Summary
本手稿描述了一种在经历缺氧缺血的新生小鼠中使用多个深度电极进行连续视频脑电图记录的方法。
Abstract
缺氧缺血是新生儿癫痫发作的最常见原因。动物模型对于了解新生儿癫痫发作和缺氧缺血的机制和生理学至关重要。本文介绍了一种在新生小鼠中连续进行视频脑电图（EEG）监测的方法，以检测癫痫发作并分析缺氧缺血期间的脑电图背景。同时使用视频和脑电图可以描述癫痫发作的符号学和确认癫痫发作。该方法还允许分析实验时间段内的功率谱图和EEG背景模式趋势。在这种缺氧缺血模型中，该方法允许在损伤前进行脑电图记录，以获得规范基线，并在损伤和恢复期间进行。总监测时间受到限制，因为无法将幼崽与母亲分开超过四个小时。虽然，我们在本文中使用了缺氧缺血性癫痫发作的模型，但这种用于新生儿视频脑电图监测的方法可以应用于啮齿动物的各种疾病和癫痫发作模型。
Introduction
缺氧缺血性脑病 （HIE） 是一种每年影响 1000 名新生儿中 1.5 名新生儿的疾病，是新生儿癫痫发作的最常见原因1，2。存活下来的婴儿有患各种神经残疾的风险，如脑瘫、智力残疾和癫痫3，4，5。
动物模型在理解和研究缺氧缺血和新生儿癫痫发作的病理生理学方面起着关键作用6，7。改进的Vannucci模型用于在出生后第10天诱导缺氧缺血（HI）（p10）7，8。这个年龄段的小鼠幼崽在神经学上大致翻译为完整的足月人类新生儿9。
与该损伤模型结合使用的连续视频脑电图 （EEG） 监测可进一步了解和表征新生儿缺氧缺血性癫痫发作。以前的研究已经使用各种方法来分析啮齿动物的新生儿癫痫发作，包括视频记录，有限的脑电图记录和遥测脑电图记录10，11，12，13，14，15，16。在下面的手稿中，我们深入讨论了在缺氧缺血期间记录小鼠幼崽连续视频脑电图的过程。这种用于新生儿小鼠幼崽连续视频脑电图监测的技术可以应用于各种疾病和癫痫发作模型。
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Protocol
所有动物研究均获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 电极建筑/电缆建筑
- 使用单极绝缘不锈钢丝（0.005"裸直径，0.008"涂层）制成与母插座连接器（母插座连接器0.079）连接的电极。
- 使用特殊的定制电缆将动物连接到放大器。
- 将一个 4 针公连接器（公连接器 0.079"）连接到 4 通道单位增益阻抗匹配运算放大器（运算放大器）。将10K电阻连接到连接到9 V电池的电线上。未连接到运算放大器的地线充当电池的中点。
- 将电缆的一端（AWG，0.012" 外径）连接到运算放大器，并将电缆的另一端连接到放大器。
2. 电极植入手术
- 在向动的罩中用 4 - 5% 异氟醚麻醉幼崽（出生后第 9 天）。在手术开始之前，向幼崽注射布比卡因（0.02-0.05 mL，0.25%皮下局部浸润）。
- 一旦动物无法移动，就转移到带有鼻锥的立体定向阶段。使用耳杆的反面，因为它很软，可以保持头部稳定。在这个年龄，幼崽没有完全发育的耳朵来使用耳杆的尖头。
- 降低异氟醚的流量，并将其保持在2.5-3%。在整个手术过程中，请密切注意幼犬的稳定呼吸。捏住尾巴以检查疼痛反应，然后进行切口。
- 用β-丁和酒精（3个循环的交替碘和70%乙醇）对颅骨上的切口区域进行灭菌。覆盖周围的身体部位，使切口区域可见。
- 从眼睛上方稍微打开头皮前后，缩回约0.5厘米的皮肤。将鼠标头部重新定位在立体定位阶段，以便皮肤向外拉出暴露的头骨。
- 使用棉签将过氧化氢涂抹在颅骨上，然后用手术刀刀片将颅骨刮干净。头骨非常柔软;刮擦时要小心。
- 涂抹一滴（约50μL）粘合剂，并使用其涂抹器将其涂抹在暴露的颅骨周围。暴露在紫外线下40秒以固定粘合剂。
- 使用暴露的边角作为参考来测量坐标。种植电极在海马体的CA1区域[-3.5 mm背腹（DV），±2 mm内侧-侧（ML），-1.75 mm深（D）]和双侧在顶叶皮层[-1.22 mm DV，±0.5 mm ML，-1 mm D]和小脑中的参考电极17。使用32 G针在标记区域创建一个孔。
- 清洁颅骨表面的血液。在立体定位臂的帮助下，连接到母插座连接器的下电极进入大脑，并用牙科丙烯酸固定到位。将电极植入大脑。插座连接器耳机位于颅骨顶部，由牙科丙烯酸粘合在一起。
- 电极固定后，皮下注射酮洛芬（5mg / kg）在肩胛间区域。将幼崽放回母亲身边。
注意：一次将一半的带有耳机的垃圾介绍给母亲，而不是一次介绍一个。这将防止母亲损坏小狗的耳机。
3. 脑电图设置和记录（基线/损伤前）
- 电极植入后恢复24小时后，将每只动物置于加热（37°C）定制的Plexiglas室中进行脑电图记录。该室还将用作缺氧室。
- 通过柔性电缆（定制运算放大器电缆）将腔室中的幼崽连接到视频脑电图监测系统。
注意：戴上耳机后，鼠标可以自由移动，并且不会表现出任何行为差异。一旦连接到电极丝上，必须在腔室系绳内调整导线，以提供适量的松弛度，以便幼犬可以在整个腔室中自由移动。 - 使用草地放大器以 1K 增益对 1000 Hz 的 EEG 数据进行数字化处理。稍后使用软件（例如LabChart Pro）查看EEG信号（3-70 Hz之间的带通滤波器）。
- 在断开动物进行颈动脉结扎手术之前，记录损伤前基线脑电图30分钟。
4. 左颈动脉结扎
- 在向动的罩中用 4 - 5% 异氟醚麻醉幼犬（出生后第 10 天），并将它们放在水浴垫上特别布置的设置上。定位动物仰卧位并用纸胶带固定前肢。
- 将异氟醚的流量降低至2-3%。捏住尾巴以获得疼痛反应，并在整个手术过程中监测呼吸。
- 用甜菜碱和酒精（3个循环的交替碘和70%乙醇）对颈部左侧的切口区域（下颌骨和锁骨之间）进行消毒。
- 使用微剪刀在颈部左侧做一个约1厘米长的切口。使用解剖显微镜，小心地缩回皮下组织和皮肤以暴露颈动脉。小心识别迷走神经（横向延伸到动脉），并小心地将其从动脉中分离并收回。
- 使用微钳在动脉下缝合5厘米长的无菌丝线。在动脉周围系上双结缝合线以阻塞血流。
- 切开多余的缝合线，并通过拉回皮下组织和皮肤来关闭暴露的动脉。使用兽医粘合来密封切口。
- 将动物放回室中在室温下的连续脑电图监测中，该室放置在加热床垫上。对幼崽核心温度进行点红外温度检查，以避免打开腔室。让动物在缺氧前恢复1小时。
5. 脑电图和缺氧
- 通过氧气监测仪连续监测腔室内的FiO2 （吸入氧气的分数）。
- 用60升/分钟的100%N2 和0.415升/分钟冲洗腔室，100%O2。一旦腔室中的氧饱和度达到12%，则将N2流量降低至10 L / min，同时保持O2 流量不变。通过小幅调整，将FiO2 保持在8%45分钟。
- 缺氧暴露45分钟后，将FiO2 返回至21%。
- 让幼崽在腔室中恢复，并在缺氧后监测脑电图2小时。
- 记录期结束后，断开小鼠与脑电图记录的连接并返回给母亲。
6. 脑电图分析
- 在LabChart Pro中用视频分析EEG文件。让盲法研究人员在脑电图上标记癫痫发作和背景模式17。癫痫发作被定义为持续超过 10 秒的心电事件，具有高频有节奏的锐波放电（≥3 倍基线），且有明显的演变17。
- 让第二个盲法研究人员随机审查标记的事件以达成一致。
- 回顾每个标记的心电图事件的相关视频，并根据新生儿啮齿动物行为癫痫发作评分进行分析16。简而言之，该评分范围为0-6（不动到严重的强直阵挛行为）。为了进一步描述癫痫发作的符号学特征，分析侧向性行为（多灶性/双侧运动 vs. 局灶性/单侧性 vs. 混合性）。
- 创建功率频谱图。将快速傅里叶变换与大小为 1024 个数据点的余弦-贝尔数据窗口结合使用。借助 87.5% 的窗口重叠，在频谱图中创建平滑的 x 轴。将功率表示为μV218。
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Representative Results
癫痫发作符号学
新生儿缺氧缺血暴露导致小鼠全身性和局灶性癫痫发作（图1A-C）。视频脑电图记录允许将电图结果与视频行为相关联。这些行为使用先前发表的新生儿啮齿动物行为癫痫发作评分（BSS）进行评分16。除BSS外，我们还根据行为是局灶性/单侧，双侧还是混合性对事件进行分类（图1B）。
在该模型中，小鼠通常表现出3种癫痫发作符号学模式：1）重复绕到结扎一侧并延伸对侧四肢，2）身体屈曲和尾巴卷曲到结扎一侧的姿势丧失，或3）单侧或双侧四肢划桨的姿势丧失（不同严重程度和长度）。大多数观察到的事件涉及局灶性/单侧或混合行为（图1B）。此外，在缺氧期间，一部分小鼠表现出非惊厥性癫痫发作活动，其中幼崽在脑电图上持续癫痫发作活动不动（图1C）。
电气记录
在颈动脉结扎前30分钟开始进行脑电图记录，以获得损伤前基线。基线活性（图1A 和 图2A）与先前描述的p10小鼠幼崽17的背景相似。结扎后，幼崽立即被放回视频脑电图。在结扎和缺氧开始之间的时间段内，一部分小鼠表现出惊厥性癫痫发作（图1A-C）。
缺氧诱导后，脑电图的背景振幅减小（图3B），间歇性地表现出尖峰波放电的爆发，随后是抑制（图2A）。小鼠表现出电图癫痫发作，其从抑制的背景中出现，作为节律性尖峰波放电，并进展为变得更加复杂和频繁，伴有多尖峰波（图2B）。在缺氧期间，功率谱图分析显着于缺血和对侧半球之间的不对称性（图3A，B）。缺血半球表现出爆发抑制模式，对侧半球表现出抑制背景（图1A 和 图3A，B）。平均而言，癫痫发作在诱导缺氧后5.5±8.1分钟开始，每次事件持续56±57秒。缺氧期间死亡率为13%（n=4/30），所有死亡均在惊厥性（BSS=5-6）癫痫发作后发生。
在复氧和恢复期间，一部分小鼠在记录期的剩余时间内（缺氧后2小时）继续癫痫发作。与缺氧后的基线相比，脑电图背景受到抑制（图1A 和 图3），在缺氧后记录期间逐渐恢复。在整个记录期间，小鼠平均表现出9±5次癫痫发作事件，每次持续54±57.7秒。
图1：暴露于新生儿缺氧缺血的p10小鼠的癫痫发作特征。 （A）代表性功率谱图从缺血性顶叶皮层电极通过实验时间轴。（振幅彩色热图比例 x10–6）。箭头表示频谱图下方的原始脑电图示踪所表示的时间。（B）整个实验的癫痫发作行为，即二次充血后/缺氧前期，缺氧期间和Hypoxia后。（C）所有癫痫发作事件的行为癫痫发作评分（BSS）和时间（n=30只小鼠，每只小鼠都有一个独特的符号，每个点是离散的癫痫发作事件）。100%的小鼠在缺氧期间被抓住（蓝框;时间=−60分钟是颈动脉结扎的完成，时间=0是缺氧的开始）。13% 的人死于惊厥性癫痫发作后的缺氧（5-6 级）。这个数字是从Burnsed等人13修改而来的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：缺氧缺血期间的特征性脑电图（EEG）模式。 （A）脑电图背景从左到右：损伤前基线，缺氧期间爆发抑制，缺氧后抑制。从同侧顶叶皮层深度电极记录。（B）缺氧期间癫痫发作的演变。从同侧海马深度电极记录。阴影框（I-V）对应于（B）右侧扩展的脑电图摘录。这个数字是从Burnsed等人13修改而来的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：缺血和对侧半球之间脑电图背景的不对称性。 （A）HI小鼠缺氧（45分钟）缺血皮层（左）和对侧皮层（右;振幅刻度x10-6）期间的非对称功率谱图。突发抑制模式和缺血半球癫痫发作，CL半球抑制。（B）IL和CL半球缺氧和再氧合期间的背景抑制。将实验时间段（基线，结扎后30分钟，缺氧期间- 开始后15分钟和30分钟，再氧合后15分钟和60分钟 - 开始后15分钟和60分钟）从脑电图随机摘录中获取的所有平均电压测量值与基线进行比较。每只动物的基线作为自己的对照，数据报告为基线的百分比（n = 5只小鼠）。测量是从皮质电极进行的。这个数字是从Burnsed等人13修改而来的。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
我们已经提出了一种在缺氧缺血性癫痫发作期间对新生小鼠进行连续视频脑电图监测的模型。结合脑电图进行视频分析，可表征癫痫发作的符号学特征。脑电图分析允许提取功率谱图和背景振幅分析。
正确和小心地放置电极在此方案中至关重要，因为电极放置过程中的伤害或不正确的放置会显着影响结果。在损伤前评估正常的基线脑电图活动至关重要，因为在电极放置过程中可能会发生出血或损伤，虽然很少见。其次，为了确认正确的电极放置，可以对大脑进行切片并检查正确位置的电极轨迹。此外，未能成群结队（单独）将幼崽送回母亲身边可能导致电极耳机损坏或幼崽被母亲杀死或忽视。
这种方法的一个局限性是小型新生儿大脑中深度电极记录的空间定位的限制。这限制了在脑电图记录中定位特定癫痫发作病灶的能力。该缺氧缺血模型的另一个局限性是癫痫发作负担的变异性。这种缺氧缺血的啮齿动物模型中病变大小和行为缺陷的变异性之前已有很好的描述7，8，19。毫不奇怪，这种变异性存在于癫痫发作负担中（癫痫发作事件的长度和癫痫发作事件的次数）。然而，始终如一的是，该模型中100%的幼崽在缺氧期间表现出癫痫发作。最后，幼崽可以进行脑电图监测（远离母亲）的时间是有限的。因此，相对于损伤，我们无法在以后的时间点用连续脑电图来表征正在进行的癫痫发作。
虽然，我们在本手稿中使用了缺氧缺血癫痫发作模型，但这种用于新生儿小鼠幼崽连续视频脑电图监测的方法可以很容易地应用于其他疾病/癫痫发作模型。仅根据行为很难识别新生儿啮齿动物的癫痫发作，因此视频脑电图监测很重要。未来的研究可以使用这些技术来分析其他新生儿癫痫发作模型中的癫痫发作负担和符号学，或对治疗和神经保护措施的反应。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们承认以下资金来源：NIH NINDS – K08NS101122 （JB）， R01NS040337 （JK）， R01NS044370 （JK）， 弗吉尼亚大学医学院 （JB）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SURGERY | |||
| Ball Point Applicator | Metrex Research | 8300-F | i-bond applicator |
| Cranioplast (Powder/Resin) | Coltene | H00383 | Perm Reline/Power |
| I-Bond | Kulzer GmbH, Germany | ||
| LOOK Silk Suture | Surgical Specialities Corporation | SP115 | LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture |
| RS-5168 Botvin Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5168 | Forcep for surgery/ligation |
| RS-5138 Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5138 | Forcep for surgery/ligation |
| UV light for I-Bond | Blast Lite By First Media | BL778 | UV ligth for I-bond |
| Vannas Microdissecting Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS5618 | Scissor for ligation |
| Vet Bond | 3M Vetbond | 1469SB | Vet Glue |
| HYPOXIA | |||
| Hypoxidial | Starr Life Science | ||
| Oxygen sensor | Medical Products | MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig | |
| EEG RECORDING | |||
| Female receptacle connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 832-10-024-10-001000 | Ordered from Digikey |
| Grass Amplifier | Natus Neurology Incorporated | Grass Product | |
| LabChart Pro | ADI Instruments | Software to run the system | |
| Male Socket Connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 833-43-024-20-001000 | Ordered from Digikey |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2274CD | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2272ACDR | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Stainless Steel wire | A-M Systems | 791400 | 0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft |
| Ultra-Flexible Wire | McMaster-Carr | 9564T1 | 36 Gauze wire of various color |
References
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