Summary
הדמיה של מסכי החיים של הקרינה הפלואורסצנטית, כימות ומבדיל את נטיות הצבירה של חלבונים בחיים, הזדקנות, והדגיש מודלים של מחלות C.
Abstract
סיבים עמילואיד קשורים מספר מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון, או אלצהיימר. העמילואיד הללו יכול להתאים חלבונים אנדוגניים, כמו גם רכיבים של רשת פרוטאוסטזיס (PN) ובכך להחריף את החלבון misfolding בתא. יש מספר מוגבל של כלים הזמינים כדי להעריך את תהליך הצבירה של חלבונים עמילואיד בתוך בעל חיים. אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופ לכל החיים של הזריחה (FLIM) המאפשר ניטור כמו גם כימות של העמילואיד בתאים ספציפיים, כגון נוירונים, בצורה לא פולשנית ועם ההתקדמות של הזדקנות על הפרטורציה של PN. FLIM אינה תלויה ברמות הביטוי של הפלואורוופפור ומאפשרת ניתוח של תהליך הצבירה ללא כתמים או הלבנה נוספים. Fluorophores הם מורהים כאשר הם בקרבת מבנים עמילואיד, אשר גורמת לירידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית. הקוצ'ינג מתואם ישירות לצבירת חלבון ה-עמילואיד. FLIM היא טכניקה רב-תכליתית שניתן להחיל כדי להשוות את תהליך fibrilization של חלבונים עמילואיד שונים, גירויים סביבתיים, או רקע גנטי vivo באופן לא פולשני.
Introduction
צבירת חלבונים מתרחשת הן בהזדקנות והן במחלה. המסלולים להוביל היווצרות והתצהיר של amyloids גדול או אמורפיות קשה לעקוב אחר הקינטיקה שלהם הם דומים מאתגרת לפענח. חלבונים יכול להטעות בשל מוטציות פנימיות בתוך רצפי הקידוד שלהם, כמו במקרה של מחלות גנטיות. חלבונים גם misfold כי הרשת פרוטאוסטזיס (PN) שמשאיר אותם מסיסים ומקופל כראוי הוא לקוי, כפי שקורה במהלך ההזדקנות. ה-PN כולל מלווים מולקולריים וmachineries השפלה והוא אחראי על ביוגנזה, קיפול, סחר והשפלה של חלבונים1.
ג. אלגיה התפתחה כמודל לחקר הזדקנות ומחלות בשל תוחלת החיים הקצרה שלה, הטבע האיזוגני וקלות התפעול הגנטי. מספר זנים של C. אלגיה המבטאים את החלבונים הגורמים למחלות אנושיות ברקמות פגיעות נוצרו. חשוב מכך, רבים מבין הזנים המכילים חלבונים הנוטים לצבור לכידה של סימן ההיכר של הפרעות עמילואיד, היווצרות של הכללות גדולות. הודות לגוף השקוף של ה-"אלאלגיה" , ניתן לדמיין את האגרגטים האלה בvivo, באופן בלתי פולשני ובלתי מורגש2. יצירת חלבון כלשהו של עניין (פוי) ב פיוז ' ן עם fluorophore מאפשר לחקור את מיקומם, סחר, אינטראקציה ברשת, והגורל הכללי.
אנו מציגים פרוטוקול לנטר את צבירת החלבונים הגורמים למחלות בחיים ובהזדקנות באמצעות מיקרוסקופהדמיה מתקופת החיים הפלואורסצנטית (flim). FLIM היא טכניקה רבת עוצמה המבוססת על החיים של fluorophore ולא ספקטרום הפליטה שלה. החיים (טאו, τ) מוגדר כזמן הממוצע הנדרש על ידי פוטון להירקב מהמצב הנרגש שלו בחזרה למדינה הקרקע שלה. תקופת החיים של מולקולה נתונה מחושבת עם טכניקת הזמן-תחום של מתאם הפוטון בודד הזמן (TCSPC). ב TCSPC-FLIM, הפונקציה ריקבון פלורסנט מושגת על ידי מרגש fluorophore עם קצר, בתדר גבוה פולסים לייזר ומדידת זמני הגעתו של פוטון הנפלט גלאי ביחס לפולסים. בעת סריקת דוגמה, נוצר מערך נתונים תלת-מימדי עבור כל פיקסל: המערך כולל מידע על התפלגות הפוטונים בקואורדינטות x, y מרחבית ועקומת הדעיכה שלהם. דוגמה נתונה הופכת למפת תקופות חיים החושפת מידע על מבנה החלבון, הכריכה והסביבה3,4. כל חלבון פלורסנט בעל חיים מהותיים ומוגדרים בדיוק, בדרך כלל של כמה ננושניות (ns), התלויים במאפיינים הפיזיוכימיים שלו. וחשוב מכך, תקופת החיים של פלואורואופלפור אינה תלויה בריכוז שלה, בעוצמת הפלורסנט ובמתודולוגיה של הדמיה. עם זאת, בתוך מערכת ביולוגית, זה יכול להיות מושפע גורמים סביבתיים כגון pH, טמפרטורה, ריכוזי יונים, רווית חמצן, ואת השותפים אינטראקציה שלה. משך החיים רגיש גם לשינויים ולאוריינטציה פנימיים של המבנה. החדרת פלואורואופלפור ל-פוי גורמת לשינוי בתקופת חייו וכתוצאה מכך מידע על התנהגות החלבון התמזגו. כאשר fluorophore מוקף או כפוף בסביבה מאוגד היטב, כגון גיליונות בטא אנטי מקבילי של מבנה עמילואיד, הוא מאבד את האנרגיה בלתי-קרינה, תהליך המכונה מקוצ'ינג5. קוצ'ינג של fluorophore תוצאות קיצור של החיים לכאורה שלה. כאשר מסיסים, חיי החלבון יישארו קרובים יותר לערך המקורי, הגבוה יותר. לעומת זאת, כאשר חלבון מתחיל לצבור, החיים שלו באופן בלתי נמנע משתנה לערך נמוך יותר6,7. לכן, ניתן לנטר את הנטייה של הצבירה של כל חלבון היוצר עמילואיד בגילאים שונים בחיים C. אלגיה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הצבירה של חלבון היתוך המורכב polyglutamine שונים (הקאג, Q) מותח (Q40, Q44, ו Q85). אנו ממחישים כיצד ניתן ליישם את הטכניקה באופן שווה לצבעים שונים, כגון חלבון פלורסנט כחול (CFP), חלבון פלורסנט צהוב (YFP) ו חלבון פלורסנט monomeric (mRFP); ובכל הרקמות של הג, כולל הנוירונים, השרירים והמעיים. יתר על כן, בהקשר של פרוטאוסטזיס, FLIM הוא כלי שימושי מאוד להתבונן שינויים על דלדול של מלווים מולקולריים. הורסים את אחד מהמלווים המולקולריים המרכזיים, חלבון הלם חום 1 (hsp-1), באמצעות הפרעות RNA מפיקה חוסר מוקדמות של חלבונים. הגידול בעומס מצבור כתוצאה של הזדקנות, מחלות או מלווים לקויה, נמדד אז כירידה בחיים הפלואורסצנטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סנכרון הג
- סינכרון C. אלגיה או באמצעות הטיפול היפוכלוריט פתרון אלקליין או דרך הנחת ביצה פשוטה עבור 4 h ב 20 ° צ'8.
- לגדול ולתחזק נמטודות ב 20 ° c על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) צלחות שנזרע עם OP50 E. coli על פי הליכים סטנדרטיים9. גיל הנמדות עד לשלב או ליום ההתפתחותי המבוקש.
הערה: בפרוטוקול זה, מבוגרים צעירים מתתמונות ביום 4 והנמטודות הישנים מתתמונות ביום 8 של החיים.
2. RNAi-בתיווך הסתרה של מכונות המלווה באמצעות האכלה
הערה: ביצוע הנוק-אין של חלבון הלם חום 1 (hsp-1) המלווה על ידי הזנת וקטור rnai המקביל ל-נמטודות10. התקן hsp-1 rnai באמצע התקבל מספריית האנגר (מזהה שיבוט: f26d 10.3).
- לגדל את HT115 (DE3) E. coli המבטא את הפלבין הראשון rnai-1 במשך 6 h אל הלילה לוריא ברטני (LB) בינונית המכילה 50 μg/mL אמפיצילין.
- להכין לוחות NGM אגר טריים המכילים איזופרופיל β-D-1-thioגלאוסייד (IPTG; 1 מ"מ) ו אמפיצילין (25 μg/mL) וזרע עם חיידקים hsp-1 rnai. השאירו צלחות יבש לזרז בטמפרטורת החדר עבור 1-3 ימים.
- המקום ביצים מסונכרן על צלחת sirna ולצאת לבקוע, או למקם נמטודות ולאפשר להטיל ביצים עבור 4 h ב 20 ° c לפני הסרת. הגדל את הנמטודות עד הגיל או השלב הרצויים.
הערה: הדור השני של נמטודות עשוי להציג פנוטיפ חזק יותר של הנוק-אין. פרוטוקול siRNA והתנאים המתוארים כאן הם כלליים ומותאמים ל- hsp1. RNA הפרעה דרך siRNA של שיבוט ספציפי/גן צריך להיות מותאם וממוטב על ידי משתמש הקצה. חשוב לציין כי לא כל siRNA יש את היעילות זהה, ולכן מומלץ לבדוק את היעילות של הנוק-אין על ידי כימות על ידי כמותית הפוכה התגובה שרשרת פולימראז (RT-qPCR) או כתם המערבי.
3. הכנת שקופיות מיקרוסקופית
- ביום ההדמיה, התחל בהכנת שקופיות ההדמיה. ממיסים את הצמח ב-ddH2O בריכוז של 3% (w/v) ולתת מגניב מעט.
- חותכים את הקצה של טיפ 1 mL ולוקח בערך 200 μL של העלה נמס. פיפטה התעורר על שקופית זכוכית נקייה ומיד מניחים השני על גבי, הימנעות היווצרות של בועות כלשהן. השאר להתייבש ולהסיר בעדינות את מגלשת הזכוכית העליונה. התוצאה היא שקופית זכוכית עם משטח מעלה אפילו היכן הנמטודות יהיה ממוקם.
הערה: כל שקופית תשמש לתמונה בין 5-10 nematodes. ניתן להכין שקופיות ולאחסנו במשך מספר שעות בתיבת humified, כדי למנוע את התייבשות הצמח.
4. הרכבה על שקופיות מיקרוסקופית
הערה: FLIM דורשת שהנמטודות יהיו ללא קיבוע. בצע שלב זה לאחר הגדרת ההדמיה (למשל, מיקרוסקופים, לייזרים, גלאים) מוכן לשימוש.
- שימוש בתיל פלטינה לבחור, מקום נמטודות של הגיל הרצוי על לוחית חדשה unseeded ולתת להם לזחול כדי להסיר את עודף חיידקים OP50 מגופם.
- הכן את תרכובת ההרדמה (נתרן אזיד או levamisole) כדי לשתק את הנמטודה. לשמור על 500 mM נאן3 מניות בחושך על 4 ° c ולדלל את רענן ddh2O לריכוז הסופי של 250 mM. אם באמצעות levamisole, לדלל מלאי 20 מ"מ כדי 2 מ"מ פתרון עבודה ב ddH2O.
התראה: נתרן עזידה (נאן3) הוא רעיל מאוד. השתמש בכפפות ובמשקפי מגן ועבוד תחת המכסה המאוורר. - עבודה תחת stereomicroscope, המקום 10 μl ירידה של תרכובת הרדמה על כרית agarose בעדינות להעביר 5-10 נמטודות לתוך זה. השתמש בעצת עפעף כדי להפריד את הנמטדות. שמור אותם קרוב ביחד אבל לא לגעת כדי לאפשר לוקליזציה קלה יותר של נמטודות במהלך רכישת תמונה.
- שכבת בזהירות על הנמדות עם שמיכות. לקחת מדידות בתוך 1 h לאחר ההרכבה.
הערה: שתי ההרדמה בסופו של דבר יהרגו את הג. הנמטודות חייבים להיות משותק לחלוטין במהלך ההדמיה, מכיוון שמפת החיים מוקלטת מכל פיקסל. כל תנועה של x, הפרמטרים y מונע את הקריאה של החיים באותו פיקסל נרגש.
5. רכישת נתוני FLIM
הערה: בפרוטוקול זה, אורך החיים של הפלואורואופפור נרכש באמצעות שיטת הזמן התחום TCSPC. FLIM דורשת פעימת אור שתיווצר על-ידי הלייזר בקצב חזרה קבוע וקבוע. קצב החזרה משתנה בהתאם לסוג הלייזר וצריך להיות מוכר על ידי המשתמש. מדידות החיים מושגת על ידי גלאים וציוד אלקטרוני המותקנים לצד מיקרוסקופ קונבנציונאלי. בפרוטוקול זה, מדידות מתבצעות על שלושה שונים סריקת לייזר קונפוקלית יקרוסקופים מיקרוסקופ עם גלאים ותוכנה שסופקו על ידי שתי חברות שונות (טבלה של חומרים) לרכישת mrfp, CFP, ו yfp אורך חיים, בהתאמה. בדוק כי המסננים הנכונים של פליטה/עירור נמצאים במקומם ומצמצמים את כל הרקע או המסך לפני שמתחילים. לפני שמתחילים כל ניסוי, ליצור את הפוטויציבות של fluorophore שנבחרו. אם הפלואורופור מלבנה תוך זמן קצר בתוך רקמות נמטודות, זה לא מתאים מדידות flim ב- C...
- פתח את תוכנת הרכישה של FLIM. התוכנה flim מאפשרת גם שליטה של המיקרוסקופ קונפוקלית וקד. אתר את הכרטיסיה/לחצן כדי לאפשר לפלטי הגלאי להיות זמינים ולחץ על אפשר פלטי מדפסת.
- השג את פונקציית התגובה של המכשיר (IRF), המתארת את דיוק התזמון של הכיוונון האינסטרומנטלי.
הערה: יש לבצע שלב זה רצוי לפני טעינת הנמטודות.- אם הוא זמין, הסר את מסנני העירור/פליטה.
- מניחים שמיכות ריקות מעל המטרה ולמצוא את פני השטח שלו. הקלט את אות הפיזור שהתקבל מהכיסויים למינימום של 30 s.
הערה: למשך תקופות חיים של מספר ננושניות, תוכנת הרכישה יכולה להעריך באופן אוטומטי את משמרת ה-IRF. מומלץ תמיד לרכוש מעין IRF.
- מקם את השקופית עם ה -C. אלגיה הרכוב על הבמה. שימוש בעדשת הגדלה של 10x במצב שידור ומיקום המיקום של הנמטודות בשקופית.
- הסר את השקופית, העבר את המטרה לעדשת הגדלה של 63 x ויישם את אמצעי הטבילה הנדרש (למשל, שמן). החלף את השקופית על הבמה והחלק את הנמטודות.
- אתר את מנהל Pinhole בתוכנת הרכישה ופתח אותה למקסימום. התחל לסרוק את המדגם, בחר אזור מעניין (למשל, ראש, גוף עליון) והתמקד במישור ההקרנה המירבי שלו.
- נטר את קצב הדופק של הלייזר ואת שלושת הערכים האחרים הקיימים בממשק של התוכנה: מבדיל השבר הקבוע (CFD), הזמן לשרעת (TAC), והממיר האנלוגי לדיגיטלי (ADC).
הערה: לייזר צריך שער מקסימלי של 1 x 108 הפוטון בודד. מספר זה מייצג את המספר המירבי של פוטונים שסופקו על-ידי הלייזר. CFD מספק מידע על קבלת פולס פוטון יחיד בהתייחסות לפעימת לייזר על ידי הגלאי. ערך זה אמור להיות בערך 1 x 105. . והדופק הבא של הלייזר לבסוף, ה-ADC ממיר את מתח ה-TAC לזיכרון שניתן לשדר11. CFD, TAC, ו-ADC צריך להיות לכולם ערכים דומים כדי להבטיח כי פוטונים הנפלטים על ידי fluorophore לא יאבדו. הערכה נכונה של פרמטרים אלה מבטיחה כי מספיק פוטונים נאספים כדי ליצור מפת חיים מדויקת. - בממשק של התוכנה FLIM, תצוגה מקדימה של מספר הפוטונים שאותרו: ערך ADC צריך להיות בין 1 x 104 ו-1 x 105. אם יש צורך, להעביר את המוקד על מישור אחר או להגדיל את כוח הלייזר כדי לאסוף פוטונים יותר.
הערה: באופן כללי, מספר הפוטונים הנרשמים לשנייה אינו עולה על 1% מקצב החזרה של הלייזר. - בשורת התפריטים, בחר את הכרטיסיה כדי להגדיר את פרמטרי הרכישה. בחר ' סרוק סינכרון ' כדי לאפשר זיהוי פוטון בודד.
- הגדר את הרכישה לפרק זמן קבוע או למספר קבוע של פוטונים. לדוגמה, לרכוש עקומת ריקבון לכל החיים עבור 2 דקות או עד שפיקסל אחד מגיע לספירת פוטון של 2,000 אירועים בודדים. לחץ על התחל כדי להתחיל ברכישה.
הערה: fluorophores שונים ידרוש עירור שונים לייזרים פליטה ומסננים. על פי הבהירות של המדגם, כוח הלייזר יכול להיות גם מותאם, אשר לא יפריעו החיים. פרוטוקולים אלה משתמשים בהגדרות עירור/פליטה הבאות: YFP ex500/em520-50 ננומטר, mRFP ex561/em580-620 nm. לייזר פוטונים פעמו שני היה מועסק עבור מדידות CFP באמצעות ex800/em440 nm. כמות הזמן וספירת הפוטונים הנדרשים לרכישת מפת FLIM צריכה להיות מבוססת במידה מדעית עבור כל הגדרה וכל מטרה ניסיונית.
6. ניתוח נתוני FLIM באמצעות תוכנת FLIMfit
הערה: בצע ניתוח נתונים באמצעות כלי התוכנה FLIMfit שפותחה באימפריאל קולג '12 (ראה איור 1).
- פתח את התוכנה ויבא קבצי נתונים של FLIM באמצעות הקובץ | טעינת נתוני FLIM. טען את כל הדגימות מתנאי אחד, גם אם התקבל בהפעלות שונות ומחזרה ביולוגית שונה.
- במידת הצורך, מחלקים נמטודה בודדת מכל תמונה FLIM באמצעות פילוח | פילוח מנהל. גררו את כלי החיתוך מסביב לאזור העניינים עד שיסומן. לאחר השלמתו, לחץ על אישור.
הערה: יש לבצע פילוח עבור כל התמונות. - בחר אזור קטן שבו התמונה מבוססת העוצמה של C. אלגיה מופיעה (איור 1, חיצים 1). עקומת הדעיכה של אזור זה תופיע בחלון הריקבון הגדול בצד הימני של הממשק (איור 1, חץ 2).
הערה: ניתן להציג את הדעיכה בצורה לינארית או עברו וגריתמית. - הגדר את הפרמטרים הנכונים כדי להסיק את משך החיים דרך האלגוריתם של התוכנה כמתואר בשלבים 6.5-6.8.
- בכרטיסיה נתונים (איור 1, חץ 3):
- הגדר ערך מינימום משולב שרירותי כדי שלא לכלול פיקסלים שאינם עמומים מדי כדי ליצור התאמה טובה. בהתאם לדגם C. אלגיה , ערך זה משתנה מ-40-300. קלט ערכים שונים עד להשגת תצוגה מקדימה משביעת רצון.
- בחר באפשרות מינימום ומספר מירבי של זמן כדי להגביל את האות flim לערכים אלה. כל האירועים המופיעים לפני ואחרי הסף הזה לא ייכללו.
הערה: לדוגמה, לניתוח של mRFP, האירועים לפני 800 ps ולאחר 4,000 ps לא נכללו. ערכים אלה תלויים באורך החיים של fluorophore וצריך להיקבע על ידי משתמש הקצה. - אין לשנות את הסעיפים המוגדרים מראש /פוטון של 1.
- להזין את קצב החזרה, ב MHz, של הלייזר מנוצל במהלך הרכישה.
הערה: עבור הפרוטוקול הנוכחי, לייזרים שונים היו מנוצלים עם שיעורי חזרה שונים. שני לייזר פוטון המשמש לרכישת תקופות חיים של CFP יש שיעור חזרה של 80 MHz, עבור YFP לייזר חוזר על 40 MHz, ו-mRFP הערך הוא 78.01 MHz. ערכים אלה הFLIMfit בהתאם למדגם. - קלט ערך מירבי של שער כדי שלא יכלול את כל הפיקסלים הרוויים.
הערה: עבור מדידות לכל החיים ב -C. אלגיה, ערך זה מוגדר לכל מספר גדול (לדוגמה, 1 x 108).
- בכרטיסיה ' חיים ', בחר התאמה כללית לשימוש (לדוגמה, התאמה מחוכמת פיקסל). ראה איור 1, חץ 4.
הערה: התאמה מחוכמת פיקסל תפיק ריקבון מותאם לכל פיקסל בודד. תמונה- התאמה נבונה תפיק התאמה גלובלית של כל תמונה בודדת ותציג ערך חיים בודד לכל תמונה. התאמה גלובלית ומתאימה תפיק התאמה אחת בכל קבוצת הנתונים. ערך של תקופת חיים בודדת מסופק עבור כל התמונות. - אל תשנה פרמטר אחר פרט ל -No. Exp בחירה אם ידוע כי ריקבון הקרינה הנבחר הוא רב מעריכי ומציג יותר מאשר תקופת חיים אחת.
הערה: בפרוטוקול הנוכחי, פונקציה זו הייתה מנוצל כדי לחשב את משך החיים של ה-מעריכי הביואקספוננציאלי של CFP fluorophore. - העלה את ה-IRF באמצעות תפריט IRF: irf | טען את IRF. כדי להעריך את התזוזה של IRF, בחר irf | הערכת משמרת IRF. קבוצת ערכים תופיע באופן אוטומטי בכרטיסיה Irf . לאחר הקמת הפעולה, אל תשנה פרמטרים אחרים של כרטיסיה זו.
- לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על התאם ערכת נתונים (איור 1, חץ 5). האלגוריתם יפיק התאמה לעקומת ריקבון וליצור ערך לכל החיים עבור כל תמונה.
הערה: ההתאמה המתקבלת, המסומנת בקו כחול, צריכה לחפוף את כל האירועים. התאמה טובה מתקבלת כאשר כל האירועים מיושרים לאורך ההתאמה. - לחץ על הכרטיסיה פרמטרים (איור 1, חץ 6), הממוקם בתוך התפריטים הימניים העליונים של ממשק התוכנה ובחר סטטיסטיקה: w_mean (ממוצע משוקלל) ובדוק שהערך chi2 קרוב ככל האפשר ל-1.
הערה: A chi2 קרוב לאחד מבטיח את הדיוק של ההתאמה. ערך תקופת החיים של התמונה שנבחרה יתגלה כtau_1. - יצא כל מידע מעניין: קובץ | ייצוא עוצמה תמונות/התאמה הטבלה התוצאה/תמונות/היסטגרמות. שמור את הגדרות הנתונים המשמשות לחישוב משך החיים: קובץ | שמירת הגדרות נתונים.
הערה: הפרמטרים המועסקים יישמרו לניתוח עתידי של הדגימות שנבחרו.
7. ייצוגים גרפיים של נתוני FLIM
הערה: ניתן לייצג את משך החיים שנאסף מדגימות שונות בדרכים שונות. בחר באפשרות זו כדי לציין את ערכי משך החיים בננו-שניות או ב-picoseconds ניות.
- הצג את איכות ההתאמה ואת דיוק העקומה על-ידי ייצוא עקומת הריקבון ישירות מ-FLIMfit.
- מייצגים את התפלגות הפוטונים על ידי התוויית התדירות של ספירת פוטון לעומת ערך החיים בהיסטוגרמה.
- לבסוף, לצורך השוואה סטטיסטית, אם השוואת שני דגימות או יותר, הצב ערכי חיים בתוספת סטיית תקן של הממוצע בגרף של שורת התוויה של פיזור. בצע כל ניתוח סטטיסטי רצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול מראה כיצד לפקח באופן מדויק על היווצרות מינים צבורים בתוך החיים,הן במהלך ההזדקנות הטבעית וכאשר הם חשופים ללחץ. בחרנו ארבעה זנים שונים של נמטודות המבטא חלבונים polyglutamine של או 40q, 44q, או 85 q חוזר על עצמו. חלבונים אלה מסונתז ברקמות שונות התמזגו fluorophores שונים. ה -C. אלגיה זנים הביעו Q40-mrfp בשרירי קיר הגוף (MQ40-rfp), Q40-CFP במערכת העצבים (NQ40-cfp), או Q44-yfp או Q85-yfp במעי (IQ44-yfp ו IQ85-yfp)13. כדי להמחיש כיצד ההזדקנות מקדמת צבירה, אספנו את החיים של זנים polyQ אלה ב nematodes צעירה, ביום 4 של החיים, ו nematodes הישן, ביום 8. כדי להראות את ההשפעות של מחסור ב-PN, ביצעת הסתרה של hsp-1 ב-MQ40-rfp והזנים nQ40.
לאחר ערכי החיים שהושגו באמצעות התוכנה FLIMfit, הנתונים שהתקבלו הראו ירידה ברורה במשך החיים של כל אחד מבני polyQ כאשר מצטברים עקב או עומס גלוטמין, הזדקנות, או מתח. FLIM נבדל בין שבר החלבון הנמס לבין מינים צבורים, ואת המעבר שלהם, על ידי הקלטת משמרת בחייהם.
ביום 4, mQ40-RFP הציג אורך חיים ממוצע של זריחה של 1.69 ns (איור 2). עם הזדקנות, מינים צבורים יותר הופיעו, להופיע כמו במשך החיים נמוך בתמונות החיים והעברת ההיסטוגרמה כדי להפחית את משך החיים (איור 2א). על ידי התוויית החיים מרושע הזריחה של כל תמונה רכשה על פני גיל של נמטודות ירידה משמעותית של תקופת החיים הפלואורסצנטית, ולכן הצטברות של מינים צבורים, הפך גלוי (איור 2ב). כושר קיפול החלבון של ה-PN נדחה לאחר יום 4 של החיים ב -C. אלגיה14 וחלבונים הנוטים לצבור עוד יותר מקופלים לאשכול לתוך עמילואיד ולאגרגטים אמורפיים. מלבד PN, הצבירה הפנימית נטיות של חלבון מסוים שיחק תפקיד חשוב בהתקדמות היווצרות צבירה. זה נותח על ידי השוואת ההתנהגות של iQ44-YFP ו iQ85-YFP. יותר Q-מתיחה של iQ85 היה נוטה יותר לצבור והציג משמרת החיים הפלואורסצנטית בהיסטוגרמה כבר ביום 4 של החיים (איור 3א). למעשה, ביום 4, היווצרות וקדי נצפתה עבור iQ85, כאשר עדיין נעדר iQ44. עם הזדקנות, עם זאת, iQ44 הציגו גם היווצרות וקדי ולכן מופחתת החיים זריחה. מכיוון iQ85 כבר הציגו אגרגטים בבגרות מוקדמת התקדמות הצבירה על הזדקנות היה פחות מבוטא, אך משמעותי (איור 3ב). לבסוף, לא הצלחנו לזהות את היווצרות וקדי ולא להפחית את תקופת החיים של הזריחה ב nQ40-CFP זן (איור 4א). עבור זן זה, היו רק שינויים עדינים, לא משמעותיים לאורך החיים של הזריחה הממוצע על הזדקנות (איור 4ב), פוטנציאל בשל הנוירונים להיות פחות רגישים לסיבות לא ידוע עדיין.
להפיל hsp-1 מהווה אתגר ל-PN של MQ40 ו nQ40 ביטוי nematodes. הדילול RNAi-בתיווך של hsp-1 הוביל לעלייה משמעותית בצבירה (איור 5 ואיור 6). Q40 ביטא שרירי הקיר הגוף נטו ליצור מספר קטן של וקדי גדול מוקף חומר לא צבור. זה הביא שתי פסגות להבדיל בהיסטגרמות (סביב 1.7 ns ו 1.4 ns, ראה איור 5א). נמטודות מטופלים בגילאי ו rnai הראה עלייה חזקה בשיא החיים נמוך בסופו של דבר להקטין את החיים הממוצעת הזריחה (איור 5ב). לעומת התנהגות biphasic זו של Q40 בשרירים, Q40 העצבי הציג התנהגות מגוונת יותר מצבור. לא יכולנו לתאם ישירות את היווצרות וקדי עם הצבירה כמו ביטוי שרירי זן (איור 6א). מכיוון FLIM מציע הזדמנות להעריך את מידת הצבירה, היסטורגרמות התגלו כי לא היה שיא ברור אלא התפלגות נפוצה של תקופות חיים של הזריחה, הצבעה על הרכב מורכב של oligomers שונים ואגרגטים הסדר גבוה. עדיין, המידה הכוללת של מצבור יכול להיות מוערך על ידי התוויית החיים מתכוון הזריחה (איור 6ב), מראה כי hsp-1 מנועד הוביל דחיפה בצבירה.
חשוב לציין כי החיים של fluorophores, חופשי שותף היתוך מחוץ למערכת ביולוגית, היה גבוה יותר. בגלל החיים מושפע בעיקר על ידי סביבתו, ירידה קלה של תקופת החיים של YFP ו RFP כבר מורגש בתוך הרקמות של C. אלגיה . לכן חשוב להשיג את תקופת החיים של פוי מסיסים בתוך נמטודות כפקד מתאים. לאחר מכן ניתן להשוות בין השבר הנמס לאורך חיים גבוה יותר ושבריר צבור עם תקופת חיים נמוכה יותר. כאן, ירידה בחיים בקורלציה עם היווצרות של וקדי גלוי בתוך השריר ותאי המעיים. עדיין, חלק של וקדי הציגו ללא ירידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית (ראה איור 2 ואיור 3, חיצים לבנים). תכונה זו מדגישה כיצד רק חלק ממבנה ההיתוך עשוי להיות מצטבר בנקודה מסוימת בזמן נתון, ואת הנוכחות והזמינות של חלבון לא מאוגד. תרחיש מורכב יותר התעורר מהחקירה של המתח Q40-CFP עצבי. ל-CFP מיסודה יש שתי תקופות חיים שונות של זריחה. בעוד CFP הוא fluorophore אידיאלי עבור Förster תהודה אנרגיה העברת (לדאוג)15 מדידות, בשילוב עם yfp, זה לא מומלץ להעסיק את זה כדי לפקח על היווצרות אגרגטים ב- C...
איור 1: צילום מסך של ממשק התוכנה FLIMFit. צילום מסך של התוכנה המשמשת לחישוב אורך חיים של הזריחה. החלון מתאר את הממשק לאחר שההגדרות הוגדרו כמתואר בטקסט, והחישוב של תקופות חיים בוצע. חיצים ממוספרים מתייחסים לשלבים ספציפיים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אורך חיים של הזריחה של שרירי Q40-RFP ירד עם הגיל. (א) מפות מייצגות של C. אלגיה ביטוי שרירי Q40-rfp ביום 4 או יום 8 של חיים שנוצרו על ידי FLIMfit. אורך חיים של זריחה, עוצמת קרינה ותמונה ממוזגת של שניהם מסופקים. קנה מידה של פסים = 25 μm. היסטורגרמות מציגות התפלגות של תקופות חיים נמדדות עבור כל נמטודות מנותח מחולקים לקטגוריות 100. (ב) מגרשי בר המראים את תוחלת החיים הפלואורסצנטית המשוקלל של כל בעלי החיים שנותחו ביום 4 או יום 8 לחייהם, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תקופות חיים של זריחה של מעיים Q44-yfp ומעיים Q85-yfp ירד עם הגיל. (א) מפות מייצגות של ה . אלגיה המבטא מעיים Q44-Yfp או מעיים Q85-yfp ביום 4 או יום 8 של חיים שנוצרו על ידי FLIMfit. אורך חיים של זריחה, עוצמת קרינה ותמונה ממוזגת של שניהם מסופקים. קנה מידה של פסים = 25 μm. היסטורגרמות מציגות התפלגות של תקופות חיים נמדדות עבור כל נמטודות מנותח מחולקים לקטגוריות 100. (ב) מגרשי בר המראים את תוחלת החיים הפלואורסצנטית המשוקלל של כל בעלי החיים שנותחו ביום 4 או יום 8 לחייהם, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אורך חיים של הזריחה של עצבי Q40-CFP לא השתנה עם הגיל. (א) מפות מייצגות של C. אלגיה המבטא עצבי Q40-CFP ביום 4 או יום 8 של החיים שנוצרו על ידי FLIMfit. אורך חיים של הזריחה, עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ותמונה ממוזגת של שניהם ניתנים (בגלגול השני, מצוין בכל הדגימות). קנה מידה של פסים = 25 μm. היסטורגרמות מציגות התפלגות של תקופות חיים נמדדות עבור כל נמטודות מנותח מחולקים לקטגוריות 100. (ב) מגרשי בר המראים את תוחלת החיים הפלואורסצנטית המשוקלל של כל בעלי החיים שנותחו ביום 4 או יום 8 לחייהם, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אורך חיים של הזריחה של שרירי Q40-RFP ירד על הנוק -אין-1. (א) מפות מייצגות של C. אלגיה ביטוי שרירי Q40-rfp ביום 4 או יום 8 של חיים שנוצרו על ידי FLIMfit. מיזוג של מיפוי החיים של הזריחה והאינטנסיביות מוצג. עבור שתי נקודות הזמן, נמטודות כי גדל על חיידקים ביטוי וקטור ריק (שליטה) או חיידקים המבטא את המבנה hsp-1 rnai מוצגים. קנה מידה של פסים = 25 μm. היסטורגרמות מציגות התפלגות של תקופות חיים נמדדות עבור כל נמטודות מנותח מחולקים לקטגוריות 100. (ב) מגרשי בר המראים את תוחלת החיים הפלואורסצנטית המשוקלל של כל בעלי החיים שנותחו ביום 4 או יום 8 לחייהם, עם שליטה או hsp-1 rnai, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אורך חיים של הזריחה של עצבי Q40-CFP ירד עם הנוק-אין של hsp-1. (א) מפות מייצגות של C. אלגיה ביטוי עצבי Q40-CFP ביום 4 של החיים שנוצרו על ידי FLIMfit. מיזוג של מיפוי החיים של הזריחה והאינטנסיביות מוצג. Nematodes הראו גדלו על חיידקים ביטוי וקטור ריק (שליטה) או חיידקים המבטא את המבנה hsp-1 rnai. קנה מידה של פסים = 25 μm. היסטורגרמות מציגות התפלגות של תקופות חיים נמדדות עבור כל נמטודות מנותח מחולקים לקטגוריות 100. (ב) מגרשי בר המראים את אורך חיי הזריחה המשוקלל של כל בעלי החיים המנותח ביום 4, עם rnai בקרה או hsp-1 rnai. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר טכניקה מבוססת-מיקרוסקופית לזיהוי מינים צבורים במערכת המודל של C. אלגיה . FLIM יכולה לאפיין במדויק את הנוכחות של מינים צבורים ומסיסים התמזגו לפלואורופור באמצעות מדידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית שלהם. כאשר חלבון היתוך מתחיל לצבור חיים ממוצע מוקלט שלה יעבור מגבוה יותר לערך נמוך יותר16. הנטייה של מצבור יכול להיות להסיק על ידי ירידה בחיים: ככל שתקופת החיים נמוכה יותר, הנוכחות של מינים מצטברים של חלבון במערכת. ובכך, זה הופך להיות אפשרי לעקוב אחר ההשפעות של הזדקנות, מחלה, או ליקוי של PN על הנטייה לצבור של חלבון כלשהו.
כדי להדגיש את צדדיות של הטכניקה, התוצאות שלנו הראו בבירור כי FLIM יכול לזהות את השינויים במבנה של המבנים polyQ השונים, ללא קשר לרקמות או פלואורוופפור. וחשוב מכך, FLIM כבר יושם בהצלחה באפיון של חלבונים אחרים הנוטים לצבור בתוך C. אלגיה, כגון α-סירוס ב-17. יתר על כן, ניתן להחיל כל גורם לחץ על C. אלגיה ולעקוב אחר התפתחות וצבירה של כל פוי. אוסמוטי, מטאל-יון, חמצון, או מתח כימי יכול לקדם חוסר איזון רעיל שניתן לעקוב בהצלחה ב -C. אלגיה העסקת flim. הפוך יכול להיות גם אפשרי: עיכוב מצבור או אפילו disaggregation עקב נוכחות של תרכובות מועילות או הגברת PN, יכול לגרום להצלה של החלבון להגדיל את החיים הסוגר.
FLIM הועסק באופן נרחב כדי לפקח על שינויים בחיים של כל חומר במגוון רחב של דיסציפלינות מכימיה לביולוגיה של סרטן18 לאבחון רפואי, אבל כמה מגבלות נותרו. בעיה עיקרית היא הפוטויציבות של fluorophores. מכיוון FLIM דורש הקלטה של מספר גדול של פוטונים, photobleaching לבנת מפחית את מספר הפוטונים שנאספו והוא יכול לשנות את עקומת ריקבון שנוצר. יתר על כן, במיוחד בתוך מערכת נמטודות, אם האינטנסיביות של fluorophore עצמו אינו גבוה מספיק עבור פוטונים מספיקים כדי להיות נאסף, עירור גבוה נדרש, המוביל פוטוהילבנת מהר ועקומת ריקבון אמין. לבסוף, הטכניקה דורשת ציוד מתוחכם ויקר כתוספת למערכות מיקרוסקופיה מורכבות, עם אלמנט קריטי אחד שהוא רגישות הגלאים19.
לעומת זאת, אחד היתרונות העיקריים של חישוב החיים של fluorophore וחלבון היתוך שלה הוא שהוא מספק מידע על שברים שונים של מתחם החלבונים באותו fluorophore-חלבון במצבים שונים של אינטראקציות בתוך הסביבה שלה, ללא קשר לריכוז לא ידוע ברובו. FLIM ניתן להשתמש גם כדי למדוד את תקופת החיים בכל שלב, גז, נוזלי, או מוצק בכל בינוני או אורגניזם כי יכול להיות בדרך כלל התמונה, מתאים לאורגניזמים, ו אורגלים לקיבוע, חלבונים מטוהרים20. טכניקות מיקרוסקופית בדרך כלל להסתמך על הדמיה של מצב יציב של חלבון מתויג fluorescently. בשונה משיטות קבועות של מצב, FLIM יכולה לפתור שינויים בכריכה, בקומפוזיציה וביצירת מצע ביולוגי. עבור חקירת חלבונים הנוטים לצבור, נוכחות של הכללות פלורסנט גדול או וקדי ניתן להציג בקלות, אבל אלה מייצגים רק סטטי, עוצמה מבוססי תמונה3. במקרה של מינים צבורים, הזוג דמיינו גם יכול להיות מטעה, כמו ריכוז גבוה של fluorophore לא בהכרח התוצאה של עמילואיד חזקה. דרך FLIM במקום זאת ניתן להבחין מסיסים מחומר לא מסיסים. לבסוף, הדבר נעשה מועיל לכל חקירה כדי להשיג הן את המידות המבוססות על אינטנסיביות והן את מדידת החיים המקבילים. בתוך השלימה של טכניקות אלה מיקרוסקופית שקרים כוחם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המתח שרירים-Q40-mRFP שסופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). הQ40-CFP היה מתנה מהסוג של מעבדת מורימוטו. אנו מכירים DFG (KI-1988/5-1 לייק, מלגת נוירוקיור PhD על ידי אשכול נוירוקיור של מצוינות to MLP), EMBO (האחווה לטווח קצר MLP) והחברה של ביולוגים (מענקים נסיעה ל-CG ו MLP) עבור מימון. אנו מכירים גם את מתקן הדימות המתקדם של מיקרוסקופ האור במרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית, ברלין, על מנת לספק את הכיוונון לדימוי המבנים של YFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Biology Direct. 11, 58 (2016).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. New York, NY. (2006).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Kaminski Schierle, G. S., et al. A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo. ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).
- Sandhof, C. A., et al. Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading. Autophagy. , 1-22 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).
- Becker, W., et al. Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).
- Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PloS one. 8 (8), e70687 (2013).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).
- Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).
- Laine, R. F., et al. Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of α-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).
- Kelbauskas, L., Dietel, W. Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation. Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).
- Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors. Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).
- Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).
