L'uso della tecnica Patch-Clamp per studiare la capacità termogenica dei mitocondri

Summary

Questo articolo sul metodo descrive in dettaglio i passaggi principali nella misurazione della perdita di H ⁺ attraverso la membrana mitocondriale interna con la tecnica patch-clamp, un nuovo approccio per studiare la capacità termogenica dei mitocondri.

Abstract

La termogenesi mitocondriale (nota anche come disaccoppiamento mitocondriale) è uno degli obiettivi più promettenti per aumentare il dispendio energetico per combattere la sindrome metabolica. I tessuti termogenici come i grassi marroni e beige sviluppano mitocondri altamente specializzati per la produzione di calore. Anche i mitocondri di altri tessuti, che producono principalmente ATP, convertono fino al 25% della produzione totale di energia mitocondriale in calore e possono, quindi, avere un impatto considerevole sulla fisiologia di tutto il corpo. La termogenesi mitocondriale non è solo essenziale per mantenere la temperatura corporea, ma previene anche l'obesità indotta dalla dieta e riduce la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) per proteggere le cellule dal danno ossidativo. Poiché la termogenesi mitocondriale è un regolatore chiave del metabolismo cellulare, una comprensione meccanicistica di questo processo fondamentale aiuterà nello sviluppo di strategie terapeutiche per combattere molte patologie associate alla disfunzione mitocondriale. È importante sottolineare che i precisi meccanismi molecolari che controllano l'attivazione acuta della termogenesi nei mitocondri sono scarsamente definiti. Questa mancanza di informazioni è in gran parte dovuta alla scarsità di metodi per la misurazione diretta delle proteine disaccoppiate. Il recente sviluppo della metodologia patch-clamp applicata ai mitocondri ha permesso, per la prima volta, lo studio diretto del fenomeno all'origine della termogenesi mitocondriale, la fuoriuscita di H⁺ attraverso l'IMM, e la prima caratterizzazione biofisica dei trasportatori mitocondriali responsabili di esso, la proteina di disaccoppiamento 1 (UCP1), specifica dei grassi bruni e beige, e il trasportatore ADP/ATP (AAC) per tutti gli altri tessuti. Questo approccio unico fornirà nuove informazioni sui meccanismi che controllano la perdita di H ⁺ e la termogenesi mitocondriale e su come possono essere mirati a combattere la sindrome metabolica. Questo articolo descrive la metodologia patch-clamp applicata ai mitocondri per studiare la loro capacità termogenica misurando direttamente le correnti H ⁺ attraverso l'IMM.

Introduction

I mitocondri sono famosi per essere la centrale elettrica della cellula. In effetti, sono la principale fonte di energia chimica, l'ATP. Ciò che è meno noto è che anche i mitocondri generano calore. Infatti, ogni mitocondrio genera costantemente i due tipi di energie (ATP e calore) e un sottile equilibrio tra le due forme energetiche definisce l'omeostasi cellulare metabolica (Figura 1). Come i mitocondri distribuiscano energia tra ATP e calore è sicuramente la questione più fondamentale nel campo della bioenergetica, anche se è ancora in gran parte sconosciuta. Sappiamo che aumentare la produzione di calore mitocondriale (chiamata termogenesi mitocondriale) e di conseguenza ridurre la produzione di ATP aumenta il dispendio energetico e questo è uno dei modi migliori per combattere la sindrome metabolica¹.

La termogenesi mitocondriale ha origine dalla perdita di H⁺ attraverso la membrana mitocondriale interna (IMM), che porta al disaccoppiamento dell'ossidazione del substrato e alla sintesi di ATP con conseguente produzione di calore, da cui il nome "disaccoppiamento mitocondriale"¹ (Figura 1). Questa ^{perdita di H +} dipende dai trasportatori mitocondriali chiamati proteine di disaccoppiamento (UCP). UCP1 è stato il primo UCP identificato. È espresso solo in tessuti termogenici, grasso bruno e grasso beige in cui i mitocondri sono specializzati per la produzione di calore ^2,3,4. L'identità di UCP nei tessuti non adiposi come il muscolo scheletrico, il cuore e il fegato, è rimasta controversa. I mitocondri in questi tessuti possono avere circa il 25% dell'energia mitocondriale totale convertita in calore, che può avere un impatto significativo sulla fisiologia di tutto il corpo¹. Oltre a mantenere la temperatura corporea interna, la termogenesi mitocondriale previene anche l'obesità indotta dalla dieta riducendo le calorie. Inoltre, riduce la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da parte dei mitocondri per proteggere le cellule dal danno ossidativo¹. Pertanto, la termogenesi mitocondriale è coinvolta nel normale invecchiamento, nei disturbi degenerativi legati all'età e in altre condizioni che coinvolgono lo stress ossidativo, come l'ischemia-riperfusione. Pertanto, la termogenesi mitocondriale è un potente regolatore del metabolismo cellulare e una comprensione meccanicistica di questo processo fondamentale promuoverà lo sviluppo di strategie terapeutiche per combattere molte patologie associate alla disfunzione mitocondriale.

La respirazione mitocondriale è stata la prima tecnica a rivelare il ruolo cruciale della termogenesi mitocondriale nel metabolismo cellulare ed è ancora la più popolare nella comunità¹. Questa tecnica si basa sulla misurazione del consumo di ossigeno da parte della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETC) che aumenta quando viene attivata la perdita mitocondriale di H⁺. Questa tecnica, sebbene strumentale, non può studiare direttamente la perdita mitocondriale di H⁺ attraverso l'IMM¹, rendendo così difficile l'identificazione e la caratterizzazione precisa delle proteine responsabili, in particolare nei tessuti non adiposi in cui la produzione di calore è secondaria rispetto alla produzione di ATP. Recentemente, lo sviluppo della tecnica patch-clamp applicata ai mitocondri, ha fornito il primo studio diretto della perdita di H⁺ attraverso l'intero IMM in vari tessuti ^5,6,7.

Il patch-clamp mitocondriale dell'intero IMM è stato stabilito per la prima volta in modo riproducibile da Kirichok et ^al.8. Hanno descritto la prima misurazione diretta delle correnti dell'uniporter di calcio mitocondriale (MCU) nel 2004 utilizzando mitoplasti delle linee cellulari COS-7⁸. Più tardi, il laboratorio kirichok ha mostrato correnti di calcio da IMM dei tessuti di topo⁹ e Drosophila ⁹. Altri laboratori ora usano abitualmente questa tecnica per studiare le proprietà biofisiche di MCU 10,11,12,13,14. È anche possibile l'analisi intera del patch-clamp IMM della conduttanza di potassio e cloruro ed è stata menzionata in diversi articoli, ma non è ancora stata l'oggetto principale di una pubblicazione ^6,7,9. La prima misurazione delle correnti H ⁺ attraverso l'IMM è stata riportata nel 2012 dai mitocondri di grasso bruno del topo⁶ e dai mitocondri di grasso beige del topo nel 2017⁷. Questa corrente è dovuta alla specifica proteina di disaccoppiamento dei tessuti termogenici, UCP1 ^6,7. Recenti lavori pubblicati nel 2019 hanno caratterizzato l'AAC come la principale proteina responsabile della perdita di H⁺ mitocondriale nei tessuti non adiposi come il cuore e il muscolo scheletrico⁵.

Questo approccio unico consente ora l'analisi funzionale diretta ad alta risoluzione dei canali ionici mitocondriali e dei trasportatori responsabili della termogenesi mitocondriale. Per facilitare l'espansione del metodo e per integrare altri studi come la respirazione mitocondriale, di seguito viene descritto un protocollo dettagliato per misurare le correnti H ⁺ trasportate da UCP1 e AAC. Vengono descritti tre passaggi importanti: 1) isolamento mitocondriale dal grasso bruno del topo per analizzare la corrente H⁺ dipendente da UCP1 e l'isolamento mitocondriale dal cuore per analizzare la corrente H⁺ dipendente da AAC, 2) preparazione di mitoplasti con una pressa francese per la rottura meccanica della membrana mitocondriale esterna (OMM), 3) registrazioni patch-clamp di correnti H⁺ UCP1 e AAC-dipendenti su tutto l'IMM.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sugli animali che sono state eseguite sono conformi alle linee guida del National Institutes of Health e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della California di Los Angeles.

NOTA: La procedura di isolamento mitocondriale si basa sulla centrifugazione differenziale e varia leggermente da tessuto a tessuto. Ad esempio, poiché il tessuto adiposo bruno è estremamente ricco di lipidi, richiede un ulteriore passaggio per separare i detriti cellulari e gli organelli dalla fase lipidica prima di raccogliere i mitocondri. Per evitare confusione, le due procedure di isolamento mitocondriale (una dal grasso bruno e l'altra dal cuore) sono dettagliate di seguito.

1. Isolamento mitocondriale dal grasso bruno interscapolare di topo (modificato da Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Eutanasia del topo maschio C57BL/6 utilizzando l'asfissia di CO₂ e la successiva lussazione cervicale, come raccomandato dall'American Veterinary Medical Association Panel e dal Comitato IACUC.
2. Dopo aver posizionato il mouse con la pancia rivolta verso il tavolo, spruzzare alcool per pulire e bagnare i capelli (modificato da Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Fai un'incisione di 2 cm nella parte superiore della schiena dopo aver afferrato la pelle con una pinzetta.
4. Estrarre il grasso interscapolare marrone del topo che corrisponde a un organo bilobato a forma di farfalla¹⁶.
5. Trasferire il grasso bruno in una capsula di Petri da 35 mm riempita con 5 ml di tampone di isolamento a freddo (Tabella 1) precedentemente posto sul ghiaccio.
6. Pulire il grasso bruno dal grasso bianco sotto un binocolo.
7. Trasferire il grasso bruno in un becher da 10 ml con 5 ml di tampone di isolamento a freddo (Tabella 1) per tagliarlo in pezzi sottili. Trasferire all'omogeneizzatore di vetro da 10 ml raffreddato a ghiaccio (pestello in politetrafluoroetilene (PTFE) di materiale plastico).
8. Utilizzare un agitatore sopraelevato per omogeneizzare il tessuto pre-tagliato sul ghiaccio con sei colpi delicati a una velocità controllata di 275 rotazioni / min.
9. Centrifugare l'omogeneizzato a 8.500 x g per 10 min a 4 °C in un tubo conico ghiacciato da 15 ml. Scartare il surnatante contenente la fase lipidica.
10. Risospesare il pellet in 5 mL di tampone di isolamento ghiaccio-freddo (Tabella 1) e omogeneizzare, una seconda volta, la sospensione su ghiaccio con sei colpi lenti ad una velocità di 275 rotazione/min.
11. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo conico ghiacciato da 15 ml e centrifugarlo a 700 x g per 10 minuti a 4 °C per pellettificare tutti i nuclei e le cellule ininterrotte.
12. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 15 ml e metterlo sul ghiaccio.
13. Centrifugare il surnatante a 8.500 x g per 10 min a 4 °C per ottenere un pellet contenente mitocondri.
14. Resuspend pellet contenente mitocondri in 3,8 mL di tampone ipertonico-mannitolo ghiacciato (Tabella 2) e incubare la sospensione mitocondriale su ghiaccio per 10-15 min.

2. Isolamento mitocondriale dal cuore del topo (modificato da Garg et al. 2019)¹⁷

1. Eutanasia del topo maschio C57BL/6 utilizzando l'asfissia di CO₂ e la successiva lussazione cervicale, come raccomandato dall'American Veterinary Medical Association Panel e dal Comitato IACUC.
2. Dopo aver posizionato il mouse sulla schiena, spruzzare alcool per pulire e bagnare i capelli. Quindi, fai un'incisione di 2 cm sul torace dopo aver afferrato la pelle con una pinzetta.
3. Sezionare il cuore dal petto dell'animale e risciacquarlo per rimuovere tutto il sangue in un becher da 10 ml con 5 ml della soluzione di isolamento a freddo (Tabella 1).
4. Una volta che il cuore è stato eliminato da tracce di sangue, trasferirlo in un altro becher da 10 ml contenente 5 ml di tampone di isolamento freddo (Tabella 1) per tagliarlo in pezzi sottili. Quindi, trasferire su un omogeneizzatore di vetro da 10 ml raffreddato a ghiaccio (pestello ptfe).
5. Utilizzare un agitatore sopraelevato per omogeneizzare il tessuto pre-tagliato sul ghiaccio con sei colpi delicati a una velocità controllata di 275 rotazioni / min.
6. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo conico ghiacciato da 15 ml e centrifugarlo a 700 x g per 10 minuti a 4 °C in nuclei di pellet e cellule ininterrotte.
7. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 15 ml e metterlo sul ghiaccio.
8. Centrifugare il surnatante a 8.500 x g per 10 min a 4 °C per ottenere un pellet contenente mitocondri.
9. Sospendere il pellet mitocondriale in 3,8 mL di tampone ipertonico-mannitolo ghiacciato (Tabella 2) e incubare la sospensione mitocondriale sul ghiaccio per 10-15 min.

3. Preparazione di mitoplasti con una pressa francese per la rottura meccanica dell'OMM.

NOTA: La procedura di stampa francese consente all'IMM di essere rilasciato dall'OMM con la sua integrità preservata, compresa la matrice e la crista (Figura 2)¹⁸. I mitocondri sono pre-incubati in un tampone ipertonico-mannitolo (Tabella 2) e sottoposti a una pressione inferiore durante la procedura di stampa francese per evitare qualsiasi drastico allungamento dell'IMM quando l'OMM viene rotto.

1. Riempire la sospensione mitocondriale-ipertonica-mannitolo in una mini cella di pressione refrigerata (diametro del pistone 3/8") della pressa francese (Figura 3A).
2. Selezionare la modalità Medium della French Press e comprimere la sospensione attraverso la mini cella di pressione a 110 sul quadrante della French Press per i mitocondri di grasso bruno e a 140 per i mitocondri cardiaci (~ 2.000 psi).  Assicurarsi che la sospensione esca dalla mini cella di pressione ad una velocità di circa 1 goccia/s.
3. Raccogliere le gocce in un tubo conico refrigerato con ghiaccio da 15 ml.
4. Centrifugare la sospensione a 10.500 x g per 10 min a 4 °C.
5. Sospendere il pellet di mitoplasti in 0,5-2 ml di tampone Hypertonic-KCl ghiacciato (Tabella 3) e conservare la sospensione su ghiaccio.
   NOTA: i mitoplasti grassi bruni e cardiaci sono pronti per le registrazioni patch-clamp e dovrebbero rimanere utilizzabili per circa 3-6 ore.

4. Registrazioni elettrofisiologiche di perdite di H⁺ attraverso UCP1 e AAC ^5,7,15

NOTA: Utilizzare la seguente configurazione elettrofisiologica (Figura 3B): microscopio invertito con contrasto di interferenza differenziale (DIC), obiettivo di immersione in acqua 60x, tavola di isolamento dalle vibrazioni e gabbia di Faraday, amplificatore standard che supporta registrazioni a basso rumore, digitalizzatore standard utilizzato per la configurazione elettrofisiologica, pClamp 10, un micromanipolatore, elettrodo di riferimento del bagno (ponte di sale KCl-agar 3 M inserito all'interno di un supporto microelettrodo contenente un pellet di cloruro d'argento / argento stampato nel corpo del supporto (descritto in Liu et al. 2021)¹⁹, camera di perfusione con un fondo di copertura in vetro da 0,13 mm, collegato a un sistema di perfusione alimentato a gravità.

1. Tirare i filamenti di vetro borosilicato il giorno della registrazione utilizzando un estrattore di micropipette. Impostare un programma sull'estrattore utilizzato per generare pipette con un alto grado di riproducibilità²⁰.
   NOTA: la progettazione di questo programma richiede diversi tentativi per ottenere pipette ottimizzate per il patch-clamp IMM. Una pipetta standard ha punte sottili con una forma conica progressiva.
2. Inserire un filamento di vetro all'interno dell'estrattore e tirare per ottenere quasi due pipette patch identiche da un filamento di borosilicato.
3. Regolare il programma quando le pipette diventano incoerenti tra i cicli di trazione a causa dell'invecchiamento del filamento della scatola di riscaldamento dell'estrattore.
4. Posizionare la pipetta all'interno della lucidatrice per pipette e posizionare la punta vicino al filamento sotto l'ingrandimento di 100x per lucidarlo a fuoco.
5. Premere più volte il pedale per riscaldare il filamento senza intasare o danneggiare la curva della punta.
6. Lucidare fino a ottenere pipette con una resistenza compresa tra 25 e 35 MΩ quando riempite con soluzione di pipetta a base di TMA (TMA per idrossido di tetrametilammonio, Tabella 4).
7. Pre-incubare i coverslip (diametro 5 mm, spessore 0,1 mm) con gelatina allo 0,1% per ridurre l'adesione del mitoplasto e sciacquarli con la soluzione da bagno KCl (Tabella 5) prima di depositare la sospensione di mitoplasti.
8. Preparare una diluizione grezza mescolando ~ 35 μL della sospensione concentrata di mitoplasti con 500 μL della soluzione da bagno KCl (Tabella 5) e posizionarla su coverslip precedentemente collocati in un pozzetto di una piastra a 4 pozzetti.
9. Incubare sul ghiaccio per 15-20 minuti affinché i mitoplasti si sedimentino sulla copertina.
10. Riempire completamente la camera da bagno con ~ 50 μL della soluzione da bagno KCl (Tabella 5).
11. Trasferire un coverslip con mitoplasti all'interno della camera utilizzando sottili pinzette a microdissezione con una punta piegata.
12. Disporre il coverslip nella parte inferiore della camera. Non perfondere la camera per mantenere i mitoplasti stabili sul coperchio.
13. Scegli un singolo mitoplasto non adesivo a forma di 8 scansionando il coverslip al microscopio con un obiettivo 60x.
14. Caricare la pipetta con la soluzione di pipetta (~50 μL) e posizionarla nel supporto della pipetta.
15. Portare la pipetta nella soluzione da bagno con un micromanipolatore e avvicinarla appena sopra il mitoplasto selezionato per avvicinarsi all'IMM. Il programma amplificatore dà la resistenza della pipetta una volta che è nella soluzione del bagno. Mantenere il potenziale di membrana a 0 mV e applicare impulsi da 10 mV utilizzando il comando di test a membrana nel programma dell'amplificatore.
16. Applicare una leggera pressione negativa per creare rapidamente un gigaseal con l'IMM (Figura 2B).
17. Sollevare la pipetta con il mitoplasto attaccato per tenerli lontani dal coperchio per evitare la rottura della guarnizione dovuta alla deriva della pipetta durante l'esperimento.
18. Compensare i transitori di capacità vagante con il comando "test di membrana" nel programma dell'amplificatore prima di testare la configurazione dell'intero mitoplasto per ottenere una corretta misurazione della capacità (Cm) per la membrana del mitoplasto dopo l'irruzione.
19. Applicare impulsi di tensione di breve durata (5-15 ms) (250-600 mV) con il programma dell'amplificatore per rompere la patch di membrana sotto la pipetta di vetro e ottenere la configurazione dell'intero mitoplasto (Figura 2C). L'irruzione riuscita si riflette nella ricomparsa dei transitori di capacità.
20. Dopo l'irruzione, montare i transitori di capacità con l'opzione di test a membrana del programma amplificatore per valutare la capacità della membrana (che riflette le dimensioni del mitoplasto) e la sua resistenza di accesso Ra (che riflette la qualità della configurazione dell'intero mitoplasto). Dopo l'irruzione, Ra dovrebbe essere compreso tra 40 e 80 MΩ. I mitoplasti (2-6 μm di dimensione) utilizzati per gli esperimenti di patch-clamp hanno tipicamente capacità di membrana di 0,5-1,1 pF.
21. Immediatamente dopo l'effrazione, sostituire la soluzione da bagno KCl (Tabella 5) con la soluzione da bagno HEPES (Tabella 6) avviando la perfusione.
22. Applicare un protocollo di rampa da 850 ms progettato con il programma amplificatore, da -160 mV a +100 mV con un intervallo di 5 s, mantenendo il mitoplasto a 0 mV. Questo protocollo funziona per gli studi UCP1 ^6,7,15 e AAC 5 (Figura 4 e Figura 5).
    NOTA: si consiglia per le misurazioni di corrente H⁺ dipendenti da UCP1 e AAC di acquisire tutti i dati elettrofisiologici a 10 kHz e di filtrare a 1 kHz utilizzando un software adeguato che aziona l'amplificatore e il digitalizzatore.

Representative Results

Lo sviluppo della metodologia patch-clamp applicata ai mitocondri ha fornito il primo studio diretto della perdita di H⁺ attraverso l'IMM e i trasportatori mitocondriali, UCP1 e AAC, che ne sono responsabili. L'analisi elettrofisiologica delle perdite H⁺ dipendenti da UCP1 e AAC può fornire una prima occhiata alla capacità termogenica dei mitocondri. La sezione dei risultati descrive le procedure standard per misurare la perdita ^{di H+} tramite UCP1 e AAC.

Misurazione della corrente H⁺ dipendente da UCP1 (Figura 4)^6,7,15
L'applicazione del protocollo di rampa di tensione induce una corrente H⁺ di grande ampiezza attraverso l'IMM di grasso bruno senza l'aggiunta di acidi grassi esogeni (FA), gli attivatori richiesti delle OCP (Figura 4A). Questa è una caratteristica specifica del grasso marrone e beige IMM a causa della produzione locale di FA da parte di un'attività fosfolipasi associata alla membrana. Quando la corrente H⁺ si sviluppa in risposta al protocollo di rampa, è importante attendere che l'ampiezza di corrente si stabilizzi. La quantificazione dell'ampiezza della corrente H⁺ tramite UCP1 richiede la determinazione della linea di base corrispondente a una corrente UCP1 pari a zero. Una volta raggiunta la stabilità dell'ampiezza di corrente H⁺, si raccomanda di perfondere l'inibitore UCP1 Guanosina difosfato (GDP - 1 mM, Figura 4A) o un chelante FA (albumina sierica bovina priva di 0,5% FA, non mostrata) o 10 mM di metil beta ciclodestrina (MβCD) per l'estrazione endogena della membrana FA, Figura 4B, traccia nera). La corrente residua è la corrente da cui verrà determinata l'ampiezza delle correnti UCP1. Per aiutare a confrontare le ampiezze delle correnti UCP1 in diversi mitoplasti, la densità di corrente (pA / pF) di ciascun mitoplasto viene calcolata normalizzando le correnti UCP1 con la capacità mitoplasta (Cm) ^5,7. La corrente può essere riattivata con l'aggiunta di FA esogena a catena lunga utilizzando acido arachidonico (AA) o acido oleico (OA) (1-2 μM). Poiché sia gli IMM grassi marroni che quelli beige possiedono attività PLA2, le FA a membrana endogena vengono parzialmente rigenerate entro pochi minuti dal lavaggio dell'MβCD/albumina dal bagno, portando alla riattivazione della corrente H⁺ tramite UCP1 ^6,7. Come previsto, questa corrente scompare completamente nell'IMM dei topi UCP1^-/- (Figura 4A)^6,7.

Un modo più preciso per confrontare la densità e l'attività di UCP1 di diversi mitoplasti dello stesso tessuto o di mitoplasti di tessuti diversi (grasso marrone e beige) è quello di controllare la concentrazione di FA sulla superficie dell'IMM ^6,7. Infatti, l'ampiezza di corrente H⁺ potrebbe variare tra i mitoplasti a causa della quantità di proteina UCP1 per IMM ma anche a causa della produzione di FA endogena. Pertanto, si raccomanda di estrarre la FA endogena dall'IMM e di riattivare la corrente H⁺ dipendente da UCP1 aggiungendo FA esogena a una concentrazione nota. Per fare ciò, le FA endogene devono prima essere estratte dall'IMM perfondendo una soluzione di bagno HEPES (Tabella 6) contenente 10 mM MβCD. Quindi, per consentire la riattivazione della corrente H⁺ tramite UCP1 solo da una concentrazione precisa di FA esogeni, quest'ultima sarà perfusa su uno sfondo HEPES/MβCD per estrarre continuamente i FA prodotti dall'IMM.

Lo studio della competizione tra nucleotide purinico e FA per il legame a UCP1 è possibile anche con la tecnica patch-clamp ^6,7,15. L'inibizione di UCP1 da parte di nucleotidi purinici (ad esempio, MG²⁺ ATP libero) può essere paragonata a due diverse concentrazioni di FA (idealmente 10 volte). A tale scopo, la membrana endogena FA viene prima rimossa applicando 10 mM MβCD (Figura 4B, traccia nera). L'applicazione di FA esogeni (ad esempio, qui, sono mostrati solo 0,5 mM FA) applicati su uno sfondo di 10 mM MβCD consente un controllo preciso della concentrazione di FA attivanti perché i FA prodotti localmente vengono immediatamente estratti dalla membrana. In questa condizione, le FA esogene sono le principali responsabili dello sviluppo ^{della corrente H}+. Diverse concentrazioni di ATP vengono successivamente aggiunte alla soluzione OA/MβCD per valutare_l'ATP IC50 per ogni concentrazione di FA testata e, quindi, stabilire se la FA compete con i nucleotidi purinici per il legame a UCP1.

Misurazione della corrente H⁺ dipendente dall'AAC (Figura 5)⁵
A differenza del grasso bruno, l'IMM dei tessuti non adiposi come il muscolo scheletrico e il cuore non sviluppa un H⁺ misurabile subito dopo l'irruzione (Figura 5, tracce nere). Per indurre una corrente H⁺ misurabile attraverso AAC, è essenziale applicare la soluzione bagnonica HEPES (Tabella 6) contenente 1-2 μM di FA esogena (AA, Figura 5A, traccia rossa). Ciò potrebbe indicare che l'IMM dei tessuti non adiposi non ha un macchinario di produzione FA nell'IMM come si trova nell'IMM dei grassi marroni e beige.

La linea di base (o corrente zero) per la quantificazione dell'ampiezza di corrente H⁺ tramite AAC corrisponde alla soluzione bagno hepes (Tabella 6) perfusa sulla superficie dell'IMM prima dell'aggiunta di FA. Per confermare che la corrente H⁺ misurata è trasportata dall'AAC, è importante applicare inibitori specifici dell'AAC aggiunti alla FA, 1 μM di carbossiatractiloside (CATR, Figura 5A) o 4 μM di acido bonkgrechico (BKA, non mostrato)⁵, che inibiscono quasi completamente la corrente H⁺ . Questa corrente scompare completamente nell'IMM dei topi AAC1^-/- (Figura 5A), essendo AAC1 l'isoforma predominante nel cuore⁵.

L'analisi patch-clamp dell'interazione tra perdita H⁺ FA-dipendente e nucleotidi è possibile anche con AAC⁵. Tuttavia, c'è un'importante differenza tra AAC e UCP1: AAC non solo trasporta H ⁺ , ma la sua funzione principale è quella di trasportare i nucleotidi adeninici ADP e ATP²¹. Per studiare come lo scambio nucleotidico di adenina influisce sulla perdita di H⁺ dipendente dalla FA, alla soluzione di pipetta viene aggiunto 1 mM mg²⁺ ADP libero. Quindi, i FA vengono perfusi per attivare la corrente H ⁺ tramite AAC. Solo l'ADP nella soluzione di pipetta non interferisce con la corrente H^{+ 5}. Una volta raggiunta un'ampiezza di corrente H⁺ stabile, l'ADP viene perfuso contemporaneamente alla FA. Solo quando l'ADP è presente su entrambi i lati della membrana per generare uno scambio nucleotidico attivo tramite AAC si ottiene un'inibizione costante ma mai completa della perdita di H⁺ (Figura 5B). Ciò può indicare che le due modalità di trasporto di AAC (fa-H⁺ corrente e scambio ADP/ATP) competono e sono suscettibili di verificarsi attraverso la stessa via di traslocazione. L'omossidazione ADP/ADP è stata selezionata per evitare la corrente aggiuntiva associata all'eteroscambio fisiologico ADP/ATP⁵.

Figura 1: Distribuzione dell'energia mitocondriale tra calore e produzione di ATP. Meccanismi di ATP mitocondriale e produzione di calore. I mitocondri hanno due membrane [l'OMM (viola) e l'IMM (arancione)], che contengono i macchinari per l'ATP e la produzione di calore. L'ETC genera un gradiente elettrochimico di H⁺ attraverso l'IMM, che viene utilizzato dall'ATP sintasi (AS) per produrre ATP e utilizzato dagli OCP per generare calore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Tecnica del patch-clamp mitocondriale (modificata da Bertholet et al. 2020)¹⁵. (A) I mitocondri sono isolati dal lisato tissutale mediante centrifugazione (OMM in viola e IMM in arancione). (B) La pressa francese a bassa pressione rompe l'OMM per rilasciare l'IMM che dà un mitoplasto. Il pannello di sinistra rappresenta un mitoplasto, che assume una forma a forma di 8 con resti dell'OMM attaccati all'IMM. Una pipetta di vetro viene avvicinata all'IMM per formare un sigillo gigaohm (configurazione attaccata al mitoplasto). Una fotografia della configurazione attaccata al mitoplasto è mostrata nel pannello di destra. (C) La configurazione dell'intero IMM (diagramma nel pannello di sinistra) si ottiene dopo aver rotto la patch di membrana sotto la pipetta da diversi impulsi di tensione (200-500 mV). Una fotografia dell'intera configurazione IMM è mostrata nel pannello di destra. Le correnti verso l'interno (I, rosso) sono negative. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: French Press e configurazione elettrofisiologica. (A) Immagine della stampa francese, che aiuta a rompere l'OMM per rilasciare l'IMM. (B) Immagine di una gabbia di Faraday, microscopio invertito con contrasto di interferenza differenziale (DIC), obiettivo di immersione in acqua 60x, una tavola di isolamento dalle vibrazioni e un micromanipolatore. L'amplificatore standard, un digitalizzatore standard e il computer PC non sono mostrati nell'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Corrente H⁺ tramite UCP1 nel grasso bruno. (A) Corrente H⁺ rappresentativa UCP1-dipendente registrata da mitoplasti di grasso bruno isolati da topi WT (pannello superiore) e UCP1^−/− (pannello inferiore). Le tracce di corrente H⁺ di controllo mostrate in nero corrispondono all'ampiezza di corrente stabilizzata dopo che l'IMM è stato rotto. 1 mM di PIL viene quindi aggiunto alla soluzione da bagno (arancione). Il protocollo di rampa di tensione è mostrato sopra le tracce WT. Il pH delle soluzioni bagno e pipetta è mostrato nel diagramma pipetta-mitoplasto. B) Inibizione di UCP1 da parte di nucleotidi purinici nel grasso bruno. Tracce rappresentative di corrente H⁺ UCP1-dipendenti in varie concentrazioni di ATP sulla faccia citosolica dell'IMM di grasso bruno di topi a termoneutralità. La corrente H⁺ dipendente da UCP1 è stata attivata con acido oleico (OA) 0,5 mM miscelato con MβCD da 10 mM.Il protocollo di tensione è indicato nella parte superiore. Nel pannello inferiore, la stessa traccia è rappresentata ma non normalizzata con la capacità della membrana mitoplastica. Il mitoplasto grasso bruno in questa figura aveva una capacità di membrana di 0,624 pF. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Corrente H⁺ FA-dipendente tramite AAC nel mitoplasto cardiaco. (A) Corrente H⁺ rappresentativa AAC-dipendente quando applicata 2 μM AA nella soluzione da bagno (pannello superiore, arancione) nei mitoplasti cardiaci WT e inibita da 1 μM CATR (viola). Le tracce rappresentative registrate nel mitoplasto cardiaco AAC1 ^−/− sono nel pannello inferiore. La corrente di controllo è in nero. Il protocollo di rampa di tensione è mostrato sopra le tracce WT. Il pH delle soluzioni bagno e pipetta è mostrato nel diagramma pipetta-mitoplasto. (B) Mentre la soluzione di pipetta conteneva 1 mM di ADP, la corrente H⁺ dipendente dall'AAC è indotta da 2 μM AA (arancione) e inibita dall'aggiunta di 1 mM di ADP al bagno (viola). Il protocollo di rampa di tensione è mostrato sopra la traccia. Il pH delle soluzioni bagno e pipetta è mostrato nel diagramma pipetta-mitoplasto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reagente	Concentrazione finale
saccarosio	250 metri quadrati
HEPES ·	10 mM
EGTA	1 mM
pH regolato a 7,2 con TrisBase

Tabella 1: Tampone di isolamento mitocondriale (tonicità ~ 300 mmol per kg)

Reagente	Concentrazione finale
saccarosio	140 metri quadrati
D-mannitolo	440 metri quadrati
HEPES ·	10 mM
EGTA	1 mM
pH regolato a 7,2 con TrisBase

Tabella 2: Tampone ipertonico-mannitolo

Reagente	Concentrazione finale
Kcl	750 metri quadrati
HEPES ·	20 mM
EGTA	1 mM
pH regolato a 7,2 con TrisBase

Tabella 3: Tampone Hypertonic-KCl

Reagente	Concentrazione finale
Tma	130 mM
HEPES ·	100 metri
EGTA	1 mM
MgCl2 per registrazioni UCP1	2 mM
o
TrisCl per registrazioni AAC
pH regolato a 7,0 o 7,5 con acido D-gluconico

Tabella 4: Soluzione di pipetta a base di TMA (tonicità ~ 360 mmol per kg)

Reagente	Concentrazione finale
Kcl	150 metri quadrati
HEPES ·	10 mM
EGTA	1 mM
pH regolato a 7,0 con TrisBase

Tabella 5: Soluzione da bagno KCl (tonicità ~ 300 mmol per kg)

Reagente	Concentrazione finale
saccarosio	100 mM per registrazioni UCP1
	o
	150 mM per registrazioni AAC
HEPES ·	150 mM per registrazioni UCP1
	o
	100 mM per registrazioni AAC
1 mM EGTA
pH regolato a 7,0 con TrisBase

Tabella 6: Soluzione da bagno HEPES (tonicità ~ 300 mmol per kg)

Discussion

Questo articolo sul metodo si propone di presentare la tecnica patch-clamp recentemente applicata ai mitocondri, un nuovo approccio per studiare direttamente la perdita di H⁺ attraverso l'IMM responsabile della termogenesi mitocondriale 5,6,7,15. Questa tecnica non è limitata ai tessuti e può anche essere utilizzata per analizzare la perdita di H ⁺ e altre conduttanze dell'IMM in diversi modelli umani e cellulari standard come cellule HAP1, COS7, C2C12 e MEF. Tuttavia, ogni isolamento mitocondriale richiede alcuni aggiustamenti specifici per ogni cellula o tipo di tessuto.

I passaggi principali nella misurazione diretta delle correnti H⁺ attraverso l'IMM del grasso bruno ^5,6 e del cuore⁵ sono qui riassunti per illustrare i meccanismi responsabili della termogenesi mitocondriale nei tessuti termogenici e non adiposi specializzati. Infatti, lo sviluppo di questa tecnica consente per la prima volta l'analisi funzionale ad alta risoluzione dei due principali OCP (UCP1 e AAC) nel loro ambiente di membrana nativo con controllo preciso di condizioni sperimentali critiche quali: 1) pH di soluzioni di pipette e bagni, 2) controllo del potenziale di membrana attraverso l'IMM e 3) composizione precisa di soluzioni per escludere eventuali ioni e metaboliti permeabili all'IMM diversi da H⁺. Le pipette a base di TMA (Tabella 4) e le soluzioni da bagno HEPES (Tabella 6) sono formulate per registrare le correnti H⁺ e contengono solo sali che si dissociano in anioni e cationi di grandi dimensioni normalmente impermeabili all'IMM. Mentre la soluzione del bagno può essere cambiata utilizzando un sistema di perfusione, consentendo l'applicazione di diversi trattamenti sul lato citosolico della membrana, non è possibile modificare la composizione della soluzione intrapipetta. Ciò limita la comprensione dei meccanismi di regolazione che si verificano sul lato della matrice. Infatti, i composti devono essere presenti all'interno della soluzione intrapipetta al momento del riempimento della pipetta. Pertanto, ^la perdita di H + può essere studiata in isolamento da altre correnti. Gli studi farmacologici e l'utilizzo di topi KO sono stati essenziali per la caratterizzazione e l'identificazione delle proteine responsabili della corrente H⁺ attraverso l'IMM di vari tessuti ^5,6,7. Questi risultati hanno stabilito che UCP1 è il principale UCP di grasso marrone e beige e AAC nei tessuti non adiposi. Non possiamo escludere completamente la possibilità dell'esistenza di altre correnti H⁺ non mediate da UCP1 e AAC. Tuttavia, se esistono altre correnti H ⁺, la loro ampiezza era al di là della risoluzione della nostra configurazione elettrofisiologica. Non misuriamo il pompaggio H⁺ dell'ETC nelle condizioni descritte in questo documento. Una volta raggiunta la configurazione IMM intera, la matrice mitocondriale viene lavata via dalla perfusione della soluzione intra-pipetta. Lo spazio intermembrana non esiste più dal passo di rompere l'OMM con la stampa francese. Non sono stati aggiunti substrati dei complessi respiratori cruciali per il pompaggio H⁺ attraverso l'ETC. È quindi improbabile che sviluppi un pompaggio H⁺ attivo nelle condizioni elettrofisiologiche qui descritte.

Le registrazioni a canale singolo delle patch asportate non sono descritte in questo articolo. Sebbene le correnti H⁺ dipendenti da UCP1 e AAC attraverso l'IMM siano robuste a causa della loro elevata densità proteica, le aperture a canale singolo non possono essere risolte perché l'ampiezza delle correnti unitarie UCP1 e AAC è probabilmente troppo piccola.

A differenza degli studi biochimici, l'isolamento mitocondriale descritto in questo articolo non ha bisogno di provocare un alto livello di purezza mitocondriale. In effetti, la preparazione mitocondriale costituita da una moltitudine di mitoplasti individualizzati e detriti cellulari viene scansionata al microscopio per trovare un mitoplasto a forma di 8 da rattoppare. La forma a forma di 8 del mitoplasto è dovuta al rilascio dell'IMM attraverso un foro nell'OMM causato dalla procedura di stampa francese (Figura 2). Il lobo meno denso corrisponde all'IMM ^15,17. Una preparazione adeguata può essere definita da mitoplasti che si muovono liberamente che possono essere facilmente distinti dai detriti cellulari. È, tuttavia, importante ridurre il numero di detriti per evitare la contaminazione dell'IMM, che può influire sulla qualità della tenuta della pipetta di vetro con la membrana. Questa fase di scansione al microscopio consente di scegliere un mitoplasto con elevata integrità IMM riconosciuta da un lobo meno denso di quello delimitato dall'OMM e quindi aumenta le possibilità di un'effrazione riuscita.

Questa tecnica per la prima volta ha fornito la misurazione diretta delle correnti H⁺ dipendenti da UCP1 e AAC all'interno della loro membrana nativa. Tuttavia, l'integrità mitocondriale e la compartimentazione non esistono più a causa della rottura dell'OMM e probabilmente delle cristae. È quindi essenziale integrare l'analisi patch-clamp con altri metodi classici come la respirazione mitocondriale per confermare il ruolo fisiologico delle proteine di nuova caratterizzazione nei mitocondri intatti.

La tecnica patch-clamp applicata ai mitocondri offre nuove possibilità per comprendere meglio i meccanismi molecolari responsabili della perdita di H⁺ mitocondriale e della termogenesi. Combinato con le moderne tecniche cellulari e molecolari, questo approccio innovativo fornirà nuove informazioni sui meccanismi che controllano la capacità termogenica dei mitocondri e su come possono essere mirati a combattere le malattie associate alla disfunzione mitocondriale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253