Anvendelsen af plasterklemmeteknikken til at studere mitokondriernes termogene kapacitet

Summary

Denne metodeartikel beskriver de vigtigste trin i måling af H ⁺ lækage over den indre mitokondriemembran med patch-clamp teknikken, en ny tilgang til at studere mitokondriernes termogene kapacitet.

Abstract

Mitokondriel termogenese (også kendt som mitokondriel afkobling) er et af de mest lovende mål for at øge energiforbruget til bekæmpelse af metabolisk syndrom. Termogene væv som brune og beige fedtstoffer udvikler højt specialiserede mitokondrier til varmeproduktion. Mitokondrier af andre væv, der primært producerer ATP, omdanner også op til 25% af den samlede mitokondrielle energiproduktion til varme og kan derfor have en betydelig indvirkning på hele kroppens fysiologi. Mitokondriel termogenese er ikke kun afgørende for at opretholde kropstemperaturen, men forhindrer også diætinduceret fedme og reducerer produktionen af reaktive iltarter (ROS) for at beskytte celler mod oxidativ skade. Da mitokondriel termogenese er en vigtig regulator for cellulær metabolisme, vil en mekanistisk forståelse af denne grundlæggende proces hjælpe med udviklingen af terapeutiske strategier til bekæmpelse af mange patologier forbundet med mitokondriel dysfunktion. Det er vigtigt, at de præcise molekylære mekanismer, der styrer akut aktivering af termogenese i mitokondrier, er dårligt defineret. Denne mangel på information skyldes i høj grad mangel på metoder til direkte måling af afkoblingsproteiner. Den nylige udvikling af patch-clamp-metoden anvendt på mitokondrier muliggjorde for første gang den direkte undersøgelse af fænomenet ved oprindelsen af mitokondriel termogenese, H ⁺ lækage gennem IMM og den første biofysiske karakterisering af mitokondrielle transportører, der er ansvarlige for det, afkoblingsproteinet 1 (UCP1), der er specifikt for brune og beige fedtstoffer, og ADP / ATP-transportøren (AAC) for alle andre væv. Denne unikke tilgang vil give ny indsigt i de mekanismer, der styrer H ⁺ lækage og mitokondriel termogenese, og hvordan de kan målrettes til bekæmpelse af metabolisk syndrom. Dette papir beskriver den patch-clamp-metode, der anvendes på mitokondrier til at studere deres termogene kapacitet ved direkte at måle H ⁺ -strømme gennem IMM.

Introduction

Mitokondrier er berømte for at være cellens kraftværk. Faktisk er de den største kilde til kemisk energi, ATP. Hvad der er mindre kendt er, at mitokondrier også genererer varme. Faktisk genererer hver mitokondrie konstant de to typer energier (ATP og varme), og en fin balance mellem de to energiformer definerer metabolisk cellehomeostase (figur 1). Hvordan mitokondrier fordeler energi mellem ATP og varme er bestemt det mest grundlæggende spørgsmål inden for bioenergetik, selvom det stadig er stort set ukendt. Vi ved, at øget mitokondriel varmeproduktion (kaldet mitokondriel termogenese) og dermed reduktion af ATP-produktionen øger energiforbruget, og dette er en af de bedste måder at bekæmpe metabolisk syndrom¹ på.

Mitokondriel termogenese stammer fra H ⁺ lækage over den indre mitokondriemembran (IMM), hvilket fører til afkobling af substratoxidation og ATP-syntese med deraf følgende produktion af varme, deraf navnet "mitokondriel afkobling"¹ (figur 1). Denne H ⁺ lækage afhænger af mitokondrielle transportører kaldet afkoblingsproteiner (UMP'er). UCP1 var den første UCP, der blev identificeret. Det udtrykkes kun i termogene væv, brunt fedt og beige fedt, hvor mitokondrier er specialiseret til varmeproduktion ^2,3,4. Identiteten af UCP i ikke-fedtvæv som skeletmuskulatur, hjerte og lever er forblevet kontroversiel. Mitokondrier i disse væv kan have ca. 25% af den samlede mitokondrielle energi omdannet til varme, hvilket kan påvirke fysiologien i hele kroppen betydeligt¹. Udover at opretholde kernekropstemperaturen forhindrer mitokondriel termogenese også diætinduceret fedme ved at reducere kalorierne. Derudover reducerer det produktionen af reaktive iltarter (ROS) af mitokondrier for at beskytte celler mod oxidativ skade¹. Mitokondriel termogenese er således involveret i normal aldring, aldersrelaterede degenerative lidelser og andre tilstande, der involverer oxidativ stress, såsom iskæmi-reperfusion. Derfor er mitokondriel termogenese en stærk regulator af cellulær metabolisme, og en mekanistisk forståelse af denne grundlæggende proces vil fremme udviklingen af terapeutiske strategier til bekæmpelse af mange patologier forbundet med mitokondriel dysfunktion.

Mitokondriel respiration var den første teknik til at afsløre den afgørende rolle mitokondriel termogenese i cellulær metabolisme og er stadig den mest populære i samfundet¹. Denne teknik er baseret på måling af iltforbrug af mitokondrieelektrontransportkæden (ETC), der stiger, når mitokondriel H ⁺ lækage aktiveres. Denne teknik, selvom den er instrumentel, kan ikke direkte studere mitokondriel H ⁺ -lækage på tværs af IMM¹, hvilket gør den nøjagtige identifikation og karakterisering af de proteiner, der er ansvarlige for den, vanskelig, især i ikke-fedtvæv, hvor varmeproduktionen er sekundær sammenlignet med ATP-produktion. For nylig gav udviklingen af patch-clamp-teknikken anvendt på mitokondrier den første direkte undersøgelse af H ⁺ lækage over hele IMM i forskellige væv ^5,6,7.

Den mitokondrielle patchklemme af hele IMM blev først etableret på en reproducerbar måde af Kirichok et ^al.8. De beskrev den første direkte måling af mitokondrie calcium uniporter (MCU) strømme i 2004 ved hjælp af mitoplaster fra COS-7 cellelinjer⁸. Senere viste Kirichok-laboratoriet calciumstrømme fra IMM'er af mus⁹ og Drosophila væv⁹. Andre laboratorier bruger nu rutinemæssigt denne teknik til at studere de biofysiske egenskaber ved MCU 10,11,12,13,14. Hele IMM-plasterklemmeanalyse af kalium- og kloridkonduktans er også mulig og er blevet nævnt i flere artikler, men har endnu ikke været hovedemnet for en publikation ^6,7,9. Den første måling af H^+-strømme på tværs af IMM blev rapporteret i 2012 fra musebrune fedtmitokondrier⁶ og fra muse-beige fedtmitokondrier i 2017⁷. Denne strøm skyldes det specifikke afkoblingsprotein af termogene væv, UCP1 ^6,7. Nyligt arbejde offentliggjort i 2019 karakteriserede AAC som det vigtigste protein, der er ansvarligt for mitokondriel H ^{+ -}lækage i ikke-fedtvæv som hjerte- og skeletmuskulatur⁵.

Denne unikke tilgang giver nu mulighed for direkte højopløselig funktionel analyse af mitokondrielle ionkanaler og transportører, der er ansvarlige for mitokondriel termogenese. For at lette udvidelsen af metoden og supplere andre undersøgelser såsom mitokondriel respiration er der beskrevet en detaljeret protokol nedenfor til måling af H ^{+ -} strømme, der bæres af UCP1 og AAC. Tre vigtige trin er beskrevet: 1) mitokondriel isolering fra musebrunt fedt for at analysere UCP1-afhængig H ⁺ -strøm og mitokondriel isolering fra hjertet for at analysere AAC-afhængig H ⁺ -strøm, 2) forberedelse af mitoplaster med en fransk presse til mekanisk brud på den ydre mitokondriemembran (OMM), 3) patch-clamp optagelser af UCP1 og AAC-afhængige H ⁺ strømme på tværs af hele IMM.

Protocol

Alle dyreforsøgsprocedurer, der blev udført, er i overensstemmelse med National Institutes of Health-retningslinjerne og blev godkendt af University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

BEMÆRK: Den mitokondrielle isolationsprocedure er baseret på differentiel centrifugering og varierer lidt fra væv til væv. For eksempel, da brunt fedtvæv er ekstremt rig på lipider, kræver det et ekstra trin at adskille celleaffald og organeller fra lipidfasen, før mitokondrierne høstes. For at undgå forvirring er de to mitokondrielle isolationsprocedurer (den ene fra det brune fedt og den anden fra hjertet) beskrevet nedenfor.

1. Mitokondriel isolering fra mus interscapular brunt fedt (modificeret fra Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Afliv C57BL / 6 hanmus ved hjælp af CO_{2 -} kvælning og efterfølgende cervikal dislokation, som anbefalet af American Veterinary Medical Association Panel og IACUC Committee.
2. Efter at have placeret musen med maven vendt mod bordet, spray alkohol for at rense og våde håret (modificeret fra Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Lav et snit på 2 cm i øvre ryg efter at have grebet huden med pincet.
4. Uddrag musens brune interscapulære fedt, der svarer til et to-lobet organ med en sommerfuglform¹⁶.
5. Overfør det brune fedt til en 35 mm petriskål fyldt med 5 ml koldisoleringsbuffer (tabel 1), der tidligere var anbragt på is.
6. Rengør det brune fedt fra det hvide fedt under en kikkert.
7. Overfør det brune fedt til et 10 ml bægerglas med 5 ml koldisoleringsbuffer (tabel 1) for at hugge det op i tynde stykker. Overfør til den iskølede 10 ml glashomogenisator (plastmateriale polytetrafluorethylen (PTFE) pestle).
8. Brug en overliggende omrører til at homogenisere det forskårne væv på is med seks blide strøg med en kontrolleret hastighed på 275 rotationer / min.
9. Homogenatet centrifugeres ved 8.500 x g i 10 minutter ved 4 °C i et 15 ml iskoldt konisk rør. Kassér supernatanten indeholdende lipidfasen.
10. Resuspend pelleten i 5 ml iskold isolationsbuffer (tabel 1) og homogeniser for anden gang suspensionen på is med seks langsomme slag med en hastighed på 275 rotation / min.
11. Overfør homogenatet i et 15 ml iskoldt konisk rør og centrifuger det ved 700 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pelletere alle kerner og ubrudte celler.
12. Saml supernatanten i et frisk 15 ml rør og læg det på is.
13. Centrifugering af supernatanten ved 8.500 x g i 10 minutter ved 4 °C for at opnå en pellet indeholdende mitokondrier.
14. Resuspend pellet indeholdende mitokondrier i 3,8 ml iskold hypertonisk-mannitolbuffer (tabel 2) og inkuber mitokondrieophænget på is i 10-15 minutter.

2. Mitokondriel isolering fra musehjertet (modificeret fra Garg et al. 2019)¹⁷

1. Afliv C57BL / 6 hanmus ved hjælp af CO_{2 -} kvælning og efterfølgende cervikal dislokation, som anbefalet af American Veterinary Medical Association Panel og IACUC Committee.
2. Efter at have placeret musen på ryggen, spray alkohol for at rense og vådt håret. Lav derefter et snit på 2 cm på brystkassen efter at have grebet huden med en pincet.
3. Dissekere hjertet fra dyrets bryst og skyl det for at fjerne alt blodet i et 10 ml bægerglas med 5 ml koldisoleringsopløsningen (tabel 1).
4. Når hjertet er blevet renset for spor af blod, overføres det til et andet 10 ml bægerglas indeholdende 5 ml koldisoleringsbuffer (tabel 1) for at hugge det op i tynde stykker. Derefter overføres til en iskølet 10 ml glashomogenisator (PTFE pestle).
5. Brug en overliggende omrører til at homogenisere det forskårne væv på is med seks blide strøg med en kontrolleret hastighed på 275 rotationer / min.
6. Overfør homogenatet til et 15 ml iskoldt konisk rør og centrifuger det ved 700 x g i 10 minutter ved 4 °C til pillekerner og ubrudte celler.
7. Saml supernatanten i et frisk 15 ml rør og læg det på is.
8. Centrifugering af supernatanten ved 8.500 x g i 10 minutter ved 4 °C for at opnå en pellet indeholdende mitokondrier.
9. Resuspend mitokondriepillen i 3,8 ml iskold hypertonisk-mannitolbuffer (tabel 2) og inkuber mitokondriesuspensionen på is i 10-15 minutter.

3. Fremstilling af mitoplaster med en fransk presse til mekanisk brud på OMM.

BEMÆRK: Stempelkandeproceduren gør det muligt at frigive IMM fra OMM, idet dens integritet bevares, herunder matrixen og crista (figur 2)¹⁸. Mitokondrier præinkuberes i en hypertonisk mannitolbuffer (tabel 2) og udsættes for et lavere tryk under stempelkandeproceduren for at undgå drastisk strækning af IMM, når OMM'en brister.

1. Fyld mitokondrie-hypertonisk-mannitol-suspensionen i en kølet minitrykcelle (stempeldiameter 3/8") i stempelpressen (figur 3A).
2. Vælg stempelkandens mediumtilstand , og komprimer suspensionen gennem minitrykcellen ved 110 på stempelkansen for de brune fedtmitokondrier og ved 140 for hjertemitokondrierne (~ 2.000 psi).  Sørg for, at suspensionen kommer ud af minitrykcellen med en hastighed på ca. 1 dråbe / s.
3. Saml dråberne i et 15 ml iskølet konisk rør.
4. Centrifugering af suspensionen ved 10.500 x g i 10 minutter ved 4 °C.
5. Resuspend mitoplasts pellet i 0,5-2 ml iskold Hypertonic-KCl buffer (tabel 3) og opbevar suspensionen på is.
   BEMÆRK: Brunt fedt og hjertemitoplaster er klar til patch-clamp optagelser og bør forblive anvendelige i ca. 3-6 timer.

4. Elektrofysiologiske optagelser af H ⁺ lækage gennem UCP1 og AAC ^5,7,15

BEMÆRK: Brug følgende elektrofysiologiske opsætning (figur 3B): omvendt mikroskop med differentiel interferenskontrast (DIC), 60x vandnedsænkningsmål, vibrationsisoleringstabel og et Faraday-bur, en standardforstærker, der understøtter støjsvage optagelser, en standarddigitalisator, der anvendes til elektrofysiologisk opsætning, pClamp 10, en mikromanipulator, badereferenceelektrode (3 M KCl-agar saltbro indsat i en mikroelektrodeholder indeholdende en sølv/sølvchloridpille støbt ind i holderlegemet (beskrevet i Liu et al. 2021)¹⁹, perfusionskammer med et 0,13 mm glasdæksel, der er forbundet med et tyngdekraftsfodret perfusionssystem.

1. Træk i borosilikatglasfilamenterne på optagelsesdagen ved hjælp af en mikropipettetrækker. Indstil et program på aftrækkeren, der bruges til generering af pipetter med en høj grad af reproducerbarhed²⁰.
   BEMÆRK: Dette programdesign kræver flere forsøg på at opnå pipetter, der er optimeret til IMM-patchklemmen. En standardpipette har fine spidser med en progressiv konisk form.
2. Indsæt et glasfilament i aftrækkeren, og træk for at opnå næsten to identiske patchpipetter fra et borosilikatfilament.
3. Juster programmet, når pipetter bliver inkonsekvente mellem trækcyklusser på grund af ældning af aftrækkerens varmeboksfilament.
4. Placer pipetten inde i pipettepoleren, og placer spidsen nær glødetråden under 100x forstørrelse for at brandpolere den.
5. Tryk på fodpedalen flere gange for at opvarme glødetråden uden at tilstoppe eller beskadige spidskurven.
6. Polske indtil pipetter med en resistens på mellem 25 og 35 MΩ opnås, når de fyldes med TMA-baseret pipetteopløsning (TMA for tetramethylammoniumhydroxid, tabel 4).
7. Forinkubation af dæksler (5 mm diameter, 0,1 mm tykkelse) med 0,1% gelatine for at reducere mitoplastadhæsionen og skylle dem med KCl-badeopløsningen (tabel 5), inden mitoplastsuspensionen deponeres.
8. Der forberedes en rå fortynding ved at blande ~35 μL af den koncentrerede mitoplastsuspension med 500 μL af KCl-badeopløsningen (tabel 5) og anbringe den på dæksler, der tidligere er anbragt i en brønd i en 4-brønds plade.
9. Inkuber på is i 15 til 20 minutter for mitoplaster at sedimentere på dækslipsen.
10. Fyld badekammeret helt med ~50 μL af KCl-badeopløsningen (tabel 5).
11. Overfør et dækslip med mitoplaster i kammeret ved hjælp af tynd mikrodissektionspincet med en bøjet spids.
12. Arranger dæksedlen i bunden af kammeret. Perfuser ikke kammeret for at holde mitoplasterne stabile på dæksedlen.
13. Vælg en individuel ikke-klæbende mitoplast i form af 8 ved at scanne dæksedlen under mikroskopet med et 60x mål.
14. Læg pipetten med pipetteopløsningen (~ 50 μL) og læg den i pipetteholderen.
15. Bring pipetten ind i badeopløsningen med en mikromanipulator, og nærkæmp den lige over den valgte mitoplast for at komme tæt på IMM. Forstærkerprogrammet giver pipettens modstand, når den er i badeopløsningen. Hold membranpotentialet på 0 mV, og påfør 10 mV impulser ved hjælp af membrantestkommandoen i forstærkerprogrammet.
16. Påfør let undertryk for hurtigt at skabe en gigaseal med IMM (figur 2B).
17. Stig pipetten med mitoplasten fastgjort for at holde dem væk fra dæksedlen for at undgå tætningsbrud på grund af pipettedriften under forsøget.
18. Kompenser de omstrejfende kapacitanstransienter med kommandoen "membrantest" i forstærkerprogrammet, før du tester hele mitoplastkonfigurationen for at opnå en korrekt kapacitansmåling (Cm) for mitoplastmembranen efter indbruddet.
19. Påfør kortvarige (5-15 ms) spændingsimpulser (250-600 mV) med forstærkerprogrammet for at sprænge membranplasteret under glaspipetten og opnå hele mitoplastkonfigurationen (figur 2C). Vellykket indbrud afspejles af, at kapacitanstransienter dukker op igen.
20. Efter indbruddet skal kapacitanstransienterne monteres med forstærkerprogrammets membrantestmulighed for at vurdere membrankaacitansen (afspejler mitoplastens størrelse) og dens adgangsmodstand Ra (afspejler kvaliteten af hele mitoplastkonfigurationen). Efter indbruddet skal Ra være mellem 40 og 80 MΩ. Mitoplaster (2-6 μm i størrelse), der anvendes til patch-clamp-eksperimenter, har typisk membrankaacitanser på 0,5-1,1 pF.
21. Umiddelbart efter indbruddet udskiftes KCl-badeopløsningen (tabel 5) med HEPES-badeopløsningen (tabel 6) ved at starte perfusionen.
22. Anvend en 850 ms rampeprotokol designet med forstærkerprogrammet, fra -160 mV til +100 mV med et interval på 5 s, mens du holder mitoplasten ved 0 mV. Denne protokol fungerer for UCP1 ^6,7,15 og AAC⁵ undersøgelser (figur 4 og figur 5).
    BEMÆRK: Det anbefales til UCP1- og AAC-afhængige H⁺ -strømmålinger at indhente alle elektrofysiologiske data ved 10 kHz og at filtrere ved 1 kHz ved hjælp af passende software, der driver forstærkeren og digitisatoren.

Representative Results

Udviklingen af patch-clamp-metoden anvendt på mitokondrier gav den første direkte undersøgelse af H ^{+ -} lækage gennem IMM og mitokondrietransportørerne, UCP1 og AAC, som er ansvarlige for den. Den elektrofysiologiske analyse af UCP1- og AAC-afhængige H ⁺ lækager kan give et første blik på mitokondriernes termogene kapacitet. Resultatafsnittet beskriver standardprocedurerne til måling ^{af H +} lækage via UCP1 og AAC.

UCP1-afhængig H^+-strømmåling (figur 4)^6,7,15
Anvendelse af spændingsrampeprotokollen inducerer en H ⁺ -strøm med stor amplitude over IMM af brunt fedt uden tilsætning af eksogene fedtsyrer (FA), de krævede aktivatorer af UMP'er (figur 4A). Dette er et specifikt kendetegn ved brunt og beige fedt IMM på grund af den lokale produktion af FA ved en phospholipaseaktivitet forbundet med membranen. Når H + ^-strømmen udvikler sig som reaktion på rampeprotokollen, er det vigtigt at vente på, at den aktuelle amplitude stabiliseres. Kvantificering af H+^-strømamplituden via UCP1 kræver bestemmelse af basislinjen svarende til en UCP1-nulstrøm. Når stabiliteten af H ⁺ strømamplituden er nået, anbefales det at perfuse enten UCP1-hæmmer Guanosindiphosphat (BNP - 1 mM, figur 4A) eller en FA-chelator (0,5% FA-fri kvægserumalbumin, ikke vist) eller 10 mM methyl beta cyclodextrin (MβCD) til den endogene membran FA-ekstraktion, figur 4B, sort spor). Reststrømmen er den strøm, hvorfra amplituden af UCP1-strømmene bestemmes. For at hjælpe med at sammenligne amplituderne af UCP1-strømme i forskellige mitoplaster beregnes strømtætheden (pA / pF) for hver mitoplast ved at normalisere UCP1-strømmene med mitoplastkakaitansen (Cm) ^5,7. Strømmen kan genaktiveres ved tilsætning af eksogen langkædede FA ved anvendelse af arachidonsyre (AA) eller oliesyre (OA) (1-2 μM). Da både brune og beige fedtim'er har PLA2-aktivitet, regenereres endogene membran-FA'er delvist inden for få minutter efter vask af MβCD / albumin fra badet, hvilket fører til reaktivering af H ^{+ -}strømmen via UCP1 ^6,7. Som forventet forsvinder denne strøm fuldstændigt i IMM for UCP1^-/- mus (figur 4A)^6,7.

En mere præcis måde at sammenligne UCP1's massetæthed og aktivitet på af forskellige mitoplaster af det samme væv eller af mitoplaster fra forskellige væv (brunt og beige fedt) er at kontrollere FA-koncentrationen på overfladen af IMM ^6,7. Faktisk kan H ⁺ strømamplitude variere mellem mitoplaster på grund af UCP1-proteinmængden pr. IMM, men også på grund af produktionen af endogen FA. Det anbefales således at ekstrahere endogen FA fra IMM og at genaktivere UCP1-afhængig H ⁺ -strøm ved at tilføje eksogen FA i en kendt koncentration. For at gøre dette skal endogene FA'er først ekstraheres fra IMM ved perfusering af en HEPES-badeopløsning (tabel 6) indeholdende 10 mM MβCD. For at muliggøre reaktivering af H^+-strømmen via UCP1 ved kun en præcis koncentration af eksogene FA'er vil sidstnævnte blive perfuseret på en HEPES/MβCD-baggrund for kontinuerligt at udtrække FA'er produceret fra IMM.

Undersøgelsen af konkurrencen mellem purinnukleotid og FA for binding til UCP1 er også mulig med patch-clamp-teknikken ^6,7,15. Inhibering af UCP1 med purinnukleotider (f.eks. Mg²⁺-fri ATP) kan sammenlignes med to forskellige koncentrationer af FA (ideelt set 10 gange). Til dette formål fjernes endogen membran FA først ved at anvende 10 mM MβCD (figur 4B, sort spor). Anvendelse af eksogene FA'er (f.eks. her vises kun 0,5 mM FA'er) påført på en baggrund på 10 mM MβCD muliggør præcis kontrol af koncentrationen af aktiverende FA'er, fordi lokalt producerede FA'er straks ekstraheres fra membranen. I denne tilstand er eksogene FA'er primært ansvarlige for udviklingen af H + ^-strømmen. Forskellige koncentrationer af ATP tilsættes efterfølgende til OA/MβCD-opløsningen for at vurdere IC50_ATP for hver undersøgt FA-koncentration og dermed fastslå, om FA konkurrerer med purinnukleotider om binding til UCP1.

AAC-afhængig H+^- strømmåling (figur 5)⁵
I modsætning til brunt fedt udvikler IMM af ikke-fedtvæv som skeletmuskulatur og hjerte ikke en målbar H ⁺ umiddelbart efter indbruddet (figur 5, sorte spor). For at inducere en målbar H^+- strøm gennem AAC er det vigtigt at anvende HEPES-badeopløsningen (tabel 6), der indeholder 1-2 μM eksogen FA (AA, figur 5A, rødt spor). Dette kan tyde på, at IMM for ikke-fedtvæv ikke har et FA-produktionsmaskineri i IMM, som det findes i IMM for brune og beige fedtstoffer.

Basislinjen (eller nulstrømmen) til kvantificering af H^+- strømamplituden via AAC svarer til HEPES-badeopløsningen (tabel 6), der blev perfuseret på overfladen af IMM før tilsætningen af FA. For at bekræfte, at den målte H^+- strøm bæres af AAC, er det vigtigt at anvende specifikke hæmmere af AAC tilsat FA, 1 μM carboxyatractylosid (CATR, figur 5A) eller 4 μM bonkgreksyre (BKA, ikke vist)⁵, som næsten fuldstændigt hæmmer H^+- strømmen. Denne strøm forsvinder fuldstændigt i IMM for AAC1^-/- mus (figur 5A), hvor AAC1 er den fremherskende isoform i hjertet⁵.

Patch-clamp analyse af interaktionen mellem FA-afhængig H ⁺ lækage og nukleotider er også mulig med AAC⁵. Der er dog en vigtig forskel mellem AAC og UCP1: AAC bærer ikke kun H ^+, men dens hovedfunktion er at transportere adeninnukleotider ADP og ATP²¹. For at undersøge, hvordan adeninnukleotidudveksling påvirker FA-afhængig H⁺ -lækage, tilsættes 1 mM Mg²⁺-fri ADP til pipetteopløsningen. Derefter perfuseres FA for at aktivere H ^{+ -} strøm via AAC. Kun ADP i pipetteopløsningen forstyrrer ^{ikke H+} strømmen⁵. Når en stabil H ⁺ strømamplitude er nået, perfunderes ADP samtidig med FA. Kun når ADP er til stede på begge sider af membranen for at generere en aktiv nukleotidudveksling via AAC, opnås en konstant, men aldrig fuldstændig hæmning af H ⁺ lækage (figur 5B). Dette kan tyde på, at de to transportformer AAC (FA-H⁺ -strøm og ADP/ATP-udveksling) konkurrerer og sandsynligvis vil forekomme via den samme translokationsvej. ADP/ADP-homoexchangen blev valgt for at undgå den ekstra strøm, der er forbundet med den fysiologiske ADP/ATP-heteroexchang⁵.

Figur 1: Mitokondriel energifordeling mellem varme og ATP-produktion. Mekanismer for mitokondriel ATP og varmeproduktion. Mitokondrier har to membraner [OMM (lilla) og IMM (orange)], som indeholder maskiner til ATP og varmeproduktion. ETC genererer en elektrokemisk gradient på H ⁺ på tværs af IMM, som bruges af ATP-syntase (AS) til fremstilling af ATP og bruges af UMP'er til at generere varme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Mitokondriel patch-clamp teknik (modificeret fra Bertholet et al. 2020) ¹⁵. (A) Mitokondrier isoleres fra vævslysat ved centrifugering (OMM i lilla og IMM i orange). (B) Lavtryksfranske presse sprænger OMM for at frigive IMM, som giver en mitoplast. Venstre panel repræsenterer en mitoplast, som antager en 8-formet form med rester af OMM fastgjort til IMM. En glaspipette nærmer sig IMM for at danne en gigaohmforsegling (mitoplast-fastgjort konfiguration). Et fotografi af den mitoplast-vedhæftede konfiguration vises i højre panel. (C) Konfigurationen af hele IMM (diagram i venstre panel) opnås efter brud på membranplasteret under pipetten med flere spændingsimpulser (200-500 mV). Et fotografi af hele IMM-konfigurationen vises i højre panel. Indadgående strømme (I, rød) er negative. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Stempelkande og elektrofysiologisk opsætning. (A) Billede af fransk presse, som hjælper med at bryde OMM for at frigive IMM. (B) Billede af et Faraday-bur, omvendt mikroskop med differentiel interferenskontrast (DIC), 60x vandnedsænkningsmål, et vibrationsisoleringsbord og en mikromanipulator. Standardforstærkeren, en standard digitizer og pc-computeren vises ikke på billedet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: H⁺ -strøm via UCP1 i brunt fedt. (A) Repræsentativ UCP1-afhængig H⁺ -strøm registreret fra brunt fedtmitoplast isoleret fra WT (øverste panel) og UCP1^{−/− mus (nederste} panel). Kontrol ^{H +} strømsporene vist i sort svarer til den stabiliserede strømamplitude, efter at IMM er blevet brudt. 1 mM BNP tilsættes derefter til badeopløsningen (orange). Spændingsrampeprotokollen er vist over WT-sporene. PH-værdien i bad- og pipetteopløsningerne er vist i pipette-mitoplast-diagrammet. (B) Inhibering af UCP1 af purinnukleotider i brunt fedt. Repræsentative UCP1-afhængige H ⁺ strømspor i forskellige koncentrationer af ATP på den cytosoliske side af IMM af brunt fedt hos mus ved termoneutralitet. UCP1-afhængig H ⁺ strøm blev aktiveret med 0,5 mM oliesyre (OA) blandet med 10 mM MβCD.Spændingsprotokollen er angivet øverst. I det nederste panel er det samme spor repræsenteret, men ikke normaliseret med mitoplastmembrankaacitansen. Den brune fedtmitoplast i denne figur havde en membrankaacitans på 0,624 pF. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: FA-afhængig H⁺ strøm via AAC i hjertemitoplast. A) Repræsentativ AAC-afhængig H⁺ -strøm, når den påføres 2 μM AA i badeopløsningen (øverste panel, orange) i WT-hjertemitoplaster og hæmmes af 1 μM CATR (lilla). Repræsentative spor registreret i AAC1 ^−/− hjertemitoplast er i nederste panel. Kontrolstrømmen er i sort. Spændingsrampeprotokollen er vist over WT-sporene. PH-værdien i bad- og pipetteopløsningerne er vist i pipette-mitoplast-diagrammet. (B) Mens pipetteopløsning indeholdt 1 mM ADP, induceres AAC-afhængig H⁺ -strøm med 2 μM AA (orange) og hæmmes ved tilsætning af 1 mM ADP til bad (lilla). Spændingsrampeprotokollen er vist over sporet. PH-værdien i bad- og pipetteopløsningerne er vist i pipette-mitoplast-diagrammet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Reagens	Endelig koncentration
saccharose	250 mM
HEPES	10 mM
EGTA	1 mM
pH justeret til 7,2 med TrisBase

Tabel 1: Mitokondriel isolationsbuffer (tonicitet ~ 300 mmol pr. kg)

Reagens	Endelig koncentration
saccharose	140 mM
D-mannitol	440 mM
HEPES	10 mM
EGTA	1 mM
pH justeret til 7,2 med TrisBase

Tabel 2: Hypertonisk-mannitolbuffer

Reagens	Endelig koncentration
KCl	750 mM
HEPES	20 mM
EGTA	1 mM
pH justeret til 7,2 med TrisBase

Tabel 3: Hypertonisk-KCl-buffer

Reagens	Endelig koncentration
Tma	130 mM
HEPES	100 mM
EGTA	1 mM
MgCl2 til UCP1-optagelser	2 mM
eller
TrisCl til AAC-optagelser
pH justeret til 7,0 eller 7,5 med D-gluconsyre

Tabel 4: TMA-baseret pipetteopløsning (tonicitet ~ 360 mmol pr. kg)

Reagens	Endelig koncentration
KCl	150 mM
HEPES	10 mM
EGTA	1 mM
pH justeret til 7,0 med TrisBase

Tabel 5: KCl-badeopløsning (tonicitet ~ 300 mmol pr. kg)

Reagens	Endelig koncentration
saccharose	100 mM til UCP1-optagelser
	eller
	150 mM til AAC-optagelser
HEPES	150 mM til UCP1-optagelser
	eller
	100 mM til AAC-optagelser
1 mM EGTA
pH justeret til 7,0 med TrisBase

Tabel 6: HEPES-badeopløsning (tonicitet ~ 300 mmol pr. kg)

Discussion

Denne metodeartikel har til formål at præsentere patch-clamp-teknikken, der for nylig blev anvendt på mitokondrier, en ny tilgang til direkte at studere H ⁺ lækage gennem IMM, der er ansvarlig for mitokondriel termogenese 5,6,7,15. Denne teknik er ikke begrænset til væv og kan også bruges til at analysere H ⁺ lækage og andre konduktanser af IMM i forskellige standard humane og cellemodeller såsom HAP1, COS7, C2C12 og MEF celler. Imidlertid kræver hver mitokondriel isolering nogle justeringer, der er specifikke for hver celle eller vævstype.

De vigtigste trin i den direkte måling af H ⁺ -strømme gennem IMM af brunt fedt ^5,6 og hjertet⁵ opsummeres her for at illustrere de mekanismer, der er ansvarlige for mitokondriel termogenese i specialiserede termogene og ikke-fedtvæv. Faktisk tillader udviklingen af denne teknik for første gang funktionel analyse i høj opløsning af de to vigtigste UCP'er (UCP1 og AAC) i deres oprindelige membranmiljø med præcis kontrol af kritiske eksperimentelle forhold såsom: 1) pH i pipette- og badeopløsninger, 2) kontrol af membranpotentialet på tværs af IMM og 3) præcis sammensætning af opløsninger for at udelukke eventuelle ioner og metabolitter, der er gennemtrængelige for IMM, bortset fra H ⁺. De TMA-baserede pipette- (tabel 4) og HEPES-badeløsninger (tabel 6) er formuleret til at registrere H⁺-strømme og indeholder kun salte, der dissocierer i store anioner og kationer, der normalt er uigennemtrængelige for IMM. Mens badeopløsningen kan ændres ved hjælp af et perfusionssystem, der gør det muligt at anvende forskellige behandlinger på den cytosoliske side af membranen, er det ikke muligt at ændre sammensætningen af intrapipetteopløsningen. Dette begrænser forståelsen af de reguleringsmekanismer, der forekommer på matrixsiden. Faktisk skal forbindelser være til stede i intrapipetteopløsningen på tidspunktet for påfyldning af pipetten. Derfor kan H ⁺ lækage undersøges isoleret fra andre strømme. Farmakologiske undersøgelser og brugen af KO-mus var afgørende for karakteriseringen og identifikationen af de proteiner, der er ansvarlige for H ^{+ -}strømmen gennem IMM af forskellige væv ^5,6,7. Disse resultater fastslog, at UCP1 er den vigtigste UCP af brunt og beige fedt og AAC i ikke-fedtvæv. Vi kan ikke helt udelukke muligheden for eksistensen af andre H ^{+ -}strømme, der ikke formidles af UCP1 og AAC. Men hvis der findes andre H ^{+ -}strømme, var deres amplitude uden for opløsningen af vores elektrofysiologiske opsætning. Vi måler ^{ikke H+} pumpning af ETC under de betingelser, der er beskrevet i dette papir. Når vi har nået hele IMM-konfigurationen, vaskes mitokondriematrixen ud ved perfusion af intrapipetteopløsningen. Intermembranrummet eksisterer ikke længere siden trinnet med at bryde OMM med den franske presse. Der er ikke tilsat substrater af de respiratoriske komplekser, der er afgørende ^{for H+}-pumpning gennem ETC. Det er derfor usandsynligt, at der udvikles aktiv H^+-pumpning under de elektrofysiologiske forhold, der er beskrevet her.

Enkeltkanaloptagelser af udskårne patches er ikke beskrevet i denne artikel. Selvom UCP1- og AAC-afhængige H ⁺ -strømme på tværs af IMM er robuste på grund af deres høje proteintæthed, kunne enkeltkanalåbningerne ikke løses, fordi amplituden af UCP1- og AAC-enhedsstrømme sandsynligvis er for lille.

I modsætning til biokemiske undersøgelser behøver den mitokondrielle isolation, der er beskrevet i denne artikel, ikke at resultere i et højt niveau af mitokondriel renhed. Faktisk scannes mitokondriepræparatet bestående af en lang række individualiserede mitoplaster og celleaffald under mikroskopet for at finde en 8-formet mitoplast at lappe. Den 8-formede form af mitoplasten skyldes frigivelse af IMM gennem et hul i OMM forårsaget af stempelkandeproceduren (figur 2). Den mindre tætte lap svarer til IMM^15,17. Et passende præparat kan defineres ved frit bevægelige mitoplaster, der let kan skelnes fra cellulært affald. Det er dog vigtigt at reducere antallet af snavs for at undgå forurening af IMM, hvilket kan påvirke kvaliteten af tætningen af glaspipetten med membranen. Dette scanningstrin under mikroskopet gør det muligt at vælge en mitoplast med høj IMM-integritet, der genkendes af en mindre tæt lap end den, der er afgrænset af OMM og øger derfor chancerne for et vellykket indbrud.

Denne teknik gav for første gang den direkte måling af UCP1- og AAC-afhængige H ^{+ -} strømme i deres oprindelige membran. Imidlertid eksisterer mitokondriel integritet og opdeling ikke længere på grund af BRUD PÅ OMM og sandsynligvis cristae. Det er derfor vigtigt at supplere patch-clamp analyse med andre klassiske metoder såsom mitokondriel respiration for at bekræfte den fysiologiske rolle af nyligt karakteriserede proteiner i intakte mitokondrier.

Patch-clamp-teknikken, der anvendes på mitokondrier, giver nye muligheder for bedre at forstå de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for mitokondriel H ⁺ lækage og termogenese. Kombineret med moderne cellulære og molekylære teknikker vil denne innovative tilgang give ny indsigt i de mekanismer, der styrer mitokondriernes termogene kapacitet, og hvordan de kan målrettes mod at bekæmpe sygdomme forbundet med mitokondriel dysfunktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253