاما في تطور التكوين الكلي. تم تحليل هذا عن طريق مقارنة سلوك iQ44-YFP و iQ85-YFP. أطول Q-تمتد من iQ85 كان أكثر عرضة للتجميع وأظهر تحول مدى الحياة الفلورية في الرسم البياني بالفعل في اليوم 4 من الحياة(الشكل 3A). في الواقع ، في اليوم 4 ، لوحظ تشكيل بؤري لiQ85 ، في حين لا يزال غائبا في iQ44. عند الشيخوخة، ومع ذلك، iQ44 كما أظهرت تشكيل بؤروبالتالي انخفاض عمر الفلورسينس. لأن iQ85 عرضت بالفعل المجاميع في مرحلة البلوغ المبكر تطور التجميع عند الشيخوخة كان أقل وضوحا، ولكن كبيرة(الشكل 3B). وأخيرا، لم نكتشف تشكيل بؤري أو انخفاض عمر الفلورسينس في سلالة nQ40-CFP(الشكل 4A). لهذه السلالة, كانت هناك فقط خفية, تغييرات غير ذات شأن لمتوسط عمر الفلورسينس عند الشيخوخة(الشكل 4B),يحتمل أن يرجع ذلك إلى الخلايا العصبية كونها أقل عرضة لأسباب غير معروفة حتى الآن.
هدم hsp-1 يشكل تحديا لPN من mQ40 و nQ40 التعبير عن الديدان الخيطية. أدى استنفاد hsp-1 بوساطة RNAi إلى زيادة كبيرة في التجميع(الشكل 5 والشكل 6). Q40 أعرب في عضلات جدار الجسم تميل إلى تشكيل عدد صغير من بؤر كبيرة محاطة المواد غير المجمعة. أدى ذلك إلى قمتين مميزتين في المخططات البيانية (حوالي 1.7 ns و 1.4 ns ، انظر الشكل 5A). العمر وRNAI المعالجة الديدان الخيطية أظهرت زيادة قوية في ذروة العمر منخفضة في نهاية المطاف خفض متوسط عمر الفلورسينس(الشكل 5B). بالمقارنة مع هذا السلوك ثنائي الطور من Q40 في العضلات، وعرض Q40 الخلايا العصبية سلوك تجميع أكثر تنوعا. لم نتمكن من ربط تشكيل بؤري مباشرة مع التجميع كما هو الحال في سلالة التعبير العضلي(الشكل 6A). ولأن FLIM يوفر فرصة لتقييم درجة التجميع، فقد كشفت المخططات البيانية أنه لم تكن هناك ذروة متميزة ولكن توزيع واسع النطاق لأعمار الفلورسينس، مما يشير إلى تكوين معقد من القلة المختلفة والمجاميع ذات الترتيب الأعلى. ومع ذلك ، يمكن تقييم الدرجة الإجمالية للتجميع عن طريق رسم متوسط عمر الفلورسينس(الشكل 6B)، مما يدل على أن الضربة القاضية hsp-1 أدت إلى زيادة في التجميع.
ومن المهم ملاحظة أن عمر الفلوروفور، الخالي من شريك الاندماج وخارج النظام البيولوجي، كان أعلى. لأن العمر يتأثر في المقام الأول ببيئتها، كان الانخفاض الطفيف في عمر YFP وRFP ملحوظًا بالفعل داخل أنسجة C. elegans. لذلك من المهم الحصول على عمر البوي القابل للذوبان داخل النيماتودا كتحكم مناسب. ويمكن بعد ذلك إجراء مقارنة بين الكسر القابل للذوبان مع عمر أعلى وكسر مجمع مع عمر أقل. هنا ، يرتبط الانخفاض في العمر مع تشكيل بؤر مرئية داخل العضلات والخلايا المعوية. ومع ذلك ، فإن جزءًا صغيرًا من بؤر لم يظهر أي انخفاض في عمر الفلورسينس (انظر الشكل 2 والشكل 3، الأسهم البيضاء). تسلط هذه الميزة الضوء على كيفية تجميع جزء فقط من بناء الانصهار عند نقطة زمنية محددة ، ووجود وتوافر البروتين غير المنضم. نشأ سيناريو أكثر تعقيدا من التحقيق في سلالة Q40-CFP العصبية. CFP تمتلك في جوهرها اثنين من حياة الفلورسينس متميزة. في حين أن CFP هو الفلوروفور المثالي لنقل الطاقة بالرنين Förster (FRET)15 القياسات، جنبا إلى جنب مع YFP، فإنه ليس من المستحسن استخدامه لرصد تشكيل المجاميع في C. elegans.
الشكل 1: لقطة شاشة لواجهة برنامج FLIMFit. لقطة شاشة للبرنامج المستخدم لحساب أعمار الفلورسينس. يصور الإطار الواجهة بعد تعريف الإعدادات كما هو موضح في النص، وتم تنفيذ حساب الأعمار. تشير الأسهم المرقمة إلى خطوات محددة داخل البروتوكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: انخفضت أعمار الفلورسينس من العضلات Q40-RFP مع التقدم في السن. (أ)خرائط تمثيلية لـ C. elegans التي تعبر عن Q40-RFP العضلي في اليوم 4 أو اليوم 8 من الحياة التي ولدتها FLIMfit. يتم توفير أعمار الفلورسينس، وشدة الفلورسينس، وصورة مدمجة لكليهما. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. تظهر الرسوم البيانية توزيع المدة المقاسة لجميع الديدان الخيطية التي تم تحليلها مقسمة إلى 100 فئة. (ب)قطع الأراضي شريط تبين متوسط مرجح حياة الفلورسينس لجميع الحيوانات تحليلها في اليوم 4 أو اليوم 8 من الحياة، على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: انخفضت أعمار الفلورسين سفيل Q44-YFP المعوية والأمعاء Q85-YFP مع التقدم في العمر. (أ)خرائط تمثيلية لـ C. elegans التي تعبر عن Q44-YFP المعويأو المعويQ85-YFP في اليوم 4 أو اليوم 8 من الحياة التي ولدتها FLIMfit. يتم توفير أعمار الفلورسينس، وشدة الفلورسينس، وصورة مدمجة لكليهما. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. تظهر الرسوم البيانية توزيع المدة المقاسة لجميع الديدان الخيطية التي تم تحليلها مقسمة إلى 100 فئة. (ب)قطع الأراضي شريط تبين متوسط مرجح حياة الفلورسينس لجميع الحيوانات تحليلها في اليوم 4 أو اليوم 8 من الحياة، على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أعمار الفلورسينس من الخلايا العصبية Q40-CFP لم تتغير مع التقدم في السن. (A)خرائط تمثيلية لC. elegans التعبير عن الخلايا العصبية Q40-CFP في اليوم 4 أو اليوم 8 من الحياة التي ولدتها FLIMfit. يتم توفير أعمار الفلورسينس، وشدة الفلورسينس، وصورة مدمجة لكليهما (يتم الإشارة إلى العمر الثاني، 2، في جميع العينات). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. تظهر الرسوم البيانية توزيع المدة المقاسة لجميع الديدان الخيطية التي تم تحليلها مقسمة إلى 100 فئة. (ب)قطع الأراضي شريط تبين متوسط مرجح حياة الفلورسينس لجميع الحيوانات تحليلها في اليوم 4 أو اليوم 8 من الحياة، على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: فلورسينس العمر من العضلات Q40-RFP انخفض عند الضربة القاضية من hsp-1. (أ)خرائط تمثيلية لـ C. elegans التي تعبر عن Q40-RFP العضلي في اليوم 4 أو اليوم 8 من الحياة التي ولدتها FLIMfit. يتم عرض دمج عمر الفلورسينس وخريطة الكثافة. بالنسبة لكل من النقطتين الزمنيتين، تظهر الديدان الخيطية التي نمت على البكتيريا التي تعبر عن متجه فارغ (السيطرة) أو البكتيريا التي تعبر عن بناء rnAi hsp-1. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. تظهر الرسوم البيانية توزيع المدة المقاسة لجميع الديدان الخيطية التي تم تحليلها مقسمة إلى 100 فئة. (ب)شريط المؤامرات تبين متوسط مرجح حياة الفلورسين سال جميع الحيوانات تحليلها في اليوم 4 أو اليوم 8 من الحياة، مع السيطرة أو hsp-1 RNAI، على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: فلورسينس أعمار الخلايا العصبية Q40-CFP انخفض عند الضربة القاضية من hsp-1. (A)خرائط تمثيلية لC. elegans التعبير عن الخلايا العصبية Q40-CFP في اليوم 4 من الحياة التي ولدتها FLIMfit. يتم عرض دمج عمر الفلورسينس وخريطة الكثافة. نمت الديدان الخيطية المعروضة على البكتيريا المعبرة عن ناقل فارغ (السيطرة) أو البكتيريا التي تعبر عن بناء rnAi hsp-1. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. تظهر الرسوم البيانية توزيع المدة المقاسة لجميع الديدان الخيطية التي تم تحليلها مقسمة إلى 100 فئة. (ب)شريط المؤامرات تبين متوسط مرجح الفلورسينس أعمار جميع الحيوانات تحليلها في اليوم 4، مع التحكم RNAI أو RNAi hsp-1. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف البروتوكول المعروض هنا تقنية تعتمد على المجهر لتحديد الأنواع المجمعة في نظام نموذج C. elegans. FLIM يمكن أن تميز بدقة وجود كل من الأنواع المجمعة والقابلة للذوبان تنصهر على الفلوروفور عن طريق قياس تسوس العمر الفلوري. عندما يبدأ بروتين الانصهار لتجميع متوسط العمر المسجل سوف يتحول من أعلى إلى قيمة أقل16. ويمكن بعد ذلك استنتاج ميل التجميع من خلال انخفاض في العمر: كلما انخفض العمر ، كلما ارتفع وجود أنواع البروتين المجمعة في النظام. وبالتالي ، يصبح من الممكن اتباع آثار الشيخوخة ، والمرض ، أو ضعف PN على ميل تجميع أي بروتين.
لتسليط الضوء على براعة هذه التقنية، أظهرت نتائجنا بوضوح أن FLIM يمكن تحديد التغيرات في هيكل بنيات متعددة التخصصات المختلفة، بغض النظر عن الأنسجة أو الفلوروفور. الأهم من ذلك، وقد تم بالفعل تطبيق FLIM بنجاح في توصيف البروتينات الأخرى المعرضة للتجميع داخل C. elegans،مثل α-synuclein17. وعلاوة على ذلك، يصبح من الممكن تطبيق أي عامل الإجهاد على C. elegans ومتابعة تتكشف وتجميع أي POI. يمكن أن يؤدي الأوسموتيك أو الأيون المعدني أو الأكسدة أو الإجهاد الكيميائي إلى تعزيز الاختلالات السامة التي يمكن مراقبتها بنجاح في C. elegans التي تستخدم FLIM. ويمكن أن يكون العكس ممكنًا أيضًا: يمكن أن يؤدي التأخير في التجميع أو حتى التصنيف بسبب وجود مركبات مفيدة أو تعزيز PN ، إلى إنقاذ البروتين وما يترتب على ذلك من زيادة مدى الحياة.
وقد استخدمت على نطاق واسع FLIM لرصد التغيرات في عمر أي مادة في مجموعة واسعة من التخصصات من الكيمياء إلى بيولوجيا السرطان18 إلى التشخيص الطبي، ولكن لا تزال هناك بعض القيود. والمشكلة الرئيسية هي عدم الاستقرار الضوئي للفلوروبورورس. نظرًا لأن FLIM يتطلب تسجيل عدد كبير من الفوتونات ، فإن التبييض الضوئي يقلل من عدد الفوتونات التي تم جمعها ويمكن أن يغير منحنى الاضمحلال الناتج. وعلاوة على ذلك، وخاصة داخل نظام النيماتودا، إذا كانت شدة الفلوروفور نفسه ليست عالية بما فيه الكفاية لجمع ما يكفي من الفوتونان، مطلوب إثارة أعلى، مما يؤدي إلى أسرع التبييض الضوئي ومنحنى تسوس لا يمكن الاعتماد عليها. وأخيراً، تتطلب التقنية معدات متطورة ومكلفة كإضافات لأنظمة المجهر الموجودة مسبقًا، مع عنصر واحد حاسم هو حساسية أجهزة الكشف19.
وعلى العكس من ذلك، فإن إحدى المزايا الرئيسية لحساب عمر الفلوروفور وبروتينها الانصهاري هي أنها توفر معلومات عن كسور مختلفة من نفس مجمع البروتين الفلوري في حالات متنوعة من التفاعلات داخل بيئتها، بغض النظر عن تركيزه غير المعروف إلى حد كبير. FLIM يمكن استخدامها أيضا لقياس مدى الحياة في أي مرحلة، والغاز، السائل، أو الصلبة وفي أي متوسطة أو كائن حي التي يمكن أن تكون عادة صورة، من الخلايا إلى الكائنات الحية، وorganelles إلى البروتينات المشلولة، النقي20. تعتمد تقنيات الفحص المجهري عادة على التصوير الثابت للبروتين الموسوم بالفلورسنت. على عكس تقنيات الدولة الثابتة ، يمكن لـ FLIM حل التغييرات في الربط والتكوين والتوافق في الركيزة البيولوجية. للتحقيق في البروتينات المعرضة للتجميع ، يمكن صورة وجود إدراجات أو بؤر فلورية كبيرة بسهولة ، ولكن هذه تمثل فقط لقطة ثابتة قائمة على الكثافة3. في حالة الأنواع المجمعة ، قد يكون البؤر المتخيلة مضللة أيضًا ، لأن التركيز العالي للفلوروفور لا يؤدي بالضرورة إلى تكوين اميلويد قوي. عبر FLIM فمن الممكن بدلا من ذلك للتمييز بين قابلة للذوبان من المواد غير القابلة للذوبان. وأخيراً، يصبح من المفيد لأي تحقيق أن يحصل على كل من القياسات المستندة إلى الكثافة وقياس العمر المتوازي. ضمن التكامل بين هذه التقنيات المجهرية تكمن قوتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
سلالة العضلات Q40-mRFP التي تقدمها CGC، والتي يتم تمويلها من قبل مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). الخلايا العصبية-Q40-CFP كان هدية لطيفة من مختبر موريموتو. نحن نعترف DFG (KI-1988/5-1 إلى JK، زمالة دكتوراه NeuroCure من قبل مجموعة NeuroCure للتميز إلى MLP)، EMBO (زمالة قصيرة الأجل إلى MLP) وشركة علماء الأحياء (منح السفر إلى CG و MLP) للتمويل. كما نعترف بمرفق التصوير المجهري الخفيف المتقدم في مركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي، برلين، لتوفير الإعداد لتصوير بنيات YFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
