En pasientavledet Xenograft-modell for venøs misdannelse

Summary

Vi presenterer en detaljert protokoll for å generere en murine xenograft modell av venøs misdannelse. Denne modellen er basert på subkutan injeksjon av pasientavledede endotelceller som inneholder hyperaktiverende TIE2- og/eller PIK3CA-genmutasjoner. Xenograft lesjoner nøye rekatolere histopatologiske trekk ved VM pasientvev.

Abstract

Venøs misdannelse (VM) er en vaskulær anomali som oppstår fra nedsatt utvikling av det venøse nettverket som resulterer i utvidede og ofte dysfunksjonelle årer. Formålet med denne artikkelen er å nøye beskrive etableringen av en murine xenograft modell som etterligner menneskelig VM og er i stand til å reflektere pasientens heterogenitet. Hyperaktiverende ikke-arvede (somatiske) TEK (TIE2) og PIK3CA mutasjoner i endotelceller (EC) har blitt identifisert som de viktigste driverne for patologisk karutvidelse i VM. Følgende protokoll beskriver isolasjon, rensing og utvidelse av pasientavledet EF som uttrykker mutert TIE2 og/eller PIK3CA. Disse EC injiseres subkutant på baksiden av immunsviktløse athymiske mus for å generere ekpatiske vaskulære kanaler. Lesjoner generert med TIE2 eller PIK3CA-mutert EC er synlig vaskularisert innen 7\u20129 dager etter injeksjon og rekatoler histopatologiske trekk ved VM pasientvev. Denne VM xenograft modellen gir en pålitelig plattform for å undersøke cellulære og molekylære mekanismer som driver VM dannelse og ekspansjon. I tillegg vil denne modellen være medvirkende for translasjonelle studier som tester effekten av nye legemiddelkandidater for å forhindre unormal fartøyutvidelse sett i menneskelig VM.

Introduction

Defekter i utviklingen av vaskulaturen er den underliggende årsaken til mange sykdommer, inkludert venøs misdannelse (VM). VM er en medfødt sykdom preget av unormal morfogenese og utvidelse av årer¹. Viktige studier på VM vev og endotelceller (EC) har identifisert gain-of-function mutasjoner i to gener: TEK, som koder tyrosin kinase reseptor TIE2, og PIK3CA, som koder p110α (katalytisk underenhet) isoform av PI3-kinase (PI3K)^2,3,4,5. Disse somatiske mutasjonene resulterer i ligand-uavhengig hyperaktivering av viktige angiogene/vekstsignalveier, inkludert PI3K/AKT, og dermed resulterer i utvidede akomtiske årer³. Til tross for disse viktige genetiske funnene, er de påfølgende cellulære og molekylære mekanismene som utløser unormal angiogenese og dannelsen av forstørrede vaskulære kanaler fortsatt ikke fullt ut forstått.

Under normal og patologisk angiogenese spirer nye fartøy fra et eksisterende vaskulært nettverk og EC en sekvens av viktige cellulære prosesser, inkludert spredning, migrasjon, ekstracellulær matrise (ECM) ombygging og^{lumenformasjon 6}. To- og tredimensjonale (2D/3D) in vitro-kulturer i EC er viktige verktøy for å undersøke hver av disse cellulære egenskapene individuelt. Likevel er det en klar etterspørsel etter en musemodell som rekafulerer patologisk karutvidelse i vertsmikromiljøet, samtidig som det gir en effektiv plattform for preklinisk evaluering av målrettede legemidler for translasjonell forskning.

Oppdatert er det ikke rapportert en transgen murinmodell av VM forbundet med TIE2 gain-of-function mutasjoner. Nåværende transgene VM musemodeller stole på allestedsnærværende eller vev-begrenset uttrykk for aktiverende mutasjon PIK3CA p.H1047R^3,5. Disse transgene dyrene gir betydelig innsikt i hele kroppen eller vevsspesifikke effekter av denne hotspot PIK3CA mutasjonen. Begrensningen av disse modellene er dannelsen av et svært patologisk vaskulært nettverk som resulterer i tidlig dødelighet. Dermed reflekterer disse musemodellene ikke fullt ut den sporadiske forekomsten av mutasjonshendelser og lokalisert natur vm-patologi.

Tvert imot er pasientavledede xenograftmodeller basert på transplantasjon eller injeksjon av patologisk vev eller celler avledet fra pasienter til immunsviktelige mus⁷. Xenograft modeller er et kraftig verktøy for å utvide kunnskap om sykdomsutvikling og oppdagelse av nye terapeutiske midler⁸. I tillegg, ved hjelp av pasientavledede celler tillater forskere å rekapulere mutasjon heterogenitet for å studere spekteret av pasient fenotyper.

Her beskriver vi en protokoll der pasientavledet VM EC som uttrykker en mutant konstitutivt aktiv form for TIE2 og/eller PIK3CA injiseres subkutant på baksiden av athymiske nakne mus. Injiserte vaskulære celler er suspendert i et ECM rammeverk for å fremme angiogenese som beskrevet i tidligere vaskulære xenograft modeller^9,10,11. Disse VM EC gjennomgår betydelig morfogenese og genererer forstørrede, perfused patologiske kar i fravær av støtteceller. Den beskrevne xenograft-modellen av VM gir en effektiv plattform for preklinisk evaluering av målrettede legemidler for deres evne til å hemme ukontrollert lumenutvidelse.

Protocol

Pasientvevsprøver ble innhentet fra deltakerne etter informert samtykke fra innsamling og repositorium for vevsprøver og data fra pasienter med svulster og vaskulære anomalier under en godkjent Institutional Review Board (IRB) per institusjonelle retningslinjer ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute og med godkjenning av Committee on Clinical Investigation. Alle dyreprosedyrer beskrevet nedenfor er gjennomgått og godkjent av CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Utarbeidelse av materialer og lagerløsninger

1. Utarbeidelse av komplett endotelcellevekstmedium (EGM)
   1. Supplement endotele basal medium (EBM) med følgende vekstfaktorer som finnes i settet (se tabell over materialer): human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β), vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), Long Arg3 Insulin-Lignende vekstfaktor- I (R³-IGF-I), askorbinsyre, epidermal vekstfaktor (EGF), gentamycinsulfat og amfotericin-B og heparin. Tilsett 1% Penicillin / Streptomycin / L-Glutamin (PSG) løsning og 20% fosterbovin serum (FBS).
      MERK: Vi anbefaler ikke å legge til hydrokortison.
   2. Sterilfilter oppløsningen under en laminær strømningshette gjennom et 0,2 μm flasketoppfilter i en autoklavet glassflaske og aliquot-medier i 50 ml koniske rør og oppbevares ved 4 °C opptil en uke eller ved -20 °C i opptil ett år.
2. Forbered kollagenase En lagerløsning
   1. Forbered 50 mg/ml kollagenase En lageroppløsning i 1x fosfatbuffersag (PBS).
   2. Sterilfilter oppløsningen under en laminær strømningshette med 0,2 μm filter og sprøyte, og oppbevar 100 μL aliquots ved -20 °C.
3. Klargjøre vevsinnsamlingsmedium (buffer A)
   1. Forbered en Ca²⁺/Mg²⁺ lagerløsning ved å tilsette 0,927 g kalsiumkloriddihydrat (CaCl₂.2H₂O) og 1 g magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO₄.7H₂O) til 500 ml destillert vann. Sterilfilter oppløsningen gjennom et 0,2 μm flasketoppfilter i en autoklavet glassflaske og oppbevar ved romtemperatur (RT).
   2. Supplement Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% Ca^{2 +}/ Mg^{2 +} løsning og 2% FBS.
   3. Sterilfilter oppløsningen under en laminær strømningshette med 0,2 μm filter og sprøyte og oppbevar aliquots på 5 ml ved -20 °C.
4. Fibronectin belegg av vev kultur plater
   1. Klargjør beleggbuffer (buffer B) ved å oppløse 5,3 g natriumkarbonat (Na₂CO₃; 0,1 M) i 500 ml avionisert vann. Juster pH-en til bufferen til 9,4 ved hjelp av 1 M saltsyre (HCl). Filtrer under en laminær strømningshette gjennom et 0,2 μm flasketoppfilter i en autoklavet glassflaske og oppbevar ved RT.
   2. For belegg, pipette 2 ml/ 5 ml / 10 ml buffer B per 60 mm / 100 mm / 145 mm vev kulturplate, henholdsvis. Tilsett 1 μg/cm² av human plasmafibronectin renset proteinoppløsning og fordel væsken forsiktig på platen.
   3. Inkuber plate ved 37 °C, 5 % CO₂ i 20 min.
   4. Aspirer buffer B og vask platen med PBS før du culturing celler.

2. Isolering av endotelceller fra VM pasientvev

1. Isolering av EC fra solid VM vev
   MERK: VM-vevet er resected ved debulking kirurgi^12,13 under en IRB godkjent protokoll.
   1. Vask VM vev (vev prøve vekt vanligvis varierer mellom 0,5 g og 1,5 g) i 5% PSG i PBS.
   2. Overfør vev til en 100 mm cellekulturrett, hakkevevsprøve i små biter ved hjelp av sterile kirurgiske disseksjonsverktøy, og overfør til et 50 ml konisk rør.
   3. Tilsett 100 μL kollagnase En lagerløsning til 5 ml buffer A for en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml, tilsett dette i vevet og fordøy det hakkete vevet ved 37 °C i 30 min mens du rister innhold hvert 5.
   4. Slip forsiktig det fordøyde vevet ved RT ved hjelp av en 6 mm, glatt overflate pestle slipemaskin i 50 ml konisk rør.
   5. Fortsett å forsiktig male fordøyd vev ved hjelp av en pestle mens du legger til 5 ml kald PBS supplert med 0,5% storfe serum albumin (BSA) og 2% PSG. Gjenta dette trinnet fire ganger.
   6. Filtrer oppløsningen gjennom en 100 μm cellesil i et konisk rør på 50 ml for å fjerne vevsfragmenter.
   7. Sentrifuge celle suspensjon i 5 min ved 400 x g ved RT. Fortsett til trinn 2.3.
2. Isolering av VM EC fra lesjonsblod hentet fra pasientskleroterapi
   1. Få menneskelig VM lesjonsblod fra skleroterapi under en IRB godkjent protokoll.
   2. Fortynn lesjonsblod (prøvevolum varierer vanligvis mellom 0,5 ml og 5 ml) i PBS til et endelig volum på 40 ml.
   3. Sentrifuge celle suspensjon i 5 min ved 200 x g ved RT.
3. Innledende celleplating
   1. Kast supernatant og resuspend encellet pellet i 1 ml EGM.
   2. Tilsett 9 ml komplett EGM på fibronektonbelagt (1 μg/cm²) 100 mm plater og frø 1 ml cellefjæring.
   3. Inkuber celler ved 37 °C i en fuktet 5 % CO_{2-atmosfære.}
   4. Annenhver dag fjerner du 2 ml medier og tilsett 2 ml sterile filtrerte FBS.
   5. Når cellekulturer når en samløpet på 40 \ u201250% endre mediet for å fullføre EGM. Det tar vanligvis mellom 2\u20123 uker for cellene å nå denne samløpet.
   6. Vær daglig for utseendet på EC kolonier. De kan gjenkjennes av sin typiske "brostein-lignende" morfologi (Figur 1A). Mellom 3\u20125 vises EC-kolonier i hvert utvalg.
   7. Endre mediet annenhver dag i ytterligere 5\u20127 dager til individuelle EC-kolonier begynner å berøre hverandre.
4. Manuell isolering av individuelle EC-kolonier
   1. For å høste EC kolonier, vask platen med 5 ml PBS og aspirer manuelt med en serologisk pipette.
   2. Ta platen til et mikroskop og sirkle plasseringen av flere EC kolonier ved hjelp av en merkepenn både på lokket og bunnen før du returnerer den til laminær strømningshette.
   3. Løsne EC-kolonier ved å pipettering 50 μL på 0,05% trypsin-EDTA-løsning på de merkede områdene.
   4. Bruk en liten celleskraper eller en pipettespiss, skrap forsiktig celler fra platen.
   5. Vipp platen til nærmeste kant, og skyll med 1 ml EGM per merket område og samle celler.
   6. Telle antall celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller.
   7. Plate de oppsamlede EC koloniene med en tetthet på 1 x 10⁴ celler / cm² på fibronectin-belagt (1 μg / cm²) celle kultur retter som inneholder fersk EGM. Neste dag, endre medium for å fullføre EGM.
   8. Endre mediet for å fullføre EGM annenhver dag i 2 \\ u20123 uker til cellene når 80% samløpet.
   9. Trypsinize EC med 2 ml forhåndsoppvarmet 0,05% trypsin-EDTA per 100 mm fat ved 37 °C i 2 min og nøytraliser trypsin ved å tilsette 4 ml EGM.
   10. Samle cellefjæringen i ett konisk rør på 15 ml og sentrifuge ved 400 x g ved RT i 5 min. Aspirer de overnaturante og gjenbrukscellene i 2 ml EGM.
   11. Telle antall celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller. Typiske celletall oppnådd er 1 x 10⁶ celler per 60 mm cellekulturplate eller 2 x 10⁶ celler per 100 mm vevskulturplate.
   12. Pellet cellene ved sentrifugering ved 400 x g ved RT i 5 min og aspirerer supernatanten. Fortsett til trinn 3.2.1.

3. Endotelcellevalg og utvidelse

1. Fremstilling av anti-CD31-konjugerte magnetiske perler
   1. Vortex hetteglasset som inneholder anti-CD31-konjugerte magnetiske perler i 30 s. Antall perler som kreves er 8 x 10⁶ perler / 2 x 10⁶ celler.
   2. Vask ønsket mengde anti-CD31-konjugerte magnetiske perler med 1 ml vaskeoppløsning som inneholder 0,1% BSA i PBS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
   3. Plasser mikrocentrifugerøret i en celleisoleringsmagnet i 1 min.
   4. Aspirer det overnaturlige og gjenta vasketrinnet.
2. Endotelcellerensing og plating
   1. Resuspend cellepellet oppnådd i 2,4,12 i 500 μL vaskeoppløsning som inneholder 0,1 % BSA i PBS.
   2. Tilsett celleløsning til mikrocentrifugerør som inneholder magnetiske perler og gjenoppliving grundig.
   3. Inkuber i 20 min ved 4 °C med skånsom tilting.
   4. Tilsett 500 μL på 0,1% BSA i PBS og bland godt.
   5. Plasser røret på en celleisoleringsmagnet i 1 min.
   6. Aspirer forsiktig all væsken, som inneholder CD31-negativ brøkdel av celler uten å berøre perlene.
   7. Vask perlepelleten som inneholder CD31-positiv cellefraksjon med 1 ml 0,1 % BSA i PBS og gjenta magnetisk separasjon.
   8. Gjenta vasking og magnetisk separasjonstrinn i minst 3 ganger for å rense CD31-positiv cellefraksjon.
   9. Resuspend renset endotelceller i en 15 ml konisk rør og spinne ned i 5 min ved 400 x g ved RT.
   10. Fjern supernatant og resuspend celle pellet i 1 ml egm.
   11. Tilsett 9 ml komplett EGM på fibronektonbelagt (1 μg/cm²) 100 mm plater og frø 1 ml cellefjæring. Legg merke til at noen magnetiske perler fortsatt er festet til cellene i dette første såingstrinnet. De fleste perler vaske bort under celleekspansjon, men lite antall perler kan vedvare i tidlige passasjer.
   12. Inkuber celler ved 37 °C i en fuktet 5 % CO_{2-atmosfære.}
   13. Endre mediet annenhver dag til cellene når 80 % samløpet (figur 1B).
3. Utvidelse av endotelceller
   1. Når cellene når 80 % samløpet, løsner du med 2 ml 0,05 % trypsin-EDTA per 100 mm fat ved 37 °C i 2 min.
   2. Nøytraliser trypsin ved å legge til 4 ml EGM og samle celler i ett konisk rør på 15 ml.
   3. Sentrifuge ved 400 x g ved RT i 5 min.
   4. Aspirer de overnaturante, resuspend cellene i 2 ml EGM, og telle antall celler med et hemocytometer eller ved automatisert celletelling.
   5. Frøceller med en tetthet på 1 x 10⁴ celler/cm² i 145 mm fibronectinbelagte (1 μg/cm²) vevskulturplater.
   6. Fortsett å passasje celler til ønsket cellenummer er oppfylt. Tenk at en sammenføyd 145 mm vev kultur plate inneholder ca 8 \\ u20129 x 10⁶ celler og antall celler som trengs er 2,5 x 10⁶ celler per injeksjon. Bare celler mellom passasje 3 og 8 bør vurderes for xenograft.

4. Vm pasient-avledet xenograft protokoll

MERK: I denne protokollen bruker vi 5 \\ u20126 uke gammel, mannlig immundeficient, athymic naken Foxn1^nu mus.

Alle dyreprosedyrer må godkjennes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Fremstilling av materialer dagen før injeksjon
   1. Ferdigkjølte sprøyter, nåler og pipetspisser i -20 °C fryser over natten.
   2. Tin langsomt kjellermembranen ekstracellulær matrise (BMEM) over natten på isbøtte plassert ved 4 °C for å unngå økt viskositet av gelen.
2. Fremstilling av cellesprøytning til injeksjon
   1. Trypsinize EC med 5 ml forhåndsoppvarmet 0,05% trypsin-EDTA per 145 mm fat ved 37 °C i 2 min.
   2. Nøytraliser trypsin ved å legge til 5 ml EGM og samle celler i ett konisk rør på 15 ml.
   3. Sentrifuge ved 400 x g ved RT i 5 min.
   4. Aspirer de overnaturante, resuspend cellene i 3 ml EGM, og telle antall celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller.
   5. Bestem det totale antallet celler som er nødvendige for alle planlagte injeksjoner.
      MERK: Det anbefalte antallet celler er 2,5 x 10⁶ celler per injeksjon. Totalt 2 injeksjoner utføres vanligvis i hver mus for tekniske duplikater. Det er nødvendig å beregne et 10% overskudd av cellenummer for å ta hensyn til tap under overføring til sprøyten.
   6. Overfør volumet som inneholder det beregnede cellenummeret til et nytt konisk rør på 50 ml konisk rør og pelletceller ved sentrifugering ved 400 x g ved RT i 5 min.
   7. Aspirer overnatanten, og etterlater et lite volum (ca. 50\u201270 μL) for å løsne pelleten.
3. Klargjøring av sprøyte
   1. Beregn et overskuddsvolum på 20 μL/injeksjon for å ta høyde for tap under overføring til sprøyten. Resuspend cellepellet med 220 μL BMEM per injeksjon på is. Det injiserte volumet av cellefjæring vil være 200 μL per lesjon.
   2. Bland cellesuspensjonen grundig på isen for å oppnå en homogen cellesuspensjon og unngå å lage bobler.
   3. Bruk en 1 ml pipet og 1 ml sprøyte, samtidig pipet BMEM-celle blanding inn i sprøyteåpningen ved sugekraft mens du trekker stempel av sprøyten.
   4. Luer låser en 26G x 5/8 tommers steril kanyle til sprøyten og holder klargjorte sprøyter flate på is før injeksjon.
4. Subkutan injeksjon i musen
   1. Bedøv musene med 5% isofluran/oksygenblanding med en strømningshastighet på 1 l/min ved hjelp av en isofluranfordamper. Sørg for riktig sedasjon av dyr (f.eks. manglende respons på tåklemmer). Opprettholde anestesi via kontinuerlig administrering av 1,5% isofluran/oksygen levert via nesekjegle.
   2. Plasser mus på magen, utsette ryggområdet hvor pode vil oppstå og desinfisere injeksjonsområdet med 70% etanol.
   3. Rull forsiktig den tilberedte sprøyten for å bruke eventuelle avgjorte celler på igjen. Sveip bobler til nåleenden av sprøyten og utvis et lite volum av cellefjæringen for å sikre fjerning av alle bobler.
      MERK: To injeksjoner kan utføres for hver mus – til venstre og høyre side av musen tilbake.
   4. Klyp og lag en "teltlignende" struktur ved hjelp av tommelen og pekefingeren og sett nålen subkutant rett under huden. Sørg for at nålen bare er huden dyp ved å slippe klemt hud for å hindre injeksjon i muskelvev.
   5. Hold nålen i 45° vinkel forsiktig injisere 200 μL av celle-suspensjon for å skape en liten sfærisk masse (Figur 1C).
   6. Registrer musevekt med en skala, øremerke musen, og gå tilbake til buret.
   7. Overvåk mus etter sedasjon for å sikre at de går tilbake til normal aktivitet.
5. Overvåking av lesjonsvekst
   1. Bruk en kaliper til å måle lengden og bredden på hver plugg (figur 1D).
   2. Dokumentmålinger annenhver dag frem til lesjonssamling.

5. Vevsinnsamling og behandling

1. Euthanize mus 9 dager etter implantasjon i et CO_{2 kammer} og sjekk vitale tegn for å bekrefte døden. Utfør cervical dislokasjon på musene som en sekundær metode for å euthanize musen.
2. Høst xenograftlesjonen/pluggen fra musens flanke ved hjelp av kirurgiske tang og saks.
   MERK: For å unngå ruptur av de blodfylte karene i pluggen, er det viktig å unngå å berøre lesjonspluggen med disseksjonsverktøy og la overdrevent omkringliggende vev som hud være festet til pluggen.
3. Senk den nye lesjonen i PBS for å vaske.
4. Konfigurer et kamerastadium med et kamera. Juster pluggene på et skjærebrett med en linjal. Ta et bilde av alle plugger for å registrere grov vaskularitet av lesjoner (Figur 1E).
5. Fest plugger ved å senke i 10% formalin over natten ved RT.
6. Vask pluggene i PBS neste dag og flytt dem til 70% etanol.
7. Prosesslesjonsplugger for parafininnbygging (patologikjerne).

6. Lesjonsseksjon

1. Bruk en mikrotom til å kutte 5 μm seksjoner fra de innsamlede murine lesjonene på positivt ladede lysbilder.
   MERK: For den påfølgende analysen er seksjoner i midten av pluggen (ca. 50\u201270 μm inn i vevet) av betydning.
2. Smelte parafin ved 60 °C i 1 time før farging.
3. De-parafinisere og re-hydrere vev sekvensielt under en kjemisk røyk strømnings hette. Derfor inkuber lysbilde i xylen i 10 min, 100% etanol (EtOH) i 5 min, 90% EtOH i 3 min, og 80% EtOH i 3 min.
4. Skyll skyv i avionisert vann i 5 min.

7. Hematoksylin og Eosin (H&E)

1. Inkuber seksjoner i Hematoxylin i 2 min.
2. Legg lysbildene i en farskrukke og skyll i en vask med en jevn strøm av vann fra springen til vannet er klart.
3. Dehydrere lysbilder ved å inkubere vev sekvensielt i 70% EtOH i 1 min, 80% EtOH i 1 min, 90% EtOH i 1 min, 100% EtOH i 1 min, og frisk 100% EtOH i 1 min.
4. Flekkseksjoner i Eosin Y i 30 s.
5. Skyll i frisk 100% EtOH til løsningen er klar.
6. Inkuber skyv i xylens i 2 min. La lysbildene tørke i 5\u201210 min under røykhetten.
7. Dispenser en dråpe permanent, ikke-vandig monteringsmedium over xenografts seksjoner og plasser dekkslipp på toppen.
8. La lysbildene tørke over natten før bildebehandling.

8. Immunohistochemistry

1. Forbered antigengjenfinningsbufferen (Tris-EDTA) ved å veie 0,6 g Tris-base og 1 ml 0,5 M EDTA til 500 ml avionisert vann. Juster pH til 9,0 med 1 M HCl. Tilsett 250 μL Tween-20.
2. Inkuber de-parafiniserte vevslys (som oppnådd i trinn 6.2\u20126.3) i et beger med antigen gjenfinningbuffer, røring på en varmeblokk, i 20 min ved 95 °C.
3. Fjern begeret fra varmeblokken, la oppløsningen avkjøles til 35 °C og vask deretter i PBS i 3 min.
4. Blokker vevsseksjoner i 5 % normalt hesteserum i PBS i 30 min ved RT.
5. Forbered en biotinylert Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) arbeidsløsning ved å fortynne 20 μg/ml biotinylert UEA-I i 5 % normalt hesteserum i PBS.
6. Pipet 50\u2012100 μL UEA-I arbeidsløsning per seksjon og inkuber i 1 time ved RT i et fuktingskammer.
7. Vask lysbildene to ganger i PBS i 3 min.
8. Slukke lysbildeseksjoner i 3% hydrogenperoksid i 5 min ved RT.
9. Vask lysbildene to ganger i PBS i 3 min.
10. Forbered 5 μg/ml Streptavidin pepperrot peroksidasekonjugert i 5 % normalt hesteserum i PBS.
11. Pipet 50\u2012100 μL på hvert vevssklie og inkuber i 1 time ved RT i et luftfuktekammer.
12. Vask lysbildene to ganger i PBS i 3 min.
13. Forbered 3,3'Diaminobenzidine (DAB) løsning i henhold til produsentens instruksjoner og legg til 50 \\ u2012100 μL per seksjon.
14. Inkuber seksjoner for 10 \\ u201215 min, kontroll og overvåking for utvikling av flekk hver 2 \ u20125 min.
15. Vask lysbildene tre ganger i PBS i 3 min.
16. Legg til en dråpe Hematoxylin og inkuber i 3 min.
17. Legg lysbildene i en farskrukke og skyll i en vask med en jevn strøm av vann fra springen til vannet er klart.
18. Sekvensielt inkuber lysbilde i 80% EtOH i 1 min, 90% EtOH i 1 min, 100% EtOH i 1 min, og xylen i 2 min.
19. La lysbildene tørke i 5\u201210 min under røykhetten.
20. Dispenser en dråpe permanent, ikke-vandig monteringsmedium over xenografts seksjoner og plasser dekkslipp på toppen.
21. La lysbildene tørke over natten før bildebehandling.

9. Analyse av menneskeavledede vaskulære kanaler

MERK: Vaskulariteten til VM-lesjoner kvantifiseres ved å måle vaskulært område og vaskulær tetthet. Bare UEA-I positive, menneskeavledede vaskulære kanaler vurderes for kvantifisering.

1. Ta fire til fem bilder per lesjonsseksjon med et lyst feltmikroskop ved en 20x forstørrelse (høyeffektsfelt [HPF]). Ta HPF-bilder i et x-plane mønster i lesjonsdelen for å unngå overlapping (figur 1F-H). Inkluder en skaleringslinje på bildene som er tatt.
2. Åpne HPF-bildene i Bilde J (Fil > Åpne). Kalibrer pikslene på skalalinjen på følgende måte. Bruk det rette linjeverktøyet og gå over skalalinjen. For å konvertere de målte pikslene til mm, klikk på Analyser > Angi skala.
3. Klikk på Analyser > Angi målinger og velg Område og Legg til i overlegg.
4. Mål det totale feltområdet i en HPF ved hjelp av Analyser > Mål. Lagre denne målingen for kvantifisering i trinn 9.8.
5. Bruk frihåndsvalgverktøyet til å skissere UEA-I^{+ vaskulære} kanaler manuelt.
   MERK: En vaskulær kanal er definert som et hvilket som helst område som er foret med UEA-I⁺ - EC som kan inneholde blodceller.
6. Klikk på Analyser > Mål for å kvantifisere det skisserte UEA-I⁺ vaskulære området (mm²/HPF).
7. Gjenta denne målingen for alle de fem HPF-ene som tas i én plugg.
8. Gjennomsnittlig det totale vaskulære området for alle fem HPF. Det oppnådde vaskulære området per HPF deles deretter på HPF-feltområdet (i mm^2,trinn 9,5) og uttrykt som en prosent (%).
9. For kvantifisering av vaskulær tetthet, telle antall UEA-I⁺ vaskulære kanaler av hver HPF tatt. Den vaskulære tettheten er gjennomsnittlig antall UEA-I⁺ vaskulære kanaler talt per HPF-område (fartøy /mm²).

Representative Results

Denne protokollen beskriver prosessen med å generere en murine xenograft modell av VM basert på subkutan injeksjon av pasientavledet EC på baksiden av immunsviktløse nakne mus. Endotelcellekolonier kan høstes innen 4 uker etter innledende celleisolasjon fra VM-vev eller lesjonsblod (figur 1A, B). Dagen etter injeksjon dekker xenograftlesjonspluggen et overflateareal på ca. 80\u2012100 mm². I våre hender er lesjonsplugger med TIE2/PIK3CA-mutert EC synlig vaskularisert og perfundert innen 7\u20129 dager fra injeksjon ^14,,15 (figur 1C-E). Imidlertid er omfanget av lesjonsvekst variabel og reflekterer på pasient og prøve heterogenitet.

Lesjon plugger tett rekatolere histopatologiske trekk ved menneskelig VM vev: forstørrede vaskulære kanaler foret av et tynt lag av endotelceller (Figur 1F \\ u2012H). Disse vaskulære strukturene inneholder vanligvis erytrocytter, som bekrefter funksjonelle anastomoser med vertsmusvasulaturen (figur 1F \\ u2012H). Immunohistokjemisk farging ved hjelp av den menneskelige spesifikke lectin UEA-I kan bekrefte at celler fôr vaskulære lesjoner er avledet fra menneskelige implanterte celler i stedet for musevaskulatur (figur 1H). En ordning som oppsummerer trinnene fra VM-EC-isolasjon til disseksjon av lesjonspluggen, presenteres i figur 2.

Figur 1: Representative resultater.
(A) Representativt bilde av primær blandet cellekultur tre uker etter isolasjon fra VM-vev før EC-valg. Typisk endotelcellekoloni (EC) og forurensende fibroblast (FB). (B) Bilde av en renset (CD31 perle-utvalg) endotelcellekultur fra VM pasient-avledet vev. Vektstangen = 200 μm. (C) Lesjonen vil danne en sfærisk struktur. Vaskularisering er synlig på grunn av blåaktig farge gjennom huden på nakne mus. (D) Stiplede linjer viser hvordan lesjonsstørrelsen omkodes ved å måle lengden (L) og bredden (W) ved hjelp av en kaliper. (E) Bilde av synlig vaskularisert, xenograft lesjon explant på dag 9. Vektlinje = 1 cm. (F) Representativt bilde av en lesjonspluggseksjon. X-plane mønsteret der fem høyeffektsfeltbilder er tatt for kvantifisering er indikert av hvite stiplede bokser. Vektlinje = 1000 μm. (G\u2012H) Representative bilder av vm lesjon plugg seksjoner. (G)Hematoksylin og Eosin farging og (H) immunohistochemistry av menneskelig spesifikk lectin UEA-I. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Skjematisk for arbeidsflyten for å generere en pasientavledet xenograft av VM.
(A)Endotelceller isolert fra pasientens VM lesjon solid vev eller lesjonsblod er belagt og, når 80% samløpet er nådd, er valgt av anti CD31-konjugert immunomagnetiske perler og utvidet. (B)For subkutan injeksjon av EC, på dag 0, huden på baksiden av musen er klemt ved hjelp av pekefinger og tommel for å skape en telt-lignende struktur. Lesjoner måles på dag 1 og deretter annenhver dag (røde piler) ved hjelp av en kaliper gjennom eksperimentell dag 9. Lesjoner dissekeres og behandles for histologisk analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Her beskriver vi en metode for å generere en pasientavledet xenograft modell av VM. Denne murine modellen presenterer et utmerket system som gjør det mulig for forskere å få en dypere forståelse av patologisk lumen utvidelse og vil være medvirkende i å utvikle mer effektive og målrettede terapier for behandling av VM. Dette kan enkelt tilpasses for å undersøke andre typer vaskulære anomalier som kapillær lymfe venøs misdannelse¹⁶. Det er flere trinn som er avgjørende for vellykket generering av reproduserbare vaskulære lesjoner. For det første må de pasientavledede endotelcellene være rene (uten tilstedeværelse av andre celletyper) og vokse eksponentielt på injeksjonsstedet. Forurensende fibroblast eller andre mesenchymale ikke-EC kan lett gjenkjennes av langstrakt morfologi. I sjeldne tilfeller er det mulig at selv etter rensing ved hjelp av anti-CD31 antistoff konjugert magnetiske perler, forblir et lite antall ikke-EC i kulturen. Disse kulturene krever ytterligere rensing med endotelspesifikke celleoverflatemarkører. Som en alternativ tilnærming er enkeltcelleklonal utvidelse av endotelceller mulig. Dette ville forsikre homogeniteten til mutant-EC som alle cellene i en kultur ville komme fra en enkelt celle. Denne tilnærmingen anbefales imidlertid ikke for VM-avledet EC som celler har en tendens til å toppe sine spredningsmuligheter og konvertere til en senescent fenotype etter 9 \\ u201210 passasjer. Det er viktig å bruke celler mellom passasjer 3\u20128 for xenograft eksperimenter og å ikke passasje celler dagen før injeksjonen.

Xenograft-modellen kan endres for å undersøke andre vaskulære anomalier som bærer forskjellige aktiverende mutasjoner. Videre, som pasientvevsprøver er vanskelig å få tilgang til for noen laboratorier, kan xenograft-modellen tilpasses ved hjelp av EC, for eksempel human navlestreng blod endotelceller (HUVEC), genetisk konstruert for å uttrykke mutasjonen / s kjent for å forårsake dysfunksjonell vaskulær^{vekst 15,17}.

Antall celler som anbefales for injeksjonen i xenograft er 2,5 x 10⁶ celler/200 μL BMEM. Men hvis cellenummeret ikke er tilstrekkelig, er det mulig å enten redusere antall injeksjoner per dyr til ett eller for å redusere injeksjonsvolumet til minimum 100 μL. For sistnevnte er det imidlertid viktig å opprettholde celletetthetsforholdet, for eksempel 1,25 x 10⁶ celler/100 μL BMEM. Ved arbeid med BMEM må alle trinnene utføres på is for å unngå størkning av celleinjeksjonen før injeksjon. Under injeksjonen er det viktig og at nålen settes inn i en vinkel på 45° direkte under huden og bort fra muskelvevet, som injiserer i muskel hindringer lesjon reproduserbarhet og gjør lesjon disseksjon vanskelig. Totalt to injeksjoner kan utføres på hver mus – en til høyre og en på venstre side av hvert dyr. Den andre injeksjonen i samme mus kan tjene som en teknisk repliker. Flere injeksjoner på baksiden anbefales ikke etter hvert som lesjonene vokser over tid og kan forstyrre hverandre. For statistisk analyse i prekliniske studier som sammenligner xenograft plugger av behandlede versus ubehandlede (kun kjøretøy) mus, anbefaler vi bruk av minst 5 dyr (10 xenograft plugger) per studiegruppe. Hvis tilgjengelig, kan den andre injeksjonen alternativt brukes som en "intern kontroll" ved hjelp av ikke-mutert EF. Vi har brukt primær ikke-mutert EC, for eksempel HUVEC, som en kontroll og har vist at disse cellene dannet et ubetydelig antall små^{kanaler 14,15}. Videre, i disse HUVEC kontrolllesjonspluggene, har vi lagt merke til infiltrasjon av murine-avledede vaskulære kanaler i pluggen etter dag 9. Hvis den eksperimentelle designen krever lengre inkubasjonstider, kan disse infiltrerende kanalene enkelt utelukkes fra analyse ved å farge etter en menneskespesifikk markør som menneskespesifikt CD31-antistoff eller Ulex europaeus agglutinin I (UEA-I) som ikke krysser reagerer med mus.

For å sikre at lesjonen ikke blir en byrde for dyrehelse og velvære, er det viktig å observere lesjonsstørrelse, registrere musevekt daglig og ta hensyn til eventuelle sidekomplikasjoner som blødning og blåmerker. Hvis lesjonsvolumet overstiger 500 mm³, må eksperimentet avsluttes.

Når vaskulære lesjoner forstørres og perfunderes, må det gis ekstrem oppmerksomhet under disseksjon for å unngå rupturing av lesjonen. Det er viktig å unngå å berøre lesjonspluggen med disseksjonsverktøy og la overdrevent omkringliggende vev (som hud) være festet til pluggen. Dette forhindrer sammenbrudd av vaskulære strukturer i xenograft plugg som ville forstyrre nøyaktig analyse.

Til slutt, for å opprettholde konsistens, er det viktig at den første histologiske analysen begynner i midten av pluggen (ca 50 \ u201270 μm inn i vevet) i stedet for grenseområdene der anastomoserende musevaskulatur kan være tilstede. Det anbefales sterkt å beise vevsseksjonene med en menneskespesifikk EC-markør, for eksempel UEA-I eller et alternativt menneskespesifikt antistoff som ikke vil kryssreagere med mus, for å bekrefte at vaskulære strukturer dannes av menneskeavledet EC i stedet for å invadere musen EC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males	Envigo	069(nu)/070(nu/+)	Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)	Vector Laboratories	B-1065	Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM)	Thermo Fisher	974106	Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA)	BSA	A7906-50MG	Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma	C7902-500G	Cell culture
Caliper	Electron Microscopy Sciences	50996491	Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)	Life Technologies	11155D	EC separation
Cell strainer (100 μM)	Greiner	542000	Cell culture
Collagenase A	Roche	10103578001	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL)	Greiner	07 000 241	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL)	Greiner	07 000 239	Cell culture
Coplin staining jar	Ted Pella	21029	Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm)	Fisher Scientific	12545E	Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)	Vector Laboratories	SK-4105	Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-027-CV	Cell culture
DynaMag-2	Life Technologies	12321D	EC separation
Ear punch	VWR	10806-286	Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0)	Life Technologies	15575-020	Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)	Lonza	CC-3162	Cell culture
Eosin Y (alcohol-based)	Thermo Scientific	71211	Histological anlaysis
Ethanol	Decon Labs	2716	Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone	GE Healthcare	SH30910.03	Cell culture
Filter tip 1,250 μL	MidSci	AV1250-H	Multiple steps
Filter tip 20 μL	VWR	10017-064	Multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	10017-068	Multiple steps
Formalin buffered solution (10%)	Sigma	F04586	Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable)	SKC FILMS	DHCN015	Cell culture
Hematoxylin	Vector Hematoxylin	H-3401	Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)	Sigma	FC010-10MG	Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)	Sigma	H1009	Histological anlaysis
ImageJ Software			Analysis
Isoflurane, USP	Akorn Animal Health	59399-106-01	Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma	M1880-500G	Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)	Corning	356237	Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	VWR	87003-294	EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)	Fisher Scientific	1255015-CS	Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles	Becton Dickinson (BD)	BD305115	Subcutaneous injection
Normal horse serum	Vector Laboratories	S-2000	Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)	Corning	30-009-CI	Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount)	Vector Laboratories	H-5000	Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain	Thomas Scientific	3431F55	EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994	Cell culture
Scale	VWR	65500-202	Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml)	VWR	89130-898	Cell culture
Serological pipettes (5ml)	VWR	89130-896	Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma	223530	Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC	Vector Laboratories	SA-5004	Cell culture
Syringe (60ml)	BD Biosciences	309653	Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM)	Corning	431219	Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock)	Becton Dickinson (BD)	BD-309628	Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)	Greiner	664160	Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm)	Greiner	639160	Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm	Eppendorf	30701119	Cell culture
Tris-base (Trizma base)	Sigma	T6066	Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %)	Life Technologies	15250061	Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)	Corning	25-052-Cl	Cell culture
Tween-20	Biorad	170-6531	Histological anlaysis
Wheaton bottle	VWR	16159-798	Cell culture
Xylenes	Fisher Scientific	X3P-1GAL	Histological anlaysis