Het gebruik van de patch-clamp-techniek om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen

Summary

Dit methodeartikel beschrijft de belangrijkste stappen in het meten van H ⁺ -lek over het binnenste mitochondriale membraan met de patch-clamp-techniek, een nieuwe benadering om de thermogene capaciteit van mitochondriën te bestuderen.

Abstract

Mitochondriale thermogenese (ook bekend als mitochondriale ontkoppeling) is een van de meest veelbelovende doelen voor het verhogen van het energieverbruik om het metabool syndroom te bestrijden. Thermogene weefsels zoals bruine en beige vetten ontwikkelen zeer gespecialiseerde mitochondriën voor warmteproductie. Mitochondriën van andere weefsels, die voornamelijk ATP produceren, zetten ook tot 25% van de totale mitochondriale energieproductie om in warmte en kunnen daarom een aanzienlijke invloed hebben op de fysiologie van het hele lichaam. Mitochondriale thermogenese is niet alleen essentieel voor het handhaven van de lichaamstemperatuur, maar voorkomt ook door voeding veroorzaakte obesitas en vermindert de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade. Aangezien mitochondriale thermogenese een belangrijke regulator is van het cellulaire metabolisme, zal een mechanistisch begrip van dit fundamentele proces helpen bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën om vele pathologieën geassocieerd met mitochondriale disfunctie te bestrijden. Belangrijk is dat de precieze moleculaire mechanismen die acute activering van thermogenese in mitochondriën regelen, slecht gedefinieerd zijn. Dit gebrek aan informatie is grotendeels te wijten aan een gebrek aan methoden voor de directe meting van ontkoppelende eiwitten. De recente ontwikkeling van patch-clamp methodologie toegepast op mitochondriën maakte voor het eerst de directe studie mogelijk van het fenomeen aan de oorsprong van mitochondriale thermogenese, H ⁺ lek door de IMM, en de eerste biofysische karakterisering van mitochondriale transporters die ervoor verantwoordelijk zijn, het ontkoppelende eiwit 1 (UCP1), specifiek van bruine en beige vetten, en de ADP / ATP-transporter (AAC) voor alle andere weefsels. Deze unieke aanpak zal nieuwe inzichten bieden in de mechanismen die H ⁺ -lekkage en mitochondriale thermogenese beheersen en hoe ze kunnen worden gericht op het bestrijden van het metabool syndroom. Dit artikel beschrijft de patch-clamp-methodologie die wordt toegepast op mitochondriën om hun thermogene capaciteit te bestuderen door H ^{+ -} stromen rechtstreeks te meten via de IMM.

Introduction

Mitochondriën staan bekend als de krachtpatser van de cel. Inderdaad, ze zijn de belangrijkste bron van chemische energie, ATP. Wat minder bekend is, is dat mitochondriën ook warmte genereren. In feite genereert elk mitochondrion constant de twee soorten energieën (ATP en warmte) en een fijne balans tussen de twee energievormen definieert metabole celhomeostase (figuur 1). Hoe mitochondriën energie verdelen tussen ATP en warmte is zeker de meest fundamentele vraag op het gebied van bio-energetica, hoewel het nog grotendeels onbekend is. We weten wel dat het verhogen van de mitochondriale warmteproductie (mitochondriale thermogenese genoemd) en bijgevolg het verminderen van de ATP-productie het energieverbruik verhoogt en dit is een van de beste manieren om het metabool syndroom te bestrijden¹.

Mitochondriale thermogenese is afkomstig van H⁺ lek over het binnenste mitochondriale membraan (IMM), wat leidt tot ontkoppeling van substraatoxidatie en ATP-synthese met daaruit voortvloeiende productie van warmte, vandaar de naam "mitochondriale ontkoppeling"¹ (figuur 1). Dit H⁺ lek is afhankelijk van mitochondriale transporters die ontkoppelende eiwitten (UCP's) worden genoemd. UCP1 was het eerste UCP dat werd geïdentificeerd. Het wordt alleen uitgedrukt in thermogene weefsels, bruin vet en beige vet waarin mitochondriën gespecialiseerd zijn voor warmteproductie ^2,3,4. De identiteit van UCP in niet-vetweefsels zoals skeletspieren, hart en lever is controversieel gebleven. Mitochondriën in deze weefsels kunnen ongeveer 25% van de totale mitochondriale energie omzetten in warmte, wat de fysiologie van het hele lichaam aanzienlijk kan beïnvloeden¹. Naast het handhaven van de kerntemperatuur van het lichaam, voorkomt mitochondriale thermogenese ook door voeding veroorzaakte obesitas door calorieën te verminderen. Bovendien vermindert het de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) door mitochondriën om cellen te beschermen tegen oxidatieve schade¹. Mitochondriale thermogenese is dus betrokken bij normale veroudering, leeftijdsgebonden degeneratieve aandoeningen en andere aandoeningen met oxidatieve stress, zoals ischemie-reperfusie. Daarom is mitochondriale thermogenese een krachtige regulator van cellulair metabolisme, en een mechanistisch begrip van dit fundamentele proces zal de ontwikkeling van therapeutische strategieën bevorderen om vele pathologieën geassocieerd met mitochondriale disfunctie te bestrijden.

Mitochondriale ademhaling was de eerste techniek die de cruciale rol van mitochondriale thermogenese in het cellulaire metabolisme onthulde en is nog steeds de meest populaire in de gemeenschap¹. Deze techniek is gebaseerd op het meten van het zuurstofverbruik door de mitochondriale elektronentransportketen (ETC) die toeneemt wanneer mitochondriaal H⁺ lek wordt geactiveerd. Deze techniek, hoewel instrumenteel, kan mitochondriaal H ⁺ -lek over de IMM¹ niet rechtstreeks bestuderen, waardoor de precieze identificatie en karakterisering van de eiwitten die ervoor verantwoordelijk zijn moeilijk wordt, met name in niet-vetweefsels waarin warmteproductie secundair is in vergelijking met ATP-productie. Onlangs leverde de ontwikkeling van de patch-clamp-techniek toegepast op mitochondriën de eerste directe studie van H ⁺ -lek over het hele IMM in verschillende weefsels ^5,6,7.

De mitochondriale patch-clamp van de hele IMM werd voor het eerst op een reproduceerbare manier vastgesteld door Kirichok et ^al.8. Ze beschreven de eerste directe meting van mitochondriale calcium uniporter (MCU) stromen in 2004 met behulp van mitoplasten uit COS-7 cellijnen⁸. Later toonde het Kirichok-lab calciumstromen van IMMS van muis⁹- en Drosophila-weefsels ⁹. Andere laboratoria gebruiken deze techniek nu routinematig om de biofysische eigenschappen van MCU 10,11,12,13,14 ^{te bestuderen}. Hele IMM patch-clamp analyse van kalium- en chloridegeleiding is ook mogelijk en is genoemd in verschillende artikelen, maar is nog niet het hoofdonderwerp geweest van een publicatie ^6,7,9. De eerste meting van H ⁺ -stromen over de IMM werd gerapporteerd in 2012 van muisbruine vet mitochondriën⁶ en van muisbeige vet mitochondriën in 2017⁷. Deze stroom is te wijten aan het specifieke ontkoppelingseiwit van thermogene weefsels, UCP1 ^6,7. Recent werk gepubliceerd in 2019 karakteriseerde OC als het belangrijkste eiwit dat verantwoordelijk is voor mitochondriaal H ⁺ -lek in niet-vetweefsels zoals het hart en de skeletspieren⁵.

Deze unieke aanpak maakt nu de directe hoge-resolutie functionele analyse mogelijk van de mitochondriale ionkanalen en transporters die verantwoordelijk zijn voor mitochondriale thermogenese. Om de uitbreiding van de methode te vergemakkelijken en andere studies zoals mitochondriale ademhaling aan te vullen, wordt hieronder een gedetailleerd protocol beschreven voor het meten van de H ⁺ -stromen die door UCP1 en AAC worden gedragen. Drie belangrijke stappen worden beschreven: 1) mitochondriale isolatie van muisbruin vet om UCP1-afhankelijke H ⁺ -stroom en mitochondriale isolatie van het hart te analyseren om AAC-afhankelijke H ⁺ -stroom te analyseren, 2) voorbereiding van mitoplasten met een Franse pers voor mechanische breuk van het buitenste mitochondriale membraan (OMM), 3) patch-clamp-opnames van UCP1- en AAC-afhankelijke H ⁺ -stromen over de hele IMM.

Protocol

Alle dierexperimentele procedures die werden uitgevoerd, voldoen aan de richtlijnen van de National Institutes of Health en zijn goedgekeurd door de University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

OPMERKING: De mitochondriale isolatieprocedure is gebaseerd op differentiële centrifugatie en varieert enigszins van weefsel tot weefsel. Omdat bruin vetweefsel bijvoorbeeld extreem rijk is aan lipiden, vereist het een extra stap om celresten en organellen van de lipidefase te scheiden voordat de mitochondriën worden geoogst. Om verwarring te voorkomen, worden de twee mitochondriale isolatieprocedures (een van het bruine vet en de andere van het hart) hieronder beschreven.

1. Mitochondriale isolatie van interscapulair bruin vet van muizen (gewijzigd van Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Euthanaseer C57BL /6 mannelijke muis met behulp van CO 2-verstikking en daaropvolgende cervicale dislocatie, zoals aanbevolen door het American Veterinary Medical Association Panel en het IACUC-comité.
2. Nadat je de muis met zijn buik naar de tafel hebt geplaatst, spuit je alcohol om het haar schoon te maken en nat te maken (aangepast van Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Maak een incisie van 2 cm in de bovenrug na het vastpakken van de huid met een pincet.
4. Extraheer het bruine interscapulaire vet van de muis dat overeenkomt met een tweelobbig orgaan met een vlindervorm¹⁶.
5. Breng het bruine vet over in een petrischaaltje van 35 mm gevuld met 5 ml koude-isolatiebuffer (tabel 1) die eerder op ijs is geplaatst.
6. Reinig het bruine vet van het witte vet onder een verrekijker.
7. Breng het bruine vet over in een bekerglas van 10 ml met 5 ml koude isolatiebuffer (tabel 1) om het in dunne stukjes te hakken. Breng over op de ijsgekoelde glazen homogenisator van 10 ml (kunststof polytetrafluorethyleen (PTFE) stamper).
8. Gebruik een bovengrondse roerder om het voorgesneden weefsel op ijs te homogeniseren met zes zachte slagen met een gecontroleerde snelheid van 275 rotaties / min.
9. Centrifugeer het homogenaat bij 8.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C in een ijskoude conische buis van 15 ml. Gooi het supernatant met de lipidefase weg.
10. Resuspend de pellet in 5 ml ijskoude isolatiebuffer (tabel 1) en homogeniseren, een tweede keer, de suspensie op ijs met zes langzame slagen met een snelheid van 275 rotatie / min.
11. Breng het homogenaat over in een ijskoude conische buis van 15 ml en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 700 x g om alle kernen en ongebroken cellen te pelleteren.
12. Verzamel het supernatant in een verse buis van 15 ml en plaats het op ijs.
13. Centrifugeer het supernatant bij 8.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om een pellet met mitochondriën te verkrijgen.
14. Resuspend pellet met mitochondriën in 3,8 ml ijskoude hypertonisch-mannitolbuffer (tabel 2) en incubeer de mitochondriale suspensie op ijs gedurende 10-15 minuten.

2. Mitochondriale isolatie van het muizenhart (gewijzigd van Garg et al. 2019)¹⁷

1. Euthanaseer C57BL /6 mannelijke muis met behulp van CO 2-verstikking en daaropvolgende cervicale dislocatie, zoals aanbevolen door het American Veterinary Medical Association Panel en het IACUC-comité.
2. Nadat je de muis op zijn rug hebt geplaatst, spray je alcohol om het haar schoon te maken en nat te maken. Maak vervolgens een incisie van 2 cm op de thorax nadat u de huid met een pincet hebt vastgepakt.
3. Ontleed het hart uit de borst van het dier en spoel het om al het bloed te verwijderen in een bekerglas van 10 ml met 5 ml koude-isolatieoplossing (tabel 1).
4. Zodra het hart is ontdaan van bloedsporen, breng het over naar een ander bekerglas van 10 ml met 5 ml koude-isolatiebuffer (tabel 1) om het in dunne stukjes te hakken. Breng vervolgens over in een ijsgekoelde glazen homogenisator van 10 ml (PTFE-stamper).
5. Gebruik een bovengrondse roerder om het voorgesneden weefsel op ijs te homogeniseren met zes zachte slagen met een gecontroleerde snelheid van 275 rotaties / min.
6. Breng het homogenaat over in een ijskoude conische buis van 15 ml en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 700 x g tot pelletkernen en ongebroken cellen.
7. Verzamel het supernatant in een verse buis van 15 ml en plaats het op ijs.
8. Centrifugeer het supernatant bij 8.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om een pellet met mitochondriën te verkrijgen.
9. Resuspend de mitochondriale pellet in 3,8 ml ijskoude hypertonisch-mannitolbuffer (tabel 2) en incubeer de mitochondriale suspensie op ijs gedurende 10-15 minuten.

3. Voorbereiding van mitoplasten met een Franse pers voor mechanische breuk van de OMM.

OPMERKING: De Franse persprocedure maakt het mogelijk dat de IMM wordt vrijgegeven van de OMM met behoud van zijn integriteit, inclusief de matrix en crista (figuur 2)¹⁸. Mitochondriën worden voorgeïncubeerd in een hypertonisch-mannitolbuffer (tabel 2) en onderworpen aan een lagere druk tijdens de Franse persprocedure om drastische uitrekking van de IMM te voorkomen wanneer de OMM wordt gescheurd.

1. Vul de mitochondriaal-hypertonische-mannitol-suspensie in een gekoelde minidrukcel (zuigerdiameter 3/8") van de Franse pers (figuur 3A).
2. Selecteer de mediummodus van de French Press en comprimeer de suspensie door de minidrukcel op 110 op de wijzerplaat van de French Press voor de bruinvette mitochondriën en op 140 voor de hart mitochondriën (~ 2.000 psi).  Zorg ervoor dat de suspensie uit de minidrukcel komt met een snelheid van ongeveer 1 druppel/s.
3. Verzamel de druppels in een 15 ml ijsgekoelde conische buis.
4. Centrifugeer de suspensie bij 10.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
5. Resuspend de mitoplastenkorrel in 0,5-2 ml ijskoude Hypertonic-KCl-buffer (tabel 3) en bewaar de suspensie op ijs.
   OPMERKING: Bruin vet en hart mitoplasten zijn klaar voor patch-clamp opnames en moeten bruikbaar blijven voor ongeveer 3-6 uur.

4. Elektrofysiologische opnames van H⁺ lek via UCP1 en AAC ^5,7,15

OPMERKING: Gebruik de volgende elektrofysiologische opstelling (figuur 3B): omgekeerde microscoop met differentieel interferentiecontrast (DIC), 60x waterdompelingsobjectief, trillingsisolatietafel en een kooi van Faraday, een standaardversterker die geluidsarme opnames ondersteunt, een standaard digitizer die wordt gebruikt voor elektrofysiologische opstelling, pClamp 10, een micromanipulator, badreferentieelektrode (3 M KCl-agar zoutbrug geplaatst in een micro-elektroderodehouder met een zilver/ zilverchloride pellet gegoten in het houderlichaam (beschreven in Liu et al. 2021)¹⁹, perfusiekamer met een glazen afdekvloer van 0,13 mm, verbonden met een door zwaartekracht gevoed perfusiesysteem.

1. Trek de filamenten van borosilicaatglas op de dag van opname met behulp van een micropipette-trekker. Stel een programma in op de trekker die wordt gebruikt voor het genereren van pipetten met een hoge mate van reproduceerbaarheid²⁰.
   OPMERKING: Dit programmaontwerp vereist verschillende pogingen om pipetten te verkrijgen die zijn geoptimaliseerd voor de IMM-patchklem. Een standaardpipet heeft fijne uiteinden met een progressieve conische vorm.
2. Plaats een glazen gloeidraad in de trekker en trek om bijna twee identieke patchpipeten uit één borosilicaatfilament te verkrijgen.
3. Pas het programma aan wanneer pipetten inconsistent worden tussen trekcycli als gevolg van veroudering van de gloeidraad van de verwarmingsdoos van de trekker.
4. Plaats de pipet in de pipetpolijster en plaats de punt in de buurt van de gloeidraad onder 100x vergroting om deze vuur te polijsten.
5. Druk meerdere keren op het voetpedaal om de gloeidraad te verwarmen zonder de tipcurve te verstoppen of te beschadigen.
6. Pipetten met een weerstand tussen 25 en 35 MΩ worden gepolijst totdat pipetten op basis van TMA (TMA voor tetramethylammoniumhydroxide, tabel 4) worden gevuld.
7. Voorincubeer coverslips (5 mm diameter, 0,1 mm dikte) met 0,1% gelatine om de adhesie van mitoplast te verminderen en spoel ze af met de KCl-badoplossing (tabel 5) voordat de mitoplast-suspensie wordt afgezet.
8. Bereid een ruwe verdunning door ~35 μL van de geconcentreerde mitoplast-suspensie te mengen met 500 μL van de KCl-badoplossing (tabel 5) en plaats deze op coverslips die eerder in een put van een 4-well plaat zijn geplaatst.
9. Incubeer op ijs gedurende 15 tot 20 minuten voor mitoplasten tot sediment op de deklip.
10. Vul de badkamer volledig met ~50 μL van de KCl-badoplossing (tabel 5).
11. Breng een coverslip met mitoplasten over in de kamer met behulp van een dun microdissectiepincet met een gebogen punt.
12. Schik de coverslip aan de onderkant van de kamer. Laat de kamer niet perfuseren om de mitoplasten stabiel op de deklip te houden.
13. Kies een individuele niet-klevende mitoplast in de vorm van 8 door de coverslip onder de microscoop te scannen met een 60x objectief.
14. Laad de pipet met de pipetoplossing (~50 μL) en plaats deze in de pipethouder.
15. Breng de pipet met een micromanipulator in de badoplossing en benader deze net boven de geselecteerde mitoplast om dicht bij de IMM te komen. Het versterkerprogramma geeft de weerstand van de pipet zodra deze in de badoplossing zit. Houd de membraanpotentiaal op 0 mV en pas 10 mV-pulsen toe met behulp van het membraantestcommando in het versterkerprogramma.
16. Oefen lichte onderdruk uit om snel een gigaseal te creëren met de IMM (figuur 2B).
17. Verhoog de pipet met de mitoplast bevestigd om ze uit de buurt van de afdekkingslip te houden om te voorkomen dat de afdichting breekt als gevolg van de pipetdrift tijdens het experiment.
18. Compenseer de verdwaalde capaciteitstransiënten met het commando "membraantest" in het versterkerprogramma voordat de hele mitoplastconfiguratie wordt getest om een correcte capaciteitsmeting (Cm) voor het mitoplastmembraan na de inbraak te verkrijgen.
19. Breng kortdurende (5-15 ms) spanningspulsen (250-600 mV) aan met het versterkerprogramma om de membraanpleister onder de glazen pipet te scheuren en de hele mitoplast-configuratie te bereiken (figuur 2C). Succesvolle inbraak wordt weerspiegeld door de terugkeer van capaciteitstransiënten.
20. Pas na de inbraak de capaciteitstransiënten aan met de membraantestoptie van het versterkerprogramma om de membraancapaciteit (die de grootte van de mitoplast weerspiegelt) en de toegangsweerstand Ra (die de kwaliteit van de hele mitoplast-configuratie weerspiegelt) te beoordelen. Na de inbraak moet Ra tussen de 40 en 80 MΩ zijn. Mitoplasten (2-6 μm groot) die worden gebruikt voor patchklemexperimenten hebben doorgaans membraancapaciteiten van 0,5-1,1 pF.
21. Vervang onmiddellijk na de inbraak de KCl-badoplossing (tabel 5) door de HEPES-badoplossing (tabel 6) door de perfusie te starten.
22. Pas een 850 ms rampprotocol toe dat is ontworpen met het versterkerprogramma, van -160 mV tot +100 mV met een interval van 5 s, terwijl u de mitoplast op 0 mV houdt. Dit protocol werkt voor UCP1 ^6,7,15 en AAC⁵ studies (Figuur 4 en Figuur 5).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen voor UCP1- en AAC-afhankelijke H⁺ -stroommetingen om alle elektrofysiologische gegevens bij 10 kHz te verkrijgen en op 1 kHz te filteren met behulp van adequate software die de versterker en digitizer aandrijft.

Representative Results

De ontwikkeling van de patch-clamp methodologie toegepast op mitochondriën leverde de eerste directe studie van H ⁺ lek door de IMM en de mitochondriale transporters, UCP1 en AAC, die ervoor verantwoordelijk zijn. De elektrofysiologische analyse van UCP1- en AAC-afhankelijke H⁺ -lekken kan een eerste blik werpen op de thermogene capaciteit van mitochondriën. De resultatensectie beschrijft de standaardprocedures voor het meten van H⁺ lekken via UCP1 en AAC.

UCP1-afhankelijke H⁺ stroommeting (figuur 4)^6,7,15
Toepassing van het voltage ramp protocol induceert een grote amplitude H⁺ stroom over de IMM van bruin vet zonder de toevoeging van exogene vetzuren (FA), de vereiste activatoren van UCP's (Figuur 4A). Dit is een specifiek kenmerk van bruin en beige vet IMM als gevolg van de lokale productie van FA door een fosfolipase-activiteit geassocieerd met het membraan. Wanneer de H⁺ stroom zich ontwikkelt als reactie op het rampprotocol, is het belangrijk om te wachten tot de huidige amplitude stabiliseert. Kwantificering van de H^+-stroomamplitude via UCP1 vereist de bepaling van de uitgangswaarde die overeenkomt met een nul-UCP1-stroom. Zodra de stabiliteit van de H⁺ stroomamplitude is bereikt, wordt aanbevolen om ofwel UCP1-remmer Guanosine-difosfaat (GDP - 1 mM, figuur 4A) of een FA-chelator (0,5% FA-vrij runderserumalbumine, niet getoond) of 10 mM Methyl Beta Cyclodextrine (MβCD) te perfuseren voor de endogene membraan FA-extractie, figuur 4B, zwart spoor). De reststroom is de stroom waaruit de amplitude van de UCP1-stromen wordt bepaald. Om de amplitudes van UCP1-stromen in verschillende mitoplasten te helpen vergelijken, wordt de stroomdichtheid (pA/pF) van elke mitoplast berekend door de UCP1-stromen te normaliseren met de mitoplastcapaciteit (Cm)^5,7. De stroom kan worden gereactiveerd door de toevoeging van exogene lange keten FA met arachidonzuur (AA) of oliezuur (OA) (1-2 μM). Aangezien zowel bruine als beige vet-IMM's PLA2-activiteit bezitten, worden endogene membraan-VA's gedeeltelijk geregenereerd binnen enkele minuten na het wassen van de MβCD / albumine uit het bad, wat leidt tot reactivering van de H ⁺ -stroom via UCP1 ^6,7. Zoals verwacht verdwijnt deze stroom volledig in de IMM van UCP1^-/- muizen (Figuur 4A)^6,7.

Een nauwkeurigere manier om de dichtheid en activiteit van UCP1 van verschillende mitoplasten van hetzelfde weefsel of van mitoplasten uit verschillende weefsels (bruin en beige vet) te vergelijken, is door de FA-concentratie aan het oppervlak van de IMM ^6,7 te regelen. Inderdaad, H ⁺ huidige amplitude kan variëren tussen mitoplasten als gevolg van de hoeveelheid UCP1-eiwit per IMM, maar ook als gevolg van de productie van endogene FA. Daarom wordt aanbevolen om endogene FA uit de IMM te extraheren en UCP1-afhankelijke H ⁺ -stroom te reactiveren door exogene FA toe te voegen in een bekende concentratie. Om dit te doen, moeten endogene VA's eerst uit de IMM worden geëxtraheerd door een HEPES-badoplossing (tabel 6) met 10 mM MβCD te perfuseren. Om vervolgens de reactivering van de H^+-stroom via UCP1 mogelijk te maken met slechts een precieze concentratie exogene VA's, zal deze laatste worden toegediend op een HEPES/MβCD-achtergrond om continu VA's te extraheren die uit de IMM zijn geproduceerd.

De studie van de concurrentie tussen het purinenucleotide en FA voor binding aan UCP1 is ook mogelijk met de patch-clamp techniek ^6,7,15. Remming van UCP1 door purinenucleotiden (bijv. Mg²⁺-vrije ATP) kan worden vergeleken met twee verschillende concentraties FA (idealiter 10-voudig). Voor dit doel worden endogene membraan FA eerst verwijderd door 10 mM MβCD aan te brengen (figuur 4B, zwart spoor). Toepassing van exogene VA's (hier wordt bijvoorbeeld slechts 0,5 mM VA's getoond) toegepast op een achtergrond van 10 mM MβCD maakt nauwkeurige controle van de concentratie van activerende VA's mogelijk omdat lokaal geproduceerde VA's onmiddellijk uit het membraan worden geëxtraheerd. In deze toestand zijn exogene VA's primair verantwoordelijk voor de ontwikkeling van de H ^{+ -}stroom. Verschillende concentraties ATP worden vervolgens toegevoegd aan de OA/MβCD-oplossing om de IC50_ATP voor elke geteste FA-concentratie te beoordelen en zo vast te stellen of FA concurreert met purinenucleotiden voor binding aan UCP1.

OC-afhankelijke H⁺ -stroommeting (figuur 5)⁵
In tegenstelling tot bruin vet ontwikkelt de IMM van niet-vetweefsels zoals skeletspieren en het hart niet direct na de inbraak een meetbaar H⁺ (figuur 5, zwarte sporen). Om een meetbare H⁺ -stroom via AAC te induceren, is het essentieel om de HEPES-badoplossing (tabel 6) toe te passen die 1-2 μM exogene FA bevat (AA, figuur 5A, rood spoor). Dit kan erop wijzen dat de IMM van niet-vetweefsels geen FA-productiemachinerie in de IMM heeft zoals wordt aangetroffen in de IMM van bruine en beige vetten.

De uitgangswaarde (of nulstroom) voor de kwantificering van de H⁺ -stroomamplitude via AAC komt overeen met de HEPES-badoplossing (tabel 6) die vóór de toevoeging van FA op het oppervlak van de IMM is geperfundeerd. Om te bevestigen dat de gemeten H^+- stroom door AAC wordt gedragen, is het belangrijk om specifieke remmers van AAC toegevoegd aan FA, 1 μM carboxyatractyloside (CATR, figuur 5A) of 4 μM bonkgrekinezuur (BKA, niet getoond)⁵ toe te passen, die de H^+- stroom bijna volledig remmen. Deze stroom verdwijnt volledig in de IMM van AAC1^-/- muizen (figuur 5A), waarbij AAC1 de overheersende isovorm in het hart^{is 5}.

Patch-clamp analyse van de interactie tussen FA-afhankelijk H⁺ lek en nucleotiden is ook mogelijk met AAC⁵. Er is echter een belangrijk verschil tussen OC en UCP1: OC draagt niet alleen H ⁺ , maar de belangrijkste functie is het transporteren van adeninenucleotiden ADP en ATP²¹. Om te bestuderen hoe adenine nucleotide uitwisseling FA-afhankelijk H ⁺ lek beïnvloedt, wordt 1 mM Mg^{2 +} -vrije ADP toegevoegd aan de pipetoplossing. Vervolgens worden FA doordrenkt om H ^{+ -} stroom via AAC te activeren. Alleen ADP in de pipetoplossing interfereert niet met de H^+- stroom⁵. Zodra een stabiele H⁺ stroomamplitude is bereikt, wordt ADP gelijktijdig met FA doordrenkt. Alleen wanneer ADP aan beide zijden van het membraan aanwezig is om een actieve nucleotide-uitwisseling via AAC te genereren, wordt een constante maar nooit volledige remming van H⁺ lek bereikt (figuur 5B). Dit kan erop wijzen dat de twee transportmodi van OC (FA-H⁺ current en ADP/ATP exchange) met elkaar concurreren en waarschijnlijk via dezelfde translocatieroute zullen plaatsvinden. De ADP/ADP homoexchange werd geselecteerd om de extra stroom geassocieerd met de fysiologische ADP/ATP heteroexchange⁵ te vermijden.

Figuur 1: Mitochondriale energieverdeling tussen warmte en ATP-productie. Mechanismen van mitochondriale ATP en warmteproductie. Mitochondriën hebben twee membranen [de OMM (paars) en de IMM (oranje)], die de machines voor ATP en warmteproductie bevatten. De ETC genereert een elektrochemische gradiënt van H ⁺ over de IMM, die wordt gebruikt door ATP-synthase (AS) om ATP te produceren en door UCP's wordt gebruikt om warmte te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Mitochondriale patch-clamp techniek (gemodificeerd van Bertholet et al. 2020)¹⁵. (A) Mitochondriën worden geïsoleerd uit weefsellysaat door centrifugering (OMM in paars en IMM in oranje). (B) Franse pers onder lage druk scheurt de OMM om de IMM vrij te maken die een mitoplast geeft. Linkerpaneel stelt een mitoplast voor, die een 8-vormige vorm aanneemt met restanten van de OMM bevestigd aan de IMM. Een glazen pipet wordt benaderd naar de IMM om een gigaohm-afdichting te vormen (mitoplast-bevestigde configuratie). Een foto van de mitoplast-bevestigde configuratie wordt getoond in het rechterpaneel. (C) De configuratie van de hele IMM (diagram in het linkerpaneel) wordt verkregen na het breken van de membraanpleister onder de pipet door verschillende spanningspulsen (200-500 mV). Een foto van de hele IMM-configuratie wordt weergegeven in het rechterdeelvenster. Inwaartse stromen (I, rood) zijn negatief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: French Press en elektrofysiologische opstelling. (A) Afbeelding van French Press, die helpt de OMM te scheuren om de IMM vrij te geven. (B) Afbeelding van een kooi van Faraday, omgekeerde microscoop met differentieel interferentiecontrast (DIC), 60x wateronderdompelingsobjectief, een trillingsisolatietafel en een micromanipulator. De standaardversterker, een standaard digitizer en pc-computer worden niet op de foto weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: H⁺ stroom via UCP1 in bruin vet. (A) Representatieve UCP1-afhankelijke H⁺ -stroom geregistreerd van bruin vet mitoplast geïsoleerd uit WT (bovenste paneel) en UCP1^−/− muizen (onderste paneel). De in zwart weergegeven regel H⁺ -stroomsporen komen overeen met de gestabiliseerde stroomamplitude nadat de IMM is verbroken. Vervolgens wordt 1 mM BBP toegevoegd aan de badoplossing (oranje). Het voltage ramp protocol wordt getoond boven de WT sporen. De pH van de bad- en pipetoplossingen wordt weergegeven in het pipet-mitoplastdiagram. B) Remming van UCP1 door purinenucleotiden in bruin vet. Representatieve UCP1-afhankelijke H⁺ stroomsporen in verschillende concentraties ATP op het cytosolische gezicht van de IMM van bruin vet van muizen bij thermoneutraliteit. UCP1-afhankelijke H⁺ stroom werd geactiveerd met 0,5 mM oliezuur (OA) gemengd met 10 mM MβCD.Het spanningsprotocol wordt bovenaan aangegeven. In het onderste paneel wordt hetzelfde spoor weergegeven, maar niet genormaliseerd met de mitoplastmembraancapaciteit. De bruinvette mitoplast in deze figuur had een membraancapaciteit van 0,624 pF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: FA-afhankelijke H⁺ stroom via AAC in hart-mitoplast. (A) Representatieve AAC-afhankelijke H⁺ -stroom bij toepassing van 2 μM AA in de badoplossing (bovenpaneel, oranje) in WT-hart-mitoplasten en geremd door 1 μM CATR (paars). Representatieve sporen geregistreerd in AAC1 ^−/− hart mitoplast bevinden zich in het onderste paneel. De regelstroom is zwart. Het voltage ramp protocol wordt getoond boven de WT sporen. De pH van de bad- en pipetoplossingen wordt weergegeven in het pipet-mitoplastdiagram. (B) Terwijl pipetoplossing 1 mM ADP bevatte, wordt AAC-afhankelijke H⁺ -stroom geïnduceerd door 2 μM AA (oranje) en geremd door toevoeging van 1 mM ADP aan bad (paars). Het voltage ramp protocol wordt boven het spoor getoond. De pH van de bad- en pipetoplossingen wordt weergegeven in het pipet-mitoplastdiagram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagens	Eindconcentratie
sacharose	250 meter
Hepes	10 meter
EGTA	1mm
pH aangepast naar 7,2 met TrisBase

Tabel 1: Mitochondriale isolatiebuffer (toniciteit ~ 300 mmol per kg)

Reagens	Eindconcentratie
sacharose	140m
D-mannitol	440 meter
Hepes	10 meter
EGTA	1mm
pH aangepast naar 7,2 met TrisBase

Tabel 2: Hypertone mannitolbuffer

Reagens	Eindconcentratie
Kcl	750 mm
Hepes	20 meter
EGTA	1mm
pH aangepast naar 7,2 met TrisBase

Tabel 3: Hypertone-KCl buffer

Reagens	Eindconcentratie
Tma	130m
Hepes	100m
EGTA	1mm
MgCl2 voor UCP1 opnames	2 meter
of
TrisCl voor OC-opnames
pH aangepast naar 7,0 of 7,5 met D-gluconzuur

Tabel 4: Pipetoplossing op basis van TMA (toniciteit ~ 360 mmol per kg)

Reagens	Eindconcentratie
Kcl	150m
Hepes	10 meter
EGTA	1mm
pH aangepast naar 7,0 met TrisBase

Tabel 5: KCl badoplossing (toniciteit ~ 300 mmol per kg)

Reagens	Eindconcentratie
sacharose	100 mM voor UCP1 opnames
	of
	150 mM voor OC opnames
Hepes	150 mM voor UCP1 opnames
	of
	100 mM voor OC opnames
1 miljoen EGTA
pH aangepast naar 7,0 met TrisBase

Tabel 6: HEPES-badoplossing (toniciteit ~ 300 mmol per kg)

Discussion

Dit methodeartikel heeft tot doel de patch-clamp-techniek te presenteren die onlangs is toegepast op mitochondriën, een nieuwe benadering om H ⁺ -lek rechtstreeks te bestuderen via de IMM die verantwoordelijk is voor mitochondriale thermogenese 5,6,7,15. Deze techniek is niet beperkt tot weefsels en kan ook worden gebruikt om H ⁺ -lekken en andere geleidingen van de IMM te analyseren in verschillende standaard menselijke en celmodellen zoals HAP1-, COS7-, C2C12- en MEF-cellen. Elke mitochondriale isolatie vereist echter enkele aanpassingen die specifiek zijn voor elk cel- of weefseltype.

De belangrijkste stappen in de directe meting van H ⁺ -stromen door de IMM van bruin vet ^5,6 en het hart⁵ worden hier samengevat om de mechanismen te illustreren die verantwoordelijk zijn voor mitochondriale thermogenese in gespecialiseerde thermogene en niet-vetweefsels. Inderdaad, de ontwikkeling van deze techniek voor het eerst maakt functionele analyse met hoge resolutie mogelijk van de twee belangrijkste UCP's (UCP1 en AAC) in hun oorspronkelijke membraanomgeving met nauwkeurige controle van kritieke experimentele omstandigheden zoals: 1) pH van pipet- en badoplossingen, 2) controle van het membraanpotentiaal over de IMM, en 3) nauwkeurige samenstelling van oplossingen om ionen en metabolieten uit te sluiten die anders dan H⁺ doorlaatbaar zijn voor de IMM. De pipet op basis van TMA (tabel 4) en hepes-badoplossingen (tabel 6) zijn geformuleerd om H⁺-stromen te registreren en bevatten alleen zouten die dissociëren in grote anionen en kationen die normaal ondoordringbaar zijn voor de IMM. Hoewel de badoplossing kan worden veranderd met behulp van een perfusiesysteem, waardoor verschillende behandelingen kunnen worden toegepast op de cytosolische kant van het membraan, is het niet mogelijk om de samenstelling van de intrapipette-oplossing te wijzigen. Dit beperkt het begrip van de regulerende mechanismen die zich aan de matrixzijde voordoen. Verbindingen moeten inderdaad aanwezig zijn in de intrapipette-oplossing op het moment van het vullen van de pipet. Daarom kan H ⁺ -lek worden bestudeerd in isolatie van andere stromen. Farmacologische studies en het gebruik van KO-muizen waren essentieel voor de karakterisering en identificatie van de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de H⁺ stroom door de IMM van verschillende weefsels ^5,6,7. Deze resultaten stelden vast dat UCP1 de belangrijkste UCP is van bruin en beige vet en AAC in niet-vetweefsels. We kunnen de mogelijkheid van het bestaan van andere H^+-stromen die niet door UCP1 en OC worden bemiddeld, niet volledig uitsluiten. Als er echter andere H ^{+ -}stromen bestaan, was hun amplitude buiten de resolutie van onze elektrofysiologische opstelling. Wij meten het H⁺ pompen van de ETC niet onder de in dit artikel beschreven omstandigheden. Zodra we de hele IMM-configuratie hebben bereikt, wordt de mitochondriale matrix weggespoeld door perfusie van de intrapipetoplossing. De intermembrane ruimte bestaat niet meer sinds de stap van het breken van de OMM met de Franse pers. Er zijn geen substraten van de ademhalingscomplexen toegevoegd die cruciaal zijn voor H⁺ pompen door de ETC. Het is daarom onwaarschijnlijk dat actieve H⁺ pompen worden ontwikkeld onder de elektrofysiologische omstandigheden die hier worden beschreven.

Single channel opnames van weggesneden patches worden niet beschreven in dit artikel. Hoewel UCP1- en AAC-afhankelijke H⁺ -stromen over de IMM robuust zijn vanwege hun hoge eiwitdichtheid, konden de eenkanaalsopeningen niet worden opgelost omdat de amplitude van UCP1- en AAC-unitaire stromen waarschijnlijk te klein is.

In tegenstelling tot biochemische studies hoeft de mitochondriale isolatie die in dit artikel wordt beschreven niet te resulteren in een hoge mate van mitochondriale zuiverheid. Inderdaad, het mitochondriale preparaat bestaande uit een veelheid van geïndividualiseerde mitoplasten en celresten wordt onder de microscoop gescand om één 8-vormige mitoplast te vinden om te patchen. De 8-vormige vorm van de mitoplast is te wijten aan het vrijkomen van de IMM door een gat in de OMM veroorzaakt door de Franse persprocedure (figuur 2). De minder dichte kwab komt overeen met de IMM^15,17. Een geschikt preparaat kan worden gedefinieerd door vrij bewegende mitoplasten die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van cellulair puin. Het is echter belangrijk om het aantal puin te verminderen om verontreiniging van de IMM te voorkomen, wat de kwaliteit van de afdichting van de glazen pipet met het membraan kan beïnvloeden. Deze scanstap onder de microscoop maakt het mogelijk om een mitoplast te kiezen met een hoge IMM-integriteit die wordt herkend door een minder dichte kwab dan degene die wordt afgebakend door de OMM en verhoogt daarom de kans op een succesvolle inbraak.

Deze techniek voorzag voor het eerst in de directe meting van UCP1- en AAC-afhankelijke H⁺ -stromen binnen hun oorspronkelijke membraan. Mitochondriale integriteit en compartimentering bestaan echter niet meer als gevolg van de breuk van de OMM en waarschijnlijk de cristae. Het is daarom essentieel om patch-clamp-analyse aan te vullen met andere klassieke methoden zoals mitochondriale ademhaling om de fysiologische rol van nieuw gekarakteriseerde eiwitten in intacte mitochondriën te bevestigen.

De patch-clamp techniek toegepast op mitochondriën biedt nieuwe mogelijkheden om de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor mitochondriaal H⁺ lek en thermogenese beter te begrijpen. In combinatie met moderne cellulaire en moleculaire technieken zal deze innovatieve aanpak nieuwe inzichten bieden in de mechanismen die de thermogene capaciteit van mitochondriën regelen en hoe ze kunnen worden gericht op het bestrijden van ziekten die verband houden met mitochondriale disfunctie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253