Die Verwendung der Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien

Summary

Dieser ^{Methodenartikel} beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Messung des H + -Lecks über die innere mitochondriale Membran mit der Patch-Clamp-Technik, einem neuen Ansatz zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien.

Abstract

Die mitochondriale Thermogenese (auch bekannt als mitochondriale Entkopplung) ist eines der vielversprechendsten Ziele für die Erhöhung des Energieverbrauchs zur Bekämpfung des metabolischen Syndroms. Thermogene Gewebe wie braune und beige Fette entwickeln hochspezialisierte Mitochondrien zur Wärmeerzeugung. Mitochondrien anderer Gewebe, die primär ATP produzieren, wandeln ebenfalls bis zu 25% der gesamten mitochondrialen Energieproduktion in Wärme um und können daher einen erheblichen Einfluss auf die Physiologie des gesamten Körpers haben. Die mitochondriale Thermogenese ist nicht nur für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur unerlässlich, sondern beugt auch ernährungsbedingter Fettleibigkeit vor und reduziert die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), um Zellen vor oxidativen Schäden zu schützen. Da die mitochondriale Thermogenese ein Schlüsselregulator des Zellstoffwechsels ist, wird ein mechanistisches Verständnis dieses grundlegenden Prozesses bei der Entwicklung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung vieler Pathologien im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion helfen. Wichtig ist, dass die genauen molekularen Mechanismen, die die akute Aktivierung der Thermogenese in Mitochondrien steuern, schlecht definiert sind. Dieser Mangel an Informationen ist weitgehend auf einen Mangel an Methoden zur direkten Messung von entkoppelnden Proteinen zurückzuführen. Die jüngste Entwicklung der Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wurde, ermöglichte zum ersten Mal die direkte Untersuchung des Phänomens am Ursprung der mitochondrialen Thermogenese, H + -Leck durch das IMM und die erste biophysikalische Charakterisierung der dafür verantwortlichen mitochondrialen Transporter, des Entkopplungsproteins 1 (UCP1), spezifisch für braune und beige Fette, und des ADP / ^{ATP-Transporters} (AAC) für alle anderen Gewebe. Dieser einzigartige Ansatz wird neue Einblicke in die Mechanismen liefern, die H ^{+ -} Leck und mitochondriale Thermogenese kontrollieren und wie sie zur Bekämpfung des metabolischen Syndroms eingesetzt werden können. Dieses Papier beschreibt die Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wird, um ihre thermogene Kapazität durch direkte Messung von H ^{+ -} Strömen durch das IMM zu untersuchen.

Introduction

Mitochondrien sind berühmt dafür, das Kraftwerk der Zelle zu sein. In der Tat sind sie die wichtigste Quelle chemischer Energie, ATP. Weniger bekannt ist, dass Mitochondrien auch Wärme erzeugen. Tatsächlich erzeugt jedes Mitochondrium ständig die beiden Arten von Energien (ATP und Wärme) und ein feines Gleichgewicht zwischen den beiden Energieformen definiert die metabolische Zellhomöostase (Abbildung 1). Wie Mitochondrien Energie zwischen ATP und Wärme verteilen, ist sicherlich die grundlegendste Frage auf dem Gebiet der Bioenergetik, obwohl sie noch weitgehend unbekannt ist. Wir wissen, dass die Erhöhung der mitochondrialen Wärmeproduktion (mitochondriale Thermogenese genannt) und folglich die Verringerung der ATP-Produktion den Energieverbrauch erhöht, und dies ist eine der besten Möglichkeiten, das metabolische Syndrom zu bekämpfen¹.

Die mitochondriale Thermogenese entsteht durch H+-Leck über die innere mitochondriale Membran (IMM), was zu einer Entkopplung der Substratoxidation und der ^ATP-Synthese mit anschließender Wärmeerzeugung führt, daher der Name "mitochondriale Entkopplung"1 (Abbildung 1^). Dieses H ^{+ -}Leck hängt von mitochondrialen Transportern ab, die als Entkopplungsproteine (UCPs) bezeichnet werden. UCP1 war der erste identifizierte UCP. Es wird nur in thermogenen Geweben, braunem Fett und beigefarbenem Fett exprimiert, in denen Mitochondrien auf die Wärmeerzeugung spezialisiert sind ^2,3,4. Die Identität von UCP in Nicht-Fettgeweben wie Skelettmuskulatur, Herz und Leber ist umstritten geblieben. Mitochondrien in diesen Geweben können etwa 25% der gesamten mitochondrialen Energie in Wärme umgewandelt werden, was die Physiologie des gesamten Körpers erheblich beeinflussen kann¹. Neben der Aufrechterhaltung der Körperkerntemperatur verhindert die mitochondriale Thermogenese auch ernährungsbedingte Fettleibigkeit durch Reduzierung der Kalorien. Darüber hinaus reduziert es die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Mitochondrien, um Zellen vor oxidativen Schäden^{zu schützen 1}. So ist die mitochondriale Thermogenese an normalem Altern, altersbedingten degenerativen Erkrankungen und anderen Erkrankungen mit oxidativem Stress wie Ischämie-Reperfusion beteiligt. Daher ist die mitochondriale Thermogenese ein starker Regulator des Zellstoffwechsels, und ein mechanistisches Verständnis dieses grundlegenden Prozesses wird die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung vieler Pathologien im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion fördern.

Die mitochondriale Atmung war die erste Technik, die die entscheidende Rolle der mitochondrialen Thermogenese im Zellstoffwechsel aufdeckte und ist immer noch die beliebteste in der Gemeinschaft¹. Diese Technik basiert auf der Messung des Sauerstoffverbrauchs durch die mitochondriale Elektronentransportkette (ETC), die zunimmt, wenn das mitochondriale H^+-Leck aktiviert wird. Diese Technik, obwohl instrumentell, kann nicht direkt mitochondrialen H + -Lecks über das IMM¹ untersuchen, wodurch die genaue Identifizierung und Charakterisierung der dafür verantwortlichen Proteine erschwert wird, insbesondere in Nicht-Fettgeweben, in denen die Wärmeproduktion im Vergleich zur ^{ATP-Produktion} sekundär ist. Vor kurzem lieferte die Entwicklung der Patch-Clamp-Technik, die auf Mitochondrien angewendet wurde, die erste direkte Studie des H ^{+ -}Lecks über das gesamte IMM in verschiedenen Geweben ^5,6,7.

Die mitochondriale Patch-Klemme des gesamten IMM wurde erstmals reproduzierbar von Kirichok et ^al.8 etabliert. Sie beschrieben die erste direkte Messung von mitochondrialen Calcium-Uniporter-Strömen (MCU) im Jahr 2004 mit Mitoplasten aus COS-7-Zelllinien⁸. Später zeigte das Kirichok-Labor Kalziumströme aus IMMs von Maus 9 und Drosophila Gewebe^9. Andere Labore verwenden diese Technik nun routinemäßig, um die biophysikalischen Eigenschaften der MCU ^{10,11,12,13,14} zu untersuchen. Die gesamte IMM-Patch-Clamp-Analyse des Kalium- und Chloridleitwerts ist ebenfalls möglich und wurde in mehreren Artikeln erwähnt, war aber noch nicht das Hauptthema einer Veröffentlichung ^6,7,9. Die erste Messung der H ⁺ -Ströme im gesamten IMM wurde 2012 von Maus-Braunfett-Mitochondrien⁶ und von Maus-Beigefett-Mitochondrien im Jahr 2017⁷ berichtet. Dieser Strom ist auf das spezifische Entkopplungsprotein thermogener Gewebe, UCP1^6,7, zurückzuführen. Jüngste Arbeiten, die 2019 veröffentlicht wurden, charakterisierten AAC als das Hauptprotein, das für das mitochondriale H + -Leck in Nicht-Fettgeweben wie Herz ^{und Skelettmuskulatur verantwortlich ist 5}.

Dieser einzigartige Ansatz ermöglicht nun die direkte hochauflösende Funktionsanalyse der mitochondrialen Ionenkanäle und Transporter, die für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich sind. Um die Erweiterung der Methode zu erleichtern und andere Studien wie die mitochondriale Atmung zu ergänzen, wird im Folgenden ein detailliertes Protokoll zur Messung der H ^{+ -}Ströme beschrieben, die von UCP1 und AAC übertragen werden. Drei wichtige Schritte werden beschrieben: 1) mitochondriale Isolierung von braunem Mausfett zur Analyse des UCP1-abhängigen H + -Stroms und der mitochondrialen Isolierung vom Herzen, um den AAC-abhängigen H + -Strom zu analysieren, 2) Vorbereitung von Mitoplasten mit einer französischen Presse für den mechanischen Bruch der äußeren mitochondrialen Membran (^OMM), 3) Patch-Clamp-Aufnahmen von UCP1- und AAC-abhängigen H ^{+ -}Strömen über das gesamte IMM.

Protocol

Alle durchgeführten Tierversuchsverfahren entsprechen den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden vom University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

HINWEIS: Das mitochondriale Isolationsverfahren basiert auf differentieller Zentrifugation und variiert leicht von Gewebe zu Gewebe. Da beispielsweise braunes Fettgewebe extrem reich an Lipiden ist, ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um Zelltrümmer und Organellen aus der Lipidphase zu trennen, bevor die Mitochondrien geerntet werden. Um Verwirrung zu vermeiden, werden die beiden mitochondrialen Isolationsverfahren (eines aus dem braunen Fett und das andere aus dem Herzen) im Folgenden beschrieben.

1. Mitochondriale Isolierung von interskapulärem braunem Fett der Maus (modifiziert von Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Euthanasieren Sie die männliche C57BL/6-Maus mit CO 2-Asphyxie und anschließender Zervixdislokation, wie vom American Veterinary Medical Association Panel und dem IACUC-Komitee empfohlen.
2. Nachdem Sie die Maus mit dem Bauch zum Tisch hin positioniert haben, sprühen Sie Alkohol ein, um das Haar zu reinigen und zu benetzen (modifiziert von Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Machen Sie einen Schnitt von 2 cm im oberen Rücken, nachdem Sie die Haut mit einer Pinzette greifen.
4. Extrahieren Sie das braune Kreuzblattfett der Maus, das einem zweilappigen Organ mit einer Schmetterlingsform^{entspricht 16}.
5. Das braune Fett in eine 35 mm große Petrischale geben, die mit 5 ml kaltem Isolationspuffer gefüllt war (Tabelle 1), die zuvor auf Eis gelegt wurde.
6. Reinigen Sie das braune Fett vom weißen Fett unter einem Fernglas.
7. Geben Sie das braune Fett in ein 10-ml-Becherglas mit 5 ml kaltem Isolationspuffer (Tabelle 1), um es in dünne Stücke zu schneiden. Auf den eisgekühlten 10 ml Glashomogenisator (Kunststoffmaterial Polytetrafluorethylen (PTFE) Stößel) übertragen.
8. Verwenden Sie einen Überkopfrührer, um das vorgeschnittene Gewebe auf Eis mit sechs sanften Strichen bei einer kontrollierten Geschwindigkeit von 275 Umdrehungen/min zu homogenisieren.
9. Das Homogenat bei 8.500 x g für 10 min bei 4 °C in einem eiskalten 15 ml eiskalten konischen Röhrchen zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand, der die Lipidphase enthält.
10. Schwebe das Pellet in 5 ml eiskaltem Isolationspuffer (Tabelle 1) und homogenisiere die Suspension auf Eis ein zweites Mal mit sechs langsamen Hüben bei einer Geschwindigkeit von 275 Umdrehungen/min.
11. Übertragen Sie das Homogenat in ein 15 ml eiskaltes konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 700 x g für 10 min bei 4 °C, um alle Kerne und ungebrochenen Zellen zu pelletieren.
12. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 15-ml-Schlauch und legen Sie ihn auf Eis.
13. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 8.500 x g für 10 min bei 4 °C, um ein Pellet mit Mitochondrien zu erhalten.
14. Resuspendieren Sie das mitochondrienhaltige Pellet in 3,8 ml eiskaltem hypertonischem Mannitolpuffer (Tabelle 2) und inkubieren Sie die mitochondriale Suspension 10-15 min lang auf Eis.

2. Mitochondriale Isolierung vom Mausherzen (modifiziert von Garg et al. 2019)¹⁷

1. Euthanasieren Sie die männliche C57BL/6-Maus mit CO 2-Asphyxie und anschließender Zervixdislokation, wie vom American Veterinary Medical Association Panel und dem IACUC-Komitee empfohlen.
2. Nachdem Sie die Maus auf dem Rücken positioniert haben, sprühen Sie Alkohol, um das Haar zu reinigen und zu benetzen. Machen Sie dann einen 2 cm langen Schnitt am Thorax, nachdem Sie die Haut mit einer Pinzette erfasst haben.
3. Sezieren Sie das Herz aus der Brust des Tieres und spülen Sie es ab, um das gesamte Blut in einem 10-ml-Becherglas mit 5 ml der kalten Isolationslösung zu entfernen (Tabelle 1).
4. Sobald das Herz von Blutspuren befreit wurde, geben Sie es in ein anderes 10-ml-Becherglas mit 5 ml kaltem Isolationspuffer (Tabelle 1), um es in dünne Stücke zu schneiden. Dann auf einen eisgekühlten 10-ml-Glashomogenisator (PTFE-Stößel) übertragen.
5. Verwenden Sie einen Überkopfrührer, um das vorgeschnittene Gewebe auf Eis mit sechs sanften Strichen bei einer kontrollierten Geschwindigkeit von 275 Umdrehungen/min zu homogenisieren.
6. Überführen Sie das Homogenat in ein 15 ml eiskaltes konisches Rohr und zentrifugieren Sie es bei 700 x g für 10 min bei 4 °C auf Pelletkerne und ungebrochene Zellen.
7. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 15-ml-Schlauch und legen Sie ihn auf Eis.
8. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 8.500 x g für 10 min bei 4 °C, um ein Pellet mit Mitochondrien zu erhalten.
9. Resuspendiert das mitochondriale Pellet in 3,8 ml eiskaltem hypertonischem Mannitolpuffer (Tabelle 2) und inkubiert die mitochondriale Suspension auf Eis für 10-15 min.

3. Vorbereitung von Mitoplasten mit einer französischen Presse für den mechanischen Bruch des OMM.

HINWEIS: Das französische Presseverfahren ermöglicht es, das IMM unter Wahrung seiner Integrität aus dem OMM zu entlassen, einschließlich der Matrix und der Crista (Abbildung 2)¹⁸. Mitochondrien werden in einem hypertonen Mannitolpuffer vorinkubiert (Tabelle 2) und während des French Press-Verfahrens einem niedrigeren Druck ausgesetzt, um eine drastische Dehnung des IMM beim Bruch des OMM zu vermeiden.

1. Füllen Sie die mitochondrial-hypertonische Mannitol-Suspension in eine gekühlte Mini-Druckzelle (Kolbendurchmesser 3/8") der französischen Presse (Abbildung 3A).
2. Wählen Sie den Medium-Modus der French Press und komprimieren Sie die Aufhängung durch die Mini-Druckzelle bei 110 auf dem Zifferblatt der French Press für die braunen Fettmitochondrien und bei 140 für die Herzmitochondrien (~ 2.000 psi).  Stellen Sie sicher, dass die Aufhängung mit einer Rate von etwa 1 Tropfen / s aus der Mini-Druckzelle kommt.
3. Sammeln Sie die Tropfen in einem 15 ml eisgekühlten konischen Röhrchen.
4. Zentrifen Sie die Suspension bei 10.500 x g für 10 min bei 4 °C.
5. Resuspendiert das Mitoplastenpellet in 0,5-2 ml eiskaltem Hypertonik-KCl-Puffer (Tabelle 3) und lagert die Suspension auf Eis.
   HINWEIS: Braunes Fett und Herzmitoplasten sind bereit für Patch-Clamp-Aufnahmen und sollten für ca. 3-6 h verwendbar bleiben.

4. Elektrophysiologische Aufzeichnungen von H⁺ Leck durch UCP1 und ^{AAC 5,7,15}

HINWEIS: Verwenden Sie den folgenden elektrophysiologischen Aufbau (Abbildung 3B): inverses Mikroskop mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC), 60-faches Wassertauchobjektiv, Schwingungsisolationstisch und Faradayscher Käfig, ein Standardverstärker für rauscharme Aufnahmen, ein Standard-Digitizer für die elektrophysiologische Einrichtung, pClamp 10, ein Mikromanipulator, Badreferenzelektrode (3 M KCl-Agar-Salzbrücke, die in einen Mikroelektrodenhalter eingeführt wird, der ein Silber / Silberchlorid-Pellet enthält, das geformt ist in den Halterkörper (beschrieben in Liu et al. 2021)¹⁹, Perfusionskammer mit einem 0,13 mm großen Glasdeckelboden, verbunden mit einem schwerkraftgespeisten Perfusionssystem.

1. Ziehen Sie die Borosilikatglasfilamente am Tag der Aufnahme mit einem Mikropipettenabzieher ab. Stellen Sie ein Programm auf dem Abzieher ein, der zum Erzeugen von Pipetten mit einem hohen Grad an Reproduzierbarkeit^{verwendet wird 20}.
   HINWEIS: Dieses Programmdesign erfordert mehrere Versuche, um Pipetten zu erhalten, die für die IMM-Patch-Klemme optimiert sind. Eine Standardpipette hat feine Spitzen mit einer progressiven konischen Form.
2. Führen Sie ein Glasfilament in den Abzieher ein und ziehen Sie, um fast zwei identische Patchpipetten aus einem Borosilikatfilament zu erhalten.
3. Passen Sie das Programm an, wenn Pipetten aufgrund der Alterung des Heizkastenfilaments des Abziehers zwischen den Zugzyklen inkonsistent werden.
4. Positionieren Sie die Pipette im Inneren des Pipettenpolierers und platzieren Sie die Spitze in der Nähe des Filaments unter 100-facher Vergrößerung, um sie feuerpolieren.
5. Drücken Sie mehrmals auf das Fußpedal, um das Filament zu erwärmen, ohne die Spitzenkurve zu verstopfen oder zu beschädigen.
6. Polieren, bis Pipetten mit einem Widerstand zwischen 25 und 35 MΩ erhalten werden, wenn sie mit TMA-basierter Pipettenlösung gefüllt werden (TMA für Tetramethylammoniumhydroxid, Tabelle 4).
7. Vorinkubieren Sie Deckgläser (5 mm Durchmesser, 0,1 mm Dicke) mit 0,1% Gelatine, um die Mitoplast-Adhäsion zu reduzieren, und spülen Sie sie mit der KCl-Badelösung (Tabelle 5) ab, bevor Sie die Mitoplast-Suspension abscheiden.
8. Bereiten Sie eine Rohverdünnung vor, indem Sie ~ 35 μL der konzentrierten Mitoplastsuspension mit 500 μL der KCl-Badelösung mischen (Tabelle 5) und legen Sie sie auf Deckgläser, die zuvor in einer Vertiefung einer 4-Well-Platte platziert wurden.
9. 15 bis 20 Minuten auf Eis inkubieren, damit Mitoplasten auf dem Deckglas sedimentieren können.
10. Füllen Sie die Badekammer vollständig mit ~50 μL der KCl-Badelösung (Tabelle 5).
11. Übertragen Sie ein Deckglas mit Mitoplasten innerhalb der Kammer mit einer dünnen Mikrodissektionspinzette mit einer gebogenen Spitze.
12. Ordnen Sie das Deckglas am Boden der Kammer an. Durchbluten Sie die Kammer nicht, um die Mitoplasten auf dem Deckglas stabil zu halten.
13. Wählen Sie einen individuellen nicht klebenden Mitoplast in Form von 8, indem Sie das Deckglas unter dem Mikroskop mit einem 60-fachen Objektiv scannen.
14. Beladen Sie die Pipette mit der Pipettenlösung (~50 μL) und legen Sie sie in den Pipettenhalter.
15. Bringen Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator in die Badlösung und nähern Sie sich ihr direkt über dem ausgewählten Mitoplasten, um sich dem IMM zu nähern. Das Verstärkerprogramm gibt den Widerstand der Pipette an, sobald sie sich in der Badlösung befindet. Halten Sie das Membranpotential bei 0 mV und wenden Sie 10 mV-Impulse mit dem Membrantestbefehl im Verstärkerprogramm an.
16. Üben Sie einen leichten Unterdruck aus, um mit dem IMM schnell eine Gigaseal zu erstellen (Abbildung 2B).
17. Heben Sie die Pipette mit dem Mitoplast an, um sie vom Deckglas fernzuhalten, um den Dichtungsbruch aufgrund der Pipettendrift während des Experiments zu vermeiden.
18. Kompensieren Sie die Streukapazitätstransienten mit dem Befehl "Membrantest" im Verstärkerprogramm, bevor Sie die Gesamt-Mitoplast-Konfiguration testen, um nach dem Einbruch eine korrekte Kapazitätsmessung (Cm) für die Mtironenmembran zu erhalten.
19. Wenden Sie kurzzeitige (5-15 ms) Spannungsimpulse (250-600 mV) mit dem Verstärkerprogramm an, um das Membranpflaster unter der Glaspipette zu brechen und die Gesamt-Mitoplast-Konfiguration zu erreichen (Abbildung 2C). Der erfolgreiche Einbruch spiegelt sich im Wiederauftreten von Kapazitätstransienten wider.
20. Passen Sie nach dem Einbruch die Kapazitätstransienten mit der Membrantestoption des Verstärkerprogramms an, um die Membrankapazität (die die Größe des Mitoplasts widerspiegelt) und seinen Zugangswiderstand Ra (der die Qualität der Gesamt-Mitoplast-Konfiguration widerspiegelt) zu beurteilen. Nach dem Einbruch sollte Ra zwischen 40 und 80 MΩ liegen. Mitoplasten (2-6 μm groß), die für Patch-Clamp-Experimente verwendet werden, haben typischerweise Membrankapazitäten von 0,5-1,1 pF.
21. Ersetzen Sie unmittelbar nach dem Einbruch die KCl-Badelösung (Tabelle 5) durch die HEPES-Badelösung (Tabelle 6), indem Sie die Perfusion starten.
22. Wenden Sie ein 850-ms-Rampenprotokoll an, das mit dem Verstärkerprogramm entwickelt wurde, von -160 mV bis +100 mV mit einem Intervall von 5 s, während Sie den Mitoplast bei 0 mV halten. Dieses Protokoll funktioniert für UCP1 ^6,7,15- und AAC ^5-Studien (Abbildung 4 und Abbildung 5).
    HINWEIS: Für UCP1- und AAC-abhängige H⁺ -Strommessungen wird empfohlen, alle elektrophysiologischen Daten bei 10 kHz zu erfassen und bei 1 kHz mit geeigneter Software zu filtern, die den Verstärker und den Digitizer antreibt.

Representative Results

Die Entwicklung der Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wird, lieferte die erste direkte Untersuchung des H ^{+ -} Lecks durch das IMM und die dafür verantwortlichen mitochondrialen Transporter UCP1 und AAC. Die elektrophysiologische Analyse von UCP1- und AAC-abhängigen H⁺ -Leckagen kann einen ersten Blick auf die thermogene Kapazität von Mitochondrien werfen. Im Abschnitt "Ergebnisse" werden die Standardverfahren zur Messung von H^+- Lecks über UCP1 und AAC beschrieben.

UCP1-abhängige H⁺-Strommessung (Abbildung 4)^6,7,15
Die Anwendung des Spannungsrampenprotokolls induziert einen H⁺-Strom mit großer Amplitude über das IMM von braunem Fett ohne Zugabe von exogenen Fettsäuren (FA), den erforderlichen Aktivatoren von UCPs (Abbildung 4A). Dies ist eine spezifische Eigenschaft von braunem und beigem Fett IMM aufgrund der lokalen Produktion von FA durch eine mit der Membran verbundene Phospholipase-Aktivität. Wenn sich der H^+-Strom als Reaktion auf das Rampenprotokoll entwickelt, ist es wichtig, darauf zu warten, dass sich die aktuelle Amplitude stabilisiert hat. Die Quantifizierung der H⁺ Stromamplitude über UCP1 erfordert die Bestimmung der Basislinie, die einem Null-UCP1-Strom entspricht. Sobald die Stabilität der H⁺-Stromamplitude erreicht ist, wird empfohlen, entweder den UCP1-Inhibitor Guanosindiphosphat (GDP - 1 mM, Abbildung 4A) oder einen FA-Chelator (0,5% FA-freies Rinderserumalbumin, nicht gezeigt) oder 10 mM Methyl-Beta-Cyclodextrin (MβCD) für die endogene Membran-FA-Extraktion, Abbildung 4B, schwarze Spur) zu perfundieren. Der Fehlerstrom ist der Strom, aus dem die Amplitude der UCP1-Ströme bestimmt wird. Um den Vergleich der Amplituden von UCP1-Strömen in verschiedenen Mitoplasten zu erleichtern, wird die Stromdichte (pA/pF) jedes Mitoplasten berechnet, indem die UCP1-Ströme mit der Mtopistenkapazität (Cm)^5,7 normalisiert werden. Der Strom kann durch Zugabe von exogenem langkettigem FA unter Verwendung von Arachidonsäure (AA) oder Ölsäure (OA) (1-2 μM) reaktiviert werden. Da sowohl braune als auch beige Fett-IMMs PLA2-Aktivität besitzen, werden endogene Membran-FAs innerhalb weniger Minuten nach dem Waschen des MβCD/Albumins aus dem Bad teilweise regeneriert, was zu einer Reaktivierung des H^+-Stroms über UCP1 ^6,7 führt. Erwartungsgemäß verschwindet dieser Strom im IMM von UCP1-^/- Mäusen vollständig (Abbildung 4A)^6,7.

Eine genauere Möglichkeit, die Dichte und Aktivität von UCP1 verschiedener Mitoplasten desselben Gewebes oder von Mitoplasten aus verschiedenen Geweben (braunes und beiges Fett) zu vergleichen, besteht darin, die FA-Konzentration an der Oberfläche des IMM ^6,7 zu kontrollieren. Tatsächlich könnte die H+-Stromamplitude zwischen Mitoplasten aufgrund der UCP1-Proteinmenge pro IMM^, aber auch aufgrund der Produktion von endogenem FA variieren. Daher wird empfohlen, endogenes FA aus dem IMM zu extrahieren und UCP1-abhängigen H⁺-Strom durch Zugabe von exogenem FA in bekannter Konzentration zu reaktivieren. Dazu müssen zunächst endogene FAs aus dem IMM extrahiert werden, indem eine HEPES-Badelösung (Tabelle 6) mit 10 mM MβCD durchblutet wird. Um dann die Reaktivierung des H+-Stroms über UCP1 nur durch eine genaue Konzentration exogener FAs zu ermöglichen, werden letztere auf einem HEPES/^{MβCD-Hintergrund} durchblutet, um kontinuierlich aus dem IMM produzierte FAs zu extrahieren.

Die Untersuchung der Konkurrenz zwischen dem Purinnukleotid und FA zur Bindung an UCP1 ist auch mit der Patch-Clamp-Technik ^6,7,15 möglich. Die Hemmung von UCP1 durch Purinnukleotide (z. B. Mg²⁺-freies ATP) kann mit zwei verschiedenen Konzentrationen von FA (idealerweise 10-fach) verglichen werden. Dazu werden zunächst endogene Membran-FA durch Auftragen von 10 mM MβCD entfernt (Abbildung 4B, schwarze Spur). Die Anwendung von exogenen FAs (z.B. werden hier nur 0,5 mM FAs gezeigt), die auf einem Hintergrund von 10 mM MβCD angewendet werden, ermöglicht eine präzise Kontrolle der Konzentration aktivierender FAs, da lokal produzierte FAs sofort aus der Membran extrahiert werden. In diesem Zustand sind exogene FAs in erster Linie für die Entwicklung des H^+-Stroms verantwortlich. Anschließend werden der OA/MβCD-Lösung unterschiedliche ATP-Konzentrationen hinzugefügt, um das IC50-ATP für jede getestete FA-Konzentration zu bewerten und somit festzustellen, ob FA mit Purinnukleotiden um die Bindung an UCP1 konkurriert.

AAC-abhängige H⁺-Strommessung (Abbildung 5)5
Im Gegensatz zu braunem Fett entwickelt das IMM von Nicht-Fettgewebe wie Skelettmuskulatur und Herz nicht unmittelbar nach dem Einbruch ein messbares H⁺ (Abbildung 5, schwarze Spuren). Um einen messbaren H⁺ -Strom durch AAC zu induzieren, ist es wichtig, die HEPES-Badelösung (Tabelle 6) aufzutragen, die 1-2 μM exogenes FA enthält (AA, Abbildung 5A, rote Spur). Dies kann darauf hindeuten, dass das IMM von Nicht-Fettgewebe keine FA-Produktionsmaschinerie in das IMM hat, wie es im IMM von braunen und beigefarbenen Fetten vorkommt.

Die Basislinie (oder Nullstrom) für die Quantifizierung der H+ Stromamplitude mittels AAC entspricht der ^{HEPES-Badlösung} (Tabelle 6), die vor der Zugabe von FA auf der Oberfläche des IMM perfundiert wurde. Um zu bestätigen, dass der gemessene H+^-Strom von AAC übertragen wird, ist es wichtig, spezifische Inhibitoren von AAC anzuwenden, die zu FA hinzugefügt werden, 1 μM Carboxyatractylosid (CATR, Abbildung 5A) oder 4 μM Bonkgrekinsäure (BKA, nicht gezeigt)⁵, die den H^+-Strom fast vollständig hemmen. Dieser Strom verschwindet vollständig im IMM von AAC1-^/- Mäusen (Abbildung 5A), wobei AAC1 die vorherrschende Isoform im Herzen⁵ ist.

Auch die Patch-Clamp-Analyse der Wechselwirkung zwischen FA-abhängigem H⁺-Leck und Nukleotiden ist mit AAC⁵ möglich. Es gibt jedoch einen wichtigen Unterschied zwischen AAC und UCP1: AAC trägt nicht nur H +, sondern seine Hauptfunktion besteht darin^, die Adeninnukleotide ADP und ATP²¹ zu transportieren. Um zu untersuchen, wie sich der Adeninnukleotidaustausch auf das FA-abhängige H+-Leck auswirkt, wird der Pipettenlösung 1 mM^{Mg 2+}-freies ADP zugesetzt. Dann werden FA durchsucht, um H ⁺ Strom über AAC zu aktivieren. Nur ADP in der Pipettenlösung stört nicht den H⁺ Strom⁵. Sobald eine stabile H⁺ Stromamplitude erreicht ist, wird ADP gleichzeitig mit FA perfundiert. Nur wenn ADP auf beiden Seiten der Membran vorhanden ist, um einen aktiven Nukleotidaustausch über AAC zu erzeugen, wird eine konstante, aber nie vollständige Hemmung des H^+-Lecks erreicht (Abbildung 5B). Dies kann darauf hindeuten, dass die beiden Verkehrsträger AAC (FA-H+ Strom- und ADP/^{ATP-Austausch}) miteinander konkurrieren und wahrscheinlich über denselben Translokationsweg stattfinden werden. Der ADP/ADP-Homoaustausch wurde ausgewählt, um den zusätzlichen Strom zu vermeiden, der mit dem physiologischen ADP/ATP-Heteroaustausch verbunden ist⁵.

Abbildung 1: Mitochondriale Energieverteilung zwischen Wärme- und ATP-Produktion. Mechanismen der mitochondrialen ATP- und Wärmeproduktion. Mitochondrien haben zwei Membranen [das OMM (lila) und das IMM (orange)], die die Maschinen für die ATP- und Wärmeerzeugung enthalten. Das ETC erzeugt einen elektrochemischen Gradienten von H+ über das IMM, der von der ^ATP-Synthase (AS) zur Erzeugung von ATP und von UCPs zur Wärmeerzeugung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Mitochondriale Patch-Clamp-Technik (modifiziert von Bertholet et al. 2020)¹⁵. (A) Mitochondrien werden aus Gewebelysat durch Zentrifugation isoliert (OMM in Lila und IMM in Orange). (B) Die französische Niederdruckpresse bricht das OMM auf, um das IMM freizusetzen, das einen Mitoplast ergibt. Das linke Feld zeigt ein Mitoplast, das eine 8-förmige Form annimmt, wobei Reste des OMM am IMM befestigt sind. Eine Glaspipette nähert sich dem IMM, um eine Gigaohm-Dichtung zu bilden (Mitoplast-Befestigungskonfiguration). Ein Foto der an Mitoplast befestigten Konfiguration ist im rechten Bereich zu sehen. (C) Die Konfiguration des Gesamt-IMM (Diagramm in der linken Tafel) wird erhalten, nachdem das Membranfeld unter der Pipette durch mehrere Spannungsimpulse (200-500 mV) gebrochen wurde. Ein Foto der gesamten IMM-Konfiguration wird im rechten Bereich angezeigt. Zuströme (I, rot) sind negativ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: French Press und elektrophysiologischer Aufbau. (A) Bild von French Press, das hilft, das OMM zu brechen, um das IMM freizugeben. (B) Bild eines Faradayschen Käfigs, eines inversen Mikroskops mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC), eines 60-fachen Wassertauchobjektivs, einer Schwingungsisolationstabelle und eines Mikromanipulators. Der Standardverstärker, ein Standard-Digitizer und der PC-Computer sind im Bild nicht zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: H+-Strom über UCP1 in braunem Fett. (A) Repräsentativer UCP1-abhängiger H⁺-Strom, aufgezeichnet von braunen Fettmitoplasten, isoliert von WT- (oberes Panel) und UCP1−^/−-Mäusen (unteres Panel). Die schwarz dargestellten Kontroll-H+-Stromspuren entsprechen der stabilisierten Stromamplitude nach Bruch des IMM^. 1 mM GDP wird dann der Badelösung (orange) hinzugefügt. Das Spannungsrampenprotokoll ist über den WT-Leiterbahnen dargestellt. Der pH-Wert der Bad- und Pipettenlösungen ist im Pipetten-Mitoplast-Diagramm dargestellt. (B) Hemmung von UCP1 durch Purinnukleotide in braunem Fett. Repräsentative UCP1-abhängige H⁺ Stromspuren in verschiedenen Konzentrationen von ATP auf der zytosolischen Oberfläche des IMM von braunem Fett von Mäusen bei Thermoneutralität. Der UCP1-abhängige H⁺-Strom wurde mit 0,5 mM Ölsäure (OA) gemischt mit 10 mM MβCD aktiviert.Das Spannungsprotokoll ist oben angegeben. Im unteren Bereich wird die gleiche Spur dargestellt, aber nicht mit der Mitoplastmembrankapazität normalisiert. Der braune Fettmitoplast in dieser Abbildung hatte eine Membrankapazität von 0,624 pF. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: FA-abhängiger H⁺-Strom über AAC im Herzmitoplasten. (A) Repräsentativer AAC-abhängiger H⁺-Strom, wenn er 2 μM AA in der Badlösung (oberes Feld, orange) in WT-Herzmitoplasten angelegt und durch 1 μM CATR (violett) gehemmt wird. Repräsentative Spuren, die in AAC1−^/− Herzmitoplast aufgezeichnet wurden, befinden sich im unteren Bereich. Der Steuerstrom ist schwarz. Das Spannungsrampenprotokoll ist über den WT-Leiterbahnen dargestellt. Der pH-Wert der Bad- und Pipettenlösungen ist im Pipetten-Mitoplast-Diagramm dargestellt. (B) Während Pipettenlösung 1 mM ADP enthielt, wird der AAC-abhängige H⁺-Strom durch 2 μM AA (orange) induziert und durch Zugabe von 1 mM ADP zum Bad (violett) gehemmt. Das Spannungsrampenprotokoll wird über der Ablaufverfolgung angezeigt. Der pH-Wert der Bad- und Pipettenlösungen ist im Pipetten-Mitoplast-Diagramm dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 

Reagenz	Endkonzentration
Saccharose	250 mM
HEPES	10 mM
EGTA	1 mM
pH-Wert mit TrisBase auf 7,2 eingestellt

Tabelle 1: Mitochondrialer Isolationspuffer (Tonizität ~ 300 mmol pro kg)

Reagenz	Endkonzentration
Saccharose	140 mM
D-Mannitol	440 mM
HEPES	10 mM
EGTA	1 mM
pH-Wert mit TrisBase auf 7,2 eingestellt

Tabelle 2: Hyperton-Mannitol-Puffer

Reagenz	Endkonzentration
Kcl	750 mM
HEPES	20 mM
EGTA	1 mM
pH-Wert mit TrisBase auf 7,2 eingestellt

Tabelle 3: Hypertonischer KCl-Puffer

Reagenz	Endkonzentration
Tma	130 mM
HEPES	100 mM
EGTA	1 mM
MgCl2 für UCP1-Aufnahmen	2 mM
oder
TrisCl für AAC-Aufnahmen
pH-Wert eingestellt auf 7,0 oder 7,5 mit D-Gluconsäure

Tabelle 4: TMA-basierte Pipettenlösung (Tonizität ~ 360 mmol pro kg)

Reagenz	Endkonzentration
Kcl	150 mM
HEPES	10 mM
EGTA	1 mM
pH-Wert mit TrisBase auf 7,0 eingestellt

Tabelle 5: KCl-Badelösung (Tonizität ~ 300 mmol pro kg)

Reagenz	Endkonzentration
Saccharose	100 mM für UCP1-Aufnahmen
	oder
	150 mM für AAC-Aufnahmen
HEPES	150 mM für UCP1-Aufnahmen
	oder
	100 mM für AAC-Aufnahmen
1 mM EGTA
pH-Wert mit TrisBase auf 7,0 eingestellt

Tabelle 6: HEPES-Badlösung (Tragfähigkeit ~ 300 mmol pro kg)

Discussion

Dieser Methodenartikel zielt darauf ab, die Patch-Clamp-Technik vorzustellen, die kürzlich auf Mitochondrien angewendet wurde, einen neuen Ansatz zur direkten Untersuchung von H ^{+ -}Leck durch das IMM, das für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich ist 5,6,7,15. Diese Technik ist nicht auf Gewebe beschränkt und kann auch zur Analyse von H + -Lecks und anderen Leitwerten des IMM in verschiedenen Standardmodellen für Menschen und Zellen wie HAP1, COS7, C2C12 und ^MEF-Zellen verwendet werden. Jede mitochondriale Isolierung erfordert jedoch einige Neueinstellungen, die für jeden Zell- oder Gewebetyp spezifisch sind.

Die Hauptschritte bei der direkten Messung von H⁺ Strömen durch das IMM von braunem Fett ^5,6 und dem Herzen⁵ werden hier zusammengefasst, um die Mechanismen zu veranschaulichen^, die für die mitochondriale Thermogenese in spezialisierten thermogenen und nicht-adipositasen ^Geweben verantwortlich sind. Tatsächlich ermöglicht die Entwicklung dieser Technik zum ersten Mal eine hochauflösende Funktionsanalyse der beiden wichtigsten UCPs (UCP1 und AAC) in ihrer nativen Membranumgebung mit präziser Kontrolle kritischer experimenteller Bedingungen wie: 1) pH-Wert von Pipetten- und Badlösungen, 2) Kontrolle des Membranpotentials über das IMM und 3) präzise Zusammensetzung von Lösungen, um andere Ionen und Metaboliten als H ⁺ auszuschließen. Die TMA-basierten Pipetten- (Tabelle 4) und HEPES-Badlösungen (Tabelle 6) sind so formuliert, dass sie H⁺-Ströme aufzeichnen und nur Salze enthalten, die sich in große Anionen und Kationen dissoziieren, die normalerweise für das IMM undurchlässig sind. Während die Badlösung mit einem Perfusionssystem gewechselt werden kann, so dass verschiedene Behandlungen auf die zytosolische Seite der Membran angewendet werden können, ist es nicht möglich, die Zusammensetzung der Intrapipettenlösung zu ändern. Dies schränkt das Verständnis der Regulationsmechanismen ein, die auf der Matrixseite auftreten. In der Tat müssen Verbindungen zum Zeitpunkt des Befüllens der Pipette in der Intrapipettenlösung vorhanden sein. Daher kann H⁺ Leck isoliert von anderen Strömen untersucht werden. Pharmakologische Studien und die Verwendung von KO-Mäusen waren für die Charakterisierung und Identifizierung der Proteine, die für den H^+-Strom verantwortlich sind, durch das IMM verschiedener Gewebe^{unerlässlich 5,6,7}. Diese Ergebnisse zeigten, dass UCP1 der Haupt-UCP von braunem und beigem Fett und AAC in Nicht-Fettgewebe ist. Wir können die Möglichkeit der Existenz anderer H^+-Ströme, die nicht durch UCP1 und AAC vermittelt werden, nicht vollständig ausschließen. Wenn jedoch andere H ⁺ -Ströme vorhanden sind, lag ihre Amplitude außerhalb der Auflösung unseres elektrophysiologischen Aufbaus. Wir messen nicht das H ⁺ -Pumpen des ETC unter den in diesem Papier beschriebenen Bedingungen. Sobald wir die gesamte IMM-Konfiguration erreicht haben, wird die mitochondriale Matrix durch Perfusion der Intrapipettenlösung ausgewaschen. Der Intermembranraum existiert seit dem Schritt, das OMM mit der French Press zu brechen, nicht mehr. Es wurden keine Substrate der Atemwegskomplexe hinzugefügt, die für das H^+-Pumpen durch das ETC entscheidend sind. Es ist daher unwahrscheinlich, dass sich unter den hier beschriebenen elektrophysiologischen Bedingungen ein aktives H^+-Pumpen entwickelt.

Einkanalaufnahmen von ausgeschnittenen Patches werden in diesem Artikel nicht beschrieben. Obwohl UCP1- und AAC-abhängige H⁺ -Ströme über das IMM aufgrund ihrer hohen Proteindichte robust sind, konnten die einkanaligen Öffnungen nicht aufgelöst werden, da die Amplitude der UCP1- und AAC-Einheitsströme wahrscheinlich zu klein ist.

Im Gegensatz zu biochemischen Studien muss die in diesem Artikel beschriebene mitochondriale Isolierung nicht zu einem hohen Grad an mitochondrialer Reinheit führen. Tatsächlich wird das mitochondriale Präparat, das aus einer Vielzahl von individualisierten Mitoplasten und Zelltrümmern besteht, unter dem Mikroskop gescannt, um einen 8-förmigen Mitoplast zum Patchen zu finden. Die 8-förmige Form des Mitoplast ist auf die Freisetzung des IMM durch ein Loch im OMM zurückzuführen, das durch das französische Pressverfahren verursacht wurde (Abbildung 2). Der weniger dichte Lappen entspricht dem IMM^15,17. Ein geeignetes Präparat kann durch frei bewegliche Mitoplasten definiert werden, die leicht von Zelltrümmern unterschieden werden können. Es ist jedoch wichtig, die Anzahl der Ablagerungen zu reduzieren, um eine Kontamination des IMM zu vermeiden, die die Qualität der Dichtung der Glaspipette mit der Membran beeinträchtigen kann. Dieser Rasterschritt unter dem Mikroskop ermöglicht es, einen Mitoplast mit hoher IMM-Integrität zu wählen, der von einem weniger dichten Lappen als dem durch das OMM abgegrenzten erkannt wird, und erhöht somit die Chancen auf einen erfolgreichen Einbruch.

Diese Technik ermöglichte erstmals die direkte Messung von UCP1- und AAC-abhängigen H⁺ -Strömen innerhalb ihrer nativen Membran. Mitochondriale Integrität und Kompartimentierung existieren jedoch aufgrund des Bruchs des OMM und wahrscheinlich des Cristae nicht mehr. Es ist daher wichtig, die Patch-Clamp-Analyse mit anderen klassischen Methoden wie der mitochondrialen Atmung zu ergänzen, um die physiologische Rolle neu charakterisierter Proteine in intakten Mitochondrien zu bestätigen.

Die Patch-Clamp-Technik, die auf Mitochondrien angewendet wird, bietet neue Möglichkeiten, die molekularen Mechanismen, die für das mitochondriale H^+- Leck und die Thermogenese verantwortlich sind, besser zu verstehen. In Kombination mit modernen zellulären und molekularen Techniken wird dieser innovative Ansatz neue Einblicke in die Mechanismen liefern, die die thermogene Kapazität von Mitochondrien steuern und wie sie zur Bekämpfung von Krankheiten im Zusammenhang mit mitochondrialen Dysfunktionen eingesetzt werden können.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253