Summary
מאמר שיטה זה מפרט את השלבים העיקריים במדידת דליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית באמצעות טכניקת הידוק טלאי, גישה חדשה לחקר היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה.
Abstract
תרמוגנזה מיטוכונדריאלית (הידועה גם בשם uncoupling מיטוכונדריאלי) היא אחד היעדים המבטיחים ביותר להגדלת הוצאות האנרגיה כדי להילחם בתסמונת המטבולית. רקמות תרמוגניות כגון שומנים חומים ובז 'מפתחות מיטוכונדריה מיוחדת מאוד לייצור חום. מיטוכונדריה של רקמות אחרות, המייצרות בעיקר ATP, ממירות גם הן עד 25% מכלל ייצור האנרגיה המיטוכונדרית לחום ולכן יכולות להשפיע באופן ניכר על הפיזיולוגיה של הגוף כולו. תרמוגנזה מיטוכונדריאלית לא רק חיונית לשמירה על טמפרטורת הגוף, אלא גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה ומפחיתה את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להגן על התאים מפני נזק חמצוני. מאחר שתרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת מרכזי של חילוף החומרים התאי, הבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למאבק בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. חשוב לציין שהמנגנונים המולקולריים המדויקים השולטים בהפעלה חריפה של תרמוגנזה במיטוכונדריה מוגדרים בצורה גרועה. מחסור זה במידע נובע במידה רבה ממחסור בשיטות למדידה ישירה של חלבונים שאינם מתחברים. ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיית מהדקי טלאים המיושמת על המיטוכונדריה אפשרה, לראשונה, את המחקר הישיר של התופעה במקור התרמוגנזה המיטוכונדרית, דליפת H+ דרך ה-IMM, ואת האפיון הביופיזי הראשון של מובילי מיטוכונדריה האחראים לכך, את החלבון הלא-משתף פעולה 1 (UCP1), ספציפי לשומנים חומים ובז', ואת טרנספורטר ADP/ATP (AAC) לכל הרקמות האחרות. גישה ייחודית זו תספק תובנות חדשות על המנגנונים השולטים בדליפת H+ ובתרמוגנזה מיטוכונדריאלית וכיצד ניתן למקד אותם כדי להילחם בתסמונת המטבולית. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית הידוק הטלאים המיושמת על המיטוכונדריה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית שלהן על ידי מדידה ישירה של זרמי H+ באמצעות ה-IMM.
Introduction
המיטוכונדריה מפורסמים בהיותם תחנת הכוח של התא. ואכן, הם המקור העיקרי לאנרגיה כימית, ATP. מה שפחות ידוע הוא כי המיטוכונדריה גם לייצר חום. למעשה, כל מיטוכונדריה מייצרת כל הזמן את שני סוגי האנרגיות (ATP וחום) ואיזון עדין בין שתי צורות האנרגיה מגדיר הומאוסטזיס של תאים מטבוליים (איור 1). כיצד המיטוכונדריה מפיצה אנרגיה בין ATP לחום היא ללא ספק השאלה הבסיסית ביותר בתחום הביו-אנרגיה, אם כי היא עדיין לא ידועה במידה רבה. אנו כן יודעים שהגדלת ייצור החום המיטוכונדריאלי (הנקראת תרמוגנזה מיטוכונדריאלית), וכתוצאה מכך הפחתת ייצור ה-ATP מגדילה את ההוצאה האנרגטית וזו אחת הדרכים הטובות ביותר להילחם בתסמונת מטבולית1.
תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מקורה בדליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית (IMM), מה שמוביל לניתוק של חמצון המצע וסינתזת ATP עם ייצור כתוצאה מכך של חום, ומכאן השם "uncoupling המיטוכונדריאלי"1 (איור 1). דליפה זו של H+ תלויה במובילים מיטוכונדריאליים הנקראים חלבונים לא משתפים פעולה (UCPs). UCP1 היה ה-UCP הראשון שזוהה. זה בא לידי ביטוי רק ברקמות תרמוגניות, שומן חום, ושומן בז 'שבו המיטוכונדריה מתמחים בייצור חום 2,3,4. הזהות של UCP ברקמות שאינן שומן כגון שרירי השלד, הלב והכבד, נותרה שנויה במחלוקת. המיטוכונדריה ברקמות אלה יכולה להיות כ -25% מכלל האנרגיה המיטוכונדרית המומרת לחום, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על הפיזיולוגיה של כל הגוף1. מלבד שמירה על טמפרטורת הגוף הבסיסית, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה על ידי הפחתת קלוריות. בנוסף, הוא מפחית את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) על ידי מיטוכונדריה כדי להגן על תאים מפני נזק חמצוני1. לפיכך, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מעורבת בהזדקנות תקינה, בהפרעות ניווניות הקשורות לגיל ובמצבים אחרים המערבים עקה חמצונית, כגון איסכמיה-רפרפוזיה. לכן, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת רב עוצמה של חילוף החומרים התאי, והבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תקדם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות כדי להילחם בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
נשימה מיטוכונדריאלית הייתה הטכניקה הראשונה שחשפה את התפקיד המכריע של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית בחילוף החומרים התאי והיא עדיין הפופולרית ביותר בקהילה1. טכניקה זו מבוססת על מדידת צריכת החמצן על ידי שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETC) הגוברת כאשר מופעלת דליפת H+ מיטוכונדריאלית. טכניקה זו, למרות שהיא אינסטרומנטלית, אינה יכולה לחקור באופן ישיר דליפת H+ מיטוכונדריאלית על פני IMM1, ובכך הופכת את הזיהוי והאפיון המדויקים של החלבונים האחראים לכך לקשה, במיוחד ברקמות שאינן שומן שבהן ייצור החום הוא משני בהשוואה לייצור ATP. לאחרונה, הפיתוח של טכניקת הידוק הטלאי המיושמת על המיטוכונדריה, סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ על פני כל ה-IMM ברקמות שונות 5,6,7.
מהדק הטלאים המיטוכונדריאלי של כל ה-IMM הוקם לראשונה בצורה ניתנת לשחזור על ידי Kirichok et al.8. הם תיארו את המדידה הישירה הראשונה של זרמי חד-פורטר סידן מיטוכונדריאלי (MCU) בשנת 2004 באמצעות מיטופלסטים מקווי תאים COS-78. מאוחר יותר, מעבדת קיריצ'וק הראתה זרמי סידן מהודעות מיידיות של רקמות עכבר9 ודרוזופילה 9. מעבדות אחרות משתמשות כיום באופן שגרתי בטכניקה זו כדי לחקור את התכונות הביופיזיות של MCU 10,11,12,13,14. ניתוח מדבקת IMM שלם של מוליכות אשלגן וכלוריד אפשרי גם הוא והוזכר במספר מאמרים אך עדיין לא היה הנושא העיקרי של פרסום 6,7,9. המדידה הראשונה של זרמי H+ ברחבי ה-IMM דווחה בשנת 2012 ממיטוכונדריה6 של שומן חום עכבר, וממיטוכונדריה של שומן בז' בעכבר בשנת 20177. זרם זה נובע מחלבון ה-uncoupling הספציפי של רקמות תרמוגניות, UCP1 6,7. עבודות שפורסמו לאחרונה בשנת 2019 אפיינו את AAC כחלבון העיקרי האחראי לדליפת H+ מיטוכונדריאלית ברקמות שאינן שומן כגון הלב ושרירי השלד5.
גישה ייחודית זו מאפשרת כעת ניתוח פונקציונלי ישיר ברזולוציה גבוהה של תעלות היונים המיטוכונדריה והמובילים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. כדי להקל על הרחבת השיטה ולהשלים מחקרים אחרים כגון נשימה מיטוכונדריאלית, מתואר להלן פרוטוקול מפורט למדידת זרמי H+ הנישאים על ידי UCP1 ו- AAC. שלושה שלבים חשובים מתוארים: 1) בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום עכברי כדי לנתח זרם H+ תלוי UCP1 ובידוד מיטוכונדריאלי מהלב כדי לנתח זרם H+ תלוי AAC, 2) הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של הממברנה המיטוכונדרית החיצונית (OMM), 3) הקלטות מהדק טלאי של זרמי UCP1 ו-H+ התלויים ב-AAC על פני כל ה-IMM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסוייים בבעלי חיים שבוצעו תואמים את הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (IACUC).
הערה: הליך הבידוד המיטוכונדריאלי מבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית ומשתנה מעט מרקמה לרקמה. לדוגמה, מכיוון שרקמת השומן החום עשירה מאוד בשומנים, היא דורשת צעד נוסף כדי להפריד בין פסולת תאים ואברונים לבין שלב השומנים לפני קצירת המיטוכונדריה. כדי למנוע בלבול, שני הליכי הבידוד המיטוכונדריאליים (אחד מהשומן החום והשני מהלב) מפורטים להלן.
1. בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום בין-סקפולרי של עכברים (שונה מ-Bertholet et al. 2020)15
- המתת עכבר זכר C57BL/6 באמצעות חנק CO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, כפי שהומלץ על ידי פאנל האיגוד הווטרינרי האמריקאי וועדת IACUC.
- לאחר מיקום העכבר עם בטנו מול השולחן, יש לרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער (שונה מ- Mann et al., 2014)16.
- בצעו חתך של 2 ס"מ בגב העליון לאחר שתפסו את העור בפינצטה.
- הוציאו את השומן הבין-סקפולרי החום של העכבר המתאים לאיבר בעל שתי אונות עם צורת פרפר16.
- מעבירים את השומן החום לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ במילוי 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) שהונח בעבר על קרח.
- נקו את השומן החום מהשומן הלבן מתחת למשקפת.
- מעבירים את השומן החום לכוס של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) כדי לחתוך אותו לחתיכות דקות. העברה להומוגנייזר זכוכית 10 מ"ל מקורר קרח (חומר פלסטי פוליטטראפלואורואתילן (PTFE) מזיקים).
- השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניות של הרקמה החתוכה מראש על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים לדקה.
- צנטריפוגה ההומוגנאט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C ב 4 °C ב 15 מ"ל צינור חרוטי קר כקרח. יש להשליך את ה-supernatant המכיל את שלב השומנים.
- החיזרו את הכדור ב-5 מ"ל של חיץ בידוד קר כקרח (טבלה 1) והומוגניזציה, בפעם השנייה, את ההשעיה על הקרח עם שש משיכות איטיות במהירות של 275 סיבוב לדקה.
- מעבירים את ההומוגנאט בצינור חרוטי קר כקרח של 15 מ"ל וצנטריפוגות שלו ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לכדור את כל הגרעינים והתאים הלא שבורים.
- אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מ"ל והניחו אותו על קרח.
- צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C כדי לקבל גלולה המכילה מיטוכונדריה.
- גלולת Resuspend המכילה מיטוכונדריה ב-3.8 מ"ל של חיץ היפרטוני-מניטול קר כקרח (טבלה 2) ומדגירה את התרחיף המיטוכונדריה על קרח למשך 10-15 דקות.
2. בידוד מיטוכונדריאלי מלב העכבר (שונה מ- Garg et al. 2019)17
- המתת עכבר זכר C57BL/6 באמצעות חנק CO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, כפי שהומלץ על ידי פאנל האיגוד הווטרינרי האמריקאי וועדת IACUC.
- לאחר הצבת העכבר על גבו, יש לרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער. לאחר מכן, בצע חתך של 2 ס"מ על בית החזה לאחר אחיזת העור בפינצטה.
- נתחו את הלב מהחזה של החיה ושטפו אותו כדי להסיר את כל הדם בכוס של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של תמיסת הבידוד הקר (טבלה 1).
- לאחר שהלב נוקה מעקבות של דם, העבירו אותו לכוס נוספת של 10 מ"ל המכילה 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) כדי לקצוץ אותו לחתיכות דקות. לאחר מכן, העבר להומוגנייזר זכוכית 10 מ"ל מקורר קרח (הדברת PTFE).
- השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניות של הרקמה החתוכה מראש על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים לדקה.
- מעבירים את ההומוגנאט לצינור חרוטי קר כקרח של 15 מ"ל וצנטריפוגות שלו ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לגרעיני כדוריות ולתאים לא שבורים.
- אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מ"ל והניחו אותו על קרח.
- צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C כדי לקבל גלולה המכילה מיטוכונדריה.
- בצעו שימוש חוזר בכדור המיטוכונדריאלי ב-3.8 מ"ל של חיץ היפרטוני-מניטול קר כקרח (טבלה 2) והדגירו את התרחיף המיטוכונדריאלי על קרח למשך 10-15 דקות.
3. הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של ה- OMM.
הערה: הליך העיתונות הצרפתית מאפשר לשחרר את ה-IMM מה-OMM כאשר שלמותו נשמרת, כולל המטריצה וה-crista (איור 2)18. המיטוכונדריה מודגרת מראש במאגר היפרטוני-מניטול (טבלה 2) ונתונה ללחץ נמוך יותר במהלך הליך העיתונות הצרפתית כדי למנוע כל מתיחה דרסטית של ה-IMM כאשר ה-OMM נקרע.
- מלאו את תרחיף המיטוכונדריה-היפרטוני-מניטול לתוך תא לחץ מיני מקורר (קוטר בוכנה 3/8 אינץ') של העיתונות הצרפתית (איור 3A).
- בחר את מצב Medium של העיתונות הצרפתית ודחס את המתלים דרך תא הלחץ המיני ב-110 בחוגה של העיתונות הצרפתית עבור המיטוכונדריה של השומן החום וב-140 עבור המיטוכונדריה של הלב (כ-2,000 psi). ודאו שהמתלים יוצאים מתא הלחץ הזעיר בקצב של כ-1 טיפה לשנייה.
- אסוף את הטיפות בצינור חרוטי מצונן קרח של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את המתלים ב 10,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
- בצעו שימוש חוזר בכדור המיטופלסטים ב-0.5-2 מ"ל של חיץ היפרטוני-KCl קר כקרח (טבלה 3) ואחסנו את ההשעיה על קרח.
הערה: שומן חום ומיטופלסטים של לב מוכנים להקלטות מהדקי טלאים וצריכים להישאר שמישים במשך כ-3-6 שעות.
4. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של דליפת H+ דרך UCP1 ו-AAC 5,7,15
הערה: השתמש במערך האלקטרופיזיולוגי הבא (איור 3B): מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות התאבכות דיפרנציאלית (DIC), 60x מטרת טבילת מים, טבלת בידוד רטט וכלוב פאראדיי, מגבר סטנדרטי התומך בהקלטות רעש נמוך, דיגיטציה סטנדרטית המשמשת להתקנה אלקטרופיזיולוגית, pClamp 10, מיקרומניפולטור, אלקטרודת ייחוס אמבטיה (3 M KCl-agar גשר מלח שהוכנס בתוך מחזיק מיקרואלקטרודה המכיל כדור כלוריד כסוף/כסוף מעוצב לתוך גוף המחזיק (המתואר ב- Liu et al. 2021)19, תא פרפוזיה עם תחתית כיסוי זכוכית 0.13 מ"מ, המחובר למערכת פרפוזיה הניזונה מכוח הכבידה.
- משוך את חוטי הזכוכית הבורוסיליקטים ביום ההקלטה באמצעות מושך מיקרופיפט. הגדר תוכנית על המושך המשמש ליצירת פיפטות עם רמה גבוהה של שכפול20.
הערה: תכנון תוכנית זה דורש מספר ניסיונות להשיג פיפטות המותאמות למהדק התיקון של IMM. לפיפטה סטנדרטית יש קצוות עדינים עם צורה חרוטית מתקדמת. - הכנס חוט זכוכית אחד בתוך המושך ומשך כדי להשיג כמעט שתי פיפטות טלאי זהות מחוט בורוסיליקט אחד.
- התאם את התוכנית כאשר פיפטות הופכות להיות לא עקביות בין מחזורי משיכה עקב הזדקנות של חוט תיבת החימום של המושך.
- מקמו את הפיפטה בתוך מלטש הפיפטה והניחו את הקצה ליד החוט מתחת להגדלה של פי 100 כדי ללטש אותו.
- לחץ על דוושת כף הרגל מספר פעמים כדי לחמם את החוט מבלי לסתום או לפגוע בעקומת הקצה.
- פיפטות פולניות עם התנגדות בין 25 ל-35 MΩ מתקבלות כאשר הן מתמלאות בתמיסת פיפטה מבוססת TMA (TMA עבור טטרה-מתילמוניום הידרוקסיד, טבלה 4).
- קדם-דגירה של כיסויים (קוטר 5 מ"מ, עובי 0.1 מ"מ) עם 0.1% ג'לטין כדי להפחית את הידבקות המיטופלסט ולשטוף אותם בתמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) לפני הפקדת תרחיף המיטופלסט.
- מכינים דילול גולמי על ידי ערבוב של כ-35 μL של תרחיף המיטופלסט המרוכז עם 500 μL של תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) ומניחים אותה על כיסויים שהונחו בעבר בבאר של צלחת בעלת 4 בארות.
- דגירה על קרח במשך 15 עד 20 דקות עבור מיטופלסטים למשקעים על הכיסוי.
- מלאו את תא האמבטיה לחלוטין בכ-50 μL של תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5).
- העבר כיסוי עם מיטופלסטים בתוך התא באמצעות פינצטה מיקרו-דיסקטיבית דקה עם קצה כפוף.
- מסדרים את הכיסוי בתחתית החדר. אין להחדיר את החדר כדי לשמור על יציבות המיטופלסטים על הכיסוי.
- בחר מיטופלסט בודד שאינו דבק בצורת 8 על ידי סריקת הכיסוי מתחת למיקרוסקופ עם מטרה של פי 60.
- טענו את הפיפטה בתמיסת הפיפטה (כ-50 μL) והניחו אותה במחזיק הפיפטה.
- הביאו את הפיפטה לתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור והתקרבו אליה ממש מעל המיטופלסט שנבחר כדי להתקרב ל-IMM. תוכנית המגבר נותנת את ההתנגדות של הפיפטה ברגע שהיא בתמיסת האמבטיה. החזק את פוטנציאל הממברנה ב- 0 mV והחיל פולסים של 10 mV באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר.
- הפעילו לחץ שלילי קל כדי ליצור במהירות ג'יגאזאל עם ה-IMM (איור 2B).
- הגבירו את הפיפטה עם המיטופלסט המחובר כדי להרחיק אותם מהכיסוי כדי למנוע את שבירת האטמים עקב סחף הפיפטה במהלך הניסוי.
- הפיצו את חולפי הקיבולים המשוטטים באמצעות הפקודה "בדיקת ממברנה" בתוכנית המגבר לפני בדיקת תצורת המיטופלסט כולו כדי לקבל מדידת קיבוליות (Cm) נכונה עבור קרום המיטופלסט לאחר הפריצה.
- החל פולסים של מתח קצר-טווח (5-15 אלפיות השנייה) (250-600 mV) עם תוכנית המגבר כדי לקרוע את תיקון הממברנה מתחת לפיפטת הזכוכית ולהשיג את תצורת המיטופלסט השלמה (איור 2C). פריצה מוצלחת משתקפת על ידי הופעתם המחודשת של ארעי הקיבול.
- לאחר הפריצה, התאם את ארעי הקיבול עם אפשרות בדיקת הממברנה של תוכנית המגבר כדי להעריך את קיבוליות הממברנה (המשקפת את גודל המיטופלסט) ואת התנגדות הגישה שלו Ra (המשקפת את איכות תצורת המיטופלסט השלם). לאחר הפריצה, Ra צריך להיות בין 40 ל 80 MΩ. למיטופלסטים (בגודל 2-6 מיקרומטר) המשמשים לניסויים בהידוק טלאי יש בדרך כלל קיבוליות ממברנה של 0.5-1.1 pF.
- מיד לאחר הפריצה, החליפו את תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) בתמיסת האמבטיה HEPES (טבלה 6) על ידי הפעלת הזלוף.
- החל פרוטוקול רמפה של 850 אלפיות השנייה שתוכנן עם תוכנית המגבר, החל מ-160 mV- ועד +100 mV עם מרווח של 5 שניות, תוך החזקת המיטופלסט ב-0 mV. פרוטוקול זה עובד עבור מחקרי UCP1 6,7,15 ו-AAC5 (איור 4 ואיור 5).
הערה: מומלץ למדידות זרם H+ תלויות UCP1 ו-AAC לרכוש את כל הנתונים האלקטרופיזיולוגיים ב-10 קילוהרץ ולסנן ב-1 קילוהרץ באמצעות תוכנה מתאימה המניעה את המגבר והדיגיטציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיתוח מתודולוגיית הידוק התיקון המיושמת על המיטוכונדריה סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ דרך ה-IMM והמובילים המיטוכונדריים, UCP1 ו-AAC, האחראים לכך. הניתוח האלקטרופיזיולוגי של דליפות H+ תלויות UCP1 ו-AAC יכול לספק מבט ראשון על היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה. סעיף התוצאות מתאר את ההליכים הסטנדרטיים למדידת דליפת H+ באמצעות UCP1 ו-AAC.
מדידת זרם H+ תלוית UCP1 (איור 4)6,7,15
יישום פרוטוקול רמפת המתח גורם לזרם H+ בעל משרעת גדולה על פני ה-IMM של שומן חום ללא תוספת של חומצות שומן אקסוגניות (FA), המפעילים הנדרשים של UCPs (איור 4A). זהו מאפיין ספציפי של IMM שומן חום ובז 'בשל הייצור המקומי של FA על ידי פעילות פוספוליפאז הקשורה לממברנה. כאשר זרם H+ מתפתח בתגובה לפרוטוקול הרמפה, חשוב להמתין עד שהמשרעת הנוכחית תתייצב. כימות משרעת זרם H+ באמצעות UCP1 דורש קביעת הבסיס המתאים לזרם UCP1 אפס. ברגע שמגיעים ליציבות משרעת הזרם H+, מומלץ לחדור או למעכב UCP1 גואנוזין דיפוספט (תמ"ג - 1 mM, איור 4A) או לכלטור FA (0.5% אלבומין סרום בקר ללא FA, לא מוצג) או 10 mM מתיל בטא ציקלודקסטרין (MβCD) עבור מיצוי FA של הממברנה האנדוגנית, איור 4B, עקבות שחורים). הזרם השיורי הוא הזרם שממנו תיקבע המשרעת של זרמי UCP1. כדי לסייע בהשוואת המשרעת של זרמי UCP1 במיטופלסטים שונים, צפיפות הזרם (pA/pF) של כל מיטופלסט מחושבת על ידי נרמול זרמי UCP1 עם קיבוליות המיטופלסט (Cm)5,7. הזרם יכול להיות מופעל מחדש על ידי תוספת של FA שרשרת ארוכה אקסוגנית באמצעות חומצה ארכידונית (AA) או חומצה אולאית (OA) (1-2 μM). מאחר שגם ל-IMMs של שומן חום וגם לשומן בז' יש פעילות PLA2, FAs של הממברנה האנדוגנית מתחדשים חלקית תוך מספר דקות מרגע שטיפת ה-MβCD/אלבומין מהאמבטיה, מה שמוביל להפעלה מחדש של זרם H+ באמצעות UCP1 6,7. כצפוי, זרם זה נעלם לחלוטין ב-IMM של עכברי UCP1-/- (איור 4A)6,7.
דרך מדויקת יותר להשוות את הצפיפות והפעילות של UCP1 של מיטופלסטים שונים של אותה רקמה או של מיטופלסטים מרקמות שונות (שומן חום ובז ') היא לשלוט בריכוז FA על פני השטח של IMM 6,7. ואכן, משרעת זרם H+ עשויה להשתנות בין מיטופלסטים בשל כמות החלבון UCP1 לכל IMM, אך גם בשל ייצור FA אנדוגני. לפיכך, מומלץ לחלץ FA אנדוגני מה-IMM ולהפעיל מחדש את זרם H+ התלוי ב-UCP1 על ידי הוספת FA אקסוגני בריכוז ידוע. לשם כך, יש לחלץ תחילה FAs אנדוגניים מה-IMM על ידי יצירת תמיסת אמבט HEPES (טבלה 6) המכילה 10 mM MβCD. לאחר מכן, כדי לאפשר הפעלה מחדש של זרם H+ באמצעות UCP1 על ידי ריכוז מדויק בלבד של FAs אקסוגניים בלבד, האחרון יוחדר מחדש על רקע HEPES/MβCD כדי לחלץ ברציפות FAs המיוצרים מה-IMM.
המחקר של התחרות בין נוקלאוטיד פורין ו FA על קשירת UCP1 אפשרי גם עם טכניקת הידוק טלאי 6,7,15. ניתן להשוות עיכוב של UCP1 על ידי נוקלאוטידים פורינים (למשל, ATP נטול Mg2+) לשני ריכוזים שונים של FA (באופן אידיאלי פי 10). לשם כך, FA של קרום אנדוגני מוסר לראשונה על ידי החלת 10 mM MβCD (איור 4B, עקבות שחורים). יישום של FAs אקסוגניים (למשל, כאן, רק 0.5 mM FAs מוצגים) המיושם על רקע של 10 mM MβCD מאפשר שליטה מדויקת על ריכוז הפעלת FAs מכיוון ש- FAs המיוצרים באופן מקומי מופקים מיד מהממברנה. במצב זה, FAs אקסוגניים אחראים בעיקר על התפתחות זרם H+ . ריכוזים שונים של ATP מתווספים לאחר מכן לפתרון OA/MβCD כדי להעריך אתה-IC50 ATP עבור כל ריכוז FA שנבדק וכך, לקבוע אם FA מתחרה בנוקלאוטידים פורינים על קשירת UCP1.
מדידת זרם H+ תלוית AAC (איור 5)5
בניגוד לשומן חום, ה-IMM של רקמות שאינן שומן, כגון שרירי השלד והלב, אינו מפתח H+ הניתן למדידה מיד לאחר הפריצה (איור 5, עקבות שחורים). כדי לגרום לזרם H+ הניתן למדידה באמצעות AAC, חיוני ליישם את תמיסת האמבטיה HEPES (טבלה 6) המכילה 1-2 μM של FA אקסוגני (AA, איור 5A, עקבות אדומים). זה עשוי להצביע על כך של- IMM של רקמות שאינן שומן אין מנגנון ייצור FA לתוך ה- IMM כפי שנמצא ב- IMM של שומנים חומים ובז '.
הבסיס (או זרם האפס) לכימות משרעת זרם H+ באמצעות AAC מתאים לתמיסת האמבטיה HEPES (טבלה 6) המחוררת על פני השטח של ה-IMM לפני הוספת FA. כדי לאשר שזרם H+ שנמדד נישא על ידי AAC, חשוב ליישם מעכבים ספציפיים של AAC שנוספו ל-FA, 1 μM של קרבוקסיטרקטילוזיד (CATR, איור 5A) או 4 μM של חומצה בונקצ'רקית (BKA, לא מוצגת)5, אשר מעכבים כמעט לחלוטין את זרם H+ . זרם זה נעלם לחלוטין ב-IMM של עכברי AAC1-/-( איור 5A), AAC1 הוא האיזופורם השולט בלב5.
ניתוח מהדקי תיקון של האינטראקציה בין דליפת H+ תלוית FA לבין נוקלאוטידים אפשרי גם עם AAC5. עם זאת, יש הבדל חשוב בין AAC ל- UCP1: AAC לא רק נושא H+ אלא שתפקידו העיקרי הוא להעביר נוקלאוטידים אדנין ADP ו- ATP21. כדי לחקור כיצד חילופי נוקלאוטידים של אדנין משפיעים על דליפת H+ תלוית FA, 1 mM Mg2+ללא ADP מתווסף לתמיסת הפיפטה. לאחר מכן, FA הם perfused כדי להפעיל H + זרם באמצעות AAC. רק ADP בתמיסת הפיפטה אינו מפריע לזרם H+ 5. ברגע שמגיעים לאמפליטודת זרם H+ יציבה, ADP מתכלה בו-זמנית עם FA. רק כאשר ADP נמצא משני צידי הממברנה כדי ליצור חילופי נוקלאוטידים פעילים באמצעות AAC, הושגה עיכוב קבוע אך לעולם לא מלא של דליפת H+ (איור 5B). הדבר עשוי להצביע על כך ששני מצבי ההובלה של AAC (זרם FA-H+ ובורסת ADP/ATP) מתחרים וסביר להניח שיתרחשו באמצעות אותו מסלול טרנסלוקציה. ה-homoexchange של ADP/ADP נבחר כדי להימנע מהזרם הנוסף הקשור להטרו-אקסצ'אנג5 של ADP/ATP פיזיולוגי.
איור 1: התפלגות אנרגיה מיטוכונדריאלית בין חום לייצור ATP. מנגנונים של ATP מיטוכונדריאלי וייצור חום. למיטוכונדריה יש שתי ממברנות [OMM (סגול) ו-IMM (כתום)], המכילות את המנגנונים לייצור ATP וחום. ה- ETC יוצר גרדיאנט אלקטרוכימי של H+ על פני ה- IMM, המשמש את ה- ATP synthase (AS) לייצור ATP ומשמש את UCPs ליצירת חום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: טכניקת הידוק טלאי מיטוכונדריאלי (שונה מ-Bertholet et al. 2020)15. (A) מיטוכונדריה מבודדות מליאסט רקמה על ידי צנטריפוגה (OMM בסגול ו-IMM בכתום). (B) עיתונות צרפתית בלחץ נמוך קורעת את ה-OMM כדי לשחרר את ה-IMM שנותן מיטופלסט. לוח שמאלי מייצג מיטופלסט, המניח צורה בצורת 8 עם שרידים של ה-OMM המחוברים ל-IMM. פיפטה מזכוכית מתקרבת ל-IMM כדי ליצור חותם ג'יגאוהם (תצורה המחוברת למיטופלסט). תמונה של התצורה המחוברת למיטופלסט מוצגת בלוח הימני. (C) התצורה של ה- Whole-IMM (דיאגרמה בלוח השמאלי) מתקבלת לאחר שבירת תיקון הממברנה מתחת לפיפטה על ידי מספר פעימות מתח (200-500 mV). תמונה של כל תצורת IMM מוצגת בלוח הימני. זרמים פנימיים (I, אדום) הם שליליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: עיתונות צרפתית ומערך אלקטרופיזיולוגי. (A) תמונה של העיתונות הצרפתית, המסייעת לקרוע את ה- OMM כדי לשחרר את ה- IMM. (B) תמונה של כלוב פאראדיי, מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות התאבכות דיפרנציאלית (DIC), מטרת טבילת מים פי 60, טבלת בידוד רטט ומיקרומניפולטור. המגבר הסטנדרטי, הדיגיטציה הסטנדרטית ומחשב המחשב אינם מוצגים בתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: זרם H+ דרך UCP1 בשומן חום. (A) זרם H+ תלוי UCP1 מייצג שתועד ממיטופלסט שומן חום שבודד מ-WT (פאנל עליון) ומ-UCP1−/− עכברים (פאנל תחתון). עקבות זרם H+ הבקרה המוצגים בשחור תואמים את משרעת הזרם המיוצב לאחר שה-IMM נשבר. 1 mM תמ"ג מתווסף לאחר מכן לתמיסת האמבטיה (כתום). פרוטוקול רמפת המתח מוצג מעל עקבות WT. ה-pH של תמיסות האמבטיה והפיפטה מוצגות בתרשים פיפטה-מיטופלסט. (ב) עיכוב של UCP1 על ידי נוקלאוטידים פורין בשומן חום. זרם H+ מייצג התלוי ב-UCP1 עוקב אחר ריכוזים שונים של ATP על פניו הציטוזוליות של ה-IMM של השומן החום של עכברים בתרמונוטרליות. זרם H+ תלוי UCP1 הופעל עם חומצה אולאית 0.5 mM (OA) מעורבב עם 10 mM MβCD.פרוטוקול המתח מצוין בחלק העליון. בלוח התחתון, אותו עקבה מיוצג אך לא מנורמל עם קיבוליות קרום המיטופלסט. למיטופלסט השומן החום באיור זה היה קיבוליות קרום של 0.624 pF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: זרם H+ תלוי FA באמצעות AAC במיטופלסט לב. (A) זרם H+ מייצג התלוי ב-AAC כאשר הוא מוחל על 2 μM AA בתמיסת האמבטיה (לוח עליון, כתום) במיטופלסטים של לב WT ומעוכב על ידי 1 μM CATR (סגול). עקבות מייצגים שנרשמו ב-AAC1 −/− מיטופלסט לב נמצאים בפאנל התחתון. זרם השליטה הוא בשחור. פרוטוקול רמפת המתח מוצג מעל עקבות WT. ה-pH של תמיסות האמבטיה והפיפטה מוצגות בתרשים פיפטה-מיטופלסט. (B) בעוד שתמיסת פיפטה הכילה 1 mM ADP, זרם H+ תלוי AAC מושרה על ידי 2 μM AA (כתום) ומעוכב על ידי תוספת של 1 mM ADP לאמבטיה (סגול). פרוטוקול רמפת המתח מוצג מעל העקבה. ה-pH של תמיסות האמבטיה והפיפטה מוצגות בתרשים פיפטה-מיטופלסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מגיב | ריכוז סופי |
| סוכרוז | 250 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 מ"מ |
| pH מותאם ל- 7.2 עם TrisBase |
טבלה 1: מאגר בידוד מיטוכונדריאלי (טוניק ~ 300 מילימול לק"ג)
| מגיב | ריכוז סופי |
| סוכרוז | 140 mM |
| D-מניטול | 440 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 מ"מ |
| pH מותאם ל- 7.2 עם TrisBase |
טבלה 2: חיץ היפרטוני-מניטול
| מגיב | ריכוז סופי |
| KCl | 750 mM |
| HEPES | 20 mM |
| EGTA | 1 מ"מ |
| pH מותאם ל- 7.2 עם TrisBase |
טבלה 3: מאגר היפרטוני-KCl
| מגיב | ריכוז סופי |
| ת"א | 130 mM |
| HEPES | 100 mM |
| EGTA | 1 מ"מ |
| MgCl2 עבור הקלטות UCP1 | 2 מ"מ |
| או | |
| TrisCl עבור הקלטות AAC | |
| pH מותאם ל-7.0 או 7.5 עם חומצה D-גלוקונית |
טבלה 4: תמיסת פיפטה מבוססת TMA (טוניקה ~ 360 מילימול לק"ג)
| מגיב | ריכוז סופי |
| KCl | 150 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 מ"מ |
| pH מותאם ל- 7.0 עם TrisBase |
טבלה 5: תמיסת אמבט KCl (טוניקה ~ 300 מילימול לק"ג)
| מגיב | ריכוז סופי |
| סוכרוז | 100 mM עבור הקלטות UCP1 |
| או | |
| 150 mM להקלטות AAC | |
| HEPES | 150 mM עבור הקלטות UCP1 |
| או | |
| 100 mM להקלטות AAC | |
| 1 mM EGTA | |
| pH מותאם ל- 7.0 עם TrisBase |
טבלה 6: תמיסת אמבטיה HEPES (טוניקות ~ 300 מילימול לק"ג)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר שיטה זה נועד להציג את טכניקת מהדק הטלאי שיושמה לאחרונה על המיטוכונדריה, גישה חדשה לחקר ישיר של דליפת H+ דרך ה-IMM האחראית על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית 5,6,7,15. טכניקה זו אינה מוגבלת לרקמות וניתן להשתמש בה גם כדי לנתח דליפת H+ ומוליכות אחרות של ה-IMM במודלים סטנדרטיים שונים של בני אדם ותאים כגון תאי HAP1, COS7, C2C12 ו-MEF. עם זאת, כל בידוד מיטוכונדריאלי דורש כמה התאמות ספציפיות לכל תא או סוג רקמה.
השלבים העיקריים במדידה הישירה של זרמי H+ דרך IMM של שומן חום 5,6 והלב5 מסוכמים כאן כדי להמחיש את המנגנונים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית ברקמות תרמוגניות מיוחדות ולא שומן. ואכן, פיתוח טכניקה זו מאפשר לראשונה ניתוח פונקציונלי ברזולוציה גבוהה של שני ה- UCPs העיקריים (UCP1 ו- AAC) בסביבת הממברנה המקורית שלהם עם שליטה מדויקת בתנאי ניסוי קריטיים כגון: 1) pH של תמיסות פיפטה ואמבטיה, 2) שליטה בפוטנציאל הממברנה על פני ה- IMM, ו- 3) הרכב מדויק של פתרונות כדי לא לכלול את כל היונים והמטבוליטים החדירים ל- IMM מלבד H +. תמיסות הרחצה המבוססות על TMA (טבלה 4) ו-HEPES (טבלה 6) מנוסחות כדי לרשום זרמי H+ ומכילות רק מלחים שמתנתקים לאניונים וקטיונים גדולים שבדרך כלל אטומים ל-IMM. אמנם ניתן לשנות את תמיסת האמבטיה באמצעות מערכת פרפוזיה, המאפשרת להחיל טיפולים שונים על הצד הציטוזולי של הממברנה, אך לא ניתן לשנות את הרכב תמיסת האינטרפיפט. זה מגביל את ההבנה של מנגנוני הרגולציה המתרחשים בצד המטריצה. ואכן, תרכובות חייבות להיות קיימות בתוך תמיסת האינטרפיפטה בזמן מילוי הפיפטה. לכן, ניתן לחקור דליפת H+ בבידוד של זרמים אחרים. מחקרים פרמקולוגיים ושימוש בעכברי KO היו חיוניים לאפיון וזיהוי של החלבונים האחראים לזרם H+ באמצעות IMM של רקמות שונות 5,6,7. תוצאות אלה קבעו כי UCP1 הוא ה-UCP העיקרי של שומן חום ובז', ו-AAC ברקמות שאינן שומן. איננו יכולים לשלול לחלוטין את האפשרות לקיומם של זרמי H+ אחרים שאינם מתווכים על ידי UCP1 ו- AAC. עם זאת, אם קיימים זרמי H+ אחרים, המשרעת שלהם הייתה מעבר לרזולוציה של המערך האלקטרופיזיולוגי שלנו. איננו מודדים שאיבת H+ של ה- ETC בתנאים המתוארים במאמר זה. לאחר שהגענו לתצורת ה-IMM השלמה, המטריצה המיטוכונדרית נשטפת החוצה על ידי זלוף של תמיסת ה-intra-pipette. החלל הבין-ממדי אינו קיים עוד מאז השלב של שבירת ה-OMM עם העיתונות הצרפתית. לא נוספו מצעים של מתחמי הנשימה החיוניים לשאיבת H+ דרך ה-ETC. לכן לא סביר לפתח שאיבה פעילה של H+ בתנאים האלקטרופיזיולוגיים המפורטים כאן.
הקלטות ערוץ יחיד של טלאים שנכרתו אינן מתוארות במאמר זה. למרות שזרמי H+ התלויים ב-UCP1 וב-AAC ברחבי ה-IMM חזקים בשל צפיפות החלבון הגבוהה שלהם, לא ניתן היה לפתור את הפתחים החד-ערוציים מכיוון שהאמפליטודה של הזרמים היחידניים UCP1 ו-AAC כנראה קטנה מדי.
בניגוד למחקרים ביוכימיים, הבידוד המיטוכונדריאלי המתואר במאמר זה אינו צריך לגרום לרמה גבוהה של טוהר מיטוכונדריאלי. ואכן, ההכנה המיטוכונדרית המורכבת משלל מיטופלסטים בודדים ופסולת תאים נסרקת תחת המיקרוסקופ כדי למצוא מיטופלסט אחד בצורת 8 לתיקון. הצורה בצורת 8 של המיטופלסט נובעת משחרור של ה-IMM דרך חור ב-OMM שנגרם על-ידי הליך העיתונות הצרפתית (איור 2). האונה הפחות צפופה מתאימה ל-IMM15,17. הכנה מתאימה יכולה להיות מוגדרת על ידי מיטופלסטים הנעים בחופשיות שניתן להבחין ביניהם בקלות לבין פסולת תאית. עם זאת, חשוב להפחית את מספר הפסולת כדי למנוע זיהום של ה- IMM, אשר יכול להשפיע על איכות האיטום של פיפטת הזכוכית עם הממברנה. שלב סריקה זה מתחת למיקרוסקופ מאפשר לבחור מיטופלסט עם שלמות IMM גבוהה המוכרת על ידי אונה פחות צפופה מזו המוגדרת על ידי ה- OMM ולכן מגדילה את הסיכויים לפריצה מוצלחת.
טכניקה זו סיפקה לראשונה את המדידה הישירה של זרמי H+ התלויים ב-UCP1 וב-AAC בתוך הממברנה הטבעית שלהם. עם זאת, שלמות מיטוכונדריאלית ומידור כבר לא קיימים בגלל הקרע של ה- OMM וכנראה גם ה- cristae. לכן חיוני להשלים את ניתוח המהדקים עם שיטות קלאסיות אחרות כגון נשימה מיטוכונדריאלית כדי לאשר את התפקיד הפיזיולוגי של חלבונים חדשים שאופיינו במיטוכונדריה שלמה.
טכניקת הידוק הטלאים המיושמת על המיטוכונדריה מציעה אפשרויות חדשות להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים האחראים לדליפת H+ מיטוכונדריאלית ולתרמוגנזה. בשילוב עם טכניקות תאיות ומולקולריות מודרניות, גישה חדשנית זו תספק תובנות חדשות על המנגנונים השולטים ביכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה וכיצד ניתן למקד אותם כדי להילחם במחלות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אני מודה לד"ר יורי קיריצ'וק על המדע הגדול שהייתי חלק ממנו במעבדתו ולחברי מעבדת קיריצ'וק על הדיונים המועילים. אני מודה גם לד"ר דאגלס ס. וואלאס על שסיפק עכברי נוקאאוט AAC1 . מימון: A.M.B נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של איגוד הלב האמריקאי 19CDA34630062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
- Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
- Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
- Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
- Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
- Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
- Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
- Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
- Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
- Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
- Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
- Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
- Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
- Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
- Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
- Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
- Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).
