Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En Patient-Afledt Xenograft Model for Venøs misdannelser

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61501
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en detaljeret protokol til at generere en murine xenograft model af venøs misdannelser. Denne model er baseret på subkutan injektion af patientbaserede endotelceller, der indeholder hyperaktiverende TIE2- og/eller PIK3CA-genmutationer. Xenograft læsioner nøje opsummere de histopatologiske træk ved VM patientvæv.

Abstract

Venøs misdannelse (VM) er en vaskulær anomali, der opstår fra nedsat udvikling af venøs netværk resulterer i udvidede og ofte dysfunktionelle vener. Formålet med denne artikel er omhyggeligt at beskrive etableringen af en murine xenograft model, der efterligner menneskelige VM og er i stand til at afspejle patientens heterogenitet. Hyperaktiverende ikke-nedarvede (somatiske) TEK -mutationer (TIE2) og PIK3CA-mutationer i endotelceller (EF) er blevet identificeret som de vigtigste drivkræfter bag den patologiske fartøjsudvidelse i VM. Følgende protokol beskriver isolering, rensning og udvidelse af patientudledt EF, der udtrykker mutant TIE2 og/eller PIK3CA. Disse EF injiceres subkutisk ind i ryggen af immundefekt athymiske mus for at generere ectatic vaskulære kanaler. Læsioner genereret med TIE2 eller PIK3CA-mutant EF er synligt vaskulariseret inden for 7\u20129 dage efter injektion og opsummere histopatologiske træk af VM patientvæv. Denne VM xenograft model giver en pålidelig platform til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der driver VM-dannelse og -udvidelse. Desuden vil denne model være afgørende for translationelle undersøgelser teste effekten af nye lægemiddel kandidater i at forhindre den unormale fartøj udvidelsen set i menneskelige VM.

Introduction

Defekter i udviklingen af vaskulaturen er den underliggende årsag til mange sygdomme, herunder venøs misdannelser (VM). VM er en medfødt sygdom karakteriseret ved unormal morfogenese og udvidelse af vener1. Vigtige undersøgelser af VM-væv og endotelceller (EF) har identificeret funktionsgevinster i to gener: TEK, som koder tyrosinkinasereceptoren TIE2, og PIK3CA, som koder p110α (katalytisk underenhed) isoform af PI3-kinase (PI3K) 2,33,4,5. Disse somatiske mutationer resulterer i ligand-uafhængig hyper-aktivering af centrale angiogene/ vækst signalering veje, herunder PI3K / AKT, hvilket resulterer i udvidede ektatiske vener3. På trods af disse vigtige genetiske opdagelser, de efterfølgende cellulære og molekylære mekanismer udløser unormal angiogenese og dannelsen af udvidede vaskulære kanaler er stadig ikke fuldt forstået.

Under normal og patologisk angiogenese spirer nye fartøjer fra et allerede eksisterende vaskulært netværk, og EF gennemgår en række vigtige cellulære processer, herunder spredning, migration, ekstracellulær matrix (ECM) remodeling og lumendannelse6. To- og tredimensionelle (2D/3D) in vitro-kulturer i EF er vigtige værktøjer til at undersøge hver af disse cellulære egenskaber individuelt. Ikke desto mindre er der en klar efterspørgsel efter en musemodel, der opsummerer den patologiske fartøjsudvidelse inden for værtsmikro miljøet, samtidig med at der skabes en effektiv platform for præklinisk evaluering af målrettede lægemidler til translationel forskning.

Ajour, en transgen murine model af VM forbundet med TIE2 gain-of-function mutationer er ikke blevet rapporteret. De nuværende transgene VM-musemodeller er afhængige af det allestedsnærværende eller vævsbegrænsede udtryk for den aktiverende mutation PIK3CA p.H1047R3,5. Disse transgene dyr giver betydelig indsigt i hele kroppen eller vævsspecifikke virkninger af denne hotspot PIK3CA-mutation. Begrænsningen af disse modeller er dannelsen af et meget patologisk vaskulært netværk, der resulterer i tidlig dødelighed. Således afspejler disse musemodeller ikke fuldt ud den sporadiske forekomst af mutationshændelser og lokaliseret karakter af VM-patologi.

Tværtimod er patientbaserede xenograftmodeller baseret på transplantation eller injektion af patologisk væv eller celler fra patienter til immundefekte mus7. Xenograft modeller er et effektivt redskab til at udvide viden om sygdomsudvikling og opdagelsen af nye terapeutiske midler8. Ved hjælp af patientafledte celler kan forskerne desuden opsummere mutationsdomogeniteten for at studere spektret af patientfænotyper.

Her beskriver vi en protokol, hvor patient-afledt VM EF, som udtrykker en mutant konstituerende aktiv form for TIE2 og / eller PIK3CA injiceres subkutant i ryggen af athymiske nøgenmus. Indsprøjtede vaskulære celler suspenderes i en ECM-ramme for at fremme angiogenese som beskrevet i tidligere vaskulære xenograftmodeller9,10,11. Disse VM EF gennemgår betydelig morfogenese og genererer forstørrede, perfunderede patologiske fartøjer i mangel af understøttende celler. Den beskrevne xenograft model af VM giver en effektiv platform for præklinisk evaluering af målrettede lægemidler for deres evne til at hæmme ukontrolleret lumen ekspansion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Patientvævsprøver blev indhentet fra deltagerne efter informeret samtykke fra indsamling og opbevaring af vævsprøver og data fra patienter med tumorer og vaskulære anomalier under en godkendt Institutional Review Board (IRB) pr institutionelle politikker på Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute og med godkendelse fra Udvalget for Klinisk Undersøgelse. Alle de dyreforsøg, der er beskrevet nedenfor, er blevet gennemgået og godkendt af CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Fremstilling af materialer og lagerløsninger

  1. Forberedelse af komplet endotelcellevækstmedium (EGM)
    1. Supplement endotel basal medium (EBM) med følgende vækstfaktorer til stede i sættet (se Tabel over materialer):human fibroblast vækstfaktor-beta (hFGF-β), vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), Long Arg3 Insulin-Like Vækstfaktor- I (R3-IGF-I), ascorbinsyre, epidermal vækstfaktor (EGF), gentamycinsulfat og amphotericin-B og heparin. Der tilsættes 1% Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin (PSG) opløsning og 20% føtalt kvægserum (FBS).
      BEMÆRK: Vi anbefaler ikke at tilsætte hydrocortison.
    2. Sterilt filtrerer opløsningen under en laminar flowhætte gennem et 0,2 μm flasketopfilter i en autoklaveret glasflaske og aliquotmedier i 50 ml koniske rør og opbevares ved 4 °C op til en uge eller ved -20 °C i op til et år.
  2. Forbered kollagenase En bestand løsning
    1. Forbered 50 mg/ml kollagenase En lageropløsning i 1x fosfatbuffer saltvand (PBS).
    2. Sterilt filtrere opløsningen under en laminar flow hætte med 0,2 μm filter og sprøjte, og gemme 100 μL aliquots ved -20 °C.
  3. Forbered vævsindsamlingsmedium (Buffer A)
    1. Der tilsættes en Ca2+/Mg2+-lageropløsning ved tilsætning af 0,927 g calciumchloriddihydrat (CaCl2,2H2O) og 1 g magnesiumsulfat heptahydrat (MgSO4.7H2O) til 500 ml destilleret vand. Sterilt filtrere opløsningen gennem et 0,2 μm flasketopfilter i en autoklaveret glasflaske og opbevares ved stuetemperatur (RT).
    2. Supplement Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% Ca2 +/ Mg2 + løsning og 2% FBS.
    3. Sterilt filtrere opløsningen under en laminar flow hætte med 0,2 μm filter og sprøjte og opbevares aliquots på 5 ml ved -20 °C.
  4. Fibronectin belægning af væv kultur plader
    1. Der klargør belægningsbufferen (Buffer B) ved at opløse 5,3 g natriumcarbonat (Na2CO3;0,1 M) i 500 ml deioniseret vand. Bufferens pH-pH til 9,4 ved hjælp af 1 M saltsyre (HCl). Filter under en laminar flow hætte gennem en 0,2 μm flaske top filter i en autoklaveret glasflaske og opbevares på RT.
    2. Til belægning, pipette 2 ml/5 ml/10 ml buffer B pr. 60 mm/100 mm/145 mm vævskulturplade. Tilsæt 1 μg/cm2 af humant plasma fibronectin renset proteinopløsning og forsigtigt distribuere væsken på pladen.
    3. Inkuber plade ved 37 °C, 5% CO2 i 20 min.
    4. Aspirat buffer B og vask pladen med PBS før dyrkning celler.

2. Isolering af endotelceller fra VM-patientvæv

  1. Isolering af EF fra fast VM-væv
    BEMÆRK: VM-væv resected ved debulking kirurgi12,13 under en IRB godkendt protokol.
    1. Vask VM-væv (vævsprøvevægt varierer typisk mellem 0,5 g og 1,5 g) i 5% PSG i PBS.
    2. Overfør væv til en 100 mm cellekulturskål, hakkes vævsprøve i små stykker ved hjælp af sterile kirurgiske dissektionsværktøjer, og overføres til et 50 ml konisk rør.
    3. Der tilsættes 100 μL kollagen En stockopløsning til 5 ml buffer A for en endelig koncentration på 1 mg/ml, tilsæt dette til vævet og fordøje det hakkede væv ved 37 °C i 30 minutter, mens indholdet rystes hver 5.
    4. Grind det fordøjede væv ved RT ved hjælp af en 6 mm, glat overflade støderesliber i det 50 ml koniske rør.
    5. Fortsæt med omhyggeligt at male fordøjet væv ved hjælp af en støder, mens du tilføjer 5 ml koldt PBS suppleret med 0,5% kvæg serum albumin (BSA) og 2% PSG. Gentag dette trin fire gange.
    6. Opløsningen filtreres gennem en 100 μm cellestien i et 50 ml konisk rør for at fjerne vævsfragmenter.
    7. Centrifugecelleaffjedring i 5 min ved 400 x g ved RT. Fortsæt til trin 2.3.
  2. Isolering af VM EC fra læsionalt blod fra patientens skleroterapi
    1. Få humant VM-læsionalt blod fra skleroterapi i henhold til en IRB-godkendt protokol.
    2. Fortyndet læsionalt blod (prøvevolumen ligger typisk mellem 0,5 ml og 5 ml) i PBS til et endeligt volumen på 40 ml.
    3. Centrifugecelleaffjedring i 5 min ved 200 x g ved RT.
  3. Indledende celleplettering
    1. Supernatant kasseres og opslæmmes enkeltcellepellet i 1 ml EGM.
    2. Der tilsættes 9 ml komplet EGM på fibronectinbelagte (1 μg/cm²) 100 mm plader og frø 1 ml cellesuspension.
    3. Inkuber celler ved 37 °C i en befugtet 5% CO2 atmosfære.
    4. Hver anden dag fjerne 2 ml medier og tilsæt 2 ml sterilt filtreret FBS.
    5. Når cellekulturer nå et sammenløb på 40 \u201250% ændre mediet til at fuldføre EGM. Det tager typisk mellem 2\u20123 uger for cellerne at nå dette sammenløb.
    6. Overhold dagligt for udseendet af EF-kolonier. De kan genkendes af deres typiske "brosten-lignende" morfologi (Figur 1A). Mellem 3\u20125 EF-kolonier vises i hver prøve.
    7. Skift mediet hver anden dag for yderligere 5\u20127 dage, indtil de enkelte EF-kolonier begynder at røre hinanden.
  4. Manuel isolering af de enkelte EF-kolonier
    1. For at høste EF kolonier, vaskes pladen med 5 ml PBS og manuelt aspirere med en serologisk pipette.
    2. Tag pladen til et mikroskop og cirkel placeringen af flere EF kolonier ved hjælp af en mærkning pen både på låg og bund, før du returnerer den til laminar flow hætte.
    3. Afrive EF kolonier ved pipettering 50 μL af 0,05% trypsin-EDTA opløsning på de markerede områder.
    4. Brug en lille celle skraber eller en pipette spids, forsigtigt skrabe celler fra pladen.
    5. Vip pladen til nærmeste kant, og skyl med 1 ml EGM pr. markeret område og celler.
    6. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
    7. De indsamlede EF-kolonier med en massetæthed på 1 x 104 celler/cm2 på fiberbelagte (1 μg/cm²) cellekulturretter indeholdende frisk egm. Den næste dag, ændre medium for at fuldføre EGM.
    8. Skift mediet til at fuldføre EGM hver anden dag i 2 \u20123 uger, indtil cellerne når 80% sammenløb.
    9. Trypsinize EF med 2 ml forvarmt 0,05% trypsin-EDTA pr. 100 mm skål ved 37 °C i 2 min. og neutralisere trypsin ved at tilføje 4 ml EGM.
    10. Cellesuspensionen opsamres i et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 400 x g ved RT i 5 min. Inspirer supernatanten og resuspenderede celler i 2 ml EGM.
    11. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Typiske celletal opnået er 1 x 106 celler pr 60 mm celle kultur plade eller 2 x 106 celler pr 100 mm væv kultur plade.
    12. Pellet cellerne ved centrifugering ved 400 x g ved RT i 5 min. og aspirere supernatanten. Fortsæt til trin 3.2.1.

3. Endotelcellevalg og -udvidelse

  1. Fremstilling af anti-CD31-konjugerede magnetiske perler
    1. Vortex hætteglasset indeholder anti-CD31-konjugerede magnetiske perler til 30 s. Antallet af nødvendige perler er 8 x 106 perler/2 x 106 celler.
    2. Den ønskede mængde anti-CD31-konjugerede magnetiske perler vaskes med 1 ml vaskeopløsning, der indeholder 0,1% BSA i PBS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    3. Anlå mikrocentrifugerøret i en celleisoleringsmagnet i 1 min.
    4. Inspirer supernatanten og gentag vasketrinnet.
  2. Endotelcellerensning og plettering
    1. Resuspend cellepelpellet opnået i 2.4.12 i 500 μL vaskeopløsning indeholdende 0,1% BSA i PBS.
    2. Tilføj celleopløsning til mikrocentrifugerør, der indeholder magnetiske perler og resuspend grundigt.
    3. Inkuberes i 20 minutter ved 4 °C med let vippe.
    4. Der tilsættes 500 μL på 0,1 % BSA i PBS, og der blandes godt.
    5. Rørret røret på en celleisoleringsmag i 1 min.
    6. Forsigtigt aspirere al væsken, som indeholder CD31-negative brøkdel af celler uden at røre perlerne.
    7. Perlepille, der indeholder den CD31-positive cellefraktion, vaskes med 1 ml BSA på 0,1 % i PBS og gentages magnetisk adskillelse.
    8. Gentag vask og magnetisk adskillelse trin for mindst 3 gange at rense CD31-positive celle fraktion.
    9. Opslæm rensede endotelceller i et 15 ml konisk rør og drej ned i 5 min. ved 400 x g ved RT.
    10. Fjern supernatant og resuspend celle pellet i 1 ml egm.
    11. Der tilsættes 9 ml komplet EGM på fibronectinbelagte (1 μg/cm²) 100 mm plader og frø 1 ml cellesuspension. Bemærk, at nogle magnetiske perler stadig er fastgjort til cellerne i dette første såningstrin. De fleste perler vaskes væk under celleudvidelse, men et lille antal perler kan vare ved i de tidlige passager.
    12. Inkuber celler ved 37 °C i en befugtet 5% CO2 atmosfære.
    13. Skift mediet hver anden dag, indtil cellerne når op på 80 % sammenløbet (figur 1B).
  3. Endotelcelleudvidelse
    1. Når cellerne når 80 % sammenløb, tages de af med 2 ml 0,05 % trypsin-EDTA pr. 100 mm skål ved 37 °C i 2 min.
    2. Neutralisere trypsin ved at tilføje 4 ml EGM og indsamle celler i en 15 ml konisk rør.
    3. Centrifuge ved 400 x g ved RT i 5 min.
    4. Inspirer supernatanten, resuspenderede celler i 2 ml EGM, og tæl antallet af celler med et hæmocytometer eller ved automatiseret celletælling.
    5. Frøceller med en massetæthed på 1 x 104 celler/cm² i 145 mm fibronectinbelagte (1 μg/cm²) vævskulturplader.
    6. Fortsæt med at passageceller, indtil det ønskede cellenummer er opfyldt. Overvej, at et sammenløb 145 mm væv kultur plade indeholder omkring 8 \u20129 x 106 celler og antallet af nødvendige celler er 2,5 x 106 celler per injektion. Kun celler mellem passage 3 og 8 bør tages i betragtning for xenograft.

4. VM patient-afledt xenograft protokol

BEMÆRK: I denne protokol bruger vi 5\u20126 uger gamle, mandlige immundefekt, athymisk nøgen Foxn1nu mus.

Alle dyreforsøg skal godkendes af Udvalget for Institutionel Pleje og Anvendelse (IACUC).

  1. Klargøring af materialer dagen før injektion
    1. Pre-chill sprøjter, nåle, og pipet tips i -20 °C fryser natten over.
    2. Langsomt tø kælderen membran ekstracellulære matrix (BMEM) natten over på isspand placeret ved 4 °C for at undgå øget viskositet af gelen.
  2. Forberedelse af cellesuspension til injektion
    1. Trypsinize EF med 5 ml forvarpret 0,05% trypsin-EDTA pr. 145 mm skål ved 37 °C i 2 min.
    2. Neutralisere trypsin ved at tilføje 5 ml EGM og indsamle celler i en 15 ml konisk rør.
    3. Centrifuge ved 400 x g ved RT i 5 min.
    4. Inspirer supernatanten, resuspenderede celler i 3 ml EGM, og tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletæller.
    5. Bestem det samlede antal celler, der er nødvendige for alle planlagte injektioner.
      BEMÆRK: Det anbefalede antal celler er 2,5 x 106 celler pr. injektion. I alt 2 injektioner udføres typisk i hver mus for tekniske dubletter. Det er nødvendigt at beregne en 10% overskydende celle nummer til at tage højde for tab under overførsel til sprøjten.
    6. Det volumen, der indeholder det beregnede cellenummer, overføres til et nyt konisk rør og pelletceller på 5 ml ved centrifugering ved 400 x g ved RT i 5 min.
    7. Inspirer supernatanten, hvilket efterlader et lille volumen (ca. 50\u201270 μL) for at løsne pellet.
  3. Forberedelse af sprøjter
    1. Der beregnes et overskydende volumen på 20 μL/injektion for at tage højde for tab under overførsel til sprøjten. Opsprænning af cellepellet med 220 μL BMEM pr. injektion på is. Den injicerede mængde cellesuspension vil være 200 μL pr. læsion.
    2. Bland cellesuspensionen grundigt på is for at opnå en homogen cellesuspension og undgå at skabe bobler.
    3. Ved hjælp af en 1 ml pipet og 1 ml sprøjte, samtidig pipet BMEM-celle blanding i sprøjten åbning ved suge kraft, mens du trækker stemplet af sprøjten.
    4. Luer låse en 26G x 5/8 tommer steril nål til sprøjten og holde forberedte sprøjter fladt på is før injektion.
  4. Subkutan injektion i musen
    1. Bedøve mus med 5% isofluran/ ilt blanding ved en strømningshastighed på 1 L / min ved hjælp af en isoflurane vaporizer. Sørg for korrekt sedation af dyr (f.eks. manglende reaktion på tåspidserne). Vedligehold anæstesi via kontinuerlig administration af 1,5% isofluran/ilt leveret via næsekeve.
    2. Placer mus på maven, udsætter tilbageregionen, hvor podning vil forekomme, og desinficere injektionsområdet med 70% ethanol.
    3. Rul forsigtigt den forberedte sprøjte for at opspjænne eventuelle faste celler. Svirp bobler til nålen ende af sprøjten og udvise en lille mængde af cellen suspension for at sikre fjernelse af alle bobler.
      BEMÆRK: Der kan udføres to injektioner for hver mus – til venstre og højre side af musens ryg.
    4. Knib og skab en 'teltlignende' struktur med tommelfingeren og pegefingeren, og indsæt nålen subkutende lige under huden. Sørg for, at nålen kun er huden dyb ved at frigive klemt hud for at forhindre injektion i muskelvæv.
    5. Holdenålen i 45° vinkel injiceres omhyggeligt 200 μL af cellesuspensionen for at skabe en lille sfærisk masse (Figur 1C).
    6. Optag musens vægt med en skala, øremærke musen, og vende tilbage til buret.
    7. Monitor mus efter sedation for at sikre, at de vender tilbage til normal aktivitet.
  5. Læsionsvækstovervågning
    1. Ved hjælp af en caliper måles længden og bredden af hvert stik(Figur 1D).
    2. Dokumentmålinger hver anden dag frem til læsionsindsamling.

5. Vævsindsamling og -behandling

  1. Aflive mus 9 dage efter implantation i et CO2 kammer og kontrollere vitale tegn for at bekræfte døden. Udfør cervikal dislokation på musene som en sekundær metode til at aflive musen.
  2. Høst xenograftlæsion/stikket fra musens flanke ved dissektion ved hjælp af kirurgiske kraft og saks.
    BEMÆRK: For at undgå, at de blodfyldte kar i stikket brister, er det vigtigt at undgå at røre ved læsionsproppen med dissektionsværktøjer og efterlade overdrevent omgivende væv såsom hud fastgjort til stikket.
  3. Den resected læsion nedsænkes i PBS for at vaske.
  4. Opret et kamerascene med et kamera. Juster stik på et skærebræt med en lineal. Tag et billede af alle stik til at registrere brutto vaskularisering af læsioner (Figur 1E).
  5. Fix stik ved nedsænkning i 10% formalin natten over på RT.
  6. Vask stik i PBS den følgende dag og flytte dem til 70% ethanol.
  7. Proceslæsionsstik til indlejring af paraffin (patologikerne).

6. Læsionsektion

  1. Brug en mikrotom til at skære 5 μm sektioner fra de indsamlede murine læsioner på positivt ladede dias.
    BEMÆRK: Til den efterfølgende analyse er sektioner i midten af stikket (ca. 50\u201270 μm i vævet) af betydning.
  2. Smelt paraffin ved 60 °C i 1 time før farvning.
  3. De-paraffinize og re-hydrat væv sekventielt under en kemisk røg flow hætte. Derfor inkubere dias i xylen i 10 min, 100% ethanol (EtOH) i 5 min, 90% EtOH i 3 min, og 80% EtOH i 3 min.
  4. Skyl dias i deioniseret vand i 5 min.

7. Hematoxylin og Eosin (H&E)

  1. Inkuber sektioner i Hematoxylin i 2 min.
  2. Placer dias i en farvning krukke og skyl i en vask ved en lind strøm af postevand, indtil vandet er klart.
  3. Dehydratdias ved inkubering af væv sekventielt i 70% EtOH i 1 min. 80% EtOH i 1 min.
  4. Pletten sektioner i Eosin Y for 30 s.
  5. Skyl frisk 100% EtOH indtil opløsningen er klar.
  6. Inkuber dias i xylenes i 2 min. Lad slides tørre i 5\u201210 min under røghætten.
  7. Dispenser en dråbe permanent, ikke-vandig montering medium over xenografts sektioner og sted coverslip på toppen.
  8. Lad slides tørre natten over før billeddannelse.

8. Immunohistochemistry

  1. Der tilberedes antigenudtagningsbuffer (Tris-EDTA) ved at veje 0,6 g Tris-base og 1 ml 0,5 M EDTA til 500 ml deioniseret vand. PH-3 til 9,0 justeres med 1 M HCl. Tilsæt 250 μL Tween-20.
  2. De paraffiniserede vævsdias (som fremstillet i trin 6.2\u20126.3) inkuberes i et bægerglas med antigenudtagningsbuffer under omrøring på en varmeblok i 20 min ved 95 °C.
  3. Bægerglasset fjernes fra varmeblokken, og opløsningen afkøles til 35 °C, og vaskes derefter i PBS i 3 min.
  4. Bloker vævssektioner i 5% normalt hesteserum i PBS i 30 min. ved RT.
  5. Der forberedes en biotinyleret Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) arbejdsopløsning ved at fortynde 20 μg/ml biotinyleret UEA-I i 5 % normalt hesteserum i PBS.
  6. Pipet 50\u2012100 μL UEA-I arbejdsopløsning pr. sektion og inkuber i 1 time ved RT i et befugtningskammer.
  7. Vask slides to gange i PBS i 3 min.
  8. Dæmpning slide sektioner i 3% hydrogenperoxid i 5 min på RT.
  9. Vask slides to gange i PBS i 3 min.
  10. Der tilberedes 5 μg/ml Streptavidin peberrodsperiltasekonjugeret i 5 % normalt hesteserum i PBS.
  11. Pipet 50\u2012100 μL på hver vævsrutsjebane og inkuberes i 1 time ved RT i et befugtningskammer.
  12. Vask slides to gange i PBS i 3 min.
  13. Forbered 3,3'Diaminobenzidin (DAB) løsning i henhold til producentens anvisninger og tilsæt 50\u2012100 μL pr. sektion.
  14. Inkuber sektioner i 10\u201215 min, kontrol og overvågning for udvikling af pletten hver 2 \u20125 min.
  15. Vask slides tre gange i PBS i 3 min.
  16. Tilsæt en dråbe Hematoxylin og inkuber i 3 min.
  17. Placer dias i en farvning krukke og skyl i en vask ved en lind strøm af postevand, indtil vandet er klart.
  18. Sekventielt inkubere dias i 80% EtOH i 1 min, 90% EtOH i 1 min, 100% EtOH i 1 min, og xylen i 2 min.
  19. Lad slides tørre i 5\u201210 min under røghætten.
  20. Dispenser en dråbe permanent, ikke-vandig montering medium over xenografts sektioner og sted coverslip på toppen.
  21. Lad slides tørre natten over før billeddannelse.

9. Analyse af menneskeafledte vaskulære kanaler

BEMÆRK: Vm-læsioners vaskulære vaskulærhed kvantificeres ved måling af vaskulært område og vaskulær tæthed. Kun UEA-I-positive, menneskeafledte vaskulære kanaler tages i betragtning til kvantificering.

  1. Tag fire til fem billeder pr. læsionssektion med et lyst feltmikroskop ved en 20x forstørrelse (højeffektfelter [HPF]). Tag HPF-billeder i et x-planmønster i læsionssektionen for at undgå overlapning (Figur 1F-H). Medtag en skaleringslinje på de billeder, der er taget.
  2. Åbn HPF-billederne i Billede J (Filer > Åbn). Kalibrer skaleringslinjens pixel på følgende måde. Brug værktøjet med lige linje, og gå hen over skalalinjen. Hvis du vil konvertere de målte pixel til mm, skal du klikke på Analysér > Indstil skala.
  3. Klik på Analysér > Angiv målinger, og vælg Område og Føj til overlejring.
  4. Mål det samlede feltområde i en HPF ved hjælp af Analysér > Mål. Gem denne måling til kvantificering i trin 9.8.
  5. Brug frihånd valg værktøj, manuelt skitsere UEA-I+ vaskulære kanaler.
    BEMÆRK: En vaskulær kanal er defineret som ethvert område, der er foret med UEA-I+ - EF, der kan indeholde blodlegemer.
  6. Klik på Analysér > Mål for at kvantificere det skitserede UEA-I+ vaskulære område (mm2/HPF).
  7. Gentag denne måling for alle fem HPF taget inden for ét stik.
  8. Gennemsnitlig det samlede vaskulære område af alle fem HPF. Det opnåede vaskulære område pr. HPF divideres efterfølgende med HPF-feltområdet (i mm2, trin 9,5) og udtrykkes som en procent (%).
  9. Ved kvantificering af vaskulær tæthed skal antallet af UEA-I+ vaskulære kanaler for hver HPF tages. Den vaskulære tæthed er det gennemsnitlige antal UEA-I+ vaskulære kanaler, der tælles pr. HPF-område (beholdere/mm2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver processen med at generere en murine xenograft model af VM baseret på den subkutane injektion af patient-afledte EF i ryggen af immundefekt nøgen mus. Endotelcellekolonier kan høstes inden for 4 uger efter første celleisolation fra VM-væv eller læsionalt blod (Figur 1A, B). Dagen efter injektionen dækker xenograftlæsionsproppen et overfladeareal på ca. 80\u2012100 mm2. I vores hænder er læsionsstik med TIE2/PIK3CA-mutant EC synligt vaskulære og perfunderede inden for 7\u20129 dage fra injektion 14,,15 ( Figur1C-E). Men omfanget af læsionsvækst er variabel og reflekterer over patientens og prøvens heterogenitet.

Læsionspropper opsummerer nøje de histopatologiske træk ved humant VM-væv: forstørrede vaskulære kanaler foret med et tyndt lag endotelceller (Figur 1F\u2012H). Disse vaskulære strukturer indeholder typisk erythrocytter, der bekræfter funktionelle anastomoses med værtsmusens vaskulatur (Figur 1F\u2012H). Immunohistokemiske farvning ved hjælp af den menneskelige specifikke lectin UEA-Jeg kan bekræfte, at celler foring vaskulære læsioner er afledt af humane implanterede celler i stedet for mus vaskulatur (Figur 1H). En ordning, der sammenfatter trinene fra ISOLERING AF VM-EF til dissektion af læsionsprop , findes i figur 2.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative resultater.
a)Repræsentativt billede af primær blandet cellekultur tre uger efter isolering fra VM-væv før EF-udvælgelsen. Typisk endotelcellekoloni (EF) og forurenende fibroblast (FB). (B)Billede af endotelcellekulturen (CD31 perleudvælgelse) fra VM-patientbaseret væv. Skalabar = 200 μm. (C) Læsionen vil danne en sfærisk struktur. Vaskularisering er synlig på grund af blålig farve gennem huden af nøgne mus. DD) Stiplede linjer viser, hvordan læsionsstørrelse omkodes ved at måle længden (L) og bredden (W) ved hjælp af en caliper. (E) Foto af synligt vaskulariseret, xenograft læsion explant på dag 9. Skalalinje = 1 cm.(F)Repræsentativt billede af en læsionsstiksektion. X-plan mønster, hvor fem høj effekt felt billeder er taget til kvantificering er angivet med hvide stiplede kasser. Skalalinje = 1000 μm. (G\u2012H) Repræsentative billeder af FO VM-læsionsstiksektioner. gG) Hematoxylin og Eosin farvning og(H) immunohistokemi af human specifik lectin UEA-I. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk af arbejdsprocessen for at generere en patient-afledt xenograft af VM.
AA) Endotelceller, der er isoleret fra patientens VM-læsion fast væv eller læsion, belagt, og når 80% sammenløb er nået, udvælges ved hjælp af anti CD31-konjugeret immunmagnetiske perler og udvides. (B) Til subkutan injektion af EF, på dag 0, huden på bagsiden af musen er klemt ved hjælp af pegefinger og tommelfinger til at skabe et telt-lignende struktur. Læsioner måles på dag 1 og derefter hver anden dag (røde pile) ved hjælp af en caliper gennem eksperimentel dag 9. Læsioner dissekeres og behandles til histologisk analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en metode til at generere en patient-afledt xenograft model af VM. Denne murine model præsenterer et fremragende system, der giver forskerne mulighed for at få en dybere forståelse af patologiske lumen udvidelsen og vil være medvirkende til at udvikle mere effektive og målrettede behandlinger til behandling af VM. Dette kan let tilpasses til at undersøge andre typer af vaskulære anomalier såsom kapillær lymfevens misdannelse16. Der er flere trin, der er afgørende for den vellykkede generation af reproducerbare vaskulære læsioner. For det første skal de patientudledte endotelceller være rene (uden tilstedeværelse af andre celletyper) og vokse eksponentielt på injektionstidstidstids gang. Forurenende fibroblast eller andre mesenkymale ikke-EF kan let genkendes ved aflange morfologi. I sjældne tilfælde er det muligt, at selv efter rensning ved hjælp af anti-CD31 antistof konjugeret magnetiske perler, et lille antal ikke-EF forbliver i kulturen. Disse kulturer kræver yderligere rensning med endotel specifikke celleoverflade markører. Som en alternativ tilgang, enkelt celle klonal udvidelse af endotelceller er mulig. Dette ville genindsætte homogeniteten af mutant-EF, da alle cellerne i en kultur ville stamme fra en enkelt celle. Denne fremgangsmåde anbefales dog ikke til VM-afledte EF-produkter, da celler har tendens til at toppe deres spredningskapaciteter og omdannes til en senescent fænotype efter 9\u201210-passager. Det er vigtigt at bruge celler mellem passager 3\u20128 til xenograft-eksperimenter og ikke at passageceller dagen før injektionen.

Xenograft-modellen kan ændres for at undersøge andre vaskulære anomalier, der bærer forskellige aktiverende mutationer. Da det desuden er vanskeligt at få adgang til patientvævsprøver for nogle laboratorier, kan xenograftmodellen tilpasses ved hjælp af EF, såsom humane navlestrengsblod endotelceller (HUVEC), genetisk manipuleret til at udtrykke mutationen / s kendt for at forårsage dysfunktionel vaskulær vækst15,17.

Antallet af celler, der anbefales til injektion i xenograft, er 2,5 x 106 celler/200 μL BMEM. Hvis celletallet imidlertid er utilstrækkeligt, er det muligt enten at reducere antallet af injektioner pr. dyr til et dyr eller at reducere injektionsvolumenet til mindst 100 μL. For sidstnævnte er det dog vigtigt at bevare celletæthedsforholdet, f.eks.6 Når der arbejdes med BMEM, skal alle trin udføres på is for at undgå størkning af cellesuspensionen før injektionen. Under injektionen er det vigtigt, og at nålen indsættes i en vinkel på 45° direkte under huden og væk fra muskelvævet, da injektion i muskel hæmmer læsion reproducerbarhed og gør læsiondissektion vanskelig. Der kan udføres i alt to injektioner på hver mus – en til højre og en på venstre side af hvert dyr. Den anden injektion i samme mus kan tjene som en teknisk replika. Flere injektioner på bagsiden anbefales ikke som læsioner vokse over tid og kan forstyrre hinanden. Til statistisk analyse i prækliniske undersøgelser, der sammenligner xenograftpropper af behandlede versus ubehandlede (kun køretøjer) mus, anbefaler vi, at der anvendes mindst 5 dyr (10 xenograftpropper) pr. studiegruppe. Hvis den anden injektion foreligger, kan den alternativt anvendes som en "intern kontrol" ved hjælp af ikke-mutant EF. Vi har brugt primær ikke-mutant EF, såsom HUVEC, som en kontrol og har vist, at disse celler dannede et ubetydeligt antal små kanaler14,,15. Desuden har vi i disse HUVEC-kontrollæsionsstik bemærket infiltration af murine-afledte vaskulære kanaler i stikket efter dag 9. Hvis forsøgsdesignet kræver længere inkubationstider, kan disse infiltrerende kanaler let udelukkes fra analyse ved at farvning for en menneskespecifik markør som humanspecifik CD31-antistof eller Ulex europaeus agglutinin I (UEA-I), der ikke krydser reagere med musen.

For at sikre, at læsionen ikke bliver en byrde for dyrs sundhed og velvære er det vigtigt at observere læsionsstørrelse, registrere musevægt dagligt, og være opmærksom på eventuelle side komplikationer såsom blødning og blå mærker. Hvis læsionsvolumenet overstiger 500 mm3, skal forsøget afsluttes.

Når vaskulære læsioner er forstørret og perfunderes, skal ekstrem opmærksomhed betales under dissektion for at undgå brud på læsionen. Det er vigtigt at undgå at røre ved læsionsproppen med dissektionsværktøj og efterlade overdrevent omgivende væv (f.eks. hud) fastgjort til stikket. Dette forhindrer sammenbrud af de vaskulære strukturer i xenograft stikket, som ville forstyrre nøjagtig analyse.

Endelig, for at opretholde konsistens, er det vigtigt, at den indledende histologiske analyse begynder i midten af stikket (ca. 50 \ u201270 μm i vævet) snarere end de grænseregioner, hvor anastomosing mus vaskulatur kan være til stede. Det anbefales på det kraftigste at plette vævssektionerne med en menneskespecifik EF-markør, såsom UEA-I eller et alternativt menneskespecifikt antistof, som ikke vil krydsreagere med musen, for at bekræfte, at vaskulære strukturer dannes af humant afledte EF i stedet for at invadere mus EF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Nora Lakes for korrekturlæsning. Forskning rapporteret i dette manuskript blev støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute, under Award Number R01 HL117952 (E.B.), en del af National Institutes of Health. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males Envigo 069(nu)/070(nu/+) Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) Vector Laboratories B-1065 Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) Thermo Fisher 974106 Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA) BSA A7906-50MG Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma C7902-500G Cell culture
Caliper Electron Microscopy Sciences 50996491 Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) Life Technologies 11155D EC separation
Cell strainer (100 μM) Greiner 542000 Cell culture
Collagenase A Roche 10103578001 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL) Greiner 07 000 241 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL) Greiner 07 000 239 Cell culture
Coplin staining jar Ted Pella 21029 Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm) Fisher Scientific 12545E Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) Vector Laboratories SK-4105 Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-027-CV Cell culture
DynaMag-2 Life Technologies 12321D EC separation
Ear punch VWR 10806-286 Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0) Life Technologies 15575-020 Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) Lonza CC-3162 Cell culture
Eosin Y (alcohol-based) Thermo Scientific 71211 Histological anlaysis
Ethanol Decon Labs 2716 Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone GE Healthcare SH30910.03 Cell culture
Filter tip 1,250 μL MidSci AV1250-H Multiple steps
Filter tip 20 μL VWR 10017-064 Multiple steps
Filter tip 200 μL VWR 10017-068 Multiple steps
Formalin buffered solution (10%) Sigma F04586 Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable) SKC FILMS DHCN015 Cell culture
Hematoxylin Vector Hematoxylin H-3401 Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) Sigma FC010-10MG Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) Sigma H1009 Histological anlaysis
ImageJ Software Analysis
Isoflurane, USP Akorn Animal Health 59399-106-01 Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma M1880-500G Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) Corning 356237 Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL) VWR 87003-294 EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) Fisher Scientific 1255015-CS Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles Becton Dickinson (BD) BD305115 Subcutaneous injection
Normal horse serum Vector Laboratories S-2000 Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) Corning 30-009-CI Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount) Vector Laboratories H-5000 Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain Thomas Scientific 3431F55 EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994 Cell culture
Scale VWR 65500-202 Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml) VWR 89130-898 Cell culture
Serological pipettes (5ml) VWR 89130-896 Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma 223530 Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC Vector Laboratories SA-5004 Cell culture
Syringe (60ml) BD Biosciences 309653 Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM) Corning 431219 Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock) Becton Dickinson (BD) BD-309628 Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) Greiner 664160 Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm) Greiner 639160 Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm Eppendorf 30701119 Cell culture
Tris-base (Trizma base) Sigma T6066 Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %) Life Technologies 15250061 Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) Corning 25-052-Cl Cell culture
Tween-20 Biorad 170-6531 Histological anlaysis
Wheaton bottle VWR 16159-798 Cell culture
Xylenes Fisher Scientific X3P-1GAL Histological anlaysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
  2. Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
  4. Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
  5. Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
  6. Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
  7. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
  8. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  9. Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
  10. Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  12. Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
  13. Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
  14. Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
  15. Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
  16. Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
  17. Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).

Tags

Udviklingsbiologi Venøs misdannelser xenograft endotelceller TIE2 PIK3CA vaskulær læsion
En Patient-Afledt Xenograft Model for Venøs misdannelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. … More

Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation. J. Vis. Exp. (160), e61501, doi:10.3791/61501 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter