Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.
Funktionelle Genomik-Studien des Immunsystems erfordern genetische Manipulationen, die sowohl die Deletion von Zielgenen als auch die Zugabe von Elementen zu interessierenden Proteinen beinhalten. Die Identifizierung von Genfunktionen in Zelllinienmodellen ist wichtig für die Genentdeckung und Erforschung zellintrinsischer Mechanismen. Genetische Manipulationen von Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagenzelllinien mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Knock-in sind jedoch aufgrund der geringen Transfektionseffizienz dieser Zellen, insbesondere in einem Ruhezustand, schwierig. Um Gene in Immunzellen zu modifizieren, werden typischerweise Arzneimittelresistenzselektion und virale Vektoren verwendet, um Zellen anzureichern, die das CRIPSR / Cas9-System exprimieren, was unweigerlich zu unerwünschten Eingriffen der Zellen führt. In einer früheren Studie haben wir duale fluoreszierende Reporter entwickelt, die mit CRISPR/Cas9 gekoppelt sind und nach der Elektroporation vorübergehend exprimiert wurden. Diese technische Lösung führt zu einer schnellen Genselöschung in Immunzellen; Das Einklopfen von Genen in Immunzellen wie T-Zellen und Makrophagen ohne den Einsatz von Arzneimittelresistenzselektion oder viralen Vektoren ist jedoch noch schwieriger. In diesem Artikel zeigen wir, dass durch die Verwendung von Zellsortierung zur Unterstützung der Selektion von Zellen, die transient CRISPR/Cas9-Konstrukte exprimieren, die auf den Rosa26-Locus in Kombination mit einem Spenderplasmid abzielen, ein Gen-Knock-in sowohl in T-Zellen als auch in Makrophagen ohne Arzneimittelresistenzanreicherung erreicht werden kann. Als Beispiel zeigen wir, wie man menschliches ACE2, einen Rezeptor von SARS-Cov-2, der für die aktuelle Covid-19-Pandemie verantwortlich ist, in RAW264.7-Makrophagen durch Knock-in-Experimente exprimiert. Solche Gen-Knock-in-Zellen können häufig für mechanistische Studien verwendet werden.
Immunzellen sind entscheidend für die Abwehr von Krankheitserregern. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunität sind für die Clearance von Infektiva und die Aufrechterhaltung der Gewebeöostase erforderlich1,2. Zelllinienmodelle sind wesentliche Werkzeuge, um die molekularen Grundlagen des Immunsystems von Säugetieren zu verstehen. Sie werden in funktionellen In-vitro-Assays verwendet, z. B. bei der Modellierung der Aktivierung menschlicher T-Zellen und bei der Bestimmung der Funktion genetischer Faktoren bei der Aktivierung oder Dämpfung von Immunantworten3,4. Es ist wichtig zu beachten, dass das Immunsystem von Säugetieren enorm heterogen ist und, ebenso wichtig, eine große Anzahl von Molekülen die Differenzierung, Migration und Funktion eines bestimmten Zelltyps5,6steuert.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Genome Editing Tools ermöglichen die genetische Manipulation bestimmter Zelltypen, was die funktionelle Annotation von Genen auf präzise Weise erleichtert7,8. Mehrere veröffentlichte Protokolle haben die Abgabe von CRISPR/Cas9 in Form von Cas9-Guide-RNA-Komplexen beschrieben, die als Ribonukleoproteine (RNPs) in HEK293-Zellen, Jurkat-Zelllinien, primären T-Zellen9,10, Makrophagen11,12,13, Stammzellen14und anderen15,16bekannt sind . In diesen Protokollen wird das Gen-Tagging normalerweise durch Verschmelzen eines fluoreszierenden Tags mit endogenen Proteinenerreicht 17,18. Es wurden jedoch nur wenige Versuche unternommen, duale fluoreszierende Reporter zu verwenden, die mit der Einzelzellsortierung kompatibel sind, um Knock-in-Experimente19,20, insbesondere in Immunzellen , zu erleichtern.
Eingehende mechanistische Analysen, die darauf abzielen, die Funktionen eines neuartigen genetischen Faktors in Immunzellen zu verstehen, erfordern in der Regel eine zelltypspezifische Deletion eines Gens, genetische Rettungsexperimente und idealerweise die Identifizierung seiner Interaktoren. Obwohl Methoden zur Optimierung der genetischen Deletion von Genen in Immunzellen veröffentlicht wurden9,15,21, wurden weit weniger Methoden zur Einführung von Knock-in-Allelen mit vielseitigen Funktionen zum Verständnis der Immunantwort berichtet. Daher wollen wir in diesem Protokoll ein effizientes und hochreproduzierbares Protokoll beschreiben, um ein Protein von Interesse (POI) am Safe-Harbor-Locus Rosa26 sowohl in menschlichen als auch in murinen Immunzelllinien zu exprimieren. Wir haben ein zweifarbiges Reportersystem entwickelt, um Zellen anzureichern, die mit Plasmiden transfiziert sind, die CRISPR/Cas9 (DsRed2) exprimieren, und eine rekombinante DNA-Vorlage (EBFP2), die durch Zellsortierung isoliert werden kann. Nach diesem Protokoll erhielten wir mehrere Knock-in-Linien der menschlichen T-Zelllinie Jurkat und des murinen Makrophagen RAW264.7 für funktionelle Analysen von schlecht untersuchten Proteinen.
Als Beispiel zeigen wir in diesem Protokoll, wie man Knock-in RAW264.7 Makrophagen erhält, die stabil menschliches ACE2 (ein Rezeptor von SARS-Cov-2)22exprimieren. Da angeborene Immunzellen an der Pathogenese von Covid-1923beteiligt sind,24 und humanes ACE2 als hauptrezeptor gilt, der für den viralen Eintritt in Zellen vor der Replikation benötigt wird, können Makrophagen mit Knock-in von humanem ACE2 als nützliches Werkzeug für mechanistische Studien der viralen Vermehrung in Makrophagen dienen. Parallel dazu präsentieren wir auch ein Beispiel für das Einschalten eines Gens am menschlichen ROSA26-Locus, um das RASGRP1-Protein zu exprimiert, das an seinem Aminoterminus mit einem Affinitäts-Twin-Strep-Tag (OST) verschmolzen wurde. T-Zellen sind wichtige Zielzellen in Immuntherapien, und eine zunehmende Anzahl von Studien hat sich auf die Manipulation ihrer Reaktionsfähigkeit auf Krebs konzentriert25,26. Da Rasgrp1 als schlüsselhaftes Signalmolekül nach dem T-Zell-Rezeptor bekannt ist und seine Interaktoren nicht gut aufgeklärt sind27, bietet das OST-RASGRP1-Knock-in-Modell die Grundlage für die Identifizierung von Interaktoren, die die Reaktion von T-Zellen auf Tumore und Infektionen regulieren. Zusammengenommen können diese Werkzeuge für Covid-19-Studien und die Entdeckung neuartiger Moleküle verwendet werden, die mit Rasgrp1 interagieren.
In unseren Experimenten haben wir gezeigt, wie man Knock-in-Editing in Immunzellen vom Konstruktdesign bis zum Knock-in-Zellscreening und Validierung am Beispiel menschlicher Jurkat-T-Zellen und muriner RAW264.7-Makrophagen durchführt. Sowohl T-Zell- als auch Makrophagen-Zelllinien sind resistent gegen Transfektion36,37; Das Problem der geringen Effizienz der CRISPR/Cas9-Abgabe kann jedoch mit Hilfe von fluoreszierenden Reportern in Verbindung mit der Zellsortie…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken der Durchflusszytometrie-Kerneinrichtung der Xinxiang Medical University. Die Entwicklung einer solchen Technologie wurde durch NSFC-Zuschüsse 81601360 an LZ, 81471595 und 32070898 an YL unterstützt. Die Arbeit wird auch von der Stiftung des Henan Educational Committee Nr. 21IRTSTHN030 unterstützt.
Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
AscI | New England BioLabs | R0558S | |
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |