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Immunology and Infection

CRISPR/Cas9 द्वारा जीन नॉक-इन और मैक्रोफेज और टी सेल लाइनों में सेल छंटाई

Published: November 13, 2021 doi: 10.3791/62328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Summary

यह प्रोटोकॉल मैक्रोफेज और टी सेल लाइनों में दस्तक प्रयोगों को सरल बनाने के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और सेल छंटाई का उपयोग करता है। इन सरलीकृत दस्तक प्रयोगों के लिए दो प्लाज्मिड का उपयोग किया जाता है, नामत CRISPR/Cas9-और DsRed2-एक्सप्रेस प्लाज्मिड और एक मुताबिक़ रीकॉम्बिनेशन डोनर प्लाज्मिड व्यक्त करते हुए EBFP2, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं में Rosa26 लोकस में स्थायी रूप से एकीकृत है ।

Abstract

प्रतिरक्षा प्रणाली के कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययनों के लिए आनुवंशिक जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है जिसमें लक्ष्य जीन को हटाना और तत्वों को रुचि के प्रोटीन में शामिल करना शामिल है। सेल लाइन मॉडल में जीन कार्यों की पहचान जीन खोज और कोशिका-आंतरिक तंत्र की खोज के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, इन कोशिकाओं की कम ट्रांसफेक्शन दक्षता, विशेष रूप से एक शांत राज्य में, के कारण CRISPR/Cas9-मध्यस्थता दस्तक का उपयोग कर टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज सेल लाइनों के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आनुवंशिक जोड़तोड़ मुश्किल हैं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं में जीन को संशोधित करने के लिए, दवा प्रतिरोध चयन और वायरल वैक्टर आम तौर पर CRIPSR/Cas9 प्रणाली है, जो अनिवार्य रूप से कोशिकाओं के अवांछनीय हस्तक्षेप में परिणाम व्यक्त कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है । पिछले एक अध्ययन में, हमने ड्यूल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को CRISPR/Cas9 के साथ मिलकर डिजाइन किया था जो इलेक्ट्रोपॉशन के बाद क्षणिक रूप से व्यक्त किए गए थे । यह तकनीकी समाधान प्रतिरक्षा कोशिकाओं में तेजी से जीन हटाने की ओर जाता है; हालांकि, दवा प्रतिरोध चयन या वायरल वैक्टर के उपयोग के बिना टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाओं में जीन नॉक-इन और भी चुनौतीपूर्ण है। इस लेख में, हम बताते है कि कोशिकाओं के चयन में सहायता करने के लिए सेल छंटाई का उपयोग करके क्षणिक CRISPR व्यक्त/Cas9 एक दाता प्लाज्मिड के साथ संयोजन में Rosa26 लोकस को लक्षित निर्माण, जीन दस्तक में दोनों टी कोशिकाओं और दवा प्रतिरोध संवर्धन के बिना मैक्रोफेज में प्राप्त किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, हम दिखाते हैं कि कैसे मानव ACE2, सार्स-Cov-2 के एक रिसेप्टर, जो वर्तमान Covid-19 महामारी के लिए जिंमेदार है, RAW264.7 मैक्रोफेज में दस्तक प्रयोगों प्रदर्शन करके व्यक्त करने के लिए । इस तरह के जीन नॉक-इन कोशिकाओं को व्यापक रूप से मशीनी अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

रोगजनकों के खिलाफ रक्षा के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाएं महत्वपूर्ण हैं। संक्रमितों की निकासी और ऊतक होयोस्टेसिस1,2के रखरखाव के लिए जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा दोनों की आवश्यकता होती है । सेल लाइन मॉडल स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रणाली के आणविक बुनियादी बातों को समझने के लिए आवश्यक उपकरण हैं; वे इस तरह के मानव टी सेल सक्रियण मॉडलिंग के रूप में इन विट्रो कार्यात्मक परख में उपयोग कियाजाताहै, और सक्रिय या प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं गीला करने में आनुवंशिक कारकों के समारोह का निर्धारण करने में 3 ,4. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रणाली अत्यधिक विषम है और समान रूप से महत्वपूर्ण, बड़ी संख्या में अणु किसी दिए गए सेल टाइप5, 6के भेदभाव, प्रवासन और कार्य कोनियंत्रितकरते हैं।

क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/Cas9 जीनोम संपादन उपकरण विशिष्ट कोशिका प्रकारों के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं, जो सटीक तरीके से जीन के कार्यात्मक एनोटेशन की सुविधा प्रदान करता है7,8। कई प्रकाशित प्रोटोकॉल में CAS9-guide आरएनए परिसरों के रूप में CRISPR/Cas9 की डिलीवरी का वर्णन किया गया है जिसे एचईके293 कोशिकाओं, जुर्कत सेल लाइनों, प्राथमिक टी कोशिकाओं9,10,मैक्रोफेज11,12,13,स्टेम सेल14,और अन्य15, 16में रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन (आरएनपी) के रूप में जानाजाताहै । इन प्रोटोकॉलों में, जीन टैगिंग आमतौर पर एंडोजेनस प्रोटीन17,18को फ्लोरोसेंट टैग को फ्यूज करके हासिल की जाती है। हालांकि दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करने के लिए कुछ प्रयास किए गए हैं, जो एकल सेल छंटाई के साथ संगत हैं, ताकि विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं में नॉक-इन प्रयोगों19,20की सुविधा प्रदान की जा सके।

प्रतिरक्षा कोशिकाओं में एक उपन्यास आनुवंशिक कारक के कार्यों को समझने के उद्देश्य से गहराई से मशीनी विश्लेषण आम तौर पर एक जीन के सेल प्रकार विशिष्ट हटाने की आवश्यकता होती है, आनुवंशिक बचाव प्रयोगों, और आदर्श रूप से अपने इंटरक्ट्राप्टर की पहचान । यद्यपि प्रतिरक्षा कोशिकाओं में जीन के आनुवंशिक विलोपन के अनुकूलन के तरीके प्रकाशित किए गए हैं9,15,21,प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए बहुमुखी कार्यों के साथ नॉक-इन एलील्स शुरू करने के लिए बहुत कम तरीके बताए गए हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में हम मानव और मुरीन प्रतिरक्षा सेल लाइनों में सुरक्षित बंदरगाह लोकस Rosa26 में रुचि के प्रोटीन (पीओआई) को व्यक्त करने के लिए विस्तार से एक कुशल और अत्यधिक प्रजनन प्रोटोकॉल का वर्णन करने का लक्ष्य रखते हैं। हमने CRISPR/Cas9 (DsRed2) और एक पुनर्संयोजन डीएनए टेम्पलेट (EBFP2) को व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड्स से संक्रमित कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए एक दो रंग रिपोर्टर सिस्टम तैयार किया है, जिसे सेल छंटाई द्वारा अलग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के बाद, हमने खराब अध्ययन किए गए प्रोटीन के कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए मानव टी सेल लाइन जुर्कट और मुरीन मैक्रोफेज RAW264.7 की कई दस्तक-इन लाइनें प्राप्त कीं।

एक उदाहरण के रूप में, हम इस प्रोटोकॉल में दिखाते हैं कि कैसे दस्तक-IN RAW264.7 मैक्रोफेज को मानव ACE2 (सार्स-Cov-2 का रिसेप्टर)22व्यक्त करते हैं। क्योंकि जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं कोविड-1923, 24के रोगजनन में शामिल हैं और मानव ACE2 को प्रतिकृति से पहले कोशिकाओं में वायरल प्रवेश के लिए आवश्यक एक प्रमुख रिसेप्टर मानाजाता है, मानव ACE2 की दस्तक के साथ मैक्रोफेज मैक्रोफेज के अंदर वायरल गुणा के मशीनी अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं। समानांतर में, हम RASGRP1 प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए मानव ROSA26 लोकस में एक जीन की दस्तक का एक उदाहरण भी पेश करते हैं, जिसे एक आत्मीयता ट्विन-स्ट्रेप-टैग (OST) के साथ अपने अमीनो टर्मिनस पर मिला दिया गया था। टी कोशिकाएं प्रतिरक्षा चिकित्सा में प्रमुख लक्ष्य कोशिकाएं हैं, और अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने कैंसर25,26के प्रति उनकी जवाबदेही में हेरफेर पर ध्यान केंद्रित किया है। के रूप में Rasgrp1 टी सेल रिसेप्टर के एक प्रमुख संकेत अणु बहाव के रूप में जाना जाता है और इसके इंटरएक्टिव्स अच्छी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे है27,OST-RASGRP1 दस्तक मॉडल ट्यूमर और संक्रमण के लिए टी कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को विनियमित इंटरप्टर्स की पहचान करने के लिए नींव प्रदान करता है । एक साथ लिया, इन उपकरणों Covid-19 अध्ययन और Rasgrp1 के साथ बातचीत उपन्यास अणुओं की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

1. डिजाइन और प्लाज्मिड SgRNAs के निर्माण Rosa26 लोकस लक्ष्यीकरण

  1. वांछित प्रविष्टि साइट के आसपास डिजाइन गाइड RNAs
    1. सुनिश्चित करें कि माउस Rosa26 के लिए प्रविष्टि साइट (इसके बाद mRosa26के रूप में नामित) दस्तक प्रयोग mRosa26के पहले intron में स्थित है; इस साइट पिछले अध्ययन28 , 29में इस्तेमाल किया गया है . मानव कोशिकाओं में दस्तक प्रयोगों के लिए, यह सुनिश्चित करें कि सम्मिलन स्थल मानव ROSA26 लोकस (इसके बाद hROSA26के रूप में संदर्भित) में रहता है, जिसे mRosa2630के मानव होमोलॉग के रूप में पहचाना गया है।
    2. माउस जीनोम इन्फॉर्मेटिक्स (http://www.informatics.jax.org/) और एनसेम्बल जीनोम ब्राउज़र (http://www.ensembl.org/index.html) से प्राप्त माउस और मानव प्रजातियों के जीनोमिक दृश्यों का क्रमशः उपयोग करें। वांछित प्रविष्टि साइट को फ्लैंक करने वाले प्रत्येक तरफ mRosa26 या hROSA26 लोकस के जीनोमिक अनुक्रम के 50 आधार जोड़े (बीपी) कॉपी करें।
    3. ऑनलाइन वेब टूल CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31का उपयोग करके डिजाइन गाइड आरएनए। 1.1.2 से इनपुट अनुक्रम के 100 बीपी पेस्ट करें। एक उच्च विशिष्टता स्कोर, एक उच्च दक्षता स्कोर, और कम ऑफ-टारगेट गतिविधि के साथ दो गाइड आरएनए का चयन करें। इसके अलावा, उच्च डोंच स्कोर के साथ आरएनए गाइड चुनें और "अक्षम"32के रूप में लेबल किए गए लोगों से बचें।
      नोट: वैकल्पिक CRISPR डिजाइन उपकरण भी मूल्यवान और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं, उदाहरण के लिए बेंचलिंग CRISPR डिजाइन उपकरण (https://benchling.com/crispr) । CRISPR/Cas9-मध्यस्थता दस्तक उत्परिवर्तित कोशिकाओं की आवृत्ति बढ़ाने के लिए, वांछित प्रविष्टि साइट के करीब दो गाइड RNAs का चयन करें जब संभव३३।
    4. mRosa26 लोकस के लिए, mR26-sg1 (5'-CTCCAGTCTCTAGAAGAT-3') और mR26-sg2 (5'-CGCCCATCATTCTAGAAAGAC-3')(चित्रा 1A)के रूप में नामित दो आसन्न गाइड RNAs का उपयोग करें । HROSA26 लोकस के लिए, दो आसन्न गाइड RNAs, अर्थात् hR26-sg1 (5'-GGCGATGATGATCACGG-3') और hR26-sg2 (5'-AATCGAGAAGCGACTCA-3')(चित्रा 1B)का उपयोग करें ।
      नोट: mR26-sg1 और mR26-sg2 और hR26-sg1 और hR26-sg2 के जीनोम संपादन गतिविधियों RAW264.7 कोशिकाओं और Jurkat कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गया, क्रमशः (पूरक फ़ाइल, चित्रा S1देखें) ।
  2. Rosa26 लोकस को लक्षित करने वाले SgRNA युक्त CRISPR अभिव्यक्ति वैक्टर की क्लोनिंग
    1. एक गाइड आरएनए के लिए आगे और रिवर्स ओलिगोस का संश्लेषण करें (पूरक फ़ाइलदेखें)।
      नोट: गाइड अनुक्रम की शुरुआत में 'जी' न्यूक्लियोटाइड जोड़ना बेहतर है, जो U6 प्रमोटर द्वारा संचालित अभिव्यक्ति के साथ मदद करता है। उदाहरण के लिए, उपरोक्त mR26-sg1 क्लोन करने के लिए, फॉरवर्ड ओलिगो सीएसीसीजीसीटीसीसीएजीटीसीटीटीसीटीजीएगागाग और रिवर्स ओलिगो AAACATCTTCTAGAAAGGAGसीहै । फॉरवर्ड ओलिगो में अतिरिक्त जी और रिवर्स ओलिगो में इसके पूरक को बोल्ड में इंगित किया जाता है।
    2. क्लोन सिंथेटिक ओलिगोस सभी में गाइड RNAs के अनुरूप एक CRISPR अभिव्यक्ति वेक्टर pX458-DsRed2 हमारे पिछले काम में उत्पन्न21 (चित्रा 1C)है झांग लैब (https://www.addgene.org/crispr/zhang/) द्वारा विकसित gRNA क्लोनिंग के लिए सामांय प्रोटोकॉल का उपयोग कर; हालांकि, जेल शुद्धिकरण कदम को छोड़ दें और पीसीआर शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके पचाने वाले वेक्टर को शुद्ध करें।
      नोट: पिछले प्रोटोकॉल में, बीबीएसआई-पचाने वाले वेक्टर का जेल शुद्धिकरण किया गया था; हालांकि, यह कदम समय लेने वाला है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, पचाने वाले उत्पाद को पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है और सीधे डाउनस्ट्रीम लिगेशन प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किया जाता है, जो आम तौर पर तुलनीय दक्षता के साथ सकारात्मक उपनिवेशों का उत्पादन करता है।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एशेरिचिया कोलाई डीएच5α सक्षम कोशिकाओं के 50 माइक्रोन में लिगेशन उत्पाद (चरण1.2.2) के 10 माइक्रोन को बदलें। बेतरतीब ढंग से एम्पीसिलिन (१०० μg/mL) के साथ एक पौंड आगर प्लेट से तीन कालोनियों उठाओ और रातोंरात खेती के लिए ampicillin के साथ पौंड माध्यम के 3 एमएल में प्रत्येक टीका ।
    4. सेंगर अनुक्रमण के लिए रात भर बैक्टीरियल संस्कृति के 1 एमसीएल का उपयोग करें और निर्माण सही होने की पुष्टि होने तक बाकी को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें: pDsR-mR26-sg1 और mRosa26 लोकस नॉक-इन के लिए pDsR-mR26-sg2, और hROSA26 लोकस के लिए pDSR-hR26-sg1 और pDSR-hR26-sg2 ।
    5. ट्रांसफेक्शन-ग्रेड प्लाज्मिड (सामग्रीकी तालिका देखें) के शुद्धिकरण के लिए एक मैक्सिपेप किट के साथ प्लाज्मिड डीएनए (लगभग 2 माइक्रोग्राम/माइक्रोन) की एक उच्च एकाग्रता तैयार करें।

2. अनुरूप पुनर्संयोजन टेम्पलेट्स के रूप में लक्ष्यीकरण वैक्टर का डिजाइन और निर्माण

  1. एक होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट डिजाइन करें
    1. पिछले अध्ययन29से अनुकूलित अभिव्यक्ति कैसेट का उपयोग करके पीओआई को संविलियन व्यक्त करने के लिए एक लक्ष्यीकरण वेक्टर डिजाइन करें, जिसमें एक सीएजी हाइब्रिड प्रमोटर, एक एएससीआई प्रतिबंध साइट शामिल है जो पीओआई के सीडीएनए की क्लोनिंग की अनुमति देता है, एक आईईईएस-ईबीएफपी2 रिपोर्टर, और एक गोजातीय विकास हार्मोन पॉलीडेनिलेशन (बीजीएच-पॉलीए) सिग्नल(चित्र 1बी और अनुपूरक फ़ाइल)।
    2. डिजाइन होमोलॉजी आर्म्स (एचएएस) जो mRosa26 या hROSA26 लोकस के जीनोमिक दृश्यों के साथ होमोलॉजी साझा करते हैं। वांछित प्रविष्टि साइट से अभिव्यक्ति कैसेट के बाईं ओर अपस्ट्रीम जीनोमिक अनुक्रम के अनुरूप 5 'एचए के ~ 1 केबी शामिल करें। इसी तरह, सम्मिलन स्थल से अभिव्यक्ति कैसेट के दाईं ओर डाउनस्ट्रीम जीनोमिक अनुक्रम के अनुरूप 3 'एचए के ~ 1 केबी शामिल हैं।
      नोट: अभिव्यक्ति कैसेट CRISPR/Cas9 दरार साइटों३४के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में डाला जाता है । CRISPR/Cas9 द्वारा लक्षित एलील को फिर से काटने से बचने के लिए, लक्ष्यीकरण वेक्टर34, 35में प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम (5'-एनजीजी-3') में न्यूक्लियोटाइड परिवर्तनों को शामिलकरें।
    3. लक्ष्यीकरण वेक्टर के रैखिकीकरण की अनुमति देने के लिए, 5 'एचए के ठीक ऊपर एक अद्वितीय इकोरी साइट डालें और 3'एचए के ठीक डाउनस्ट्रीम में एक अद्वितीय बाम्ही साइट डालें।
    4. एक वाणिज्यिक विक्रेता लक्षित वैक्टर का संश्लेषण करें और उन्हें क्रमशः mRosa26 और hROSA26 नॉक-इन के लिए pKR26-iBFP और pKhR26-iBFP के रूप में नामित करें।
  2. एक होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट के रूप में एक लक्ष्यीकरण वेक्टर का निर्माण करें
    1. पीओआई को व्यक्त करने के लिए, एनसेम्बल जीनोम ब्राउज़र से सीडीएनए अनुक्रम (कोडिंग अनुक्रम) प्राप्त करें और सबसे लंबे प्रोटीन अनुक्रम वाले ट्रांसक्रिप्ट का चयन करें। उदाहरण के लिए, मानव ACE2 जीन का सीडीएनए ACE2-202 ENST00000427411.2 है और मानव RASGRP1 जीन का सीडीएनए RASGRP1 ENSG0000172575 है ।
    2. एक वाणिज्यिक विक्रेता की मदद से पीओआई के सीडीएनए को संश्लेषित करें। पीसीआर प्रवर्धन (यहां वर्णित नहीं) के माध्यम से सीडीएनए का क्लोन बनाना भी संभव है। सीडीएनए के स्टॉप कॉडन के बाद सीजीसीजी सीजीसीसीएसीसी (5'-3'), जिसमें एक एएससीआई प्रतिबंध साइट (इटालिक्स और बोल्ड) और कोजाक आम सहमति अनुवाद दीक्षा साइट (रेखांकित) शामिल है, तुरंत पहले सीडीएनए के एटीसी दीक्षा कोडन और एक अन्य एएससीआई प्रतिबंध स्थल (5'-जीजीसीजीसीजीसीसी-3') को रखें।
    3. AscI के साथ संश्लेषित अनुक्रम को पचाएं और प्रतिबंध पाचन के बाद डीएनए टुकड़ों को शुद्ध करने के लिए डिज़ाइन की गई पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके शुद्ध करें, निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए (सामग्रियों की तालिकादेखें)।
    4. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए टी 4 डीएनए लिगाज़ का उपयोग करके एएससीआई-रैखिक बैकबोन वेक्टर पीकेआर26-आईबीएफपी या पीकेआर26-आईबीएफपी में शुद्ध सीडीएनए डालें।
    5. अनुक्रमण द्वारा अंतिम लक्ष्यीकरण वेक्टर, pKR26-POI-iBFP या pKhR26-POI-iBFP सत्यापित करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सत्यापित निर्माणों को शुद्ध करने के लिए मैक्सिप का उपयोग करें।
    6. इकोरी या बाम्ही का उपयोग करके लक्षित वेक्टर को पचाएं और निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पाचन उत्पाद को शुद्ध करें। इलेक्ट्रोपाउशन तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रैखिक लक्ष्यीकरण वेक्टर (~ 0.8 माइक्रोग्राम/माइक्रोन) स्टोर करें।

3. मैक्रोफेज और टी सेल लाइंस का इलेक्ट्रोपॉशन

  1. इलेक्ट्रोपाउशन के लिए सेल कल्चर तैयार करें
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 को जुरकट टी कोशिकाओं के लिए पूर्ण विकास माध्यम के रूप में तैयार करें। RAW264.7 मैक्रोफेज की खेती के लिए 10% एफबीएस के साथ दुलबेक्को के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) तैयार करें। सेल छंटाई से पहले पोस्ट-ट्रांसफैक्शन इनक्यूबेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया को छोड़कर 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और 100 μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप) के साथ सभी पूर्ण विकास मीडिया को पूरक करें।
    2. आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार RAW264.7 और जुर्कत टी कोशिकाओं की उपकुलरिंग करें (सामग्रियों की तालिकादेखें)। RAW264.7 कोशिकाओं को उपकुलेचर करते समय, कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान (0.25%) का उपयोग करें। RAW264.7 और जुरकट कोशिकाओं के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम के रूप में 10% (v/v) डीएमएसओ के साथ पूरक एफबीएस का उपयोग करें।
    3. RAW264.7 मैक्रोफेज के लिए 5 मिनट के लिए 250 × जी पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 90 × ग्राम Jurkat टी कोशिकाओं के लिए 8 मिनट के लिए। फिर 1× डीपीबीएस (सीए2 + या एमजी 2 + आयनों के बिना) के5-10 मिलीएल के साथ धोएं। डीपीबीएस निकालें।
    4. 1× डीपीबीएस के 2 एमएल का उपयोग करके सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ल करें। कोशिकाओं के 10 माइक्रोन का उपयोग करें और सेल गिनती और व्यवहार्यता का अनुमान लगाने के लिए 0.2% ट्राइपैन नीले रंग की बराबर मात्रा के साथ मिलाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृति में >90% व्यवहार्यता है जो ट्रांसफैक्शन के दिन है।
    5. एक दस्तक प्रयोग के लिए, पांच पुनरावृत्ति के साथ 10 माइक्रोन न्यूक्लियोफेक्शन युक्तियों के साथ इलेक्ट्रोपॉरेशन करें। 2.0 × 106 कोशिकाओं के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। चरण 3.1.3 में वर्णित 1× डीपीबीएस के साथ सेल पेलेट को फिर से धोएं।
      नोट: 10 माइक्रोल न्यूक्लियोफेक्शन युक्तियों का उपयोग करते समय, प्रति इलेक्ट्रोपॉरेशन 4.0 ×10 5 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। तदनुसार, एक दस्तक प्रयोग के लिए कम से कम 2.0 ×10 6 कोशिकाओं को तैयार करें।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पेन/स्ट्रेप और प्रीवार्म के बिना 0.5 एमएल पूर्ण विकास माध्यम (चरण 3.1.1 में तैयार) के साथ 24-अच्छी प्लेट तैयार करें।
  2. CRISPR/Cas9 घटकों और लक्ष्यीकरण वेक्टर का विद्युतप्रय
    1. इलेक्ट्रोपॉरेशन सिस्टम चालू करें। पिछले अध्ययन में अनुकूलित इलेक्ट्रोपॉनेशन पैरामीटर्स का उपयोग करें21:1,400 V/20 ms/2 दालों के लिए RAW264.7 मैक्रोफेज और 1350 V/20 ms/2 दालों के लिए जुरकट टी कोशिकाओं के लिए ।
    2. पाइप्टिंगिंग के कारण नमूना हानि के लिए लेखांकन, एक बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 55 माइक्रोकॉवर का मिश्रण तैयार करें जिसमें प्रत्येक CRISPR/Cas9 वेक्टर का 2.5 माइक्रोग्राम, 2.4 μg रैखिक लक्षित वेक्टर का, और Resuspension बफर आर।
      नोट: समय बचाने के लिए, विद्युत निगम मिश्रण अपकेंद्रित्र (चरण 3.1.5) के दौरान तैयार किया जा सकता है।
    3. स्टेप 3.2.2 से 55 माइक्रोन इलेक्ट्रोपॉशन मिश्रण में 2.0 × 106 कोशिकाएं (चरण 3.1.5 में तैयार) पुनर्सुख करें।
    4. एक पिपेट के साथ 10 माइक्रोल न्यूक्लियोफेक्शन टिप का उपयोग करके स्टेप 3.2.3 से सेल/इलेक्ट्रोप्यूमेशन मिश्रण को एस्पिरेट करें।
      नोट: पिपटिंग के दौरान, हवा के बुलबुले पेश करने से बचें, जिससे इलेक्ट्रोपॉरेशन विफलता हो सकती है।
    5. इलेक्ट्रोपॉनेशन किट से बफर ई के 3 एमएल से भरी ट्यूब में सैंपल डालें।
    6. चरण 3.2.1 में वर्णित दो सेल प्रकारों के लिए इलेक्ट्रोपाउरेशन पैरामीटर लागू करें।
    7. नमूना को 3.1.6 चरण से प्रीवार्म्ड माध्यम के साथ 24-अच्छी प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
    8. अन्य चार पुनरावृत्तियों के साथ-साथ लक्ष्यीकरण वेक्टर के लिए केवल और CRISPR अभिव्यक्ति वेक्टर केवल नियंत्रण के लिए कदम 3.2.4-3.2.7 दोहराएं।
      नोट: एक अलग सेल प्रकार/प्लाज्मिड डीएनए पर स्विच करते समय नाभिक की नोक और ट्यूब बदलें ।
    9. संस्कृति 48-72 घंटे के लिए संक्रमित कोशिकाओं को इलेक्ट्रोडॉशन और CRISPR की अभिव्यक्ति के बाद वसूली के लिए अनुमति देने के लिए/ 24 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन पर एक लाल चैनल से लैस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डीएसड्रेड 2 की अभिव्यक्ति की जांच करें।
      नोट: DsRed2 फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की निगरानी का एक लाभ यह है कि इलेक्ट्रोपाउरेशन की दक्षता का अनुमान लगाया जा सकता है और आगे सेल छंटाई के लिए उपयुक्तता की भविष्यवाणी की जा सकती है।

4. ख्यात दस्तक कोशिकाओं में अलग करने के लिए सेल छंटाई

  1. FACS छंटाई से पहले, संक्रमित कोशिकाओं को एक बार पूर्ण विकास माध्यम के साथ धो लें। अपकेंद्रित्र द्वारा गोली कोशिकाओं के रूप में कदम 3.1.3 में वर्णित है और ताजा माध्यम के 500 μL में गोली resuspend.
  2. सेल सॉर्टर (एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में स्थित) को 85 माइक्रोन नोजल और कम प्रवाह दर के साथ सेट करें। 96-वेल माइक्रोप्लेट के कवर पर 20-30 कोशिकाओं को छांटकर एकल कोशिका छंटाई दक्षता और परिशुद्धता का परीक्षण करने के लिए "एकल सेल" मोड का चयन करें। प्रत्येक कुएं के केंद्र में स्थानीय एक बूंद उपकरण के उचित सेटअप को इंगित करती है।
  3. सेल निलंबन को स्टेप 4.1 से बाँझ FACS ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 1 एनएम की अंतिम एकाग्रता में SYTOX रेड डेड सेल दाग जोड़ें।
  4. सेल सॉर्टर पर नमूनों का विश्लेषण करें। SYTOX लाल और EBFP2 एक ४०५ एनएम लेजर से उत्साहित है और क्रमशः V450/BV421 और एपीसी चैनलों द्वारा पता चला रहे हैं । DsRed2 एक 488 एनएम लेजर से उत्साहित है और पीई चैनल द्वारा पता लगाया है। स्पेक्ट्रल मुआवजे के लिए नियंत्रण के रूप में गैर-संक्रमित कोशिकाओं और EBFP2-और DsRed2-एकल सकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग करें।
  5. 10 एकल कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में सॉर्ट करें जिसमें 150 माइक्रोल प्रति अच्छी तरह से पूर्व-गर्म पूर्ण विकास माध्यम होता है। अनुयायी RAW264.7 मैक्रोफेज के लिए जुरकट टी कोशिकाओं और फ्लैट बॉटम माइक्रोप्लेट जैसे सस्पेंशन सेल लाइनों को बनाने के लिए राउंड बॉटम माइक्रोप्लेट का उपयोग करें।
    नोट: प्रति अच्छी तरह से 10 कोशिकाओं की छंटाई सेल अस्तित्व में सुधार लाने और ९६-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट की संख्या को कम करने के लिए एक अनुकूलित रणनीति है जिसे वरीयता प्राप्त करने की आवश्यकता है और प्रवाह साइटोमेट्री और जेनोटीपिंग द्वारा जांच किए जाने वाले नमूनों की संख्या; यदि प्रति अच्छी तरह से केवल एक सेल को छांटना है, तो सही ढंग से संपादित कोशिकाओं को प्राप्त करने की संभावना को बढ़ाने के लिए अधिक माइक्रोप्लेट की सीडिंग की आवश्यकता होती है।

5. स्क्रीनिंग और सकारात्मक दस्तक कोशिकाओं में सत्यापन

  1. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा उम्मीदवार नॉक-इन कोशिकाओं के लिए स्क्रीनिंग
    1. कोशिकाओं को 10-15 दिनों के लिए चरण 4.5 से बढ़ाएं और वाष्पीकरण के माध्यम से खोए गए तरल को बदलने के लिए हर 3 दिनों में पूर्ण विकास माध्यम जोड़ें। जुरकट टी कोशिकाओं के लिए, कोशिका प्रसार को अनुकूलित करने के लिए राउंड बॉटम 96-वेल प्लेट में एक फ्लैट बॉटम प्लेट में उगाई गई कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    2. आगे के विस्तार के लिए विस्तारित छंटाई कोशिकाओं को 48-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करें।
    3. जब कोशिकाएं संगम के करीब हों, तो प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 3)द्वारा EBFP2 अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीन करने के लिए संस्कृति के आधे का उपयोग करें। आम तौर पर, एक 48-अच्छी तरह से प्लेट में संस्कृति का आधा 10 5 कोशिकाओं के × 0.5-1.0 के बराबर है, जो प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एक नमूने के विश्लेषण के लिए पर्याप्त है।
    4. शेष कोशिकाओं को आगे प्रसार के लिए 24-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करें।
    5. आगे जेनोटीपिंग प्रयोगों के लिए EBFP2-सकारात्मक कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत रखने वाले उम्मीदवार सेल आबादी रखें।
      नोट: क्योंकि 10 कोशिकाओं को ९६-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में हल कर रहे हैं, यह संभव है कि दस्तक कोशिकाओं में कोशिकाओं है कि दस्तक जीन में व्यक्त नहीं करते के साथ विकसित होगा । इसलिए, नकारात्मक कोशिकाओं से EBFP2-सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के लिए सेल छंटाई का एक अतिरिक्त दौर करना सामान्य है।
  2. पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा उम्मीदवार नॉक-इन सेल के लिए स्क्रीनिंग
    1. 10 5 उम्मीदवार प्रकोष्ठों ×2 एकत्र करें। डीएनए प्रेप किट का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निकालें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. यह सत्यापित करने के लिए कि सटीक होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) उम्मीदवार नॉक-इन कोशिकाओं के जीनोम में यादृच्छिक स्थलों के बजाय एमRosa26 लोकस में हुई है, एचए(चित्रा 4)के प्रत्येक पक्ष में फैले प्राइमर के साथ पीसीआर प्रदर्शन करें। लक्ष्यीकरण वेक्टर (बाहरी ओलिगो) के बाहर जीनोमिक क्षेत्र में स्थित एक प्राइमर और लक्ष्यीकरण वेक्टर (आंतरिक ओलिगो) के अंदर स्थित एक अन्य प्राइमर चुनें।
      नोट: hROSA26 लोकस पर एचडीआर को सत्यापित करने के लिए इसी तरह के डिजाइन का उपयोग किया जाता है। पीओआई सीक्वेंस के सम्मिलन का पता लगाने के लिए पीसीआर प्राइमर भी आसानी से डिजाइन किए जा सकते हैं। इसके अलावा, वाइल्ड-टाइप और नॉक-इन एलील जीनोटाइप को एक साथ थ्री-प्राइमर पीसीआर (सप्लीमेंट्री फाइल,फिगर S2 देखें) का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है।
    3. एक फास्ट क्लोनिंग किट का उपयोग कर सकारात्मक पीसीआर उत्पादों क्लोन (सामग्री की तालिकादेखें) । प्रतिक्रिया मिश्रण को DH5α सक्षम कोशिकाओं में बदलें।
    4. बेतरतीब ढंग से परिवर्तन के अनुसार 8-10 व्यक्तिगत जीवाणु कालोनियों लेने और Sanger अनुक्रम द्वारा चरण 5.2.3 से पीसीआर उत्पादों अनुक्रम।
  3. इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण और आत्मीयता शुद्धि द्वारा सकारात्मक दस्तक कोशिकाओं का सत्यापन
    नोट: उम्मीदवार कोशिकाओं को प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए पीओआई, या आत्मीयता शुद्धि (एपी) के सम्मिलन के सत्यापन के सत्यापन के लिए इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के अधीन किया जाता है।
    1. एंटीबॉडी निर्माता के निर्देशों के अनुसार इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण करें। प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए स्ट्रेप-टैक्टिन सेफारोज मोतियों का उपयोग करके एपी को OST-टैग किए गए पीओआई को व्यक्त करने वाली नॉक-इन कोशिकाओं के lysates के अधीन (सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. इमेजर का उपयोग करके रसायनीयता का पता लगाएं।

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Representative Results

मुरीन RAW264.7 मैक्रोफेज का उपयोग करके mRosa26 लोकस में दस्तक प्रयोग करने के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, हमने मानव ACE2 को व्यक्त करने के लिए एक लक्ष्यीकरण वेक्टर तैयार किया, जो सार्स-कॉव-2 वायरस(चित्रा 2 ए)के लिए एक रिसेप्टर है। इसी तरह के डिजाइन का उपयोग करके, हमने ओस्ट-टैग किए गए RASGRP1 फ्यूजन प्रोटीन(चित्रा 2C)की दस्तक के साथ मानव जुर्कट टी कोशिकाओं को उत्पन्न किया। तीन प्लाज्मिड के ट्रांसफैक्शन के बाद, जिनमें से दो का उपयोग CRISPR/Cas9 (DsRed2; pDSR-mR26-sg1 और mRosa26 नॉक-इन के लिए pDSR-mR26-sg2 की अभिव्यक्ति के लिए किया गया था; pDsR-hR26-sg1 और hROSA26 दस्तक के लिए pDsR-hR26-sg2) और एक और समरूप पुनर्संयोजन (EBFP2) के लिए एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया, डबल सकारात्मक दो फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त कोशिकाओं को एक ९६ अच्छी तरह से थाली में हल किया गया । एकल सेल छंटाई मोड का उपयोग करके हल की गई RAW264.7 कोशिकाओं में से, 0.91% DsRed2+ EBFP2+थे, लेकिन प्रत्येक कुएं में 10 कोशिकाओं को एकत्र किया गया(चित्रा 2B)। जुरकट टी कोशिकाओं में एक उच्च ट्रांसफैक्शन दक्षता थी, और इस प्रतिनिधि प्रयोग में डबल पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत 7.91% था, जो OST-RASGRP1 फ्यूजन प्रोटीन(चित्रा 2D)के सफल नॉक-इन का प्रदर्शन करता है।

अगले चरण में, प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग EBFP2-सकारात्मक कोशिकाओं के साथ उम्मीदवार कुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया था। प्रतिनिधि हिस्टोग्राम से पता चला है कि वहां स्पष्ट EBFP2-सकारात्मकआबादी (चित्रा 3)थे । यह उल्लेखनीय है कि दस्तक कोशिकाओं DsRed2 व्यक्त नहीं किया जब प्रवाह साइटोमेट्री सेल छंटाई के बाद दो सप्ताह किया गया था ।

सटीक दस्तक-ins और यादृच्छिक सम्मिलन के भेदभाव के लिए, EBFP2-सकारात्मक कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए आगे लक्ष्यीकरण वेक्टर के एचए के लिए बाहरी जीनोमिक अनुक्रम को पहचानने प्राइमर के साथ पीसीआर प्रदर्शन करके परीक्षण किया गया था और अभिव्यक्ति कैसेट के अंदर विशिष्ट क्षेत्र(चित्रा 4A और 4B)। इन पीसीआर उत्पादों के अनुक्रम विश्लेषण ने mRosa26 लक्ष्य स्थल(चित्रा 4C)पर एचडीआर की घटना की पुष्टि की । एक ही जीनोटाइपिंग रणनीति को जुरकट टी कोशिकाओं केhROSA26 लोकस में अभिव्यक्ति कैसेट के सटीक सम्मिलन को मान्य करने के लिए लागू किया जा सकता है।

HACE2 की एक शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए-RAW264.7 कोशिकाओं को व्यक्त, हम आगे कोशिकाओं को हल और नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग कर विस्तार के बाद फ्लोरोसेंट संवाददाताओं की उपस्थिति मांय(चित्रा 5A)। विस्तारित कोशिकाएं EBFP2 सकारात्मक थीं, और एचएईई2 प्रोटीन को मुरीन RAW264.7 मैक्रोफेज(चित्रा 5B और 5C)में आसानी से पता लगाया जा सकता था। इसी तरह, हमने स्क्रीनिंग के बाद मानव जुरकट टी कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और OST-RASGRP1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति और सेल छंटाई के दूसरे दौर(चित्रा 6A और 6B)को मान्य किया । इसके अलावा, ओएसटी-RASGRP1 प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोतियों का उपयोग करके किया गया था। हमें जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में दस्तक-इन जुरकट कोशिकाओं की कुल कोशिका में RASGRP1 प्रोटीन की एक उच्च मात्रा में पाया गया; RASGRP1 नॉकआउट Jurkat कोशिकाओं नियंत्रण(चित्रा 6C)के रूप में इस्तेमाल किया गया । ओएसटी टैग का उपयोग कर शुद्धिकरण के बाद, केवल दस्तक नमूनों का पता लगाने योग्य RASGRP1(चित्रा 6D)था ।

Figure 1
चित्रा 1। एमरोसा26/एचआरओए26 नॉक-इन सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए जीन लक्ष्यीकरण रणनीति ब्याज के प्रोटीन को अधिक प्रसारित करती है । (ए) mRosa26-विशिष्टगाइड आरएनए लक्ष्यीकरण दृश्यों और वांछित प्रविष्टि साइट में प्रोटोस्पेसर आसन्न रूपांकनों (PAMs) क्रमशः नीले और लाल अक्षरों में इंगित कर रहे हैं । Cas9 आम तौर पर पाम अनुक्रम के 3-4 बीपी अपस्ट्रीम को क्लीव्स करता है, जो हरे तीरों द्वारा इंगित किया जाता है। लक्ष्यीकरण वेक्टर का उपयोग होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया जाता है जिससे माउस या मानव जीनोम में अभिव्यक्ति कैसेट का सटीक सम्मिलन होता है। वांछित लक्ष्य स्थल के ऊपर और डाउनस्ट्रीम 1 केबी दृश्यों में से प्रत्येक को लक्ष्यीकरण वेक्टर में 5' और 3 ' होमोलॉजी आर्म्स (एचएएस) के रूप में उपयोग किया जाता है। एचए एक सीएजी प्रमोटर से मिलकर एक अभिव्यक्ति कैसेट से अलग कर रहे हैं, ब्याज के प्रोटीन के सीडीएनए अनुक्रम (POI) एक OST टैग के साथ, एक IRES-EBFP2 रिपोर्टर, और एक bGH-polya संकेत (पीए) । प्रतिबंध साइट AscI का उपयोग पीओआई की क्लोनिंग के लिए किया जाता है, और इकोरी और बाम्ही का उपयोग लक्षित वेक्टर के रैखिकीकरण के लिए किया जाता है। CRISPR/Cas9 के लिए रणनीति hROSA26 लोकस में मध्यस्थता दस्तक समान है । (ख) मानव ROSA26 लोकस का आरेख । HR26-sg1 और hR26-sg2 लक्ष्यीकरण दृश्यों नीले अक्षरों में और लाल रंग में इसी पाम दृश्यों में संकेत दिया जाता है । (ग) ऑल-इन-वन CRISPR अभिव्यक्ति वेक्टर pX458-DsRed2 के लिए योजनाबद्ध, जिसमें एक मानव U6-चालित sgRNA अभिव्यक्ति कैसेट और Cas9-T2A-DsRed2 फ्लोरेसेंट रिपोर्टर कैसेट शामिल हैं । दो BBSI प्रतिबंध साइटों गाइड आरएनए की क्लोनिंग के लिए अनुमति देते हैं । U6, मानव U6 आरएनए बहुलक III प्रमोटर; sgRNA, एक चिमरिक एकल गाइड आरएनए; CBh, एक चिकन β-actin संकर प्रमोटर; एनएलएस, परमाणु स्थानीयकरण संकेत; T2A, थेना asigna वायरस 2A स्वयं स्प्लिसिंग पेप्टाइड; बीजीएच-पीए, गोजातीय विकास हार्मोन पॉलीडेनिलेशन सिग्नल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। CRISPR/Cas9 वैक्टर से संक्रमित RAW264.7 और जुर्कट कोशिकाओं की एकल कोशिका छंटाई और समरूप पुनर्संयोजन के लिए वैक्टर को लक्षित करना । RAW264.7 (A) और जुरकट (सी) कोशिकाओं में स्थिर जीन अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किए जाने वाले वैक्टर को लक्षित करना। माउस RAW264.7 मैक्रोफेज (बी) और मानव Jurkat टी कोशिकाओं (डी) के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक भूखंडों CRISPR/Cas9 वैक्टर के साथ संक्रमित DsRed2 रिपोर्टर और लक्ष्यीकरण वेक्टर EBFP2 रिपोर्टर व्यक्त व्यक्त करते हैं । कोशिकाओं को सह-व्यक्त DsRed2 और EBFP2 सेल छंटाई और विस्तार के लिए सुसंस्कृत के अधीन थे; उल्लिखित क्षेत्रों से सटे नंबर प्रत्येक गेट में कोशिकाओं के प्रतिशत को इंगित करते हैं, और गैर-संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। EBFP2 अभिव्यक्ति का पता लगाने के द्वारा दस्तक कोशिकाओं की स्क्रीनिंग। इलेक्ट्रोपॉशन के 14 दिन बाद ईबीएफपी2+ और डीएसड्रेड2+ RAW264.7 मैक्रोफेज (ए) और जुरकट टी कोशिकाओं (बी) का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण। हिस्टोग्राम में, ईबीएफपी 2+ या DsRed2 +कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता (एफआई) एक्स-एक्सिस पर प्रदर्शित की जाती है और प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल में घटनाओं की गिनती वाई-एक्सिस पर प्रदर्शित होती है। (क) ईबीएफपी2 और एचएसीई2 की अभिव्यक्ति RAW2647 मुरीन मैक्रोफेज में Rosa26 लोकस में एक ही प्रमोटर द्वारा संचालित की गई थी । (ख) जुरकट कोशिकाओं में, OST-RASGRP1 अभिव्यक्ति मानव ROSA26 लोकस में EBFP2 अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है । इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 14 दिनों में, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण ने क्रमबद्ध कोशिकाओं के बीच लगभग शून्य DsRed2+ कोशिकाओं का खुलासा किया। जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और KI दस्तक कोशिकाओं के लिए खड़ा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा उम्मीदवार नॉक-इन सेल के लिए स्क्रीनिंग। (क) एचएईई2 नॉक-इन कोशिकाओं को उत्पन्न करने की कार्यनीति। सटीक एचडीआर और यादृच्छिक प्रविष्टि को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर प्राइमर की स्थिति हरे तीरों द्वारा इंगित की जाती है। (ख) पांच उम्मीदवार कोशिकाओं (#4, #15, #22, #25, और #43) की पीसीआर जेनोटीपिंग, जिन्हें EBFP2 अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह साइटोमेट्री स्क्रीनिंग द्वारा चित्र 3में उदाहरण के रूप में पहचाना गया था, से पता चला है कि 5 ' जंक्शन (१४७२ बीपी) और 3 ' जंक्शन (१४७२ बीपी) दोनों hom शस्त्र विज्ञान में फैले सही थे । एम, डीएनए सीढ़ी; डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार RAW264.7 नियंत्रण; एच2ओ, नकारात्मक नियंत्रण। (ग) बी से पीसीआर उत्पादों के सेंगर अनुक्रमण ने बिना म्यूटेशन के mRosa26 लोकस में hACE2-अभिव्यक्ति कैसेट की सफल दस्तक का खुलासा किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। RAW264.7 मैक्रोफेज में mRosa26 लोकस में hACE2 अभिव्यक्ति कैसेट के सफल नॉक-इन का सत्यापन। (ए) डब्ल्यूटी RAW264.7 मैक्रोफेज का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। (ख) नकारात्मक कोशिकाओं से EBFP2-सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के लिए, लगभग १००% EBFP2+ नॉक-इन कोशिकाओं से मिलकर जनसंख्या प्राप्त करने के लिए सेल छंटाई का एक अतिरिक्त दौर किया गया था, जो hACE2 KI कोशिकाओं के रूप में नामित किया गया था । यह सुनिश्चित करने के लिए DsRed2 अभिव्यक्ति की भी जांच की गई थी कि CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड को RAW264.7 मैक्रोफेज के जीनोम में एकीकृत नहीं किया गया था । हिस्टोग्राम में, ईबीएफपी 2+ या DsRed2 +कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता (एफआई) एक्स-एक्सिस पर प्रदर्शित की जाती है और प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल में घटनाओं की संख्या वाई-एक्सिस पर प्रदर्शित की जाती है। (ग) खरगोश विरोधी मानव ACE2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा hACE2 अभिव्यक्ति का पता लगाना । HACE2 की अभिव्यक्ति कई कुओं (#4, #15, # 22, # 25, और #43) से कोशिकाओं में देखी गई थी । डब्ल्यूटी RAW264.7 मैक्रोफेज का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता था और गैपध का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। ओएसटी-RASGRP1 अभिव्यक्ति कैसेट के सफल नॉक-इन का सत्यापन ज्यूरकैट टी कोशिकाओं में hROSA26 लोकस में । (ए) डब्ल्यूटी जुरकट टी कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । (ख) जुरकट कोशिकाओं की ईबीपीएफ2+ उप-जनसंख्या कोशिका छंटाई और विस्तारित के अतिरिक्त दौरों से समृद्ध थी; इन कोशिकाओं को OST-RASGRP1 KI कोशिकाओं के रूप में नामित किया गया था। दस्तक कोशिकाओं प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया और DsRed2-एक्सप्रेसिंग वेक्टर नहीं रखा । हिस्टोग्राम में, ईबीएफपी 2 + या DsRed2+ कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता (एफआई) एक्स-एक्सिस पर प्रदर्शित की जाती है और प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल में घटनाओं की गिनती वाई-एक्सिस पर प्रदर्शित की जाती है। (ग) एंटी-RASGRP1 एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा दो स्वतंत्र नॉक-इन कोशिकाओं (#1 और #2) में OST-RASGRP1 अभिव्यक्ति का पता लगाना । डब्ल्यूटी ज्यूरकैट और RASGRP1-नॉकआउट जुरकट कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था और लोडिंग नियंत्रण के रूप में β-ऐक्टिन का उपयोग किया गया था। (घ) ओएसटी-मध्यस्थता आत्मीयता शुद्धि का उपयोग एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में RASGRP1 नॉकआउट कोशिकाओं का उपयोग करके OST-RASGRP1 की अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए किया गया था । कोशिका से प्रोटीन की समान मात्रा का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण जो या तो स्ट्रीप-टैक्टिन सेफ्रॉज मोतियों (आत्मीयता शुद्धि) पर आत्मीयता शुद्धि के अधीन थे या सीधे विश्लेषण (कुल lysates) और RASGRP1 या GAPDH (लोडिंग नियंत्रण) एंटीबॉडी के साथ जांच की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फ़ाइल: सहायक आंकड़े, तालिका और दृश्य कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमारे प्रयोगों में, हमने प्रदर्शन किया कि उदाहरण के रूप में मानव जुरकट टी कोशिकाओं और मुरीन RAW264.7 मैक्रोफेज का उपयोग करके डिजाइन निर्माण डिजाइन से लेकर नॉक-इन सेल स्क्रीनिंग और सत्यापन तक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में नॉक-इन संपादन कैसे करें। टी सेल और मैक्रोफेज सेल दोनों लाइनें36,37के ट्रांसफैक्शन के लिए प्रतिरोधी हैं . हालांकि, CRISPR/Cas9 डिलीवरी की कम दक्षता की समस्या को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की सहायता से सेल छंटाई के साथ मिलकर दूर किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल जीन बचाव प्रयोगों और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन प्रयोगों के लिए उपयुक्त है, लेकिन इसे नियामक डीएनए दृश्यों जैसे ट्रांसक्रिप्शन कारकों की बाध्यकारी साइटों के अध्ययन पर लागू नहीं किया जा सकता क्योंकि प्रोटोकॉल Rosa26 लोकस के नॉक-इन संशोधन के लिए विकसित किया गया था ।

दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स सहायता प्राप्त CRISPR/Cas9 दस्तक संपादन में
हमने प्रतिरक्षा कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 वैक्टर के स्वतंत्र सेटों को क्षणिक रूप से व्यक्त करने के लिए एक दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रणाली को सफलतापूर्वक लागू किया, जिसके परिणामस्वरूप पिछले अध्ययनों में डीएनए के बड़े टुकड़ों को हटा दिया गया21। हमने एक रिपोर्टर के रूप में DsRed2 फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके एक CRISPR/Cas9 लक्ष्यीकरण उपकरण तैयार किया और दस्तक के लिए डीएनए टेम्पलेट की डिलीवरी को ट्रैक करने के लिए एक अतिरिक्त स्पेक्ट्रेली विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन तैयार किया। नॉक-इन एलील संशोधन को व्यवहार्य बनाने के लिए, हमने ईबीएफपी2 फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर का उपयोग किया, जिसमें आरएफपी (हमारे मामले में DsRed2) के साथ कोई स्पेक्ट्रल स्पिलओवर नहीं है, जो कि निरूपण पुनर्संयोजन के दौरान टेम्पलेट के रूप में सेवारत दाता डीएनए के ट्रांसफेक्शन की निगरानी करने के लिए है। पीओआई और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को व्यक्त करने वाले कैसेट को अनुकूलित करने के लिए, स्वतंत्र प्रोटीन प्राप्त करने के लिए एक IRES अनुक्रम पेश किया गया था। हमारे पिछले अध्ययन में, हमने कहा कि P2A या T2A लिंकर से अवशिष्ट अमीनो एसिड के बाद ट्रांसक्रिप्शनल दरार कोशिका की सतह पर प्रोटीन स्थानीयकरण प्रभावित शेष है । IRES अनुक्रम इस तरह के अवशिष्ट अमीनो एसिड नहीं छोड़ता है। जैसा कि पिछले अध्ययन में वर्णित है, आईरेस ने कैग प्रमोटर३८द्वारा संचालित Cas9 प्रोटीन की अभिव्यक्ति के बाद फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के उच्च स्तर को जन्म दिया ।

ऑल-इन-वन CRISPR/Cas9 प्लाज्मिड
पिछले अध्ययनों में CRISPR/Cas9 प्रणाली के विभिन्न प्रारूपों और संयोजनों का वर्णन किया गया है, जैसे Cas9 ट्रांसफैक्शन एक एमआरएनए या प्रोटीन के रूप में रासायनिक संश्लेषित sgRNAs३९के साथ । CRISPR/Cas9 RNP परिसरों को भी स्तनधारी कोशिकाओं में वितरित किया गया है; यह रणनीति नाभिक गतिविधि की पहले की शुरुआत और एक छोटे आधे जीवन के फायदे प्रदान करती है; हालांकि, सभी में एक प्लाज्मिड के निर्माण के साथ तुलना में आरएनपी लेबलिंग कम लागत प्रभावी है। हमारे पिछले अध्ययनों में, हमने पाया कि CRISPR/Cas9 (DsRed2 सकारात्मक) और दस्तक प्रोटीन (EBFP2 सकारात्मक) व्यक्त उन दुर्लभ कोशिकाओं को अलग करने के लिए एकल सेल छंटाई का उपयोग करना आरएनपी डिलीवरी का उपयोग करने की तुलना में बहुत कम जटिल है, और प्लाज्मिड्स तैयार करना आसान है । यह सच है कि यह प्रोटोकॉल सिंगल सेल छंटाई पर निर्भर करता है। लेकिन हमारे प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए आसान है और उच्च प्रजनन के साथ संशोधनों में सफल दस्तक पैदावार ।

Rosa26 लोकस से एक पीओआई की अभिव्यक्ति
साहित्य में कई रिपोर्टें हैं जिनमें फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ एंडोजेनस प्रोटीन को टैग करने के तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसमें CRISPR/Cas9 संपादन४०,४१,४२का उपयोग किया गया है । अंतर्जात टैगिंग के फायदे यह हैं कि उपकोशिकीय स्थानीयकरण निर्धारित करना और अंतर्जात प्रोटीन की वीवो ट्रैकिंग में प्रदर्शन करना संभव है। हालांकि, समस्याओं का सामना करना पड़ सकता है यदि अंतर्जात लोकस में उपयुक्त क्रिप्सआर गाइड आरएनए डिजाइन करना संभव नहीं है। यहां हमने जीनोमिक सुरक्षित बंदरगाह लोकस Rosa26में पीओआई-आईईईएस-ईबीएफपी2 को शामिल करके एक वैकल्पिक नॉक-इन विधि विकसित की है, जो अंतर्जात टैग को स्थिति के लिए उपयुक्त गाइड खोजने की सीमाओं पर काबू पा रही है।

हम कुछ प्रमुख बिंदुओं को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं जिन पर तकनीकी प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगों के दौरान विचार किए जाने की आवश्यकता है। सबसे पहले, सेल सॉर्टर को EBFP2 की उमंग के लिए 405 एनएम वायलेट लेजर और 488 एनएम ब्लू लेजर या वैकल्पिक रूप से DsRed2 के उत्तेजन के लिए 561 एनएम पीले लेजर की आवश्यकता होती है। इस तरह के विन्यास के साथ, EBFP2 और DsRed2 कोई स्पेक्ट्रल स्पिलओवर के साथ पता लगाया जा सकता है, जो झूठे सकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हमारे प्रयोगों में, DsRed2+ EBFP2+ डबल सकारात्मक कोशिकाओं का अनुपात 0.9% के रूप में कम था; इसलिए, प्रयोगों की सफलता के लिए उचित जनसंख्या की गेटिंग आवश्यक थी। EBFP2+ सकारात्मक कोशिकाओं को गेट करने के लिए छंटाई का दूसरा दौर किया गया था, जिसके बाद पीसीआर सत्यापन किया गया था। इसके अलावा, नॉक-इन प्रोटीन डिटेक्शन के लिए, ओएसटी या किसी अन्य प्रकार के टैग जैसे प्रोटीन टैग को पेश करना बेहतर है। Rosa26 लोकस नॉक-इन प्रयोगों से पहले जीन के नॉकआउट एक अच्छा आकलन करने का अवसर प्रदान करता है कि एंटीबॉडी वांछनीय विशिष्टता है । जब एंटीबॉडी विशिष्टता पर्याप्त नहीं है, तो प्रोटीन टैग के माध्यम से पुलडाउन के बाद नॉक-इन प्रोटीन का पता लगाया जाना चाहिए। अंत में, दस्तक-इन एलील व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की FACS स्क्रीनिंग के दौरान, EBFP2 की तीव्रता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या दो प्रतियां या नॉक-इन एलील की एक प्रति मौजूद है।

अनुप्रयोगों
इस प्रोटोकॉल में हमने RASGRP1 के नॉक-इन संशोधन का वर्णन किया, जो टी सेल एक्टिवेशन27में शामिल एक प्रमुख अणु है । हमने पहली बार RASGRP1-नॉकआउट जुरकट कोशिकाओं को प्राप्त किया जिसका उपयोग नुकसान-कार्य अध्ययनों के लिए किया जा सकता है, और हमने एचआरओएसए26 लोकस में OST-RASGRP1 व्यक्त करते हुए अतिरिक्त जुरकट कोशिकाएं उत्पन्न कीं। ज्यूरकैट कोशिकाएं टी सेल जीव विज्ञान43का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली मानव कोशिका रेखा हैं । कैंसर रोगियों में टी सेल थकावट को रोकने में इम्यूनोथेरेपी की सफलता के कारण, इम्यूनोलॉजिस्ट और कैंसर जीवविज्ञानी उम्मीदवार अणुओं के कार्यात्मक अध्ययन के लिए जुर्कट कोशिकाओं को संशोधित करने में बहुत रुचि रखते हैं। यह भी उल्लेखनीय है कि जुरकट टी सेल लाइन का उपयोग आमतौर पर सिग्नलिंग रास्तों के विच्छेदन के लिए किया जाता है, लेकिन इस सेल लाइन का उपयोग करने की सीमाएं हैं, क्योंकि जुरकट कोशिकाएं उत्तेजना44पर आईएफएन-γ के गरीब उत्पादक हैं। पिछले अध्ययनों ने मानव जुरकट कोशिकाओं में दस्तक प्रयोग करने के लिए एचआरओए26 लोकस46 में अंतर्जात लोकस संशोधन45 और जेनेटिक इंजीनियरिंग दोनों का उपयोग किया। दोनों रणनीतियों के अपने फायदे हैं; अंतर्जात लोकस को संशोधित करके प्रोटीन संभवतः "शारीरिक" स्तर पर व्यक्त किया जाता है। hROSA26 लोकस में दस्तक संशोधन उम्मीद के मुताबिक परिणाम पैदा करता है क्योंकि mRNA के वैकल्पिक splicing से बचा जाता है, और संशोधित प्रोटीन की बहुतायत भी आसानी से पता लगाने योग्य है । अन्य जीनोमिक सुरक्षित बंदरगाह, जैसे एडेनो से जुड़े वायरस साइट 1(AAVS1)और केमोकिन (सीसी आकृति) रिसेप्टर 5(सीसीआर 5)47,48 अधिक अन्वेषण के हकदार हैं।

हमारे पिछले अध्ययन में, जब Vav1-OST RAW26 6 लोकस में उच्च स्तर पर RAW264.7 कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, जो बहुत बार मैक्रोफेज कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, हम बाट प्रोटीन के उच्च स्तर और ऑस्टिशिनिटी शुद्धिकरण13की उच्च दक्षता के कारण नीच व्यक्त Vav3 अणुओं के साथ अपनी बातचीत का पता लगाने में सक्षम थे । हमने एक मैक्रोफेज सेल लाइन को स्थापित करने के लिए नॉक-इन प्रयोगों का भी वर्णन किया, जो सार्स-सीओवी-2 के लिए एक रिसेप्टर hACE2 को व्यक्त करता है, जिसमें प्रचुर मात्रा में अभिव्यक्ति की गारंटी है । एकल सेल आरएनए अनुक्रमण डेटाबेस में, मुरीन Ace2 फेफड़ों के मैक्रोफेज में व्यक्त किया जाता है, और आनुवंशिक सेलुलर मॉडल एचएई2 को व्यक्त करता है जो हमने विकसित किया है, सार्स-सीओवी-2 संक्रमण के दौरान मैक्रोफेज के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है।

अन्य बातें
यह प्रोटोकॉल नॉक-इन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषणों की सहायता से एक पीओआई व्यक्त करते हैं, हमारे मामले में EBFP2 रिपोर्टर। हालांकि, जब एफएसीएस द्वारा पता लगाने योग्य सतह लेबलिंग एंटीबॉडी सतह प्रोटीन49के लिए उपलब्ध हैं, तो रिपोर्टर सिस्टम50का उपयोग करना आवश्यक नहीं है। टी सेल और मैक्रोफेज सेल लाइनों, साथ ही इंटरटैक्टोम अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले OST-टैग किए गए प्रोटीन के उदाहरणों का उपयोग मुख्य रूप से संकेत अध्ययन के लिए किया जाता है, और इनमें से अधिकांश सिग्नलिंग अणु कोशिकाओं के साइटोसोल या नाभिक में स्थानीयकृत होते हैं। इस प्रकार, वांछनीय दस्तक कोशिकाओं की पहचान के लिए एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की आवश्यकता हो सकती है।

यह बताना महत्वपूर्ण है कि यह प्रोटोकॉल सेल लाइनों के लिए विकसित किया गया था, और प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे टी कोशिकाओं, मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज के लिए आवेदन को मान्य नहीं किया गया था । कोशिकाओं की सीमित क्षमता के कारण, हम प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उपयोग के लिए इस प्रोटोकॉल की सिफारिश नहीं करते हैं। के रूप में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर EBFP2 दस्तक जीन या POI के रूप में एक IRES तत्व का उपयोग कर एक ही प्रमोटर के तहत व्यक्त किया गया था, हम कोशिकाओं है कि दस्तक जीन के अभाव में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर व्यक्त का पालन नहीं किया । हमें संदेह है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की वसूली समरूप पुनर्संयोजन की सफलता पर अत्यधिक निर्भर है। जैसा कि पिछले अध्ययन में बताया गया है, एकल सेल छंटाई द्वारा सही दस्तक कोशिकाओं को सॉर्ट, विस्तार करना और पहचानना थकाऊ है, जब दस्तक दक्षता बहुत कम है42,जो यह भी बताती है कि सफलता दर में सुधार करने के लिए हमें कोशिकाओं को थोक में सॉर्ट करने की आवश्यकता क्यों है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम शिनजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी की फ्लो साइटोमेट्री कोर फैसिलिटी को धन्यवाद देते हैं । इस तरह की तकनीक के विकास को एनएसएफसी ने एलजेड, 81471595 और 32070898 को 81601360 आईएल के लिए अनुदान प्रदान किया है । इस काम को फाउंडेशन ऑफ हेलन एजुकेशनल कमेटी नंबर 21IRTSTHN030 का भी समर्थन है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amersham Imager 600 Ge Healthcare imaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium salt MP Biomedicals 194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074 at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 Merck MABS146 1.0 μg/mL of working concentration
AscI New England BioLabs R0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 8457 at 1/1000 dilution
BamHI-HF New England BioLabs R3136S
BbsI-HF New England BioLabs R3539S
Cellometer Mini Automated Cell Counter Nexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent Cells Takara 9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MP Biomedicals 196055
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69506 cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose HyClone SH30022.01
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
FACSAria™ Fusion BD Biosciences equipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube BD Biosciences 352003
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10099141
FlowJo version 10.7 BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 5174 at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP ThermoFisher Scientific 31430 at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF Membrane Millipore ISEQ00010
Jurkat ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfate MP Biomedicals 194531
LB agar powder ThermoFisher Scientific 22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL) Eppendorf, or similar
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix New England BioLabs (M0489) for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa ThermoFisher Scientific 26616
Pipette tip 0.1-20µl Eppendorf, or similar 0030 075.005
Pipette tip 2-200µl Eppendorf, or similar 0030 075.021
Pipette tip 50-1000µl Eppendorf, or similar 0030 075.064
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
pX458-DsRed2 Addgene 112219
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New England BioLabs M0494S
RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] Abcam ab108252 at 1/1000 dilution
RPMI 1640 Medium HyClone SH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beads IBA Lifesciences 2-1201-010
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific S34859
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202S
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red ThermoFisher Scientific 25200056
ZOE Fluorescent Cell Imager Bio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-clean Eppendorf, or similar 0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates Corning 3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate Corning 3799

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १७७ नॉक-इन CRISPR/Cas9 Rosa26,मैक्रोफेज टी सेल hACE2
CRISPR/Cas9 द्वारा जीन नॉक-इन और मैक्रोफेज और टी सेल लाइनों में सेल छंटाई
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Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu,… More

Zhang, L., Huang, R., Lu, L., Fu, R., Guo, G., Gu, Y., Liu, Z., He, L., Malissen, M., Liang, Y. Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (177), e62328, doi:10.3791/62328 (2021).

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