Summary
L’imagerie à vie de fluorescence surveille, quantifie et distingue les tendances d’agrégation des protéines dans les modèles vivants, vieillissants et stressés de la maladie de C. elegans.
Abstract
Les fibrilles amyloïdes sont associées à un certain nombre de maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson ou la maladie d’Alzheimer. Ces fibrilles amyloïdes peuvent séquestrer des protéines métastables endogènes ainsi que des composants du réseau de protéostasie (PN) et exacerber ainsi les mauvais pliages de protéine dans la cellule. Il existe un nombre limité d’outils disponibles pour évaluer le processus d’agrégation des protéines amyloïdes chez un animal. Nous présentons un protocole pour la microscopie à vie de fluorescence (FLIM) qui permet la surveillance ainsi que la quantification de la fibrilisation amyloïde dans des cellules spécifiques, telles que les neurones, d’une manière non invasive et avec la progression du vieillissement et sur la perturbation de le PN. La FLIM est indépendante des niveaux d’expression du fluorophore et permet une analyse du processus d’agrégation sans autre coloration ni blanchiment. Les fluorophores sont étanchéités lorsqu’elles sont à proximité des structures amyloïdes, ce qui entraîne une diminution de la durée de vie de la fluorescence. L’étanchéité est directement corrélée avec l’agrégation de la protéine amyloïde. FLIM est une technique polyvalente qui peut être appliquée pour comparer le processus de fibrilisation de différentes protéines amyloïdes, stimuli environnementaux, ou des antécédents génétiques in vivo d’une manière non invasive.
Introduction
L’agrégation protéique se produit à la fois dans le vieillissement et la maladie. Les voies qui mènent à la formation et au dépôt de grands amyloïdes ou d’inclusions amorphes sont difficiles à suivre et leur cinétique est tout aussi difficile à démêler. Les protéines peuvent se tromper en raison de mutations intrinsèques dans leurs séquences de codage, comme dans le cas des maladies génétiques. Les protéines se déplient également parce que le réseau de protéostasie (PN) qui les maintient solubles et correctement pliés est altéré, comme cela arrive pendant le vieillissement. Le PN comprend les chaperons moléculaires et les machines de dégradation et est responsable de la biogenèse, le pliage, le trafic et la dégradation des protéines1.
C. elegans est apparu comme un modèle pour étudier le vieillissement et la maladie en raison de sa courte durée de vie, la nature isogénique, et la facilité de manipulation génétique. Plusieurs souches transgéniques C. elegans qui expriment des protéines pathogènes humaines dans les tissus vulnérables ont été créées. Fait important, bon nombre des souches contenant des protéines sujettes à l’agrégation récapitulent la marque des troubles amyloïdes, la formation de grandes inclusions. Grâce au corps transparent de C. elegans, ces agrégats peuvent être visualisés in vivo, non invasivement et nontructivement2. Générer n’importe quelle protéine d’intérêt (POI) dans la fusion avec un fluorophore permet d’étudier ses emplacements, le trafic, le réseau d’interaction, et le destin général.
Nous présentons un protocole pour surveiller l’agrégation des protéines pathogènes dans la microscopie imageuse vivante et vieillissante de C. eleganpar l’intermédiaire de la microscopie imageuse à vie de fluorescence (FLIM). FLIM est une technique puissante basée sur la durée de vie d’un fluorophore, plutôt que sur ses spectres d’émission. La durée de vie (tau,) est définie comme le temps moyen requis par un photon pour se décomposer de son état excité de retour à son état au sol. La durée de vie d’une molécule donnée est calculée avec la technique de domaine temporel du comptage du photon unique en corrélation temporelle (TCSPC). Dans TCSPC-FLIM, la fonction de désintégration fluorescente est obtenue en excitant le fluorophore avec des impulsions laser courtes et à haute fréquence et en mesurant les heures d’arrivée du photon émis à un détecteur en ce qui concerne les impulsions. Lors de la numérisation d’un échantillon, un tableau de données tridimensionnel est créé pour chaque pixel : le tableau comprend des informations sur la distribution des photons dans leurs coordonnées spatiales x,y et leur courbe de désintégration temporelle. Un échantillon donné devient donc une carte des vies révélant des informations sur la structure de la protéine, la liaison et l’environnement3,4. Chaque protéine fluorescente possède une durée de vie intrinsèque et précisément définie, généralement de quelques nanosecondes (ns), dépendante de ses propriétés physiochimiques. Fait important, la durée de vie d’un fluorophore est indépendante de sa concentration, de son intensité fluorescente et de la méthodologie d’imagerie. Cependant, au sein d’un système biologique, il peut être affecté par des facteurs environnementaux tels que le pH, la température, les concentrations d’ions, la saturation en oxygène et ses partenaires d’interaction. Les durées de vie sont également sensibles aux changements structurels internes et à l’orientation. Le fusion d’un fluorophore à un POI entraîne un changement dans sa vie et, par conséquent, des informations sur le comportement de la protéine fusionnée. Lorsqu’un fluorophore est entouré ou encapsulé dans un environnement étroitement lié, comme les feuilles bêta antiparallel d’une structure amyloïde, il perd de l’énergie de façon non radiative, un processus connu sous le nom d’étanchéité5. L’étanchéité du fluorophore entraîne un raccourcissement de sa durée de vie apparente. Lorsqu’elle est soluble, la durée de vie d’une protéine restera plus proche de sa valeur d’origine et plus élevée. En revanche, quand une protéine commence à s’agréger, sa durée de vie passera inévitablement à une valeur inférieure6,7. Par conséquent, il devient possible de surveiller la propension à l’agrégation de toute protéine amyloïde-formant à différents âges dans la vie C. elegans.
Ici, nous décrivons un protocole pour analyser l’agrégation d’une protéine de fusion comprenant différentes étendues de polyglutamine (CAG, Q) (Q40, Q44, et Q85). Nous physions comment la technique peut être appliquée également à différents fluorophores, tels que la protéine fluorescente cyane (PCP), la protéine fluorescente jaune (YFP) et la protéine fluorescente rouge monomérique (mRFP); et dans tous les tissus de C. elegans, y compris les neurones, les muscles et l’intestin. En outre, dans le contexte de la protéostasie, la FLIM est un outil très utile pour observer les changements lors de l’épuisement des chaperons moléculaires. Abattre l’un des principaux chaperons moléculaires, protéine de choc thermique 1 (hsp-1), via l’interférence de l’ARN produit un mauvais pliage prématuré des protéines. L’augmentation de la charge d’agrégation en raison du vieillissement, de la maladie, ou des chaperons déficients, est alors mesurée comme une diminution de la durée de vie de fluorescence.
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Protocol
1. Synchronisation de C. elegans
- Synchroniser C. elegans soit par traitement de solution d’hypochlorite alcaline ou via la ponte simple pour 4 h à 20 oC8.
- Cultivez et maintenez les nématodes à 20 oC sur les plaques moyennes de croissance des nématodes (NGM) ensemencées avec OP50 E. coli selon les procédures standard9. Vieillissez les nématodes jusqu’au stade ou au jour du développement désiré.
REMARQUE : Dans ce protocole, les jeunes adultes sont photographiés le jour 4 et les vieux nématodes sont photographiés le jour 8 de la vie.
2. RNAi-négocié knockdown de machines chaperon via l’alimentation
REMARQUE : Effectuez le knockdown de la protéine de choc thermique 1 (hsp-1) chaperon en alimentant le vecteur RNAi correspondant aux nématodes10. Le plasmide hsp-1 RNAi a été obtenu de la bibliothèque Ahringer (id clone: F26D10.3).
- Cultivez le PLASMide HT115 (DE3) E. coli exprimant le plasmide RNAi hsp-1 pendant 6 h à la nuit dans le milieu Luria Bertani (LB) contenant 50 g/ampicilline de l’ampicilline.
- Préparer des plaques d’agar NGM fraîches contenant de l’isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) et de l’ampicilline (25 g/mL) et des graines avec les bactéries hsp-1 RNAi. Laisser sécher les plaques et induire à température ambiante pendant 1-3 jours.
- Déposer les œufs synchronisés sur une plaque de siRNA et laisser éclore, ou placer les nématodes gravidés et laisser pondre des œufs pendant 4 h à 20 oC avant de l’enlever. Cultivez les nématodes jusqu’à l’âge ou l’étape désirés.
REMARQUE : La deuxième génération de nématodes pourrait présenter un phénotype plus fort du knockdown. Le protocole et les conditions de siRNA décrits ici sont généraux et adaptés à hsp1. L’interférence d’ARN via le siRNA d’un clone/gène spécifique doit être établie et optimisée par l’utilisateur final. Il est important de noter que tous les siRNA n’ont pas la même efficacité, et il est donc recommandé de tester l’efficacité de l’élimination par quantification par la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse de transcription (RT-qPCR) ou blot occidental.
3. Préparation de diapositives de microscopie
- Le jour de l’imagerie, commencez par préparer les diapositives d’imagerie. Faire fondre l’agarose dans ddH2O à une concentration de 3% (w/v) et laisser refroidir légèrement.
- Couper l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 mL et prendre environ 200 L d’agarose fondue. Pipette l’agarose sur un toboggan en verre propre et immédiatement placer un deuxième sur le dessus, en évitant la formation de toutes les bulles. Laisser sécher et retirer délicatement la glissière en verre supérieure. Le résultat est une glissière en verre avec une surface d’agarose égale où les nématodes seront positionnés.
REMARQUE : Chaque diapositive sera utilisée pour l’image entre 5-10 nématodes. Les diapositives peuvent être préparées et entreposées pendant quelques heures dans une boîte humifiée pour empêcher l’agarose de se dessécher.
4. Montage de nématodes sur des toboggans de microscopie
REMARQUE : La FLIM exige que les nématodes soient immobilisés. Effectuez cette étape une fois que la configuration d’imagerie (p. ex., microscopes, lasers, détecteurs) est prête à l’emploi.
- À l’aide d’une prise de fil de platine, placez les nématodes de l’âge désiré sur une plaque fraîche non ensegueded et laissez-les ramper pour enlever l’excès de bactéries OP50 de leur corps.
- Préparer le composé anesthésique (azide de sodium ou levamisole) pour immobiliser le nématode. Gardez un stock NaN3 de 500 mM dans l’obscurité à 4 oC et diluez-le en ddH2O frais à une concentration finale de 250 mM. Si vous utilisez du levamisole, diluer une solution de travail de 20 mM à 2 mM dans ddH2O.
CAUTION: L’azide de sodium (NaN3) est très toxique. Utilisez des gants et des lunettes de protection et travaillez sous une capuche ventilée. - Travailler sous un stéréomicroscope, placer une goutte de composé anesthésique de 10 L sur un tampon d’agarose et y transférer délicatement 5-10 nématodes. Utilisez une pointe de cils pour séparer les nématodes. Gardez-les proches mais ne touchez pas pour faciliter la localisation des nématodes lors de l’acquisition d’images.
- Superposer soigneusement les nématodes d’un coverlip. Prenez des mesures dans les 1 h après le montage.
REMARQUE: Les deux anesthésiques finiront par tuer C. elegans. Les nématodes doivent être complètement immobiles pendant l’imagerie, car la carte de la durée de vie est enregistrée à partir de chaque pixel. Tout mouvement des paramètres x,y empêche la lecture de la durée de vie dans le même pixel excité.
5. Acquisition de données FLIM
REMARQUE : Dans ce protocole, la durée de vie du fluorophore est acquise par la méthode TCSPC de domaine temporel. FLIM nécessite une impulsion de lumière pour être générée par le laser à un rythme de répétition fixe et constante. Le taux de répétition varie selon le type laser et doit être connu par l’utilisateur. Les mesures à vie sont effectuées par des détecteurs et des équipements électroniques installés à côté d’un microscope conventionnel. Dans ce protocole, des mesures sont effectuées sur trois microscopes confocals à balayage laser différents avec des détecteurs et des logiciels fournis par deux entreprises différentes(Tableau des matériaux) pour l’acquisition de vies mRFP, CFP et YFP, respectivement. Vérifiez que les filtres corrects d’émission/excitation sont en place et minimisez tout rétroéclairage ou moniteur avant de commencer. Avant de commencer toute expérience, établir la photostabilité du fluorophore choisi. Si le fluorophore blanchit dans un court laps de temps dans les tissus nématodes, il n’est pas adapté pour les mesures FLIM dans C. elegans.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition FLIM. Le logiciel FLIM permet également le contrôle du microscope confocal. Localiser l’onglet/bouton pour permettre l’activation des sorties du détecteur et appuyez sur Activer les sorties.
- Acquérir la fonction de réponse aux instruments (IRF), qui décrit la précision de synchronisation de la configuration instrumentale.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée de préférence avant de monter les nématodes.- Si disponible, supprimez les filtres excitation/émission.
- Placez un allier vide au-dessus de l’objectif et trouvez sa surface. Enregistrez le signal de dispersion obtenu à partir du coverlip pour un minimum de 30 s.
REMARQUE : Pour une durée de vie de plusieurs nanosecondes, le logiciel d’acquisition peut automatiquement estimer le changement iRF. L’acquisition d’un IRF est toujours recommandée.
- Placez la glissière avec les C. elegans montés sur la scène. À l’aide d’une lentille de grossissement 10x en mode transmission et localisation de la position des nématodes sur la diapositive.
- Retirez la glissière, passez l’objectif à une lentille de grossissement 63x et appliquez le support d’immersion requis (p. ex., huile). Remplacez la diapositive sur la scène et localisez les nématodes.
- Localiser le gestionnaire de trou d’épingle sur le logiciel d’acquisition et l’ouvrir au Maximum. Commencez à numériser l’échantillon, sélectionnez une région d’intérêt (p. ex., tête, haut du corps) et concentrez-vous sur son plan de projection maximal.
- Surveillez le pouls laser et les trois autres valeurs présentes sur l’interface du logiciel : The Constant Fraction Discriminator (CFD), le Time-to-Amplitude (TAC) et le convertisseur analogique-numérique (ADC).
REMARQUE : Le laser doit avoir une porte maximale de 1 x 108 nombres de photon simples. Ce nombre représente le nombre maximum de photons fournis par le laser. Le CFD fournit des informations sur la réception de l’impulsion de photon unique en référence à l’impulsion laser par le détecteur. Cette valeur devrait être d’environ 1 x 105. Le TAC établit une distinction entre le moment où un photon a été détecté et l’impulsion laser suivante. Enfin, l’ADC convertit la tension TAC en un signal de mémoirestorable 11. La CFD, le TAC et l’ADC devraient toutes avoir des valeurs similaires pour s’assurer que les photons émis par le fluorophore ne sont pas perdus. Une évaluation correcte de ces paramètres garantit que suffisamment de photons sont collectés pour créer une carte précise à vie. - Sur l’interface du logiciel FLIM, prévisualisez le nombre de photons détectés : la valeur ADC doit se situer entre 1 x 104 et 1 x 105. Si nécessaire, déplacez l’accent sur un autre plan ou augmentez la puissance laser pour recueillir plus de photons.
REMARQUE : En général, le nombre de photons enregistrés par seconde ne doit pas dépasser 1 % du taux de répétition du laser. - Dans la barre de menu, sélectionnez l’onglet pour définir les paramètres d’acquisition. Sélectionnez la synchronisation d’analyse pour permettre la détection de photon unique.
- Définissez l’acquisition à un temps fixe ou à un nombre fixe de photons. Par exemple, acquérir une courbe de désintégration à vie pendant 2 minutes ou jusqu’à ce qu’un seul pixel atteigne un nombre de photon de 2 000 événements uniques. Appuyez sur Commencer à acquérir.
REMARQUE : Différents fluorophores nécessiteront différents lasers et filtres d’excitation et d’émission. Selon la luminosité de l’échantillon, la puissance laser peut également être ajustée, ce qui n’interfère pas avec la durée de vie. Ces protocoles utilisent les paramètres d’excitation/émission suivants : YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Un laser à deux photon pulsé a été utilisé pour des mesures de CFP utilisant ex800/em440 nm. Le temps et le nombre de photon requis pour l’acquisition d’une carte FLIM devront être établi empiriquement pour chaque configuration et chaque but expérimental.
6. Analyse des données FLIM à l’aide du logiciel FLIMfit
REMARQUE : Effectuez l’analyse des données à l’aide de l’outil logiciel FLIMfit développé à l’Imperial College De Londres12 (voir la figure 1).
- Ouvrez le logiciel et importz des fichiers de données FLIM via File . Chargez les données FLIM. Chargez tous les échantillons d’une seule condition, même s’ils sont obtenus en différentes sessions et à partir de différentes répétitions biologiques.
- Si nécessaire, segmentez un seul nématode à partir de n’importe quelle image FLIM via Segmentation . Gestionnaire de segmentation. Faites glisser l’outil de culture autour de la zone d’intérêt jusqu’à ce qu’il soit mis en évidence. Une fois terminé, appuyez sur OK.
REMARQUE : La segmentation doit être faite pour toutes les images. - Sélectionnez une petite région où apparaît l’image basée sur l’intensité d’un C. elegans (figure 1, Flèches 1). La courbe de décomposition de cette région apparaîtra dans la grande fenêtre de désintégration du côté droit de l’interface(figure 1, Flèche 2).
REMARQUE : La pourriture peut être affichée linéairement ou logarithmiquement. - Définissez les paramètres corrects pour extrapoler la durée de vie via l’algorithme du logiciel tel que décrit dans les étapes 6.5-6.8.
- Sur l’onglet Données (figure 1, Flèche 3) :
- Définissez une valeur minimale intégrée arbitraire pour exclure tous les pixels trop faibles pour produire un bon ajustement. Selon l’échantillon C. elegans, cette valeur varie de 40 à 300. Entrez différentes valeurs jusqu’à ce qu’un aperçu satisfaisant soit atteint.
- Sélectionnez un Time Min et un numéro Time Max pour limiter le signal FLIM à ces valeurs. Tous les événements qui apparaissent avant et après ce seuil seront exclus.
REMARQUE: Par exemple, pour l’analyse de mRFP, les événements avant 800 ps et après 4.000 ps ont été exclus. Ces valeurs dépendent de la durée de vie du fluorophore et doivent être déterminées par l’utilisateur final. - Ne modifiez pas les comptes/Photon prédéfinis de 1.
- Entrez le taux de répétition, dans MHz, du laser utilisé lors de l’acquisition.
REMARQUE : Pour le protocole actuel, différents lasers ont été utilisés avec différents taux de répétition. Les deux lasers photon utilisés pour l’acquisition de durées de vie CFP possède un taux de répétition de 80 MHz, pour YFP le laser se répète à 40 MHz, et pour mRFP la valeur est de 78,01 MHz. Ces valeurs ont été intégrées à FLIMfit selon l’échantillon analysé. - Entrez une valeur Gate Max pour exclure tous les pixels saturés.
REMARQUE : Pour les mesures à vie dans C. elegans,cette valeur est réglée à n’importe quel grand nombre (par exemple, 1 x 108).
- Sur l’onglet Lifetime, sélectionnez un raccord global à utiliser (p. ex., un ajustement pixel-sage). Voir la figure 1, Flèche 4.
REMARQUE : Un raccord Pixel-sage produira une décomposition ajustée à chaque pixel individuel. Un montage image-sage produira un ajustement global de chaque image individuelle et affichera une valeur à vie unique par image. Un montage global-sage produira un seul montage sur l’ensemble des données. Une valeur à vie unique est fournie pour toutes les images. - Ne modifiez aucun autre paramètre, sauf le No. Sélection d’exp si l’on sait que la carie de fluorescence choisie est multiexponentielle et montre plus d’une seule vie.
REMARQUE : Dans le protocole actuel, cette fonction a été employée pour calculer les durées de vie du fluorophore biexponential de CFP. - Téléchargez l’IRF via le menu IRF : IRF (fr) Charge IRF. Pour estimer le quart de travail de l’IRF, sélectionnez iRF Estimation IRF Shift. Un ensemble de valeurs apparaîtra automatiquement sur l’onglet IRF. Une fois cela établi, ne modifiez aucun autre paramètre de cet onglet.
- Une fois que tous les paramètres sont définis, appuyez sur Fit Dataset (figure 1, Flèche 5). L’algorithme produira un ajustement pour la courbe de décomposition et établira une valeur à vie pour chaque image.
REMARQUE : L’ajustement qui en résulte, mis en évidence à la ligne bleue, devrait se chevaucher avec tous les événements. Un bon ajustement est obtenu lorsque tous les événements sont alignés le long de l’ajustement. - Cliquez sur l’onglet Paramètres (figure 1, Flèche 6), situé dans les menus en haut à droite de l’interface du logiciel, et sélectionnez Statistique: w_mean (moyenne pondérée) et vérifiez que la valeur chi2 est aussi proche que possible de 1.
REMARQUE : Un chi2 proche de l’un d’eux assure la précision de l’ajustement. La valeur à vie de l’image sélectionnée est ainsi révélée comme tau_1. - Exporter toute information d’intérêt : Fichier Images d’intensité d’exportation/Table/Images/Histogrammes. Enregistrer les paramètres de données utilisés pour calculer la durée de vie : Fichier Enregistrer les paramètres de données.
REMARQUE : Les paramètres utilisés seront enregistrés pour une analyse future des échantillons sélectionnés.
7. Représentations graphiques des données FLIM
REMARQUE : Les durées de vie prélevées à partir de différents échantillons peuvent être représentées visuellement de diverses façons. Sélectionnez pour indiquer les valeurs à vie en nanosecondes ou en picosecondes.
- Montrez la qualité de l’ajustement et la précision de la courbe en exportant la courbe de décomposition directement à partir de FLIMfit.
- Représenter la distribution des photons en traçant la fréquence du nombre de photons par rapport à la valeur à vie dans un histogramme.
- Enfin, pour la comparaison statistique, si vous comparez deux échantillons ou plus, placez des valeurs à vie plus l’écart standard de la moyenne dans un graphique à barres de parcelle de dispersion. Effectuez toute analyse statistique souhaitée.
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Representative Results
Le protocole montre comment surveiller avec précision la formation d’espèces agrégées dans les C. elegansvivants, tant pendant son vieillissement naturel que lorsqu’elles sont soumises au stress. Nous avons sélectionné quatre souches différentes de nématodes transgéniques exprimant des protéines de polyglutamine de 40Q, 44Q, ou 85Q répétitions. Ces protéines sont synthétisées dans différents tissus et ont été fusionnées à différents fluorophores. Les souches C. elegans ont exprimé soit Q40-mRFP dans les muscles de la paroi du corps (mQ40-RFP), Q40-CFP dans le système nerveux (nQ40-CFP), et soit Q44-YFP ou Q85-YFP dans l’intestin (iQ44-YFP et iQ85-YFP)13. Pour illustrer comment le vieillissement favorise l’agrégation, nous avons recueilli la durée de vie de ces souches de polyQ chez les jeunes nématodes, au quatrième jour de la vie, et les vieux nématodes, au 8e jour. Pour montrer les effets d’une carence dans le PN, nous avons effectué un knockdown de hsp-1 dans le mQ40-RFP et les souches nQ40.
Une fois que les valeurs à vie ont été extrapolées par l’intermédiaire du logiciel FLIMfit, les données obtenues ont montré une réduction claire de la durée de vie de l’une des constructions de polyQ lorsqu’elles ont été agrégées en raison de la charge de glutamine, du vieillissement ou du stress. La FLIM a fait la distinction entre la fraction de protéines solubles et les espèces agrégées, et leur transition, en enregistrant un changement dans leur vie.
Au jour 4, le mQ40-RFP affichait une durée de vie moyenne de fluorescence de 1,69 ns(figure 2). Au vieillissement, des espèces plus agrégées sont apparues, apparaissant comme des foyers à vie faible dans les images à vie et déplaçant l’histogramme à des durées de vie réduites(figure 2A). En traçant la durée de vie moyenne de fluorescence de chaque image acquise au-dessus de l’âge des nématodes une réduction significative de la durée de vie de fluorescence, et donc l’accumulation d’espèces agrégées, est devenue visible(figure 2B). La capacité de pliage des protéines du PN a diminué après le jour 4 de la vie dans C. elegans14 et les protéines sujettes à l’agrégation encore mal pliées pour se regrouper en agrégats amyloïdes et amorphes. Outre le PN, les propensions intrinsèques à l’agrégation d’une certaine protéine ont joué un rôle important dans la progression de la formation globale. Ceci a été analysé en comparant le comportement d’iQ44-YFP et iQ85-YFP. Le Q-stretch plus long de l’iQ85 était plus enclin à l’agrégation et a montré un changement de durée de vie de fluorescence dans l’histogramme déjà au jour 4 de la vie (figure 3A). En fait, au jour 4, la formation de foci a été observée pour iQ85, alors qu’elle était toujours absente dans iQ44. Au vieillissement, cependant, iQ44 a également montré la formation de foci et donc une durée de vie réduite de fluorescence. Étant donné que l’iQ85 présentait déjà des agrégats au début de l’âge adulte, la progression de l’agrégation au vieillissement était moins prononcée, mais significative(figure 3B). Enfin, nous n’avons pas détecté la formation de foyers ni diminué la durée de vie de fluorescence dans la souche nQ40-CFP(figure 4A). Pour cette souche, il n’y avait que des changements subtils et non significatifs à la durée de vie moyenne de fluorescence au vieillissement(figure 4B), potentiellement due aux neurones étant moins sensibles pour des raisons encore inconnues.
L’élimination du hsp-1 pose un défi au PN de mQ40 et nQ40 exprimant des nématodes. L’épuisement par médiation de l’ARNi de hsp-1 a entraîné une augmentation significative de l’agrégation(figure 5 et figure 6). Q40 exprimé dans les muscles de la paroi du corps a eu tendance à former un petit nombre de grands foyers entourés de matériel non agrégaté. Il en est résulté deux pics distinctifs dans les histogrammes (environ 1,7 ns et 1,4 ns, voir la figure 5A). Les nématodes âgés et traités par les ARNi ont montré une forte augmentation du pic à vie faible, ce qui a fini par diminuer la durée de vie moyenne de fluorescence(figure 5B). Comparé à ce comportement biphasique de Q40 dans les muscles, le Q40 neuronal a montré un comportement d’agrégation plus divers. Nous ne pouvions pas directement corréler la formation de foyers avec l’agrégation comme dans la souche d’expression musculaire(figure 6A). Parce que FLIM offre l’occasion d’évaluer le degré d’agrégation, les histogrammes ont révélé qu’il n’y avait pas de pic distinct, mais une distribution généralisée des durées de vie de fluorescence, ce qui indique une composition complexe de différents oligomers et des agrégats de commande plus élevée. Pourtant, le degré global d’agrégation pourrait être évalué en traçant la durée de vie moyenne de fluorescence(figure 6B), montrant que hsp-1 knockdown a conduit à un coup de pouce dans l’agrégation.
Il est important de noter que la durée de vie des fluorophores, exempte d’un partenaire de fusion et à l’extérieur d’un système biologique, était plus élevée. Étant donné que la durée de vie est principalement affectée par son environnement, une légère réduction de la durée de vie de la DP et de la DP était déjà perceptible dans les tissus de C. elegans. Il est donc important d’obtenir la durée de vie de la POI soluble dans le nématode comme un contrôle approprié. Une comparaison entre la fraction soluble avec une durée de vie plus élevée et une fraction agrégée avec une durée de vie plus faible peut alors être faite. Ici, la diminution de la durée de vie corrélée avec la formation de foyers visibles dans les cellules musculaires et intestinales. Pourtant, une fraction des foyers n’a montré aucune diminution de la durée de vie de fluorescence (voir la figure 2 et la figure 3, les flèches blanches). Cette caractéristique met en évidence comment seule une partie de la construction de fusion pourrait être agrégée à un point spatiotemporal particulier, et la présence et la disponibilité de protéines non liées. Un scénario plus complexe est né de l’étude de la souche neuronale Q40-CFP. CFP possède intrinsèquement deux durées de vie distinctes de fluorescence. Bien que le PCP soit un fluorophore idéal pour le transfert d’énergie par résonance (FRET)15 mesures, en conjonction avec YFP, il n’est pas conseillé de l’employer pour surveiller la formation d’agrégats à C. elegans.
Figure 1 : Capture d’écran de l’interface logicielle FLIMFit. Capture d’écran du logiciel utilisé pour calculer les durées de vie de fluorescence. La fenêtre représente l’interface après que les paramètres ont été définis comme décrits dans le texte, et le calcul des durées de vie a été effectué. Les flèches numérotées se réfèrent à des étapes spécifiques dans le protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les durées de vie de fluorescence de la DP musculaire du T40 ont diminué avec l’âge. (A) Cartes représentatives de C. elegans exprimant la Q40-RFP musclée le jour 4 ou le jour 8 de la vie générée par FLIMfit. Des durées de vie de fluorescence, une intensité de fluorescence et une image fusionnée des deux sont fournies. Barres d’échelle de 25 m. Les histogrammes montrent une distribution des durées de vie mesurées pour tous les nématodes analysés divisés en 100 catégories. (B) Parcelles de bar montrant les durées de vie moyennes pondérées de fluorescence de tous les animaux analysés le jour 4 ou le jour 8 de la vie, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les durées de vie de fluorescence de L’intestin Q44-YFP et du Q85-YFP intestinal ont diminué avec l’âge. (A) Cartes représentatives de C. elegans exprimant l’intestin Q44-YFP ou L’intestin Q85-YFP le jour 4 ou le jour 8 de la vie généré par FLIMfit. Des durées de vie de fluorescence, une intensité de fluorescence et une image fusionnée des deux sont fournies. Barres d’échelle de 25 m. Les histogrammes montrent une distribution des durées de vie mesurées pour tous les nématodes analysés divisés en 100 catégories. (B) Parcelles de bar montrant les durées de vie moyennes pondérées de fluorescence de tous les animaux analysés le jour 4 ou le jour 8 de la vie, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Les durées de vie de fluorescence du Q40-CFP neuronal n’ont pas changé avec l’âge. (A) Cartes représentatives de C. elegans exprimant neuronale Q40-CFP le jour 4 ou jour 8 de la vie générée par FLIMfit. Les durées de vie de fluorescence, l’intensité de fluorescence et une image fusionnée des deux sont fournies (la deuxième vie, 2, est indiquée dans tous les échantillons). Barres d’échelle de 25 m. Les histogrammes montrent une distribution des durées de vie mesurées pour tous les nématodes analysés divisés en 100 catégories. (B) Parcelles de bar montrant les durées de vie moyennes pondérées de fluorescence de tous les animaux analysés le jour 4 ou le jour 8 de la vie, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : La durée de vie de fluorescence de la T40-RFP musculaire a diminué à la suite d’un renversement de hsp-1. (A) Cartes représentatives de C. elegans exprimant la Q40-RFP musclée le jour 4 ou le jour 8 de la vie générée par FLIMfit. Une fusion de la carte de la durée de vie et de l’intensité de fluorescence est affichée. Pour les deux points de temps, les nématodes qui ont grandi sur les bactéries exprimant un vecteur vide (contrôle) ou des bactéries exprimant la construction hsp-1 RNAi sont montrés. Barres d’échelle de 25 m. Les histogrammes montrent une distribution des durées de vie mesurées pour tous les nématodes analysés divisés en 100 catégories. (B) Parcelles de bar montrant les durées de vie moyennes pondérées de fluorescence de tous les animaux analysés le jour 4 ou le jour 8 de la vie, avec contrôle ou hsp-1 RNAi, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : La durée de vie de fluorescence du Q40-CFP neuronal a diminué à la suite d’un renversement de hsp-1. (A) Cartes représentatives de C. elegans exprimant neuronale Q40-CFP le jour 4 de la vie générée par FLIMfit. Une fusion de la carte de la durée de vie et de l’intensité de fluorescence est affichée. Les nématodes montrés ont été cultivés sur des bactéries exprimant un vecteur vide (contrôle) ou des bactéries exprimant la construction hsp-1 RNAi. Barres d’échelle de 25 m. Les histogrammes montrent une distribution des durées de vie mesurées pour tous les nématodes analysés divisés en 100 catégories. (B) Parcelles de bar montrant les durées de vie pondérées moyenne de fluorescence de tous les animaux analysés le jour 4, avec le contrôle RNAi ou le hsp-1 RNAi. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole présenté ici décrit une technique à base de microscopie pour identifier les espèces agrégées dans le système modèle C. elegans. FLIM peut caractériser avec précision la présence d’espèces agrégées et solubles fusionnées à un fluorophore par mesure de leurs caries de fluorescence à vie. Lorsqu’une protéine de fusion commence à agréger sa durée de vie moyenne enregistrée passera d’une valeur plus élevée à une valeur inférieurede 16. La propension de l’agrégation peut alors être déduite par la baisse de la vie : plus la durée de vie est faible, plus la présence d’espèces de protéines agrégées dans le système est élevée. Ainsi, il devient possible de suivre les effets du vieillissement, de la maladie ou de l’affaiblissement de PN sur la propension d’agrégation de n’importe quelle protéine.
Pour souligner la polyvalence de la technique, nos résultats ont clairement montré que FLIM pouvait identifier les changements de structure des différentes constructions de polyQ, quel que soit le tissu ou le fluorophore. Fait important, FLIM a déjà été appliqué avec succès dans la caractérisation d’autres protéines sujettes à l’agrégation dans C. elegans, tels que la synucleine17. En outre, il devient possible d’appliquer n’importe quel facteur de stress à C. elegans et de suivre le déroulement et l’agrégation de tout POI. L’osmotique, l’ion métallique, le redox ou le stress chimique peuvent tous favoriser des déséquilibres toxiques qui peuvent être surveillés avec succès dans C. elegans employant FLIM. L’inverse pourrait également être possible: un retard dans l’agrégation ou même la désagrégation due à la présence de composés bénéfiques ou le renforcement de la PN, peut entraîner un sauvetage de la protéine et une augmentation de la durée de vie conséquente.
FLIM a été largement utilisé pour surveiller les changements dans la vie de toute substance dans un large éventail de disciplines de la chimie à la biologie du cancer18 au diagnostic médical, mais certaines limitations demeurent. Un problème principal est la photostabilité des fluorophores. Étant donné que la FLIM nécessite l’enregistrement d’un grand nombre de photons, le photobleaching réduit le nombre de photons collectés et peut modifier la courbe de désintégration qui en résulte. En outre, en particulier dans le système de nématode, si l’intensité du fluorophore lui-même n’est pas suffisamment élevée pour que suffisamment de photons soient recueillis, une excitation plus élevée est nécessaire, conduisant à un photobleaching plus rapide et une courbe de désintégration peu fiable. Enfin, la technique nécessite un équipement sophistiqué et coûteux comme add-ons aux systèmes de microscopie préexistante, avec un élément critique étant la sensibilité des détecteurs19.
Inversement, l’un des principaux avantages de calculer la durée de vie d’un fluorophore et de sa protéine de fusion est qu’elle fournit des informations sur différentes fractions du même complexe fluorophore-protéine dans divers états d’interactions dans son environnement, indépendamment de sa concentration largement inconnue. FLIM peut également être utilisé pour mesurer la durée de vie dans n’importe quelle phase, gaz, liquide, ou solide et dans n’importe quel milieu ou organisme qui peut normalement être photographié, des cellules aux organismes, et les organites aux protéines immobilisées et purifiées20. Les techniques de microscopie reposent généralement sur l’imagerie à stable état d’une protéine marquée fluorescente. Contrairement aux techniques d’état stables, FLIM peut résoudre les changements dans la liaison, la composition et la conformation d’un substrat biologique. Pour étudier les protéines sujettes à l’agrégation, la présence de grandes inclusions fluorescentes ou de foyers peut être facilement illustrée, mais celles-ci ne représentent qu’un instantané statique basé sur l’intensité3. Dans le cas des espèces agrégées, les foyers visualisés peuvent également être trompeurs, car une forte concentration de fluorophore n’entraîne pas nécessairement une forte formation amyloïde. Via FLIM, il est plutôt possible de distinguer les matériaux solubles des matières insolubles. Enfin, il devient avantageux pour toute enquête d’obtenir à la fois les mesures basées sur l’intensité et la mesure de la durée de vie parallèle. Dans la complémentarité de ces techniques de microscopie se trouve leur force.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La souche muscle-Q40-MRFP fournie par la CCG, qui est financée par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440). Le neuronal-Q40-CFP était un bon cadeau du Morimoto Lab. Nous reconnaissons le DFG (KI-1988/5-1 à JK, neuroCure PhD fellowship par le Groupe d’excellence NeuroCure à MLP), EMBO (bourse à court terme à MLP) et la Société des biologistes (subventions de voyage à CG et MLP) pour le financement. Nous reconnaissons également l’installation d’imagerie par microscopie lumineuse avancée du Centre max Delbrack de médecine moléculaire de Berlin pour avoir fourni la configuration pour l’image des constructions YFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
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