Summary
Este artigo de método detalha os principais passos na medição do vazamento de H+ através da membrana mitocondrial interna com a técnica de patch-clamp, uma nova abordagem para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias.
Abstract
A termogênese mitocondrial (também conhecida como desacoplamento mitocondrial) é uma das metas mais promissoras para aumentar o gasto energético para combater a síndrome metabólica. Tecidos termogênicos como gorduras marrons e bege desenvolvem mitocôndrias altamente especializadas para produção de calor. Mitocôndrias de outros tecidos, que produzem principalmente ATP, também convertem até 25% da produção total de energia mitocondrial em calor e podem, portanto, ter um impacto considerável na fisiologia de todo o corpo. A termogênese mitocondrial não é apenas essencial para manter a temperatura corporal, mas também previne a obesidade induzida pela dieta e reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) para proteger as células contra danos oxidativos. Uma vez que a termogênese mitocondrial é um dos principais reguladores do metabolismo celular, uma compreensão mecanicista desse processo fundamental ajudará no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial. É importante ressaltar que os mecanismos moleculares precisos que controlam a ativação aguda da termogênese nas mitocôndrias são mal definidos. Essa falta de informação deve-se, em grande parte, à escassez de métodos para a medição direta de proteínas desacoplamento. O desenvolvimento recente da metodologia de patch-clamp aplicada às mitocôndrias possibilitou, pela primeira vez, o estudo direto do fenômeno na origem da termogênese mitocondrial, o vazamento de H+ através do IMM, e a primeira caracterização biofísica dos transportadores mitocondriais responsáveis por ele, a proteína desacoplamento 1 (UCP1), específica das gorduras marrom e bege, e o transporte ADP/ATP (AAC) para todos os outros tecidos. Esta abordagem única fornecerá novas percepções sobre os mecanismos que controlam o vazamento de H+ e a termogênese mitocondrial e como eles podem ser direcionados para combater a síndrome metabólica. Este artigo descreve a metodologia de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias para estudar sua capacidade termogênica medindo diretamente as correntes H+ através do IMM.
Introduction
Mitocôndrias são famosas por serem a potência da célula. Na verdade, eles são a principal fonte de energia química, ATP. O que é menos conhecido é que mitocôndrias também geram calor. De fato, cada mitocôndria constantemente gera os dois tipos de energias (ATP e calor) e um equilíbrio fino entre as duas formas de energia define homeostase de células metabólicas (Figura 1). Como as mitocôndrias distribuem energia entre ATP e calor é certamente a questão mais fundamental no campo da bioenergetics, embora ainda seja amplamente desconhecida. Sabemos que o aumento da produção de calor mitocondrial (chamada termogênese mitocondrial), e consequentemente reduzir a produção de ATP aumenta o gasto energético e esta é uma das melhores formas de combater a síndrome metabólica1.
A termogênese mitocondrial origina-se do vazamento de H+ através da membrana mitocondrial interna (IMM), levando ao desacoplamento da oxidação do substrato e da síntese de ATP com consequente produção de calor, daí o nome "desacoplamento mitocondrial"1 (Figura 1). Este vazamento H+ depende de transportadores mitocondriais chamados proteínas de desacoplamento (UCPs). A UCP1 foi a primeira UCP identificada. É expressa apenas em tecidos termogênicos, gordura marrom e gordura bege em que mitocôndrias são especializadas para produção de calor 2,3,4. A identidade da UCP em tecidos não adiposos, como músculo esquelético, coração e fígado, tem permanecido controversa. Mitocôndrias nesses tecidos podem ter cerca de 25% da energia mitocondrial total convertida em calor, o que pode impactar significativamente a fisiologia de todo o corpo1. Além de manter a temperatura corporal do núcleo, a termogênese mitocondrial também previne a obesidade induzida pela dieta, reduzindo as calorias. Além disso, reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por mitocôndrias para proteger as células de danos oxidativos1. Assim, a termogênese mitocondrial está envolvida no envelhecimento normal, distúrbios degenerativos relacionados à idade e outras condições que envolvem estresse oxidativo, como isquemia-reperfusão. Portanto, a termogênese mitocondrial é um poderoso regulador do metabolismo celular, e uma compreensão mecanicista desse processo fundamental promoverá o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial.
A respiração mitocondrial foi a primeira técnica a revelar o papel crucial da termogênese mitocondrial no metabolismo celular e ainda é a mais popular na comunidade1. Esta técnica é baseada na medição do consumo de oxigênio pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) que aumenta quando o vazamento mitocondrial H+ é ativado. Esta técnica, embora instrumental, não pode estudar diretamente o vazamento mitocondrial H+ através do IMM1, dificultando assim a identificação e caracterização precisas das proteínas responsáveis por isso, particularmente em tecidos não adiposos em que a produção de calor é secundária em comparação com a produção de ATP. Recentemente, o desenvolvimento da técnica de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias, forneceu o primeiro estudo direto do vazamento de H+ em todo o IMM em vários tecidos 5,6,7.
O grampo mitocondrial de toda a IMM foi estabelecido pela primeira vez de forma reprodutível por Kirichok et al.8. Eles descreveram a primeira medição direta das correntes mitocondriais de cálcio (MCU) em 2004 usando mitoplastos das linhas celulares COS-78. Mais tarde, o laboratório de Kirichok mostrou correntes de cálcio de IMMs de tecidos de camundongo9 e Drosophila 9. Outros laboratórios agora usam essa técnica rotineiramente para estudar as propriedades biofísicas da MCU 10,11,12,13,14. A análise completa do grampo de remendo do IMM da condutância de potássio e cloreto também é possível e foi mencionada em vários artigos, mas ainda não foi o tema principal de uma publicação 6,7,9. A primeira medição das correntes H+ em todo o IMM foi relatada em 2012 a partir de mitocôndrias de gorduramarrom-rato 6, e de mitocôndrias de gordura bege do rato em 20177. Esta corrente é devido à proteína de desacoplamento específica dos tecidos termogênicos, UCP1 6,7. Trabalho recente publicado em 2019 caracterizou a AAC como a principal proteína responsável pelo vazamento mitocondrial H+ em tecidos não adiposos, como o coração e o músculo esquelético5.
Esta abordagem única agora permite a análise funcional direta de alta resolução dos canais mitocondriais e transportadores responsáveis pela termogênese mitocondrial. Para facilitar a expansão do método e complementar outros estudos como a respiração mitocondrial, um protocolo detalhado é descrito abaixo para medir as correntes H+ transportadas pela UCP1 e AAC. Três passos importantes são descritos: 1) isolamento mitocondrial da gordura marrom do rato para analisar a corrente H+ dependente de UCP1 e o isolamento mitocondrial do coração para analisar a corrente H+ dependente de AAC, 2) preparação de mitoplastos com uma prensa francesa para ruptura mecânica da membrana mitocondrial externa (OMM), 3) gravações de grampos de remendo de UCP1 e correntes H+ dependentes de AAC em todo o IMM.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais animais que foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em Los Angeles (IACUC).
NOTA: O procedimento de isolamento mitocondrial é baseado na centrifugação diferencial e varia ligeiramente de tecido para tecido. Por exemplo, uma vez que o tecido adiposo marrom é extremamente rico em lipídios, requer um passo adicional para separar detritos celulares e organelas da fase lipídica antes de colher as mitocôndrias. Para evitar confusão, os dois procedimentos de isolamento mitocondrial (um da gordura marrom e outro do coração) são detalhados abaixo.
1. Isolamento mitocondrial da gordura marrom interscapular do rato (modificado a partir de Bertholet et al. 2020)15
- Euthanize C57BL/6 camundongo macho usando asfixia de CO2 e posterior luxação cervical, conforme recomendado pelo American Veterinary Medical Association Panel e pelo Comitê IACUC.
- Depois de posicionar o rato com a barriga de frente para a mesa, pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo (modificado de Mann et al., 2014)16.
- Faça uma incisão de 2 cm na parte superior das costas depois de agarrar a pele com pinças.
- Extrair a gordura interscapular marrom do rato que corresponde a um órgão de dois lobed com uma forma de borboleta16.
- Transfira a gordura marrom para uma placa de Petri de 35 mm cheia de 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) previamente colocada no gelo.
- Limpe a gordura marrom da gordura branca sob um binóculo.
- Transfira a gordura marrom para um béquer de 10 mL com 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) para cortá-la em pedaços finos. Transfira para o homogeneizador de vidro de 10 mL refrigerado ao gelo (material plástico politetrafluororetileno (PTFE).
- Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações/min.
- Centrifugar o homogeneizar a 8.500 x g por 10 min a 4 °C em um tubo cônico gelado de 15 mL. Descarte o supernatante contendo a fase lipídica.
- Resuspenda a pelota em 5 mL de tampão de isolamento gelado (Tabela 1) e homogeneize, uma segunda vez, a suspensão no gelo com seis golpes lentos a uma velocidade de 275 rotação/min.
- Transfira o homogene de homogeneização em um tubo cônico gelado de 15 mL e centrifuse-o a 700 x g por 10 min a 4 °C para pelotar todos os núcleos e células ininterruptas.
- Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mL e coloque-o no gelo.
- Centrifugar o supernante a 8.500 x g por 10 min a 4 °C para obter uma pelota contendo mitocôndrias.
- Pelota resuspend contendo mitocôndrias em 3,8 mL de tampão hipertônico-mannitol frio (Tabela 2) e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10-15 min.
2. Isolamento mitocondrial do coração do rato (modificado a partir de Garg et al. 2019)17
- Euthanize C57BL/6 camundongo macho usando asfixia de CO2 e posterior luxação cervical, conforme recomendado pelo American Veterinary Medical Association Panel e pelo Comitê IACUC.
- Depois de posicionar o rato nas costas, pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo. Em seguida, faça uma incisão de 2 cm no tórax depois de agarrar a pele com pinças.
- Disseque o coração do peito do animal e enxágue-o para remover todo o sangue em um béquer de 10 mL com 5 mL da solução de isolamento frio (Tabela 1).
- Uma vez que o coração tenha sido limpo de vestígios de sangue, transfira-o para outro béquer de 10 mL contendo 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) para cortá-lo em pedaços finos. Em seguida, transfira para um homogeneizador de vidro de 10 mL refrigerado ao gelo (pilão PTFE).
- Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações/min.
- Transfira o homogene de homogeneização para um tubo cônico gelado de 15 mL e centrifuá-lo a 700 x g por 10 min a 4 °C para pelotas de núcleos e células ininterruptas.
- Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mL e coloque-o no gelo.
- Centrifugar o supernante a 8.500 x g por 10 min a 4 °C para obter uma pelota contendo mitocôndrias.
- Resuspend a pelota mitocondrial em 3,8 mL de tampão hipertônico-mannitol frio (Tabela 2) e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10-15 min.
3. Preparação de mitoplastos com uma Prensa Francesa para ruptura mecânica do OMM.
NOTA: O procedimento de imprensa francês permite que o IMM seja liberado do OMM com sua integridade preservada, incluindo a matriz e a crista (Figura 2)18. Mitocôndrias são pré-incubadas em um tampão hipertônico-mannitol (Tabela 2) e submetidas a uma pressão menor durante o procedimento de imprensa francês para evitar qualquer alongamento drástico do IMM quando o OMM é rompido.
- Encha a suspensão mitocondrial-hipertônico-mannitol em uma mini célula de pressão refrigerada (diâmetro do pistão 3/8") da prensa francesa (Figura 3A).
- Selecione o modo médio da Imprensa Francesa e comprima a suspensão através da mini célula de pressão a 110 no mostrador da Imprensa Francesa para as mitocôndrias de gordura marrom e a 140 para as mitocôndrias cardíacas (~2.000 psi). Certifique-se de que a suspensão saia da mini célula de pressão a uma taxa de cerca de 1 drop/s.
- Colete as gotas em um tubo cônico refrigerado a gelo de 15 mL.
- Centrifugar a suspensão a 10.500 x g por 10 min a 4 °C.
- Resuspenda a pelota de mitoplastos em 0,5-2 mL de tampão hipertônico-kcl frio (Tabela 3) e armazene a suspensão no gelo.
NOTA: Gordura marrom e mitoplastos cardíacos estão prontos para gravações de grampos de remendo e devem permanecer utilizáveis por cerca de 3-6 h.
4. Gravações eletrofisiológicas de H+ vazam através de UCP1 e AAC 5,7,15
NOTA: Utilize a seguinte configuração eletrofisiológica (Figura 3B): microscópio invertido com contraste de interferência diferencial (DIC), objetivo de imersão de água de 60x, mesa de isolamento de vibração e uma gaiola Faraday, um amplificador padrão que suporta gravações de baixo ruído, um digitalizador padrão usado para configuração eletrofisiológica, pClamp 10, um micromanipulador, eletrodo de referência de banho (ponte de sal de 3 M KCl-gar inserida dentro de um suporte de microeletríno contendo uma pelota de cloreto de prata/prata moldada no corpo do titular (descrito em Liu et al. 2021)19, câmara de perfusão com fundo de deslizamento de vidro de 0,13 mm, conectado a um sistema de perfusão alimentado pela gravidade.
- Puxe os filamentos de vidro borossilicato no dia da gravação usando um puxador de micropipette. Coloque um programa no puxador usado para gerar pipetas com alto grau de reprodutibilidade20.
NOTA: Este projeto do programa requer várias tentativas de obter pipetas otimizadas para o grampo de remendo IMM. Uma pipeta padrão tem pontas finas com uma forma cônica progressiva. - Insira um filamento de vidro dentro do puxador e puxe para obter quase duas pipetas de remendo idênticas de um filamento borossilicato.
- Ajuste o programa quando as pipetas se tornarem inconsistentes entre os ciclos de puxar devido ao envelhecimento do filamento da caixa de aquecimento do puxador.
- Posicione a pipeta dentro do polidor de pipeta e coloque a ponta perto do filamento sob a ampliação de 100x para poli-la.
- Pressione o pedal do pé várias vezes para aquecer o filamento sem entupir ou danificar a curva da ponta.
- Polonês até que as pipetas com resistência entre 25 e 35 MΩ sejam obtidas quando preenchidas com solução de pipeta baseada em TMA (TMA para hidróxido de tetrametilamônio, Tabela 4).
- Tampas pré-incubadas (5 mm de diâmetro, 0,1 mm de espessura) com gelatina de 0,1% para reduzir a adesão mitoplasta e enxágüe-as com a solução de banho KCl (Tabela 5) antes de depositar a suspensão mitoplastia.
- Prepare uma diluição crua misturando ~35 μL da suspensão mitoplastia concentrada com 500 μL da solução de banho KCl (Tabela 5) e coloque-a em tampas previamente colocadas em um poço de uma placa de 4 poços.
- Incubar no gelo por 15 a 20 minutos para mitoplastos para sedimentos na mancha de cobertura.
- Encha completamente a câmara de banho com ~50 μL da solução de banho KCl (Tabela 5).
- Transfira um deslizamento com mitoplastos dentro da câmara usando pinças finas de microdisseção com uma ponta dobrada.
- Organize a tampa na parte inferior da câmara. Não perfunda a câmara para manter os mitoplastos estáveis na tampa.
- Escolha um mitoplasto não adesivo individual na forma de 8, escaneando o deslizamento sob o microscópio com um objetivo de 60x.
- Carregue a pipeta com a solução de pipeta (~50 μL) e coloque-a no porta-pipetas.
- Traga a pipeta para a solução de banho com um micromanipulador e aproxime-a logo acima do mitoplasto selecionado para chegar perto do IMM. O programa do amplificador dá a resistência da pipeta uma vez que está na solução de banho. Segure o potencial da membrana a 0 mV e aplique pulsos de 10 mV usando o comando de teste de membrana no programa do amplificador.
- Aplique uma leve pressão negativa para criar rapidamente um gigaseal com o IMM (Figura 2B).
- Levante a pipeta com o mitoplasto ligado para mantê-los longe da tampa para evitar a quebra da vedação devido à deriva da pipeta durante o experimento.
- Compense os transitórios de capacitância perdida com o comando "teste de membrana" no programa do amplificador antes de testar toda a configuração mitoplastia para obter uma medição correta de capacitância (Cm) para a membrana mitoplasta após a invasão.
- Aplique pulsos de tensão de curta duração (5-15 ms) (250-600 mV) com o programa do amplificador para romper o patch de membrana sob a pipeta de vidro e alcançar a configuração de mitoplasto inteiro (Figura 2C). A invasão bem sucedida é refletida pelo reaparecimento dos transitórios de capacitância.
- Após a invasão, encaixe os transitórios de capacitância com a opção de teste de membrana do programa do amplificador para avaliar a capacitância da membrana (refletindo o tamanho do mitoplasto) e sua resistência de acesso Ra (refletindo a qualidade da configuração de mitoplasto total). Após a invasão, Ra deve estar entre 40 e 80 MΩ. Mitoplastos (2-6 μm de tamanho) usados para experimentos com grampos de remendo normalmente têm capacitâncias de membrana de 0,5-1,1 pF.
- Imediatamente após o arrombamento, substitua a solução de banho KCl (Tabela 5) pela solução de banho HEPES (Tabela 6) iniciando a perfusão.
- Aplique um protocolo de rampa de 850 ms projetado com o programa do amplificador, de -160 mV a +100 mV com intervalo de 5 s, mantendo o mitoplast a 0 mV. Este protocolo funciona para os estudos UCP1 6,7,15 e AAC5 (Figura 4 e Figura 5).
NOTA: Recomenda-se que as medições de corrente H+ dependentes de UCP1 e AAC adquiram todos os dados eletrofisiológicos a 10 kHz e filtram a 1 kHz usando software adequado que conduz o amplificador e o digitalizador.
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Representative Results
O desenvolvimento da metodologia de grampo de remendo aplicado às mitocôndrias proporcionou o primeiro estudo direto do vazamento de H+ através do IMM e dos transportadores mitocondriais, UCP1 e AAC, responsáveis por isso. A análise eletrofisiológica dos vazamentos H+ dependentes de UCP1 e AAC pode fornecer um primeiro olhar da capacidade termogênica das mitocôndrias. A seção de resultados descreve os procedimentos padrão para medir o vazamento de H+ via UCP1 e AAC.
Medição de corrente H+ dependente de UCP1 (Figura 4)6,7,15
A aplicação do protocolo de rampa de tensão induz uma corrente H+ de grande amplitude em toda a IMM de gordura marrom sem a adição de ácidos graxos exógenos (FA), os ativadores necessários de UCPs (Figura 4A). Esta é uma característica específica do IMM de gordura marrom e bege devido à produção local de FA por uma atividade de fosfolipase associada à membrana. Quando a corrente H+ se desenvolve em resposta ao protocolo de rampa, é importante esperar que a amplitude atual se estabilize. A quantificação da amplitude de corrente H+ via UCP1 requer a determinação da linha de base correspondente a uma corrente UCP1 zero. Uma vez alcançada a estabilidade da amplitude de corrente H+, recomenda-se perfuse tanto o inibidor de UCP1 Difosfato de Guanosina (PIB - 1 mM, Figura 4A) ou um chelator FA (0,5% de albumina bovina livre de FA, não mostrada) ou 10 mm de Methyl Beta Ciclodextrina (MβCD) para a endogenosa membrana FA extração, Figura 4B, traço preto). A corrente residual é a corrente a partir da qual será determinada a amplitude das correntes UCP1. Para ajudar a comparar as amplitudes das correntes UCP1 em diferentes mitoplastos, a densidade atual (pA/pF) de cada mitoplast é calculada pela normalização das correntes UCP1 com a capacitância mitoplast (Cm)5,7. A corrente pode ser reativada pela adição de FA de cadeia longa exógena usando ácido aracidônico (AA) ou ácido oleico (OA) (1-2 μM). Uma vez que os IMMs de gordura marrom e bege possuem atividade PLA2, as FAs de membrana endógena são parcialmente regeneradas em poucos minutos após a lavagem do MβCD/albumina do banho, levando à reativação da corrente H+ via UCP1 6,7. Como esperado, essa corrente desaparece completamente no IMM de CAMUNDONGOS UCP1-/- (Figura 4A)6,7.
Uma maneira mais precisa de comparar a densidade e a atividade de UCP1 de mitoplastos diferentes do mesmo tecido ou de mitoplastos de diferentes tecidos (gordura marrom e bege) é controlar a concentração de FA na superfície do IMM 6,7. De fato, a amplitude de corrente H+ pode variar entre mitoplastos devido à quantidade de proteína UCP1 por IMM, mas também devido à produção de FA endógeno. Assim, recomenda-se extrair FA endógeno do IMM e reativar a corrente H+ dependente de UCP1 adicionando FA exógena em uma concentração conhecida. Para isso, as FAs endógenas devem primeiro ser extraídas do IMM, perfundando uma solução de banho HEPES (Tabela 6) contendo 10 mM MβCD. Em seguida, para permitir a reativação da corrente H+ via UCP1 por apenas uma concentração precisa de FAs exógenos, este último será perfundido em um fundo HEPES/MβCD para extrair continuamente FAs produzidos a partir do IMM.
O estudo da competição entre o nucleotídeo purino e a FA para vinculação à UCP1 também é possível com a técnicade grampo de remendo 6,7,15. A inibição de UCP1 por nucleotídeos purinos (por exemplo, MG2+-free ATP) pode ser comparada a duas concentrações diferentes de FA (idealmente 10 vezes). Para isso, a membrana endógena FA é removida pela primeira vez aplicando 10 mM MβCD (Figura 4B, traço preto). Aplicação de FAs exógenos (por exemplo, aqui, apenas 0,5 mM FAs são mostrados) aplicados em um fundo de 10 mM MβCD permite o controle preciso da concentração de FAs ativantes porque as FAs produzidas localmente são imediatamente extraídas da membrana. Nesta condição, as FAs exógenas são as principais responsáveis pelo desenvolvimento da corrente H+. Diferentes concentrações de ATP são posteriormente adicionadas à solução OA/MβCD para avaliar oATP IC50 para cada concentração de FA testada e, assim, estabelecer se a FA compete com nucleotídeos purinos para vinculação ao UCP1.
Medição de corrente H+ dependente de AAC (Figura 5)5
Ao contrário da gordura marrom, o IMM de tecidos não adiposos, como o músculo esquelético e o coração, não desenvolve um H+ mensurável imediatamente após a invasão (Figura 5, traços negros). Para induzir uma corrente H+ mensurável através da AAC, é essencial aplicar a solução de banho HEPES (Tabela 6) contendo 1-2 μM de FA exógeno (AA, Figura 5A, traço vermelho). Isso pode indicar que o IMM de tecidos não adiposos não possui um maquinário de produção fa no IMM como é encontrado no IMM de gorduras marrons e beges.
A linha de base (ou corrente zero) para a quantificação da amplitude de corrente H+ via AAC corresponde à solução de banho HEPES (Tabela 6) perfundida na superfície do IMM antes da adição de FA. Para confirmar que a corrente H+ medida é transportada pela AAC, é importante aplicar inibidores específicos de AAC adicionados à FA, 1 μM de carboxyatractyloside (CATR, Figura 5A) ou 4 μM de ácido bonkgrekic (BKA, não mostrado)5, que quase inibem completamente a corrente H+. Esta corrente desaparece completamente no IMM de AAC1-/- ratos (Figura 5A), sendo AAC1 o isoforme predominante no coração5.
A análise do grampo de correção da interação entre vazamento H+ dependente de FA e nucleotídeos também é possível com a AAC5. No entanto, há uma diferença importante entre a AAC e a UCP1: a AAC não só carrega H+ mas sua principal função é transportar nucleotídeos de adenina ADP e ATP21. Para estudar como a troca de nucleotídeos de adenina afeta o vazamento H+ dependente de FA, o ADP 2+sem isentos deMG 1 mM é adicionado à solução de pipeta. Em seguida, fa são perfundidos para ativar a corrente H+ via AAC. Apenas a ADP na solução de pipeta não interfere na corrente H+ 5. Uma vez alcançada uma amplitude de corrente H+ estável, o ADP é perfundido simultaneamente com FA. Somente quando a ADP está presente em ambos os lados da membrana para gerar uma troca ativa de nucleotídeos via AAC é uma inibição constante, mas nunca completa, do vazamento H+ alcançado (Figura 5B). Isso pode indicar que os dois modos de transporte da AAC (corrente FA-H+ e câmbio ADP/ATP) competem e provavelmente ocorrerão através da mesma via de translocação. A homoexchange ADP/ADP foi selecionada para evitar a corrente adicional associada ao heteroexchange ADP/ATPfisiológico 5.
Figura 1: Distribuição de energia mitocondrial entre calor e produção de ATP. Mecanismos de ATP mitocondrial e produção de calor. Mitocôndrias têm duas membranas [a OMM (roxa) e a IMM (laranja)], que contêm o maquinário para ATP e produção de calor. O ETC gera um gradiente eletroquímico de H+ em todo o IMM, que é usado pela ATP synthase (AS) para produzir ATP e usado por UCPs para gerar calor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Técnica mitocondrial de grampo de remendo (modificada de Bertholet et al. 2020)15. (A) As mitocôndrias são isoladas do tecido por centrifugação (OMM em roxo e IMM em laranja). (B) A prensa francesa de baixa pressão rompe o OMM para liberar o IMM que dá um mitoplasto. O painel esquerdo representa um mitoplasto, que assume uma forma em forma de 8 com remanescentes do OMM anexados ao IMM. Uma pipeta de vidro é abordada ao IMM para formar um selo gigaohm (configuração anexada a mitoplast). Uma fotografia da configuração anexada a mitoplast é mostrada no painel direito. (C) A configuração do IMM inteiro (diagrama no painel esquerdo) é obtida após a quebra do patch de membrana sob a pipeta por vários pulsos de tensão (200-500 mV). Uma fotografia de toda a configuração IMM é mostrada no painel direito. Correntes interiores (I, vermelho) são negativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imprensa francesa e configuração eletrofisiológica. (A) Imagem da Imprensa Francesa, que ajuda a romper o OMM para liberar o IMM. (B) Imagem de uma gaiola faraday, microscópio invertido com contraste de interferência diferencial (DIC), objetivo de imersão de água de 60x, uma mesa de isolamento de vibração e um micromanipulador. O amplificador padrão, um digitalizador padrão e o computador PC não são mostrados na imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Corrente H+ via UCP1 em gordura marrom. (A) Corrente H+ dependente do representante UCP1 registrada de mitoplast de gordura marrom isolada de WT (painel superior) e camundongos UCP1−/− (painel inferior). Os traços de corrente H+ de controle mostrados em preto correspondem à amplitude de corrente estabilizada após a quebra do IMM. 1 mM PIB é então adicionado à solução de banho (laranja). O protocolo de rampa de tensão é mostrado acima dos traços WT. O pH das soluções de banho e pipeta são mostrados no diagrama pipeta-mitoplast. (B) Inibição de UCP1 por nucleotídeos de purina em gordura marrom. Representativo UCP1-dependent H+ traços de corrente em várias concentrações de ATP na face citosolica do IMM de gordura marrom de camundongos na termoneutralidade. A corrente H+ dependente de UCP1 foi ativada com ácido oleico de 0,5 mM (OA) misturado com MβCD de 10 mM.O protocolo de tensão é indicado na parte superior. No painel inferior, o mesmo traço é representado, mas não normalizado com a capacitância da membrana mitoplastia. O mitoplasto de gordura marrom nesta figura apresentou uma capacitância de membrana de 0,624 pF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Corrente H+ dependente de FA via AAC em mitoplastia cardíaca. (A) Corrente H+ dependente do AAC representativa quando aplicada 2 μM AA na solução de banho (painel superior, laranja) em mitoplastos cardíacos WT e inibida por 1 μM CATR (roxo). Traços representativos registrados em AAC1 −−−− mitoplasto cardíaco estão no painel inferior. A corrente de controle está em preto. O protocolo de rampa de tensão é mostrado acima dos traços WT. O pH das soluções de banho e pipeta são mostrados no diagrama pipeta-mitoplast. (B) Enquanto a solução de pipeta continha 1 mM ADP, a corrente H+ dependente de AAC é induzida por 2 μM AA (laranja) e inibida pela adição de 1 mM ADP ao banho (roxo). O protocolo de rampa de tensão é mostrado acima do traço. O pH das soluções de banho e pipeta são mostrados no diagrama pipeta-mitoplast. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Concentração final |
| sacarose | 250 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH ajustado para 7.2 com TrisBase |
Tabela 1: Tampão de isolamento mitocondrial (tônica ~ 300 mmol por kg)
| Reagente | Concentração final |
| sacarose | 140 mM |
| D-mannitol | 440 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH ajustado para 7.2 com TrisBase |
Tabela 2: Tampão de manitol hipertônico
| Reagente | Concentração final |
| Kcl | 750 mM |
| HEPES | 20 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH ajustado para 7.2 com TrisBase |
Tabela 3: Tampão hipertônico-KCl
| Reagente | Concentração final |
| Tma | 130 mM |
| HEPES | 100 mM |
| EGTA | 1 mM |
| MgCl2 para gravações ucp1 | 2 mM |
| ou | |
| TrisCl para gravações AAC | |
| pH ajustado para 7,0 ou 7,5 com ácido D-gluconic |
Tabela 4: Solução de pipeta baseada em TMA (tnicidade ~ 360 mmol por kg)
| Reagente | Concentração final |
| Kcl | 150 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH ajustado para 7.0 com TrisBase |
Tabela 5: Solução de banho KCl (tônica ~ 300 mmol por kg)
| Reagente | Concentração final |
| sacarose | Gravações de 100 mM para UCP1 |
| ou | |
| 150 mM para gravações AAC | |
| HEPES | 150 mM para gravações UCP1 |
| ou | |
| 100 mM para gravações AAC | |
| 1 mM EGTA | |
| pH ajustado para 7.0 com TrisBase |
Tabela 6: Solução de banho HEPES (tônica ~ 300 mmol por kg)
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Discussion
Este artigo de método visa apresentar a técnica de grampo de remendo recentemente aplicada às mitocôndrias, uma nova abordagem para estudar diretamente o vazamento de H+ através do IMM responsável pela termogênese mitocondrial 5,6,7,15. Esta técnica não se limita aos tecidos e também pode ser usada para analisar vazamento de H+ e outras conduções do IMM em diferentes modelos humanos e celulares padrão, como células HAP1, COS7, C2C12 e MEF. No entanto, cada isolamento mitocondrial requer alguns reajustes específicos para cada tipo de célula ou tecido.
Os principais passos na medição direta das correntes H+ através do IMM de gordura marrom 5,6 e do coração5 são resumidos aqui para ilustrar os mecanismos responsáveis pela termogênese mitocondrial em tecidos termogênicos especializados e não adiposos. De fato, o desenvolvimento desta técnica pela primeira vez permite a análise funcional de alta resolução das duas principais UCPs (UCP1 e AAC) em seu ambiente de membrana nativa com controle preciso de condições experimentais críticas como: 1) pH de soluções de pipeta e banho, 2) controle do potencial de membrana em todo o IMM, e 3) composição precisa de soluções para excluir quaisquer íons e metabólitos permeáveis ao IMM outro que não h+. As soluções de banho baseadas em TMA (Tabela 4) e HEPES (Tabela 6) são formuladas para registrar correntes H+ e contêm apenas sais que se dissociam em ânions grandes e cáations normalmente impermeáveis ao IMM. Embora a solução de banho possa ser alterada usando um sistema de perfusão, permitindo que diferentes tratamentos sejam aplicados ao lado citosolico da membrana, não é possível alterar a composição da solução intrapipette. Isso limita a compreensão dos mecanismos regulatórios que ocorrem no lado matricial. De fato, os compostos devem estar presentes dentro da solução intrapipette no momento do enchimento da pipeta. Portanto, o vazamento de H+ pode ser estudado isoladamente de outras correntes. Estudos farmacológicos e o uso de camundongos KO foram essenciais para a caracterização e identificação das proteínas responsáveis pela corrente H+ através do IMM de diversos tecidos 5,6,7. Esses resultados estabeleceram que a UCP1 é a principal UCP de gordura marrom e bege, e AAC em tecidos não adiposos. Não podemos excluir completamente a possibilidade da existência de outras correntes H+ não mediadas pela UCP1 e AAC. No entanto, se existem outras correntes H+, sua amplitude estava além da resolução de nossa configuração eletrofisiológica. Não medimos o bombeamento H+ do ETC nas condições descritas neste artigo. Uma vez que tenhamos atingido a configuração de IMM inteiro, a matriz mitocondrial é lavada por perfusão da solução intra-pipeta. O espaço intermembrano não existe mais desde o passo de romper o OMM com a imprensa francesa. Não foram adicionados substratos dos complexos respiratórios cruciais para o bombeamento de H+ através do ETC. É, portanto, improvável desenvolver bombeamento H+ ativo sob as condições eletrofisiológicas aqui detalhadas.
Gravações de canais únicos de patches excisados não são descritas neste artigo. Embora as correntes H+ dependentes de UCP1 e AAC em todo o IMM sejam robustas devido à sua alta densidade proteica, as aberturas de um único canal não puderam ser resolvidas porque a amplitude das correntes unitárias UCP1 e AAC são provavelmente muito pequenas.
Em contraste com os estudos bioquímicos, o isolamento mitocondrial descrito neste artigo não precisa resultar em um alto nível de pureza mitocondrial. De fato, a preparação mitocondrial composta por uma infinidade de mitoplastos individualizados e detritos celulares é escaneada sob o microscópio para encontrar um mitoplasto em forma de 8 para remendar. A forma 8 do mitoplast é devido à liberação do IMM através de um orifício no OMM causado pelo procedimento de imprensa francês (Figura 2). O lobo menos denso corresponde ao IMM15,17. Uma preparação adequada pode ser definida por mitoplastos em movimento livre que podem ser facilmente distinguidos dos detritos celulares. É importante, no entanto, reduzir o número de detritos para evitar a contaminação do IMM, o que pode afetar a qualidade da vedação da pipeta de vidro com a membrana. Esta etapa de digitalização sob o microscópio permite escolher um mitoplasto com alta integridade IMM reconhecida por um lobo menos denso do que o delimitado pelo OMM e, portanto, aumenta as chances de uma invasão bem sucedida.
Esta técnica forneceu pela primeira vez a medição direta das correntes H+ dependentes de UCP1 e AAC dentro de sua membrana nativa. No entanto, a integridade mitocondrial e a compartimentação não existem mais devido à ruptura do OMM e, provavelmente, da cristae. Por isso, é essencial complementar a análise de grampos com outros métodos clássicos, como a respiração mitocondrial, para confirmar o papel fisiológico de proteínas recém-caracterizadas em mitocôndrias intactas.
A técnica de remendo aplicada às mitocôndrias oferece novas possibilidades para entender melhor os mecanismos moleculares responsáveis pelo vazamento mitocondrial H+ e termogênese. Combinada com técnicas celulares e moleculares modernas, essa abordagem inovadora fornecerá novas percepções sobre os mecanismos que controlam a capacidade termogênica das mitocôndrias e como elas podem ser direcionadas para combater doenças associadas à disfunção mitocondrial.
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Disclosures
O autor declara não interesses concorrentes.
Acknowledgments
Yuriy Kirichok pela grande ciência da qual fiz parte do laboratório dele e dos membros do laboratório Kirichok pelas discussões úteis. Também agradeço ao Dr. Douglas C. Wallace por fornecer ratos aac1 . Financiamento: A.M.B foi apoiado por um American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
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