Summary
本稿では、低酸素虚血を起こす新生児マウスにおける複数の深度電極を用いた連続的なビデオEEG記録の方法を説明する。
Abstract
低酸素虚血は新生児発作の最も一般的な原因である。動物モデルは、新生児発作や低酸素虚血の根底にあるメカニズムと生理学を理解するために重要です。本稿では、新生児マウスにおける連続的な脳波(脳波)モニタリングを行い、低酸素虚血中の脳波背景を解析する方法を説明する。ビデオとEEGを併用すると、発作のセミオロジーの記述と発作の確認が可能になります。この方法は、実験期間におけるパワースペクトログラムおよびEEG背景パターンの傾向を分析することも可能である。この低酸素虚血モデルでは、この方法は、損傷前のEEG記録が規範的ベースラインを得ることを可能にし、傷害および回復の間に。総モニタリング時間は、4時間以上母親から子犬を分離できないことによって制限されます。この原稿では低酸素虚血性発作のモデルを用いてきたが、新生児ビデオ脳Gモニタリングのこの方法は、げっ歯類の多様な疾患および発作モデルに適用することができる。
Introduction
低酸素性虚血性脳症(HIE)は、新生児1000人に1.5人の新生児に影響を及ぼし、新生児発作の最も一般的な原因である1,2である。生き残った乳児は、脳性麻痺、知的障害、てんかん3,4,5などの様々な神経障害の危険にさらされています。
動物モデルは、低酸素虚血および新生児発作の病態生理を理解し、調査する上で重要な役割を果たす6,7。修飾されたヴァンヌッチモデルは、出生後10日目(p10)7,8に低酸素虚血(HI)を誘導するために使用される。この年齢のマウスの子犬は、人間の新生児の完全な用語に神経学的に大まかに変換します 9.
この傷害モデルと組み合わせて使用される連続ビデオ脳波(EEG)モニタリングは、新生児低酸素虚血性発作のさらなる理解と特徴付けを可能にする。これまでの研究では、ビデオ録画、限られたEEG記録、テレメトリEEG記録10、11、12、13、14、15、16など、げっ歯類の新生児発作を分析するための様々な方法を使用してきました。以下の原稿では、低酸素虚血中のマウスの子犬に連続したビデオEEGを記録する過程について詳しく述べる。新生児マウスの子犬における連続的なビデオEEGモニタリングのためのこの技術は、様々な疾患および発作モデルに適用することができる。
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Protocol
すべての動物研究は、バージニア大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 電極建物/ケーブルビルディング
- 単極絶縁ステンレス鋼線(0.005"裸径0.008"被覆)を使用して、メスソケットコネクタ(メスレセプタクルコネクタ0.079)で接続された電極を作ります。
- 特別なカスタムケーブルを使用して、動物をアンプに接続します。
- オスの4ピンコネクタ(オスコネクタ0.079")を4チャンネルユニティゲインインピーダンスマッチングオペアンプ(op-amp)に取り付けます。9 V バッテリに接続するワイヤに 10K の抵抗を接続します。オペアンプに接続されていないアース線は、バッテリーの中点として機能します。
- ケーブルの一方の端(AWG、0.012"OD)をop-ampに接続し、ケーブルのもう一方の端をアンプに接続します。
2. 電極注入手術
- 下向きのフローフードで4-5%のイオブルランで子犬(出生後9日目)を麻酔します。手順の開始前に、ブピバカイン(0.02-0.05 mL、0.25%皮下局所浸潤)で子犬を注入する。
- 動物が不動になったら、鼻コーンで立体的な段階に移します。耳をしっかり止めるには柔らかいので、イヤーバーの裏側を使用します。この年齢では、子犬は耳棒の尖った端を使用するために完全に発達した耳を持っていません。
- イオフルランの流れを下げ、2.5~3%に維持します。手術を通して子犬の安定した呼吸に目を光らせる。尾をつまんで痛みの反応を確認し、切開に進みます。
- 頭蓋骨の切開領域をベタジンとアルコール(ヨウ素と70%エタノールの3サイクル交互)で殺菌する。切開領域が見えるように周囲の身体部分をドレープする。
- 目の上から頭皮前部後部を開き、約0.5cmの皮膚を引き込みます。皮膚が頭蓋骨を露出して外側に引っ張るように、ステレオタックスステージ上でマウスの頭を再配置します。
- 綿棒を使用して頭蓋骨に過酸化水素を塗布し、メスの刃を使用して頭蓋骨をきれいに削ります。頭蓋骨は非常に柔らかいです。擦り傷をしながら注意を払ってください。
- 接着剤を1滴(約50μL)塗布し、そのアプリケータを使用して露出した頭蓋骨領域の周りに広げます。40sの紫外線に露出して接着剤をセットします。
- 参照として、露出したブレグマを使用して座標を測定します。海馬のCA1領域に両側電極を移植する [-3.5 mm側側腹孔(DV),±2mm内側側面(ML)、-1.75mm深部(D)、頭頂皮質内の両側[-1.22mm DV、±0.5mm D]および小脳内の参照電極。32G針を使用して、マークされた領域に穴を開けます。
- 頭蓋骨の表面から血液をきれいにします。立体的な腕の助けを借りて脳に女性のソケットコネクタに取り付けられた下の電極と歯科アクリルで所定の位置に固定します。脳に電極を埋め込む。ソケットコネクタヘッドセットは、歯科アクリルで接着頭蓋骨の上に座っています。
- 電極が固定されたら、ケトプロフェン(5mg/kg)を皮間領域に皮下に注入します。子犬を母親と一緒に戻します。
注:一度に1つずつ導入するのではなく、一度にヘッドセットでゴミの半分を導入してください。これは、母親が子犬のヘッドセットを損傷するのを防ぎます。
3. EEGのセットアップと記録(ベースライン/プレ傷害)
- 電極注入後24時間の回収後、各動物をEEG記録用の加熱(37°C)カスタムメイドのプレキシグラスチャンバーに入れます。このチャンバーは低酸素室としても機能します。
- 柔軟なケーブル(カスタムメイドのオペアンプケーブル)を介してビデオ-EEG監視システムにチャンバー内の子犬を接続します。
メモ:ヘッドセットを設置すると、マウスは自由に移動可能で、動作に違いはありません。電極ワイヤーに取り付けられたら、ワイヤーは、子犬がチャンバー全体を自由に移動できるように、適切な量の緩みを提供するためにチャンバーテザー内で調整する必要があります。 - 草のアンプを使用して1Kゲインで1000 HzでEEGデータをデジタル化します。ソフトウェア(例えば、LabChart Pro)を使用して、後でEEG信号(3〜70 Hzの間のバンドパスフィルタ)を確認してください。
- 頸動脈結紮術のために動物を切断する前に、傷害前のベースラインEEGを30分間記録する。
4. 左頸動脈結紮
- 下向きのフローフードで4-5%のイオブルランで子犬(出生後10日目)を麻酔し、ウォーターバスパッドに特別に配置されたセットアップに置きます。動物のスピージンを配置し、紙テープで前肢を固定します。
- イオブルランの流れを2~3%に下げる。痛みの反応のために尾をつまみ、手順全体の呼吸を監視します。
- ベタジンとアルコール(ヨウ素と70%エタノールの3サイクル)で首の左側の切開領域(下顎骨と鎖骨の間)を殺菌します。
- マイクロシザーを使用して、首の左側に約1cmの長さの切開を行います。解剖顕微鏡を用いて、皮下組織と皮膚を慎重に引き込み、頸動脈を露出させる。迷走神経(動脈に横向きに走る)を特定し、動脈から繊細に分離して引き込むのに注意してください。
- マイクロ鉗子を使用して動脈の下に長さ5cmの無菌シルク縫合糸を通す。動脈の周りに二重結び目の縫合糸を結んで、閉塞流れにします。
- 余分な縫合糸をカットし、皮下組織と皮膚を引き戻すことによって露出した動脈を閉じます.切開を密封するために獣医の結合を使用してください。
- 動物を温かいマットレスの上に置かれる室温の部屋の連続的なEEGの監視に戻す。チャンバーを開けないように、子犬のコア温度のスポット赤外線温度チェックを取ります。動物が低酸素症の前に1時間回復することを許可します。
5. EEGと低酸素症
- 酸素モニターを介してチャンバー内のFiO2 (インスパイアされた酸素の一部)を継続的に監視します。
- 100%N2 の60 L/minと100%O2のための0.415 L /分でチャンバーを洗い流す。チャンバーの酸素飽和度が12%に達したら、O2の流れを変えずにN2 の流れを10 L/分に減らします。小さな調整で、45分間8%でFiO2 を維持します。
- 低酸素暴露の45分後、21%にFiO2 を戻す。
- 子犬はチャンバーで回復し、2時間ポスト低酸素症のEEG上で監視しています。
- 記録期間終了後、マウスをEEG記録から切り離し、母親に戻します。
6. EEG分析
- ラボチャートプロのビデオでEEGファイルを分析します。目の不自由な研究者に発作と背景パターンのEEGをマークしてもらいます17。発作は、高周波のリズミカルな鋭波放電(≥3xベースライン)を持つ10秒以上続く電写イベントと定義され、明確な進化17を有する。
- 2番目の盲目の研究者レビューは、合意のためにランダムにマークされたイベントを持っています。
- マークされた各電気イベントの関連ビデオをレビューし、新生児げっ歯類行動発作スコア16に従って分析する。簡単に言えば、このスコアは0-6(不動から重度の強壮性クロニック挙動)の範囲です。発作セミオロジーをさらに特徴付けるには、横性(多焦点/二国間運動対焦点/一方的な混合)の行動を分析する。
- パワースペクトログラムを作成します。1024 データ ポイントのサイズを持つコサイン ベル データ ウィンドウを使用して高速フーリエ変換を使用します。87.5%のウィンドウオーバーラップの助けを借りてスペクトログラムに滑らかなX軸を作成します。電源をμV218として表現します。
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Representative Results
発作セミロジー
新生児低酸素-虚血曝露は、マウスの全身発作と焦点発作の両方をもたらす(図1A-C)。ビデオ脳波録画により、電解調査結果をビデオの動作と相関させます。これらの行動は、以前に公表された新生児げっ歯類行動発作スコア(BSS)16を用いて採点された。BSS に加えて、行動が焦点/一方的、二国間、または混合であるかに基づいてイベントを分類しました(図 1B)。
このモデルでは、マウスは一般的に3パターンの発作セミオロジーを示した:1)対側の四肢の延長を伴う結紮の側に繰り返し回る、2)身体屈曲と尾を結ぶ姿勢の喪失、または3)四肢の一方的または両側のパドリング(様々な重症度および長さ)で姿勢の喪失(様々な重症度および長さ)。観察されたイベントの大半は、焦点/一方的または混合行動を伴う(図1B)。さらに、低酸素期の間に、マウスのサブセットは、EEG上で持続的な発作活性を有する子犬が不動であった非痙攣発作活性を示した(図1C)。
電図録音
EEG記録は、頚動脈結紮の30分前に開始し、傷害前のベースラインを得るために開始した。ベースライン活性(図1Aおよび図2A)は、p10マウスpups17における前述の背景と類似していた。ライゲーションの後、子犬はすぐにビデオEEGに戻されました。低酸素症の結紮と開始の間に、マウスのサブセットは痙攣性発作を示す(図1A-C)。
低酸素誘導後、EEGのバックグラウンド振幅が低下し(図3B)、スパイク波放電のバーストが断続的に発生し、続いて抑制が行われた(図2A)。マウスは、リズミカルなスパイク波放電として抑制された背景から出現し、ポリスパイク波でより複雑で頻繁に進行する電解発作を示す(図2B)。低酸素症の間、パワースペクトログラム分析は虚血性と対側半球の非対称性に顕著であった(図3A、B)。虚血性半球はバースト抑制パターンを示し、対側半球は抑制された背景を示した(図1A および 図3A、B)。平均発作は低酸素症の誘導後5.5±8.1分で始まり、各事象は56±57秒間続く。低酸素症(n=4/30)の間に13%の死亡率があり、痙攣(BSS=5-6)発作後のすべての死亡があった。
再酸素化および回復の間、マウスのサブセットは、記録期間の残りの期間にわたって発作を起こし続ける(2時間後低酸素症)。低酸素症に続くベースライン(図1A および 図3)に比べ、EEG背景は抑制され、低酸素後の記録期間中は緩やかに回復した。全体の記録期間中、マウスは平均9±5の発作イベントを示し、それぞれ54±57.7s続いた。
図1:新生児低酸素-虚血に曝露したp10マウスにおける発作特性 (a)実験タイムラインを介して虚血性頭頂皮質電極からの代表的なパワースペクトログラム。(振幅カラーヒートマップスケールx10–6)。矢印は、スペクトログラムの下にある生の脳波トレースが表す時間を示します。(B)実験全体、心血症/前低酸素症、低酸素症、および低低酸素症の発作行動。(C)行動発作スコア(BSS)及び全ての発作イベント(n=30マウス、各マウスは固有のシンボルを有し、各点は離散発作イベント)のタイミングを有する。低酸素症の間に押収されたマウスの100%(青いボックス;時間=−60分は頸動脈結紮の完了、時間=0は低酸素症の始まり)である。痙攣発作(グレード5~6)の後、低酸素症の間に13%が死亡した。この図は、バーンズら13から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:低酸素虚血中の特徴的な脳波(EEG)パターン。 (A) 左から右へのEEG背景:傷害前ベースライン、低酸素症中のバースト抑制、低酸素症後抑制。イプシアショナル頭頂皮質深度電極からの記録。(B) 低酸素症における発作の進化海馬深度電極から記録。シェーディングボックス(I-V)は、(B)の右側にある拡張されたEEG抜粋に対応した。この図は、バーンズら13から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:虚血性半球と対角半球の脳脳の背景における非対称性 (A) 虚血性皮質(左)と対側皮質(右;振幅スケールx10-6)の低酸素(45分期間)中のHIマウスの非対称パワースペクトログラム。虚血性半球におけるバースト抑制パターン及び発作、CL半球における抑制。(B) ILおよびCL半球における低酸素および再酸素化中のバックグラウンド抑制。実験期間における脳科学の10秒ランダムな抜粋(ベースライン、30分後合分、低酸素期(開始後15分30分、再酸素化後15分と60分)から得られた平均電圧の全ての測定値をベースラインと比較した。各動物のベースラインは独自のコントロールとして働き、データはベースライン(n=5匹のマウス)の割合として報告される。測定は皮質電極から採取した。この図は、バーンズら13から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、低酸素虚血発作の間に新生児マウスにおける連続的なビデオ-脳細胞モニタリングのためのモデルを提示した。EEGと連動したビデオ分析により、発作セミロジーの特徴付けが可能になります。EEGの分析は、パワースペクトログラムの抽出とバックグラウンド振幅分析を可能にします。
電極の配置中または不正確な配置時の損傷は結果に大きな影響を与える可能性がありますので、電極の正しく、慎重な配置は、このプロトコルで重要です。損傷前の正常なベースライン脳G活性の評価は、電極配置中の出血または傷害として最も重要であるが、まれに起こり得る。第二に、正しい電極配置を確認するために、脳を適切な配置で電極トラックについて切り離し、検査することができる。さらに、グループ(個別)で母親に子犬を返さないと、電極ヘッドセットが損傷したり、母親によって子犬が殺されたり無視されたりする可能性があります。
この方法の1つの制限は、小さな新生児脳における深度電極記録の空間的局在化の限界である。これは、EEGの記録に特定の発作病巣を局的にする能力を制限します。低酸素虚血のこのモデルのもう一つの制限は、発作負担の変動である。低酸素虚血のこのげっ歯類モデルにおける病変サイズおよび行動障害の変動性は、以前7,8,19に十分に記載されている。当然のことながら、この変動は発作の負担(発作事象の長さおよび発作事象の数の両方)に存在する。しかし、一貫して、このモデルの100%の子犬は低酸素症の間に発作を示す。最後に、子犬がEEGモニタリング(母親から離れている)にすることができる時間の量は限られています。したがって、我々は、怪我に関連して、後で継続的なEEGポイントで進行中の発作を特徴付けることができません。
この原稿では低酸素虚血発作モデルを用いたが、新生児マウスの子犬における連続的なビデオ-EEGモニタリングのためのこの方法は、他の疾患/発作モデルに容易に適用できる。新生児げっ歯類の発作は、単独で行動に基づいて認識することが困難であり、ビデオEEGモニタリングが重要です。今後の調査は、これらの技術を使用して、他の新生児発作モデルにおける発作負担と血管質学、または治療および神経保護措置への応答を分析する可能性がある。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
我々は、次の資金源を認める: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), バージニア大学医学部 (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SURGERY | |||
| Ball Point Applicator | Metrex Research | 8300-F | i-bond applicator |
| Cranioplast (Powder/Resin) | Coltene | H00383 | Perm Reline/Power |
| I-Bond | Kulzer GmbH, Germany | ||
| LOOK Silk Suture | Surgical Specialities Corporation | SP115 | LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture |
| RS-5168 Botvin Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5168 | Forcep for surgery/ligation |
| RS-5138 Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5138 | Forcep for surgery/ligation |
| UV light for I-Bond | Blast Lite By First Media | BL778 | UV ligth for I-bond |
| Vannas Microdissecting Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS5618 | Scissor for ligation |
| Vet Bond | 3M Vetbond | 1469SB | Vet Glue |
| HYPOXIA | |||
| Hypoxidial | Starr Life Science | ||
| Oxygen sensor | Medical Products | MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig | |
| EEG RECORDING | |||
| Female receptacle connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 832-10-024-10-001000 | Ordered from Digikey |
| Grass Amplifier | Natus Neurology Incorporated | Grass Product | |
| LabChart Pro | ADI Instruments | Software to run the system | |
| Male Socket Connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 833-43-024-20-001000 | Ordered from Digikey |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2274CD | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2272ACDR | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Stainless Steel wire | A-M Systems | 791400 | 0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft |
| Ultra-Flexible Wire | McMaster-Carr | 9564T1 | 36 Gauze wire of various color |
References
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