Summary
Fluorescentie levenslange beeldvorming monitoren, kwantificeert en onderscheidt de aggregatie tendensen van eiwitten in het leven, veroudering, en benadrukt C. elegans ziekte modellen.
Abstract
Amyloïde fibrils worden geassocieerd met een aantal neurodegeneratieve ziekten zoals de ZvH, Parkinson of de ziekte van Alzheimer. Deze amyloïde fibrils kunnen endogene metastabiele eiwitten en componenten van het proteostasenetwerk (PN) afzonderen en daardoor eiwitmisvouwen in de cel verergeren. Er zijn een beperkt aantal instrumenten beschikbaar om het aggregatieproces van amyloïde eiwitten binnen een dier te beoordelen. We presenteren een protocol voor fluorescentie levensduur microscopie (FLIM) dat monitoring en kwantificering van de amyloïde fibrilisatie in specifieke cellen, zoals neuronen, op een niet-invasieve manier en met de progressie van veroudering en bij verstoring van de PN. FLIM is onafhankelijk van de expressieniveaus van de fluoropforen en maakt een analyse van het aggregatieproces mogelijk zonder verdere vlekken of bleken. Fluorophoren worden gedoofd wanneer ze zich in de nabijheid van amyloïde structuren bevinden, wat resulteert in een afname van de fluorescentielevensduur. Het blussen correleert direct met de aggregatie van het amyloïde eiwit. FLIM is een veelzijdige techniek die kan worden toegepast om het fibrilisatieproces van verschillende amyloïde eiwitten, omgevingsstimuli of genetische achtergronden in vivo op een niet-invasieve manier te vergelijken.
Introduction
Eiwitaggregatie komt zowel bij veroudering als bij ziekte voor. De paden die leiden tot de vorming en afzetting van grote amyloïden of amorfe insluitsels zijn moeilijk te volgen en hun kinetiek zijn eveneens uitdagend om te ontrafelen. Eiwitten kunnen verkeerd worden gevouwen als gevolg van intrinsieke mutaties binnen hun coderingssequenties, zoals in het geval van genetische ziekten. Eiwitten ook verkeerd vouwen omdat de proteostase netwerk (PN) dat houdt ze oplosbaar en goed gevouwen is aangetast, zoals gebeurt tijdens het ouder worden. De PN omvat moleculaire chaperonne en afbraakmachines en is verantwoordelijk voor de biogenese, vouwen, handel en afbraak van eiwitten1.
C. elegans is ontstaan als een model om veroudering en ziekte te bestuderen als gevolg van de korte levensduur, isogene aard, en het gemak van genetische manipulatie. Verschillende C. elegans transgene stammen die menselijke ziekte-veroorzakende eiwitten uitdrukken in kwetsbare weefsels zijn gemaakt. Belangrijk is dat veel van de stammen die aggregatiegevoelige eiwitten bevatten, het kenmerk van amyloïdeaandoeningen, de vorming van grote insluitsels, samenvatten. Dankzij het transparante lichaam van C. elegans kunnen deze aggregaten in vivo, niet-invasief en niet-destructief worden gevisualiseerd2. Het genereren van eiwit van belang (POI) in fusie met een fluorophore maakt het mogelijk om de locaties, mensenhandel, interactie netwerk, en het algemene lot te onderzoeken.
We presenteren een protocol om de aggregatie van ziekteveroorzakende eiwitten in levende en verouderende C. elegans via fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) te monitoren. FLIM is een krachtige techniek gebaseerd op de levensduur van een fluorophore, in plaats van de emissiespectra. De levensduur (tau, τ) wordt gedefinieerd als de gemiddelde tijd die een foton nodig heeft om te vergaan van zijn opgewonden toestand terug naar zijn grondstaat. De levensduur van een bepaald molecuul wordt berekend met de tijd-domein techniek van tijd-gecorreleerde enkele foton tellen (TCSPC). In TCSPC-FLIM wordt de fluorescerende vervalfunctie verkregen door de fluorophore op te winden met korte, hoogfrequente laserpulsen en de aankomsttijden van het uitgezonden foton te meten aan een detector met betrekking tot de pulsen. Bij het scannen van een voorbeeld wordt voor elke pixel een driedimensionale gegevensarray gemaakt: de array bevat informatie over de verdeling van de fotonen in hun x,y ruimtelijke coördinaten en hun temporele vervalcurve. Een bepaald monster wordt daarom een kaart van levens die informatie onthult over de structuur van het eiwit, binding en omgeving3,4. Elk fluorescerend eiwit heeft een intrinsieke en nauwkeurig gedefinieerde levensduur, meestal van een paar nanoseconden (ns), afhankelijk van de fysiochemische eigenschappen. Belangrijk is dat de levensduur van een fluorophore onafhankelijk is van zijn concentratie, fluorescerende intensiteit en van de beeldvormingsmethode. Binnen een biologisch systeem kan het echter worden beïnvloed door omgevingsfactoren zoals pH, temperatuur, ionenconcentraties, zuurstofverzadiging en zijn interactiepartners. Levens zijn ook gevoelig voor interne structurele veranderingen en oriëntatie. Het smelten van een fluorophore aan een POI resulteert in een verandering in zijn levensduur en dus informatie over het gedrag van het gesmolten eiwit. Wanneer een fluorophore is omgeven of ingekapseld in een strak gebonden omgeving, zoals de antiparallelle bètabladen van een amyloïde structuur, verliest het energie niet-radiatief, een proces dat bekend staat als het blussen5. Het blussen van de fluoropforen resulteert in een verkorting van de schijnbare levensduur. Wanneer oplosbaar, zal de levensduur van een eiwit dichter bij zijn oorspronkelijke, hogere waarde blijven. Wanneer een eiwit zich daarentegen begint op te saggregeren, zal de levensduur ervan onvermijdelijk verschuiven naar een lagere waarde6,7. Daarom wordt het mogelijk om de aggregatieneiging van amyloïde-vormende eiwitten op verschillende leeftijden in levende C. eleganste controleren.
Hier beschrijven we een protocol om de aggregatie te analyseren van een fusie-eiwit bestaande uit verschillende polyglutamine (CAG, Q) (Q40, Q44 en Q85). We illustreren hoe de techniek ook kan worden toegepast op verschillende fluorophoren, zoals cyaan fluorescerend eiwit (GVB), geel fluorescerend eiwit (YFP) en monomeric rood fluorescerend eiwit (mRFP); en in alle weefsels van C. elegans,met inbegrip van de neuronen, spieren, en de darm. Bovendien is FLIM in de context van proteostase een zeer nuttig instrument om veranderingen bij uitputting van moleculaire chaperononen waar te nemen. Het neerhalen van een van de belangrijkste moleculaire chaperononen, hitteshock eiwit 1 (hsp-1), via RNA interferentie produceert voortijdige misfolding van eiwitten. De toename van de aggregatiebelasting als gevolg van veroudering, ziekte of gebrekkige chaperonen, wordt vervolgens gemeten als een afname van de levensduur van de fluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synchronisatie van C. elegans
- Synchroniseer C. elegans via alkalische hypochlorietoplossingsbehandeling of via eenvoudige eieren die 4 uur bij 20 °C8 leggen.
- Groeien en onderhouden van aaltjes op nematoden groeimedium (NGM) platen die zijn ingezaaid met OP50 E. coli volgens standaardprocedures9. Verouder de nematoden tot de gewenste ontwikkelingsfase of dag.
OPMERKING: In dit protocol worden jongvolwassenen afgebeeld op dag 4 en worden oude aaltjes afgebeeld op dag 8 van het leven.
2. RNAi-gemedieerde knockdown van chaperonnemachines via voeding
OPMERKING: Voer knockdown van hitteshock-eiwit 1 (hsp-1) chaperonne uit door de overeenkomstige RNAi-vector aan de aaltjes10te voeren . De hsp-1 RNAi plasmid werd verkregen uit de Ahringer bibliotheek (kloon ID: F26D10.3).
- Kweek de HT115 (DE3) E. coli die de hsp-1 RNAi plasmide 6 uur tot 's nachts uitdrukt in Luria Bertani (LB) medium met 50 μg/mL ampicillin.
- Bereid verse NGM-agarplaten met isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) en ampicilline (25 μg/mL) en zaad met de hsp-1 RNAi-bacteriën. Laat platen drogen en induceren bij kamertemperatuur gedurende 1-3 dagen.
- Plaats gesynchroniseerde eieren op een siRNA-plaat en laat uitkomen, of plaats gravid aaltjes en laat eieren leggen voor 4 uur bij 20 °C voordat u het verwijdert. Laat de aaltjes groeien tot de gewenste leeftijd of stadium.
OPMERKING: De tweede generatie aaltjes kan een sterker fenotype van de knockdown opleveren. Het siRNA protocol en de hier beschreven voorwaarden zijn algemeen en aangepast aan hsp1. RNA interferentie via siRNA van een specifieke kloon/gen moet door de eindgebruiker worden vastgesteld en geoptimaliseerd. Het is belangrijk op te merken dat niet alle siRNA dezelfde efficiëntie hebben, en het wordt daarom aanbevolen om de werkzaamheid van de knockdown te testen door kwantificering door kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR) of westerse vlek.
3. Voorbereiding van microscopiedia's
- Op de dag van beeldvorming, beginnen met het voorbereiden van de beeldvorming dia's. Smelt agarose in ddH2O bij een concentratie van 3% (w/v) en laat iets afkoelen.
- Snijd de punt van een pipettip van 1 mL door en neem ongeveer 200 μL gesmolten agarose. Pipetteer de agarose op een schone glazen glijbaan en plaats onmiddellijk een tweede op de top, het vermijden van de vorming van eventuele bubbels. Laat drogen en verwijder voorzichtig de bovenste glazen schuif. Het resultaat is een glazen glijbaan met een gelijkmatig agarose oppervlak waar de aaltjes zullen worden geplaatst.
LET OP: Elke dia wordt gebruikt om tussen de 5-10 aaltjes weer te geven. Dia's kunnen worden voorbereid en opgeslagen voor een paar uur in een gemeterde doos om te voorkomen dat de agarose uitdrogen.
4. Bevestiging van aaltjes op microscopieplaten
LET OP: FLIM vereist dat de aaltjes worden geïmmobiliseerd. Voer deze stap uit zodra de imaging setup (bijvoorbeeld microscopen, lasers, detectoren) klaar is voor gebruik.
- Plaats met behulp van een platina draadpickneming aaltjes van de gewenste leeftijd op een verse ongeplaatste plaat en laat ze kruipen om de overtollige OP50-bacteriën uit hun lichaam te verwijderen.
- Bereid de verdovingsstof (natriumazide of levamisole) voor om de nematode te immobiliseren. Houd een 500 mM NaN3 voorraad in het donker bij 4 °C en verdun in verse ddH2O tot een uiteindelijke concentratie van 250 mM. Bij gebruik van levamisole, verdun een 20 mM voorraad tot 2 mM werkoplossing in ddH2O.
LET OP: Natriumazide (NaN3)is zeer giftig. Gebruik handschoenen en beschermende brillen en werk onder een geventileerde kap. - Werk onder een stereomicroscoop, plaats een 10 μL druppel verdovingsstof op een agarosepad en breng er voorzichtig 5-10 aaltjes in. Gebruik een wimperpunt om de aaltjes te scheiden. Houd ze dicht bij elkaar, maar niet aanraken om gemakkelijker lokalisatie van de aaltjes tijdens het verwerven van afbeeldingen mogelijk te maken.
- Bedek de aaltjes voorzichtig met een coverslip. Neem metingen binnen 1 uur na montage.
LET OP: Beide verdovingen zullen uiteindelijk C. elegansdoden. De aaltjes moeten volledig onbeweeglijk zijn tijdens beeldvorming, omdat de kaart van de levensduur wordt vastgelegd vanaf elke pixel. Elke beweging van de x,y parameters voorkomt het lezen van de levensduur in dezelfde opgewonden pixel.
5. Verwerving van FLIM-gegevens
OPMERKING: In dit protocol wordt de levensduur van de fluorophore verkregen via de time-domain TCSPC-methode. FLIM vereist een lichtpuls die door de laser wordt gegenereerd met een vaste en constante herhalingssnelheid. De herhalingssnelheid is afhankelijk van het lasertype en moet bekend zijn bij de gebruiker. Levenslange metingen worden uitgevoerd door detectoren en elektronische apparatuur geïnstalleerd naast een conventionele microscoop. In dit protocol worden metingen uitgevoerd op drie verschillende laserscanningconfocale microscopen met detectoren en software die door twee verschillende bedrijven (Table of Materials) worden geleverd voor de verwerving van respectievelijk mRFP-, GVB- en YFP-levensduur. Controleer of de juiste filters van emissie/excitatie aanwezig zijn en minimaliseer eventuele achtergrond- of monitorachtergrondverlichting voordat u begint. Voordat u met een experiment begint, stelt u de fotostabiliteit van de gekozen fluorophore vast. Als de fluoroftoforen binnen een korte tijd in de nematodeweefsels bleken, is het niet geschikt voor FLIM-metingen in C. elegans.
- Open de FLIM-acquisitiesoftware. De FLIM-software maakt het ook mogelijk om de confocale microscoop te bedienen. Zoek het tabblad/de knop om de uitvoer van de detector in te schakelen en druk op Uitvoer inschakelen.
- Verwerf de instrumentresponsfunctie (IRF), die de timingprecisie van de instrumentale setup beschrijft.
LET OP: Deze stap moet bij voorkeur worden uitgevoerd voordat de aaltjes worden gemonteerd.- Verwijder indien beschikbaar de excitatie-/emissiefilters.
- Plaats een leeg uitglijder boven het doel en vind het oppervlak. Noteer het strooisignaal verkregen van de coverslip voor een minimum van 30 s.
OPMERKING: Voor levens van meerdere nanoseconden kan de acquisitiesoftware automatisch de IRF-verschuiving schatten. Het verkrijgen van een IRF wordt altijd aanbevolen.
- Plaats de schuif met de gemonteerde C. elegans op het podium. Met behulp van een 10x vergroting lens in transmissie-modus en lokaliseren van de positie van de aaltjes op de dia.
- Verwijder de dia, schakel het doel om op een 63x vergrotingslens en breng het vereiste onderdompelingsmedium (bijvoorbeeld olie) aan. Vervang de glijbaan op het podium en lokaliseer de aaltjes.
- Zoek de Pinhole Manager op de acquisitie software en open deze voor de maximale. Begin met het scannen van het voorbeeld, selecteer een gebied van belang (bijvoorbeeld hoofd, bovenlichaam) en richt u op het maximale projectievlak.
- Monitor de laserpulssnelheid en de drie andere waarden die aanwezig zijn op de interface van de software: The Constant Fraction Discriminator (CFD), de Time-to-Amplitude (TAC) en de Analogue-to-Digital Converter (ADC).
LET OP: De laser moet een maximale poort van 1 x 108 enkele foton telt. Dit aantal vertegenwoordigt het maximum aantal fotonen geleverd door de laser. De CFD geeft informatie over de ontvangst van de enkele fotonpuls met betrekking tot de laserpuls door de detector. Deze waarde moet ongeveer 1 x 105 zijn. De TAC discrimineert tussen de tijd dat een foton werd gedetecteerd en de volgende laserpuls. Ten slotte zet de ADC de TAC-spanning om in een storable memory signaal11. De CFD, TAC en ADC moeten allemaal vergelijkbare waarden hebben om ervoor te zorgen dat fotonen die door de fluoropforen worden uitgestoten, niet verloren gaan. Een correcte evaluatie van deze parameters zorgt ervoor dat er voldoende fotonen worden verzameld om een nauwkeurige levensduurkaart te maken. - Bekijk op de interface van de FLIM-software een voorbeeld van het aantal gedetecteerde fotonen: de ADC-waarde moet tussen 1 x 104 en 1 x 105 liggen. Verplaats indien nodig de focus op een ander vlak of verhoog de laserkracht om meer fotonen te verzamelen.
OPMERKING: Over het algemeen mag het aantal opgenomen fotonen per seconde niet hoger zijn dan 1% van de herhalingssnelheid van de laser. - Selecteer op de menubalk het tabblad om de acquisitieparameters in te stellen. Selecteer scansynchronisatie om één fotondetectie mogelijk te maken.
- Stel de overname in op een vaste tijd of een vast aantal fotonen. Krijg bijvoorbeeld een levenslange vervalcurve voor 2 minuten of totdat een enkele pixel een fotontelling van 2.000 enkele gebeurtenissen bereikt. Druk op Start om de acquisitie te starten.
OPMERKING: Voor verschillende fluorophores zijn verschillende excitatie- en emissielasers en -filters vereist. Afhankelijk van de helderheid van het monster kan het laservermogen ook worden aangepast, wat de levensduur niet verstoort. Deze protocollen maken gebruik van de volgende excitatie/emissie-instellingen: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Voor GVB-metingen werd een gepulseerde twee fotonlaser gebruikt met ex800/em440 nm. De hoeveelheid tijd en fotontelling die nodig is voor de aanschaf van een FLIM-kaart moet empirisch worden vastgesteld voor elke installatie en elk experimenteel doel.
6. Analyse van FLIM-gegevens met FLIMfit-software
OPMERKING: Voer data-analyse uit met behulp van de FLIMfit-softwaretool ontwikkeld aan het Imperial College London12 (zie figuur 1).
- Open de software en importeer FLIM-gegevensbestanden via bestand | FLIM-gegevens laden. Laad alle monsters uit één voorwaarde, zelfs als ze in verschillende sessies en uit verschillende biologische herhalingen worden verkregen.
- Segmenteer indien nodig één nematode van elke FLIM-afbeelding via segmentatie | Segmentatiemanager. Sleep het bijsnijdgereedschap rond het interessegebied totdat het is gemarkeerd. Eenmaal voltooid, drukt u op OK.
OPMERKING: Segmentatie moet worden gedaan voor alle afbeeldingen. - Selecteer een klein gebied waar de afbeelding op basis van intensiteit van een C. elegans wordt weergegeven (figuur 1, Pijlen 1). De vervalcurve van dat gebied wordt weergegeven in het grote vervalvenster aan de rechterkant van de interface(figuur 1, pijl 2).
LET OP: Het verval kan lineair of logatisch worden weergegeven. - Stel de juiste parameters in om de levensduur te extrapoleren via het algoritme van de software zoals beschreven in stappen 6.5-6.8.
- Ga op het tabblad Gegevens (figuur 1, pijl 3):
- Stel een willekeurige geïntegreerde minimumwaarde in om pixels uit te sluiten die te zwak zijn om een goede pasvorm te produceren. Afhankelijk van het C. elegans monster varieert deze waarde van 40-300. Voer verschillende waarden in totdat een bevredigend voorbeeld is bereikt.
- Selecteer een Time Min en een Time Max-nummer om het FLIM-signaal te beperken tot deze waarden. Alle gebeurtenissen die voor en na deze drempel worden weergegeven, worden uitgesloten.
OPMERKING: Voor de analyse van mRFP werden bijvoorbeeld de gebeurtenissen vóór 800 pk en na 4.000 pk uitgesloten. Deze waarden zijn afhankelijk van de levensduur van de fluoropfore en moeten door de eindgebruiker worden bepaald. - Wijzig de vooraf ingestelde tellingen/foton van 1 niet.
- Voer de herhalingssnelheid, in MHz, van de laser gebruikt tijdens de overname.
OPMERKING: Voor het huidige protocol, verschillende lasers werden gebruikt met verschillende herhaling tarieven. De twee fotonlaser die wordt gebruikt voor de aanschaf van GVB-levens heeft een herhalingssnelheid van 80 MHz, voor YFP wordt de laser herhaald op 40 MHz en voor mRFP is de waarde 78,01 MHz. Deze waarden werden ingevoerd in FLIMfit volgens de geanalyseerde steekproef. - Voer een Gate Max-waarde in om alle verzadigde pixels uit te sluiten.
OPMERKING: Voor levensduurmetingen in C. elegansis deze waarde ingesteld op een groot aantal (bijvoorbeeld 1 x 108).
- Selecteer op het tabblad Levensduur een globale fitting die moet worden gebruikt (bijvoorbeeld een pixel-wise fitting). Zie figuur 1, Pijl 4.
OPMERKING: Een Pixel-wise fitting produceert een verval dat op elke afzonderlijke pixel is gemonteerd. Een afbeeldingsgerichte fitting produceert een globale aanpassing van elke afzonderlijke afbeelding en geeft één levenslange waarde per afbeelding weer. Een Global-wise fitting zal één fitting produceren in de hele dataset. Voor alle afbeeldingen is één levenslange waarde beschikbaar. - Wijzig geen andere parameter, behalve de nr. Exp selectie als bekend is dat de gekozen fluorescentie verval is multiexponentieel en vertoont meer dan een enkele levensduur.
OPMERKING: In het huidige protocol werd deze functie gebruikt om de levensduur van het biexponentiële GVB-fluoropforen te berekenen. - Upload de IRF via het IRF-menu: IRF | IRF laden. Als u de IRF-verschuiving wilt schatten, selecteert u IRF | Schatting IRF Shift. Er wordt automatisch een set waarden weergegeven op het tabblad IRF. Zodra dit is vastgesteld, wijzig dan geen andere parameters van dit tabblad.
- Zodra alle parameters zijn ingesteld, drukt u op Fit-gegevensset (figuur 1, Pijl 5). Het algoritme produceert een pasvorm voor de vervalcurve en stelt een levenslange waarde vast voor elke afbeelding.
OPMERKING: De resulterende pasvorm, gemarkeerd in een blauwe lijn, moet overlappen met alle gebeurtenissen. Een goede pasvorm wordt verkregen wanneer alle gebeurtenissen langs de pasvorm worden gericht. - Klik op het tabblad Parameters (figuur 1,Pijl 6), in de rechterbovenhoek van de interface van de software, en selecteer Statistiek: w_mean (gewogen gemiddelde) en controleer of de chi2-waarde zo dicht mogelijk bij 1 ligt.
LET OP: Een chi2 dicht bij een zorgt voor de nauwkeurigheid van de pasvorm. De levensduurwaarde van de geselecteerde afbeelding wordt dus als tau_1weergegeven . - Alle informatie van belang uitvoeren: Dossier | Export Intensiteit beelden / Fit Resultaat Tabel / Afbeeldingen / Histogrammen. Sla de gegevensinstellingen op die worden gebruikt om de levensduur te berekenen: Bestand | Gegevensinstellingen opslaan.
OPMERKING: De gebruikte parameters worden opgeslagen voor toekomstige analyse van de geselecteerde monsters.
7. Grafische voorstellingen van FLIM-gegevens
OPMERKING: De levens verzameld uit verschillende monsters kunnen visueel worden weergegeven op verschillende manieren. Selecteer om de levensduurwaarden aan te duiden in nanoseconden of picoseconden.
- Toon de kwaliteit van de pasvorm en de nauwkeurigheid van de curve door de vervalcurve rechtstreeks van FLIMfit te exporteren.
- Vertegenwoordigen de verdeling van de fotonen door het plotten van de frequentie van het foton en tellen ten opzichte van de levensduur waarde in een histogram.
- Ten slotte, voor statistische vergelijking, als het vergelijken van twee of meer monsters, plaats levensduur waarden plus standaarddeviatie van het gemiddelde in een scatter plot bar grafiek. Voer elke gewenste statistische analyse uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol laat zien hoe nauwkeurig de vorming van geaggregeerde soorten in levende C. eleganste controleren , zowel tijdens de natuurlijke veroudering en wanneer onderworpen aan stress. We selecteerden vier verschillende stammen van transgene aaltjes die polyglutamine-eiwitten uitdrukken van 40Q, 44Q of 85Q herhalingen. Deze eiwitten worden gesynthetiseerd in verschillende weefsels en werden gesmolten tot verschillende fluorophoren. De C. elegans stammen ofwel uitgedrukt Q40-mRFP in de body wall spieren (mQ40-RFP), Q40-GVB in het zenuwstelsel (nQ40-GVB), en ofwel Q44-YFP of Q85-YFP in de darm (iQ44-YFP en iQ85-YFP)13. Om te illustreren hoe veroudering aggregatie bevordert, verzamelden we de levensduur van deze polyQ-stammen in jonge aaltjes, op dag 4 van het leven en oude aaltjes, op dag 8. Om de effecten van een tekort in de PN te laten zien, hebben we een knockdown van hsp-1 uitgevoerd in de mQ40-RFP en de nQ40 stammen.
Zodra de levensduur waarden werden geëxtrapoleerd via de FLIMfit software, de verkregen gegevens toonde een duidelijke vermindering van de levensduur van een van de polyQ constructies wanneer geaggregeerdals gevolg van ofwel glutamine belasting, veroudering, of stress. FLIM onderscheidde tussen de oplosbare eiwitfractie en geaggregeerde soorten, en hun overgang, door een verschuiving in hun levensduur vast te houden.
Op dag 4 vertoonde de mQ40-RFP een gemiddelde fluorescentielevensduur van 1,69 ns (figuur 2). Bij veroudering ontstonden meer geaggregeerde soorten, die als een leven lang worden beschouwd in de levensbeelden en het histogram verschuiven naar verminderde levensduur(figuur 2A). Door het in kaart brengen van de gemiddelde fluorescentielevensduur van elk verworven beeld ouder dan de leeftijd van de nematoden werd een significante vermindering van de fluorescentielevensduur, en dus accumulatie van geaggregeerde soorten, zichtbaar (figuur 2B). De eiwitvouwcapaciteit van de PN daalde na dag 4 van het leven in C. elegans14 en aggregatie-gevoelige eiwitten verder verkeerd gevouwen om te clusteren in amyloïde en amorfe aggregaten. Afgezien van de PN speelden de intrinsieke aggregatieneigingen van een bepaald eiwit een belangrijke rol in de progressie van aggregaatvorming. Dit werd geanalyseerd door het gedrag van iQ44-YFP en iQ85-YFP te vergelijken. De langere Q-stretch van de iQ85 was meer vatbaar voor aggregatie en vertoonde een fluorescentie levensduur verschuiving in het histogram al op dag 4 van het leven (Figuur 3A). In feite, op dag 4, foci vorming werd waargenomen voor iQ85, terwijl nog steeds afwezig in iQ44. Bij veroudering vertoonde iQ44 echter ook foci-vorming en dus een verminderde fluorescentielevensduur. Omdat iQ85 al aggregaten in de vroege volwassenheid vertoonde, was de progressie van aggregatie bij veroudering minder uitgesproken, maar toch significant (figuur 3B). Ten slotte hebben we geen foci-vorming of verminderde fluorescentielevensduur in de nQ40-GVB-stam (figuur 4A) niet gedetecteerd. Voor deze stam waren er slechts subtiele, niet-significante veranderingen in de gemiddelde fluorescentie levensduur bij veroudering (Figuur 4B), mogelijk te wijten aan de neuronen die minder gevoelig om nog onbekende redenen.
Het neerhalen van hsp-1 vormt een uitdaging voor de PN van mQ40 en nQ40 die aaltjes uitdrukken. RNAi-gemedieerde uitputting van hsp-1 leidde tot een aanzienlijke toename van de aggregatie(figuur 5 en figuur 6). Q40 uitgedrukt in body wall spieren de neiging om een klein aantal grote foci omgeven door niet-geaggregeerde materiaal te vormen. Dit resulteerde in twee te onderscheiden pieken in de histogrammen (ongeveer 1,7 ns en 1,4 ns, zie figuur 5A). De met ouderen en RNAi behandelde aaltjes vertoonden een sterke toename van de lage levensduurpiek en daalden uiteindelijk de gemiddelde fluorescentielevensduur(figuur 5B). Vergeleken met dit bifasische gedrag van Q40 in spieren, vertoonde de neuronale Q40 een diverser aggregatiegedrag. We konden foci-vorming niet direct correleren met aggregatie zoals in de spierexpressiestam (Figuur 6A). Omdat FLIM een kans biedt om de mate van aggregatie te beoordelen, bleek uit de histogrammen dat er geen duidelijke piek was, maar een wijdverspreide verdeling van fluorescentielevens, wijzend op een complexe samenstelling van verschillende oligomeren en aggregaten met een hogere orde. Toch kan de algemene mate van aggregatie worden geëvalueerd door de gemiddelde fluorescentielevensduur(figuur 6B)in kaart te brengen, waaruit blijkt dat hsp-1 knockdown leidde tot een boost in aggregatie.
Het is belangrijk op te merken dat de levensduur van de fluorophoren, vrij van een fusiepartner en buiten een biologisch systeem, hoger was. Omdat de levensduur voornamelijk wordt beïnvloed door zijn omgeving, was een lichte vermindering van de levensduur van YFP en RFP al merkbaar binnen de weefsels van C. elegans. Het is daarom belangrijk om de levensduur van de oplosbare POI binnen de nematode te verkrijgen als een geschikte controle. Er kan dan een vergelijking worden gemaakt tussen de oplosbare fractie met een hogere levensduur en een geaggregeerde fractie met een lagere levensduur. Hier correleerde de afname van de levensduur met de vorming van zichtbare foci in de spier- en darmcellen. Toch vertoonde een fractie van de foci geen afname van de fluorescentielevensduur (zie figuur 2 en figuur 3, witte pijlen). Deze functie benadrukt hoe slechts een deel van de fusieconstructie kan worden samengevoegd op een bepaald spatiotemporele punt en de aanwezigheid en beschikbaarheid van niet-gebonden eiwitten. Een complexer scenario ontstond uit onderzoek naar de neuronale Q40-GVB-stam. GVB bezit intrinsiek twee verschillende fluorescentielevens. Hoewel GVB een ideale fluorophore is voor Förster resonantie-energieoverdracht (FRET)15 metingen, is het in combinatie met YFP niet raadzaam om het te gebruiken om de vorming van aggregaten in C. eleganste monitoren.
Figuur 1: Screenshot van flimfit software-interface. Schermafbeelding van de software die wordt gebruikt om de fluorescentielevensduur te berekenen. Het venster toont de interface nadat instellingen zijn gedefinieerd zoals beschreven in de tekst, en de berekening van levens werd uitgevoerd. Genummerde pijlen verwijzen naar specifieke stappen binnen het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Fluorescentie levensduur van gespierde Q40-RFP daalde met de leeftijd. (A) Representatieve kaarten van C. elegans uitdrukken gespierde Q40-RFP op dag 4 of dag 8 van het leven gegenereerd door FLIMfit. Fluorescentielevensduur, fluorescentieintensiteit en een samengevoegd beeld van beide worden verstrekt. Schaalstaven = 25 μm. Histogrammen vertonen een verdeling van gemeten levens voor alle geanalyseerde aaltjes verdeeld in 100 categorieën. bB) Staafpercelen met de gewogen gemiddelde fluorescentielevensduur van alle geanalyseerde dieren op dag 4 of dag 8 van het leven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Fluorescentie levensduur van intestinale Q44-YFP en intestinale Q85-YFP daalde met de leeftijd. (A) Representatieve kaarten van C. elegans die intestinale Q44-YFP of intestinale Q85-YFP uitdrukken op dag 4 of dag 8 van het leven gegenereerd door FLIMfit. Fluorescentielevensduur, fluorescentieintensiteit en een samengevoegd beeld van beide worden verstrekt. Schaalstaven = 25 μm. Histogrammen vertonen een verdeling van gemeten levens voor alle geanalyseerde aaltjes verdeeld in 100 categorieën. bB) Staafpercelen met de gewogen gemiddelde fluorescentielevensduur van alle geanalyseerde dieren op dag 4 of dag 8 van het leven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Fluorescentielevensduur van neuronale Q40-GVB veranderde niet met de leeftijd. (A) Representatieve kaarten van C. elegans uitdrukken neuronale Q40-GVB op dag 4 of dag 8 van het leven gegenereerd door FLIMfit. Fluorescentielevensduur, fluorescentieintensiteit en een samengevoegd beeld van beide worden verstrekt (de tweede levensduur, τ2, wordt in alle monsters aangegeven). Schaalstaven = 25 μm. Histogrammen vertonen een verdeling van gemeten levens voor alle geanalyseerde aaltjes verdeeld in 100 categorieën. bB) Staafpercelen met de gewogen gemiddelde fluorescentielevensduur van alle geanalyseerde dieren op dag 4 of dag 8 van het leven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Fluorescentie levensduur van gespierde Q40-RFP daalde bij knockdown van hsp-1. (A) Representatieve kaarten van C. elegans uitdrukken gespierde Q40-RFP op dag 4 of dag 8 van het leven gegenereerd door FLIMfit. Er wordt een samenvoeging van de fluorescentielevensduur en intensiteitskaart weergegeven. Voor beide tijdpunten worden nematoden getoond die groeiden op bacteriën die een lege vector (controle) uitdrukken of bacteriën die de hsp-1 RNAi-constructie uitdrukken. Schaalstaven = 25 μm. Histogrammen vertonen een verdeling van gemeten levens voor alle geanalyseerde aaltjes verdeeld in 100 categorieën. bB) Staafpercelen met de gewogen gemiddelde fluorescentielevensduur van alle geanalyseerde dieren op dag 4 of dag 8 van het leven, met respectievelijk controle of hsp-1 RNAi. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Fluorescentie levensduur van neuronale Q40-GVB afgenomen bij knockdown van hsp-1. (A) Representatieve kaarten van C. elegans uitdrukken neuronale Q40-GVB op dag 4 van het leven gegenereerd door FLIMfit. Er wordt een samenvoeging van de fluorescentielevensduur en intensiteitskaart weergegeven. Nematoden getoond werden gekweekt op bacteriën uitdrukken van een lege vector (controle) of bacteriën uitdrukken van de hsp-1 RNAi constructie. Schaalstaven = 25 μm. Histogrammen vertonen een verdeling van gemeten levens voor alle geanalyseerde aaltjes verdeeld in 100 categorieën. (B) Bar percelen met de gewogen gemiddelde fluorescentie levensduur van alle geanalyseerde dieren op dag 4, met controle RNAi of de hsp-1 RNAi. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een op microscopie gebaseerde techniek om geaggregeerde soorten in het C. elegans-modelsysteem te identificeren. FLIM kan de aanwezigheid van zowel geaggregeerde als oplosbare soorten die tot fluorophore zijn gefuseerd nauwkeurig karakteriseren door meting van hun fluorescentielevensduurverval. Wanneer een fusie-eiwit begint te aggregeren zal de geregistreerde gemiddelde levensduur verschuiven van een hogere naar een lagere waarde16. De neiging van aggregatie kan dan worden afgeleid door de daling van de levensduur: hoe lager de levensduur, hoe hoger de aanwezigheid van geaggregeerde eiwitsoorten in het systeem. Hierdoor wordt het mogelijk om de effecten van veroudering, ziekte of aantasting van PN op de aggregatieneiging van eiwitten te volgen.
Om de veelzijdigheid van de techniek te benadrukken, toonden onze resultaten duidelijk aan dat FLIM de veranderingen in structuur van de verschillende polyQ-constructies kon identificeren, ongeacht het weefsel of fluoropforen. Belangrijk is dat FLIM al met succes is toegepast bij de karakterisering van andere aggregatiegevoelige eiwitten binnen C. elegans, zoals α-synuclein17. Bovendien wordt het mogelijk om elke stressfactor toe te passen op C. elegans en de ontplooiing en aggregatie van elke POI te volgen. Osmotische, metaal-ion, redox, of chemische stress kan alle bevorderen toxische onevenwichtigheden die met succes kunnen worden gecontroleerd in C. elegans in dienst FLIM. Het omgekeerde zou ook mogelijk kunnen zijn: een vertraging in aggregatie of zelfs disaggregatie als gevolg van de aanwezigheid van gunstige verbindingen of het stimuleren van de PN, kan resulteren in een redding van het eiwit en een daaruit voortvloeiende levensduur verhoging.
FLIM is op grote schaal gebruikt om veranderingen in de levensduur van een stof in een breed scala van disciplines van chemie tot kanker biologie18 tot medische diagnostiek te controleren, maar sommige beperkingen blijven. Een groot probleem is de fotostabiliteit van fluorophoren. Omdat FLIM de opname van een groot aantal fotonen vereist, vermindert fotobleekmiddel het aantal verzamelde fotonen en kan de resulterende vervalcurve veranderen. Bovendien, vooral binnen het nematodesysteem, als de intensiteit van de fluorophore zelf niet hoog genoeg is om voldoende fotonen te verzamelen, is een hogere excitatie vereist, wat leidt tot snellere fotobleekte en een onbetrouwbare vervalcurve. Ten slotte vereist de techniek geavanceerde en kostbare apparatuur als add-ons voor reeds bestaande microscopiesystemen, waarbij één cruciaal element de gevoeligheid van de detectorenis 19.
Een van de belangrijkste voordelen van de berekening van de levensduur van een fluoropforen en zijn fusie-eiwit is daarentegen dat het informatie geeft over verschillende fracties van hetzelfde fluoropfore-eiwitcomplex in diverse toestanden van interacties binnen zijn omgeving, ongeacht de grotendeels onbekende concentratie. FLIM kan ook worden gebruikt om de levensduur te meten in elke fase, gas, vloeistof of vaste stof en in een medium of organisme dat normaal kan worden afgebeeld, van cellen tot organismen, en organellen tot geïmmobiliseerde, gezuiverde eiwitten20. Microscopie technieken meestal vertrouwen op de steady-state beeldvorming van een fluorescerend gelabeld eiwit. In tegenstelling tot steady state technieken kan FLIM veranderingen in binding, samenstelling en bevleesdheid van een biologisch substraat oplossen. Voor het onderzoeken van aggregatiegevoelige eiwitten kan de aanwezigheid van grote fluorescerende insluitsels of foci gemakkelijk worden weergegeven, maar deze vertegenwoordigen slechts een statische, op intensiteit gebaseerde momentopname3. In het geval van geaggregeerde soorten kunnen de gevisualiseerde foci ook misleidend zijn, omdat een hoge concentratie fluorofise niet noodzakelijkerwijs leidt tot sterke amyloïdevorming. Via FLIM is het in plaats daarvan mogelijk om oplosbaar te onderscheiden van onoplosbaar materiaal. Ten slotte wordt het voor elk onderzoek nuttig om zowel de op intensiteit gebaseerde metingen als de parallelle levensduurmeting te verkrijgen. Binnen de complementariteit van deze microscopietechnieken ligt hun kracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De spier-Q40-mRFP stam die door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Het neuronale Q40-GVB was een soort geschenk van het Morimoto Lab. Wij erkennen de DFG (KI-1988/5-1 aan JK, NeuroCure PhD fellowship door de NeuroCure Cluster of Excellence aan MLP), EMBO (Korte termijn fellowship to MLP) en het Bedrijf van Biologen (reissubsidies aan CG en MLP) voor financiering. We erkennen ook de Advanced Light Microscopy imaging faciliteit in het Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlijn, voor het verstrekken van de setup om de YFP constructies beeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
