L’utilisation de la technique Patch-Clamp pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries

Summary

Cet article sur la méthode détaille les principales étapes de la mesure de la fuite H⁺ à travers la membrane mitochondriale interne avec la technique patch-clamp, une nouvelle approche pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries.

Abstract

La thermogenèse mitochondriale (également connue sous le nom de découplage mitochondrial) est l’une des cibles les plus prometteuses pour augmenter la dépense énergétique afin de lutter contre le syndrome métabolique. Les tissus thermogéniques tels que les graisses brunes et beiges développent des mitochondries hautement spécialisées pour la production de chaleur. Les mitochondries d’autres tissus, qui produisent principalement de l’ATP, convertissent également jusqu’à 25% de la production totale d’énergie mitochondriale en chaleur et peuvent donc avoir un impact considérable sur la physiologie de tout le corps. La thermogenèse mitochondriale est non seulement essentielle pour maintenir la température corporelle, mais prévient également l’obésité induite par l’alimentation et réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pour protéger les cellules des dommages oxydatifs. Étant donné que la thermogenèse mitochondriale est un régulateur clé du métabolisme cellulaire, une compréhension mécaniste de ce processus fondamental aidera au développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial. Il est important de noter que les mécanismes moléculaires précis qui contrôlent l’activation aiguë de la thermogenèse dans les mitochondries sont mal définis. Ce manque d’information est en grande partie dû à une pénurie de méthodes pour la mesure directe des protéines de découplage. Le développement récent de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a permis, pour la première fois, l’étude directe du phénomène à l’origine de la thermogenèse mitochondriale, de la fuite H⁺ à travers l’IMM, et de la première caractérisation biophysique des transporteurs mitochondriaux qui en sont responsables, la protéine de découplage 1 (UCP1), spécifique des graisses brunes et beiges, et le transporteur ADP/ATP (AAC) pour tous les autres tissus. Cette approche unique fournira de nouvelles informations sur les mécanismes qui contrôlent les fuites H⁺ et la thermogenèse mitochondriale et sur la façon dont ils peuvent être ciblés pour lutter contre le syndrome métabolique. Cet article décrit la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries pour étudier leur capacité thermogénique en mesurant directement les courants H⁺ à travers l’IMM.

Introduction

Les mitochondries sont célèbres pour être la centrale électrique de la cellule. En effet, ils sont la principale source d’énergie chimique, l’ATP. Ce que l’on sait moins, c’est que les mitochondries génèrent également de la chaleur. En fait, chaque mitochondrie génère constamment les deux types d’énergies (ATP et chaleur) et un équilibre fin entre les deux formes d’énergie définit l’homéostasie cellulaire métabolique (Figure 1). Comment les mitochondries distribuent l’énergie entre l’ATP et la chaleur est certainement la question la plus fondamentale dans le domaine de la bioénergétique, bien qu’elle soit encore largement inconnue. Nous savons que l’augmentation de la production de chaleur mitochondriale (appelée thermogenèse mitochondriale) et, par conséquent, la réduction de la production d’ATP augmentent la dépense énergétique et c’est l’un des meilleurs moyens de lutter contre le syndrome métabolique¹.

La thermogenèse mitochondriale provient d’une fuite de H⁺ à travers la membrane mitochondriale interne (IMM), conduisant au découplage de l’oxydation du substrat et de la synthèse de l’ATP avec la production conséquente de chaleur, d’où le nom de « découplage mitochondrial »¹ (Figure 1). Cette fuite H⁺ dépend de transporteurs mitochondriaux appelés protéines de découplage (UCP). UCP1 a été le premier UCP identifié. Il n’est exprimé que dans les tissus thermogéniques, la graisse brune et la graisse beige dans lesquels les mitochondries sont spécialisées pour la production de chaleur ^2,3,4. L’identité de l’UCP dans les tissus non adipeux tels que les muscles squelettiques, le cœur et le foie est restée controversée. Les mitochondries dans ces tissus peuvent avoir environ 25% de l’énergie mitochondriale totale convertie en chaleur, ce qui peut avoir un impact significatif sur la physiologie de tout le corps¹. En plus de maintenir la température corporelle centrale, la thermogenèse mitochondriale prévient également l’obésité induite par l’alimentation en réduisant les calories. De plus, il réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les mitochondries pour protéger les cellules des dommages oxydatifs¹. Ainsi, la thermogenèse mitochondriale est impliquée dans le vieillissement normal, les troubles dégénératifs liés à l’âge et d’autres conditions impliquant un stress oxydatif, telles que l’ischémie-reperfusion. Par conséquent, la thermogenèse mitochondriale est un puissant régulateur du métabolisme cellulaire, et une compréhension mécaniste de ce processus fondamental favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial.

La respiration mitochondriale a été la première technique à révéler le rôle crucial de la thermogenèse mitochondriale dans le métabolisme cellulaire et reste la plus populaire dans la communauté¹. Cette technique est basée sur la mesure de la consommation d’oxygène par la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux (ETC) qui augmente lorsque la fuite mitochondriale H⁺ est activée. Cette technique, bien qu’instrumentale, ne peut pas étudier directement la fuite mitochondriale H⁺ à travers l’IMM¹, ce qui rend difficile l’identification et la caractérisation précises des protéines qui en sont responsables, en particulier dans les tissus non adipeux dans lesquels la production de chaleur est secondaire par rapport à la production d’ATP. Récemment, le développement de la technique patch-clamp appliquée aux mitochondries a fourni la première étude directe de la fuite H⁺ sur l’ensemble de l’IMM dans divers tissus ^5,6,7.

Le patch-clamp mitochondrial de l’ensemble de l’IMM a été établi pour la première fois de manière reproductible par Kirichok et ^al.8. Ils ont décrit la première mesure directe des courants mitochondriaux d’uniporteur de calcium (MCU) en 2004 à l’aide de mitoplastes des lignées cellulaires COS-7⁸. Plus tard, le laboratoire Kirichok a montré les courants de calcium des IMM de souris⁹ et des tissus de la drosophile ⁹. D’autres laboratoires utilisent maintenant régulièrement cette technique pour étudier les propriétés biophysiques du MICROCONTRÔLEUR 10,11,12,13,14. L’analyse complète de la conductance du potassium et du chlorure par patch-clamp IMM est également possible et a été mentionnée dans plusieurs articles, mais n’a pas encore fait l’objet principal d’une publication ^6,7,9. La première mesure des courants H⁺ à travers l’IMM a été rapportée en 2012 à partir de mitochondries de graisse brune^{de souris 6}, et de mitochondries de graisse beige de souris en 2017⁷. Ce courant est dû à la protéine de découplage spécifique des tissus thermogéniques, UCP1 ^6,7. Des travaux récents publiés en 2019 ont caractérisé la CAA comme la principale protéine responsable de la fuite mitochondriale de H⁺ dans les tissus non adipeux tels que le cœur et le muscle squelettique⁵.

Cette approche unique permet maintenant l’analyse fonctionnelle directe à haute résolution des canaux ioniques mitochondriaux et des transporteurs responsables de la thermogenèse mitochondriale. Pour faciliter l’expansion de la méthode et compléter d’autres études telles que la respiration mitochondriale, un protocole détaillé est décrit ci-dessous pour mesurer les courants H⁺ transportés par UCP1 et AAC. Trois étapes importantes sont décrites : 1) isolement mitochondrial de la graisse brune de souris pour analyser le courant H⁺ dépendant de l’UCP1 et isolement mitochondrial du cœur pour analyser le courant H⁺ dépendant de l’AAC, 2) préparation des mitoplastes avec une Français Pression pour la rupture mécanique de la membrane mitochondriale externe (OMM), 3) enregistrements patch-clamp des courants UCP1 et AAC-dépendants H⁺ sur l’ensemble de l’IMM.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales sur les animaux qui ont été effectuées sont conformes aux directives des National Institutes of Health et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Los Angeles (IACUC).

REMARQUE: La procédure d’isolement mitochondrial est basée sur la centrifugation différentielle et varie légèrement d’un tissu à l’autre. Par exemple, comme le tissu adipeux brun est extrêmement riche en lipides, il nécessite une étape supplémentaire pour séparer les débris cellulaires et les organites de la phase lipidique avant de récolter les mitochondries. Pour éviter toute confusion, les deux procédures d’isolement mitochondrial (l’une de la graisse brune et l’autre du cœur) sont détaillées ci-dessous.

1. Isolement mitochondrial de la graisse brune interscapulaire de souris (modifié à partir de Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Euthanasier la souris mâle C57BL/6 en utilisant l’asphyxie au CO₂ et la luxation cervicale subséquente, comme recommandé par le panel de l’American Veterinary Medical Association et le comité de l’IACUC.
2. Après avoir positionné la souris avec son ventre face à la table, vaporisez de l’alcool pour nettoyer et mouiller les cheveux (modifié à partir de Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Faites une incision de 2 cm dans le haut du dos après avoir saisi la peau avec une pince à épiler.
4. Extraire la graisse interscapulaire brune de la souris qui correspond à un organe à deux lobes avec une forme de papillon¹⁶.
5. Transférer la graisse brune dans une boîte de Petri de 35 mm remplie de 5 mL de tampon d’isolement à froid (tableau 1) préalablement placée sur de la glace.
6. Nettoyez la graisse brune de la graisse blanche sous une jumelle.
7. Transférer la graisse brune dans un bécher de 10 mL avec 5 mL de tampon d’isolation à froid (tableau 1) pour la couper en morceaux minces. Transférer dans l’homogénéisateur de verre de 10 mL réfrigéré à la glace (pilon en polytétrafluoroéthylène (PTFE) en matière plastique).
8. Utilisez un agitateur aérien pour homogénéiser le tissu prédécoupé sur la glace avec six coups doux à une vitesse contrôlée de 275 rotations / min.
9. Centrifuger l’homogénat à 8 500 x g pendant 10 min à 4 °C dans un tube conique glacé de 15 mL. Jeter le surnageant contenant la phase lipidique.
10. Remettre en suspension la pastille dans 5 mL de tampon d’isolation glacé (tableau 1) et homogénéiser, une deuxième fois, la suspension sur glace à six coups lents à une vitesse de rotation de 275/min.
11. Transférer l’homogénat dans un tube conique glacé de 15 mL et le centrifuger à 700 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler tous les noyaux et cellules ininterrompues.
12. Recueillir le surnageant dans un tube frais de 15 ml et le placer sur de la glace.
13. Centrifuger le surnageant à 8 500 x g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir une pastille contenant des mitochondries.
14. Remettre en suspension la pastille contenant des mitochondries dans 3,8 mL de tampon hypertonique-mannitol glacé (tableau 2) et incuber la suspension mitochondriale sur de la glace pendant 10 à 15 min.

2. Isolement mitochondrial du cœur de la souris (modifié à partir de Garg et al. 2019)¹⁷

1. Euthanasier la souris mâle C57BL/6 en utilisant l’asphyxie au CO₂ et la luxation cervicale subséquente, comme recommandé par le panel de l’American Veterinary Medical Association et le comité de l’IACUC.
2. Après avoir positionné la souris sur le dos, vaporisez de l’alcool pour nettoyer et mouiller les cheveux. Ensuite, faites une incision de 2 cm sur le thorax après avoir saisi la peau avec une pince à épiler.
3. Disséquer le cœur de la poitrine de l’animal et le rincer pour enlever tout le sang dans un bécher de 10 mL avec 5 mL de la solution d’isolement à froid (tableau 1).
4. Une fois que le cœur a été débarrassé des traces de sang, transférez-le dans un autre bécher de 10 mL contenant 5 mL de tampon d’isolement à froid (tableau 1) pour le couper en morceaux minces. Ensuite, transférer dans un homogénéisateur en verre de 10 mL réfrigéré à la glace (pilon PTFE).
5. Utilisez un agitateur aérien pour homogénéiser le tissu prédécoupé sur la glace avec six coups doux à une vitesse contrôlée de 275 rotations / min.
6. Transférer l’homogénat dans un tube conique glacé de 15 mL et le centrifuger à 700 x g pendant 10 min à 4 °C pour les granuler dans les noyaux de granulés et les cellules ininterrompues.
7. Recueillir le surnageant dans un tube frais de 15 ml et le placer sur de la glace.
8. Centrifuger le surnageant à 8 500 x g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir une pastille contenant des mitochondries.
9. Remettre en suspension la pastille mitochondriale dans 3,8 mL de tampon hypertonique-mannitol glacé (tableau 2) et incuber la suspension mitochondriale sur de la glace pendant 10 à 15 min.

3. Préparation des mitoplastes avec une presse Français pour rupture mécanique de l’OMM.

REMARQUE : La procédure de presse Français permet de libérer l’IMM de l’OMM avec son intégrité préservée, y compris la matrice et le crista (Figure 2)¹⁸. Les mitochondries sont pré-incubées dans un tampon hypertonique-mannitol (tableau 2) et soumises à une pression plus faible pendant la procédure de presse Français pour éviter tout étirement drastique de l’IMM lorsque l’OMM est rompu.

1. Remplissez la suspension mitochondriale-hypertonique-mannitol dans une mini-cellule de pression réfrigérée (diamètre du piston 3/8 ») de la presse Français (Figure 3A).
2. Sélectionnez le mode Moyen de la Français Appuyez et comprimez la suspension à travers la mini cellule de pression à 110 sur le cadran de la Français Pressez pour les mitochondries de graisse brune et à 140 pour les mitochondries cardiaques (~2 000 psi).  Assurez-vous que la suspension sort de la mini cellule de pression à une vitesse d’environ 1 goutte / s.
3. Recueillir les gouttes dans un tube conique glacé de 15 mL.
4. Centrifuger la suspension à 10 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Remettre en suspension la pastille de mitoplastes dans 0,5 à 2 mL de tampon hypertonique-KCl glacé (tableau 3) et conserver la suspension sur de la glace.
   REMARQUE: Les mitoplastes de graisse brune et de cœur sont prêts pour les enregistrements de patch-clamp et devraient rester utilisables pendant environ 3-6 h.

4. Enregistrements électrophysiologiques des fuites H⁺ à travers UCP1 et AAC ^5,7,15

REMARQUE: Utilisez la configuration électrophysiologique suivante (Figure 3B): microscope inversé avec contraste d’interférence différentielle (DIC), objectif d’immersion dans l’eau 60x, table d’isolation des vibrations et cage de Faraday, amplificateur standard prenant en charge les enregistrements à faible bruit, numériseur standard utilisé pour la configuration électrophysiologique, pClamp 10, micromanipulateur, électrode de référence de bain (pont de sel KCl-agar de 3 M inséré dans un support de microélectrode contenant une pastille d’argent / chlorure d’argent moulée dans le corps du support (décrit dans Liu et al. 2021)¹⁹, chambre de perfusion avec un fond de couvercle en verre de 0,13 mm, relié à un système de perfusion alimenté par gravité.

1. Tirez les filaments de verre borosilicate le jour de l’enregistrement à l’aide d’un extracteur de micropipette. Réglez un programme sur l’extracteur utilisé pour générer des pipettes avec un haut degré de reproductibilité²⁰.
   REMARQUE: Cette conception de programme nécessite plusieurs tentatives pour obtenir des pipettes optimisées pour la pince de patch IMM. Une pipette standard a des pointes fines avec une forme conique progressive.
2. Insérez un filament de verre dans l’extracteur et tirez pour obtenir presque deux pipettes de patch identiques à partir d’un filament borosilicate.
3. Ajustez le programme lorsque les pipettes deviennent incohérentes entre les cycles de traction en raison du vieillissement du filament de la boîte chauffante de l’extracteur.
4. Placez la pipette à l’intérieur de la polisseuse à pipette et placez la pointe près du filament sous un grossissement de 100x pour la polir au feu.
5. Appuyez plusieurs fois sur la pédale pour chauffer le filament sans obstruer ou endommager la courbe de pointe.
6. Polir jusqu’à ce que des pipettes ayant une résistance comprise entre 25 et 35 MΩ soient obtenues lorsqu’elles sont remplies d’une solution de pipette à base de TMA (TMA pour l’hydroxyde de tétraméthylammonium, tableau 4).
7. Pré-incuber des couvercles (5 mm de diamètre, 0,1 mm d’épaisseur) avec 0,1% de gélatine pour réduire l’adhérence du mitoplast et les rincer avec la solution de bain KCl (Tableau 5) avant de déposer la suspension de mitoplast.
8. Préparer une dilution brute en mélangeant ~35 μL de la suspension de mitoplast concentrée avec 500 μL de la solution de bain KCl (tableau 5) et placez-la sur des couvercles préalablement placés dans un puits d’une plaque à 4 puits.
9. Incuber sur de la glace pendant 15 à 20 min pour que les mitoplastes sédimentent sur la couche de couverture.
10. Remplissez complètement la chambre de bain avec environ 50 μL de la solution de bain KCl (tableau 5).
11. Transférer un couvercle avec des mitoplastes à l’intérieur de la chambre à l’aide d’une pince à microdissection mince avec une pointe pliée.
12. Disposez le couvercle au bas de la chambre. Ne perfuser pas la chambre pour garder les mitoplastes stables sur le couvercle.
13. Choisissez un mitoplaste individuel non adhésif de la forme de 8 en scannant le couvercle sous le microscope avec un objectif 60x.
14. Chargez la pipette avec la solution de pipette (~50 μL) et placez-la dans le porte-pipette.
15. Apportez la pipette dans la solution de bain avec un micromanipulateur et approchez-la juste au-dessus du mitoplast sélectionné pour vous rapprocher de l’IMM. Le programme d’amplification donne la résistance de la pipette une fois qu’elle est dans la solution de bain. Maintenez le potentiel de la membrane à 0 mV et appliquez des impulsions de 10 mV à l’aide de la commande de test de membrane dans le programme d’amplification.
16. Appliquez une légère pression négative pour créer rapidement une gigaseal avec l’IMM (Figure 2B).
17. Soulevez la pipette avec le mitoplast attaché pour les tenir à l’écart du couvercle afin d’éviter la rupture du joint due à la dérive de la pipette pendant l’expérience.
18. Compenser les transitoires de capacité parasites avec la commande « test de membrane » dans le programme d’amplification avant de tester la configuration de l’ensemble du mitoplast pour obtenir une mesure correcte de la capacité (Cm) pour la membrane mitoplast après l’effraction.
19. Appliquez des impulsions de tension de courte durée (5-15 ms) (250-600 mV) avec le programme d’amplification pour rompre le patch membranaire sous la pipette en verre et obtenir la configuration du mitoplast entier (Figure 2C). Le rodage réussi se reflète dans la réapparition de transitoires de capacité.
20. Après l’effraction, équipez les transitoires de capacité avec l’option de test de membrane du programme d’amplification pour évaluer la capacité de la membrane (reflétant la taille du mitoplast) et sa résistance d’accès Ra (reflétant la qualité de la configuration du mitoplast entier). Après l’effraction, Ra doit être compris entre 40 et 80 MΩ. Les mitoplastes (de 2 à 6 μm) utilisés pour les expériences de patch-clamp ont généralement des capacités membranaires de 0,5 à 1,1 pF.
21. Immédiatement après l’effraction, remplacer la solution de bain KCl (tableau 5) par la solution de bain HEPES (tableau 6) en démarrant la perfusion.
22. Appliquez un protocole de rampe de 850 ms conçu avec le programme amplificateur, de -160 mV à +100 mV avec un intervalle de 5 s, tout en maintenant le mitoplaste à 0 mV. Ce protocole fonctionne pour les études UCP1 ^6,7,15 et AAC⁵ (Figure 4 et Figure 5).
    REMARQUE: Il est recommandé pour les mesures de courant H⁺ dépendant de l’UCP1 et de l’AAC d’acquérir toutes les données électrophysiologiques à 10 kHz et de filtrer à 1 kHz à l’aide d’un logiciel adéquat pilotant l’amplificateur et le numériseur.

Representative Results

Le développement de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a fourni la première étude directe de la fuite H⁺ à travers l’IMM et les transporteurs mitochondriaux, UCP1 et AAC, qui en sont responsables. L’analyse électrophysiologique des fuites H⁺ dépendantes de l’UCP1 et de l’AAC peut fournir un premier aperçu de la capacité thermogénique des mitochondries. La section des résultats décrit les procédures standard pour mesurer ^{les fuites H+} via UCP1 et AAC.

Mesure du courant H⁺ dépendant de l’UCP1 (Figure 4)^6,7,15
L’application du protocole de rampe de tension induit un courant H⁺ de grande amplitude à travers l’IMM de graisse brune sans ajout d’acides gras exogènes (AF), les activateurs requis des UCP (Figure 4A). Il s’agit d’une caractéristique spécifique de la graisse brune et beige IMM en raison de la production locale de FA par une activité phospholipase associée à la membrane. Lorsque le courant H⁺ se développe en réponse au protocole de rampe, il est important d’attendre que l’amplitude du courant se stabilise. La quantification de l’amplitude du courant H⁺ via UCP1 nécessite la détermination de la ligne de base correspondant à un courant UCP1 nul. Une fois la stabilité de l’amplitude du courant H⁺ atteinte, il est recommandé de perfuser soit l’inhibiteur de l’UCP1 Guanosine diphosphate (GDP - 1 mM, Figure 4A) soit un chélateur FA (albumine sérique bovine sans FA à 0,5 %, non représentée), soit 10 mM de méthyl-bêta cyclodextrine (MβCD) pour l’extraction de la membrane endogène FA, Figure 4B, trace noire). Le courant résiduel est le courant à partir duquel l’amplitude des courants UCP1 sera déterminée. Pour aider à comparer les amplitudes des courants UCP1 dans différents mitoplastes, la densité de courant (pA/pF) de chaque mitoplaste est calculée en normalisant les courants UCP1 avec la capacité mitoplaste (Cm)^5,7. Le courant peut être réactivé par l’ajout de FA exogène à longue chaîne à l’aide d’acide arachidonique (AA) ou d’acide oléique (OA) (1-2 μM). Étant donné que les MMI gras bruns et beiges possèdent une activité PLA2, les AF membranaires endogènes sont partiellement régénérés quelques minutes après le lavage du MβCD / albumine du bain, ce qui entraîne la réactivation du courant H ⁺ via UCP1 ^6,7. Comme prévu, ce courant disparaît complètement dans l’IMM des souris UCP1^-/- (Figure 4A)^6,7.

Une façon plus précise de comparer la densité et l’activité de l’UCP1 de différents mitoplastes d’un même tissu ou de mitoplastes de différents tissus (graisse brune et beige) est de contrôler la concentration de FA à la surface de l’IMM ^6,7. En effet, ^{l’amplitude du} courant H+ pourrait varier entre les mitoplastes en raison de la quantité de protéines UCP1 par IMM mais aussi en raison de la production de FA endogène. Ainsi, il est recommandé d’extraire l’AF endogène de l’IMM et de réactiver le courant H⁺ dépendant de l’UCP1 en ajoutant de l’AF exogène à une concentration connue. Pour ce faire, les AF endogènes doivent d’abord être extraits de l’IMM par perfusion d’une solution de bain HEPES (tableau 6) contenant 10 mM de MβCD. Ensuite, pour permettre la réactivation du courant H⁺ via UCP1 par une concentration précise de FA exogènes, ces derniers seront perfusés sur un fond HEPES/MβCD pour extraire en continu les FA produits à partir de l’IMM.

L’étude de la compétition entre le nucléotide purine et le FA pour la liaison à UCP1 est également possible avec la technique patch-clamp ^6,7,15. L’inhibition de l’UCP1 par les nucléotides puriques (par exemple, l’ATP sans Mg²⁺) peut être comparée à deux concentrations différentes de FA (idéalement 10 fois). À cette fin, les FA de membrane endogène sont d’abord éliminés en appliquant 10 mM de MβCD (Figure 4B, trace noire). L’application d’AF exogènes (par exemple, ici, seulement 0,5 mM d’AF sont montrés) appliquée sur un fond de 10 mM de MβCD permet un contrôle précis de la concentration des AF activatrices car les AF produites localement sont immédiatement extraites de la membrane. Dans cette condition, les FA exogènes sont principalement responsables du développement ^{du courant H}+. Différentes concentrations d’ATP sont ensuite ajoutées à la solution d’OA/MβCD pour évaluer_l’ATP IC50 pour chaque concentration d’AF testée et ainsi, établir si l’AF est en concurrence avec les nucléotides puriques pour se lier à l’UCP1.

Mesure du courant H+ dépendant de la CAA (Figure 5)⁵
Contrairement à la graisse brune, l’IMM des tissus non adipeux tels que le muscle squelettique et le cœur ne développe pas un H⁺ mesurable immédiatement après l’effraction (Figure 5, traces noires). Pour induire un courant H⁺ mesurable par caA, il est essentiel d’appliquer la solution de bain HEPES (tableau 6) contenant 1 à 2 μM d’AF exogène (AA, figure 5A, trace rouge). Cela peut indiquer que l’IMM des tissus non adipeux n’a pas de machinerie de production d’AF dans l’IMM comme on le trouve dans l’IMM des graisses brunes et beiges.

La valeur de référence (ou courant nul) pour la quantification de l’amplitude du courant H⁺ via la CAA correspond à la solution de bain HEPES (tableau 6) perfusée à la surface de l’IMM avant l’ajout de FA. Pour confirmer que le courant H⁺ mesuré est transporté par la CAA, il est important d’appliquer des inhibiteurs spécifiques de la CAA ajoutés à l’AF, 1 μM de carboxyatractyloside (CATR, Figure 5A) ou 4 μM d’acide bonkgrekique (BKA, non montré)⁵, qui inhibent presque complètement le courant H⁺ . Ce courant disparaît complètement dans l’IMM des souris AAC1^-/- (Figure 5A), l’AAC1 étant l’isoforme prédominante dans le cœur⁵.

L’analyse patch-clamp de l’interaction entre la fuite H⁺ dépendante de la FA et les nucléotides est également possible avec aAC⁵. Cependant, il existe une différence importante entre l’AAC et l’UCP1 : l’AAC porte non seulement H⁺ , mais sa fonction principale est de transporter les nucléotides d’adénine ADP et d’ATP²¹. Pour étudier comment l’échange de nucléotides d’adénine affecte la fuite H⁺ dépendante de l’AF, 1 mM Mg²⁺ d’ADP sans ADP est ajouté à la solution de pipette. Ensuite, les FA sont perfusés pour activer ^le courant H + via AAC. Seul l’ADP dans la solution de pipette n’interfère pas avec le courant H^{+ 5}. Une fois qu’une amplitude de courant H⁺ stable est atteinte, l’ADP est perfusé simultanément avec LE FA. Ce n’est que lorsque l’ADP est présent des deux côtés de la membrane pour générer un échange de nucléotides actif via la CAA qu’une inhibition constante mais jamais complète de la fuite H⁺ est obtenue (Figure 5B). Cela peut indiquer que les deux modes de transport de la CAA (courant FA-H⁺ et échange ADP/ATP) sont en concurrence et sont susceptibles de se produire par la même voie de translocation. L’homo-échange ADP/ADP a été choisi pour éviter le courant supplémentaire associé à l’hétéro-échange physiologique ADP/ATP⁵.

Figure 1 : Répartition de l’énergie mitochondriale entre la chaleur et la production d’ATP. Mécanismes de l’ATP mitochondrial et de la production de chaleur. Les mitochondries ont deux membranes [l’OMM (violet) et l’IMM (orange)], qui contiennent les machines pour la production d’ATP et de chaleur. L’ETC génère un gradient électrochimique de H⁺ à travers l’IMM, qui est utilisé par l’ATP synthase (AS) pour produire de l’ATP et utilisé par les UCP pour générer de la chaleur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Technique du patch-clamp mitochondrial (modifié à partir de Bertholet et al. 2020)¹⁵. (A) Les mitochondries sont isolées du lysat tissulaire par centrifugation (OMM en violet et IMM en orange). (B) La presse Français basse pression rompt l’OMM pour libérer l’IMM qui donne un mitoplaste. Le panneau de gauche représente un mitoplaste, qui prend une forme en forme de 8 avec des restes de l’OMM attachés à l’IMM. Une pipette en verre est approchée de l’IMM pour former un joint gigaohm (configuration fixée au mitoplast). Une photographie de la configuration attachée au mitoplast est affichée dans le panneau de droite. (C) La configuration de l’IMM entier (schéma dans le panneau de gauche) est obtenue après avoir brisé le patch de membrane sous la pipette par plusieurs impulsions de tension (200-500 mV). Une photographie de l’ensemble de la configuration IMM est affichée dans le panneau de droite. Les courants intérieurs (I, rouge) sont négatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Français presse et configuration électrophysiologique. (A) Image de Français Press, qui aide à rompre l’OMM pour libérer l’IMM. (B) Image d’une cage de Faraday, microscope inversé avec contraste d’interférence différentiel (DIC), objectif d’immersion dans l’eau 60x, une table d’isolation des vibrations et un micromanipulateur. L’amplificateur standard, un numériseur standard et un ordinateur PC ne sont pas représentés sur l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Courant H⁺ via UCP1 dans la graisse brune. (A) Courant H⁺ représentatif dépendant de l’UCP1 enregistré à partir de mitoplaste de graisse brune isolé de souris WT (panneau supérieur) et UCP1^−/− (panneau inférieur). Les traces de courant H⁺ de contrôle indiquées en noir correspondent à l’amplitude de courant stabilisée après la rupture de l’IMM. 1 mM de PIB est ensuite ajouté à la solution de bain (orange). Le protocole de rampe de tension est indiqué au-dessus des traces WT. Le pH des solutions de bain et de pipette est indiqué dans le diagramme pipette-mitoplast. (B) Inhibition de l’UCP1 par les nucléotides puriques dans la graisse brune. Traces représentatives de courant H⁺ dépendant de l’UCP1 à diverses concentrations d’ATP sur la face cytosolique de l’IMM de graisse brune de souris à thermoneutralité. Le courant H⁺ dépendant de l’UCP1 a été activé avec 0,5 mM d’acide oléique (OA) mélangé à 10 mM de MβCD.Le protocole de tension est indiqué en haut. Dans le panneau inférieur, la même trace est représentée mais non normalisée avec la capacité de la membrane mitoplaste. Le mitoplaste de graisse brune dans cette figure avait une capacité membranaire de 0,624 pF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Courant H⁺ dépendant de l’AF via la CAA dans le mitoplaste cardiaque. (A) Courant H⁺ représentatif dépendant de la CAA lorsqu’il est appliqué 2 μM AA dans la solution de bain (panneau supérieur, orange) dans les mitoplastes cardiaques WT et inhibé par 1 μM CATR (violet). Les traces représentatives enregistrées dans le mitoplaste cardiaque AAC1^−/− se trouvent dans le panneau inférieur. Le courant de contrôle est en noir. Le protocole de rampe de tension est indiqué au-dessus des traces WT. Le pH des solutions de bain et de pipette est indiqué dans le diagramme pipette-mitoplast. (B) Alors que la solution de pipette contenait 1 mM d’ADP, le courant H⁺ dépendant de l’AAC est induit par 2 μM AA (orange) et inhibé par l’ajout de 1 mM d’ADP au bain (violet). Le protocole de rampe de tension est indiqué au-dessus de la trace. Le pH des solutions de bain et de pipette est indiqué dans le diagramme pipette-mitoplast. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Réactif	Concentration finale
saccharose	250 mM
HEPES	10 mM
L’EGTA	1 mM
pH ajusté à 7,2 avec TrisBase

Tableau 1 : Tampon d’isolement mitochondrial (tonicité ~ 300 mmol par kg)

Réactif	Concentration finale
saccharose	140 mM
D-mannitol	440 mM
HEPES	10 mM
L’EGTA	1 mM
pH ajusté à 7,2 avec TrisBase

Tableau 2 : Tampon hypertonique-mannitol

Réactif	Concentration finale
Kcl	750 mM
HEPES	20 mM
L’EGTA	1 mM
pH ajusté à 7,2 avec TrisBase

Tableau 3 : Tampon hypertonique-KCl

Réactif	Concentration finale
Tma	130 mM
HEPES	100 mM
L’EGTA	1 mM
MgCl2 pour les enregistrements UCP1	2 mM
ou
TrisCl pour les enregistrements AAC
pH ajusté à 7,0 ou 7,5 avec de l’acide D-gluconique

Tableau 4 : Solution de pipette à base de TMA (tonicité ~ 360 mmol par kg)

Réactif	Concentration finale
Kcl	150 mM
HEPES	10 mM
L’EGTA	1 mM
pH ajusté à 7,0 avec TrisBase

Tableau 5 : Solution de bain KCl (tonicité ~ 300 mmol par kg)

Réactif	Concentration finale
saccharose	100 mM pour les enregistrements UCP1
	ou
	150 mM pour les enregistrements AAC
HEPES	150 mM pour les enregistrements UCP1
	ou
	100 mM pour les enregistrements AAC
1 mM EGTA
pH ajusté à 7,0 avec TrisBase

Tableau 6 : Solution de bain HEPES (tonicité ~ 300 mmol par kg)

Discussion

Cet article sur la méthode vise à présenter la technique patch-clamp récemment appliquée aux mitochondries, une nouvelle approche pour étudier directement la fuite H⁺ à travers l’IMM responsable de la thermogenèse mitochondriale ^5,6,7,15. Cette technique ne se limite pas aux tissus et peut également être utilisée pour analyser les fuites H⁺ et d’autres conductances de l’IMM dans différents modèles humains et cellulaires standard tels que les cellules HAP1, COS7, C2C12 et MEF. Cependant, chaque isolement mitochondrial nécessite des réajustements spécifiques à chaque type de cellule ou de tissu.

Les principales étapes de la mesure directe des courants H⁺ à travers l’IMM de la graisse brune ^5,6 et du cœur⁵ sont résumées ici pour illustrer les mécanismes responsables de la thermogenèse mitochondriale dans les tissus thermogéniques et non adipeux spécialisés. En effet, le développement de cette technique permet pour la première fois une analyse fonctionnelle à haute résolution des deux principaux UCP (UCP1 et AAC) dans leur environnement membranaire natif avec un contrôle précis des conditions expérimentales critiques telles que : 1) le pH des solutions pipette et bain, 2) le contrôle du potentiel membranaire à travers l’IMM, et 3) la composition précise des solutions pour exclure les ions et métabolites perméables à l’IMM autres que H⁺. Les solutions de bain à base de TMA (tableau 4) et de bain HEPES (tableau 6) sont formulées pour enregistrer ^les courants H+ et ne contiennent que des sels qui se dissocient en gros anions et cations normalement imperméables à l’IMM. Bien que la solution de bain puisse être modifiée à l’aide d’un système de perfusion, ce qui permet d’appliquer différents traitements sur le côté cytosolique de la membrane, il n’est pas possible de modifier la composition de la solution intrapipette. Cela limite la compréhension des mécanismes de régulation qui se produisent du côté de la matrice. En effet, des composés doivent être présents dans la solution intrapipette au moment du remplissage de la pipette. Par conséquent, ^la fuite H+ peut être étudiée isolément des autres courants. Les études pharmacologiques et l’utilisation de souris KO ont été essentielles pour la caractérisation et l’identification des protéines responsables du courant H⁺ à travers l’IMM de divers tissus ^5,6,7. Ces résultats ont établi que l’UCP1 est la principale UCP de la graisse brune et beige, et de la CAA dans les tissus non adipeux. Nous ne pouvons pas exclure complètement la possibilité de l’existence d’autres courants H⁺ non médiés par UCP1 et AAC. Cependant, si d’autres courants H⁺ existent, leur amplitude était au-delà de la résolution de notre configuration électrophysiologique. Nous ne mesurons pas le pompage H⁺ de l’ETC dans les conditions décrites dans cet article. Une fois que nous avons atteint la configuration IMM entière, la matrice mitochondriale est lavée par perfusion de la solution intra-pipette. L’espace intermembranaire n’existe plus depuis l’étape consistant à casser l’OMM avec la presse Français. Aucun substrat des complexes respiratoires cruciaux pour le pompage H⁺ à travers l’ETC n’a été ajouté. Il est donc peu probable qu’il développe un pompage H⁺ actif dans les conditions électrophysiologiques détaillées ici.

Les enregistrements à canal unique des patchs excisés ne sont pas décrits dans cet article. Bien que les courants H⁺ dépendants de l’UCP1 et de l’AAC dans l’IMM soient robustes en raison de leur densité protéique élevée, les ouvertures à canal unique n’ont pas pu être résolues car l’amplitude des courants unitaires UCP1 et AAC est probablement trop faible.

Contrairement aux études biochimiques, l’isolement mitochondrial décrit dans cet article n’a pas besoin d’entraîner un niveau élevé de pureté mitochondriale. En effet, la préparation mitochondriale composée d’une multitude de mitoplastes individualisés et de débris cellulaires est scannée au microscope pour trouver un mitoplaste en forme de 8 à patcher. La forme en forme de 8 du mitoplaste est due à la libération de l’IMM à travers un trou dans l’OMM causé par la procédure de presse Français (Figure 2). Le lobe moins dense correspond à l’IMM^15,17. Une préparation appropriée peut être définie par des mitoplastes en mouvement libre qui peuvent être facilement distingués des débris cellulaires. Il est toutefois important de réduire le nombre de débris pour éviter la contamination de l’IMM, ce qui peut affecter la qualité de l’étanchéité de la pipette en verre avec la membrane. Cette étape de balayage au microscope permet de choisir un mitoplaste à haute intégrité IMM reconnue par un lobe moins dense que celui délimité par l’OMM et augmente donc les chances d’une effraction réussie.

Cette technique a fourni pour la première fois la mesure directe des courants H⁺ dépendants de l’UCP1 et de l’AAC dans leur membrane native. Cependant, l’intégrité mitochondriale et le compartimentage n’existent plus en raison de la rupture de l’OMM et probablement du cristae. Il est donc essentiel de compléter l’analyse patch-clamp avec d’autres méthodes classiques telles que la respiration mitochondriale pour confirmer le rôle physiologique des protéines nouvellement caractérisées dans les mitochondries intactes.

La technique patch-clamp appliquée aux mitochondries offre de nouvelles possibilités pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la fuite mitochondriale H⁺ et de la thermogenèse. Combinée à des techniques cellulaires et moléculaires modernes, cette approche innovante fournira de nouvelles informations sur les mécanismes qui contrôlent la capacité thermogénique des mitochondries et sur la façon dont elles peuvent être ciblées pour lutter contre les maladies associées au dysfonctionnement mitochondrial.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253