Summary
Deze studie demonstreert de toediening van een repetitief traumatisch hersenletsel aan muizen en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende intravitale beeldvorming van een tot expressie gebracht neuron EGFP met behulp van twee-fotonmicroscopie.
Abstract
Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe de expressie en lokalisatie van een eiwit van belang in specifieke celtypen van de hersenen van een dier longitudinaal kan worden gevisualiseerd, bij blootstelling aan exogene stimuli. Hier wordt de toediening van een traumatisch hersenletsel (TBI) met gesloten schedel en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen getoond. Muizen worden intracraniaal geïnjecteerd met een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een neuronale specifieke promotor. Na 2 tot 4 weken worden de muizen onderworpen aan een repetitieve TBI met behulp van een gewichtsdruppelapparaat boven de AAV-injectielocatie. Binnen dezelfde chirurgische sessie worden de muizen geïmplanteerd met een metalen hoofdpost en vervolgens een glazen schedelvenster over de TBI-impactplaats. De expressie en cellulaire lokalisatie van EGFP wordt onderzocht met behulp van een microscoop met twee fotonen in hetzelfde hersengebied dat in de loop van maanden aan trauma is blootgesteld.
Introduction
Traumatisch hersenletsel (TBI), dat het gevolg kan zijn van sportblessures, botsingen met voertuigen en militaire gevechten, is een wereldwijd gezondheidsprobleem. TBI kan leiden tot fysiologische, cognitieve en gedragsstoornissen en levenslange invaliditeit of mortaliteit 1,2. De ernst van TBI kan worden geclassificeerd als mild, matig en ernstig, waarbij de overgrote meerderheid milde TBI is (75%-90%)3. Het wordt steeds meer erkend dat TBI, met name herhaalde voorvallen van TBI, neuronale degeneratie kan bevorderen en als risicofactoren kan dienen voor verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en chronische traumatische encefalopathie (CTE)4,5,6. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan TBI-geïnduceerde neurodegeneratie blijven echter onduidelijk en vormen dus een actief studiegebied. Om inzicht te krijgen in hoe neuronen reageren op en herstellen van TBI, wordt hierin een methode beschreven voor het monitoren van fluorescerend gelabelde eiwitten die van belang zijn, met name in neuronen, door middel van longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen na TBI.
Daartoe laat deze studie zien hoe een chirurgische ingreep voor de toediening van gesloten schedel-TBI die vergelijkbaar is met wat eerder is gerapporteerd7,8 kan worden gecombineerd met een chirurgische ingreep voor implantatie van een schedelvenster voor stroomafwaartse intravitale beeldvorming, zoals beschreven door Goldey et al9. Het is met name niet haalbaar om eerst een schedelraam te implanteren en vervolgens een TBI in dezelfde regio uit te voeren, omdat de impact van de gewichtsval die de TBI induceert het venster waarschijnlijk zal beschadigen en onherstelbare schade aan de muis zal toebrengen. Daarom is dit protocol ontworpen om de TBI toe te dienen en vervolgens het schedelvenster direct boven de impactplaats te implanteren, allemaal binnen dezelfde chirurgische sessie. Een voordeel van het combineren van zowel de TBI als de schedelvensterimplantatie in één operatiesessie is een vermindering van het aantal keren dat een muis wordt geopereerd. Verder stelt het iemand in staat om de onmiddellijke respons (d.w.z. op de tijdschaal van uren) op TBI te volgen, in tegenstelling tot het implanteren van het venster bij een latere chirurgische sessie (d.w.z. de eerste beeldvorming die begint op een tijdschaal van dagen na TBI). Het craniale venster en het intravitale beeldvormingsplatform bieden ook voordelen ten opzichte van het monitoren van neuronale eiwitten met conventionele methoden, zoals immunokleuring van vaste weefsels. Er zijn bijvoorbeeld minder muizen nodig voor intravitale beeldvorming, omdat dezelfde muis op meerdere tijdstippen kan worden bestudeerd, in tegenstelling tot afzonderlijke cohorten muizen die nodig zijn voor discrete tijdstippen. Verder kunnen dezelfde neuronen in de loop van de tijd worden gevolgd, waardoor men specifieke biologische of pathologische gebeurtenissen binnen dezelfde cel kan volgen.
Als proof of concept wordt hier de neuronspecifieke expressie van versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) onder de synapsinepromotor gedemonstreerd10. Deze benadering kan worden uitgebreid tot 1) verschillende hersenceltypen door gebruik te maken van andere celtypespecifieke promotors, zoals myeline-basisproteïne (MBP)-promotor voor oligodendrocyten en glia-fibrillair zuur eiwit (GFAP)-promotor voor astrocyten11, 2) verschillende doeleiwitten van belang door hun genen te fuseren met het EGFP-gen, en 3) meerdere eiwitten tot co-expressie te brengen die zijn gefuseerd met verschillende fluoroforen. Hier wordt EGFP verpakt en tot expressie gebracht via adeno-geassocieerd virus (AAV) toediening via een intracraniële injectie. Een TBI met gesloten schedel wordt toegediend met behulp van een apparaat voor gewichtsval, gevolgd door implantatie van een schedelvenster. Visualisatie van neuronale EGFP wordt bereikt door het craniale venster, met behulp van twee-fotonmicroscopie om EGFP-fluorescentie in vivo te detecteren. Met de twee-fotonlaser is het mogelijk om dieper in het corticale weefsel door te dringen met minimale fotoschade, waardoor herhaalde longitudinale beeldvorming van dezelfde corticale regio's binnen een individuele muis gedurende dagen en tot maanden mogelijk is12,13,14,15. Kortom, deze benadering van het combineren van een TBI-operatie met intravitale beeldvorming heeft tot doel het begrip van de moleculaire gebeurtenissen die bijdragen aan TBI-geïnduceerde ziektepathologie te vergroten16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle diergerelateerde protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, gepubliceerd door de commissie van de National Research Council (VS). De protocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Chan Medical School (UMMS) van de Universiteit van Massachusetts (vergunningsnummer 202100057). In het kort, zoals te zien is in het schema van de studie (figuur 1), krijgt het dier een virusinjectie, een TBI, een vensterimplantatie en vervolgens intravitale beeldvorming in een tijdsvolgorde.
OPMERKING: Commerciële termen zijn verwijderd. Raadpleeg de materiaaltabel voor de specifieke apparatuur die wordt gebruikt.
1. Intracraniële injectie van AAV met behulp van een stereotaxisch apparaat
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Gebruik een virale titer van 1 x 1013 virale genomen per milliliter (vg/ml). Syn1 verwijst naar Synapsin1, een neuronale specifieke promotor die beperkte virale expressie in neuronen mogelijk maakt. Het virus kan in eigen beheer worden voorbereid of worden uitbesteed.
- Voorbereiding op stereotactische injectiechirurgie voor toediening van AAV
- Autoclaaf gewone schaar, een chirurgische schuifmaat, chirurgische veerschaar, chirurgische pincet, muggenpincet, gaas, een applicator met wattenstaafje en een glazen microliterspuit.
- Ontsmet het operatiegebied met 75% ethanol. Breid het steriele chirurgische wegwerplaken uit om het operatiegebied op het stereotaxische platform te bedekken.
OPMERKING: Om de lichaamstemperatuur van het dier tijdens de injectieoperatie op peil te houden, gebruikt u een feedbackgestuurd verwarmingsapparaat. - Weeg en registreer het lichaamsgewicht van de muis.
- Open de klep van de zuurstoftank en stel de zuurstofstroom in op 1.5 l/min. Open het anesthesieapparaat en stel de waarde van het isofluraanniveau in op drie.
NOTITIE: Het draaggas kan in deze stap kamerlucht of 100% zuurstof zijn. - Plaats de muis in de inductiekamer en laat deze 5 minuten blijven om volledige anesthesie te bereiken.
- Zodra de muis volledig is verdoofd (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex), haalt u de muis uit de inductiekamer en plaatst u de muiskop in het stereotaxische frame.
- Plaats de neuskegel van de anesthesieslang over de snuit van de muis.
- Handhaaf de anesthesie met 1,5% isofluraan, met draaggas met een stroomsnelheid van 1 l/min tot het einde van de operatie. Controleer regelmatig de ademhalingsfrequentie en knijp tijdens de operatie ten minste elke 15 minuten in de staart of teen om de juiste anesthesie te beoordelen. Pas de isofluraanconcentratie naar wens aan om de gewenste diepte van de anesthesie te behouden.
- Vul een injectiespuit van een microliter (10 μL) met de virusoplossing. Bevestig vervolgens de spuit op de bijpassende micro-injectorpomp van het stereotaxische apparaat.
- Injectie operatie
- Dien buprenorfine (1 mg/kg, subcutaan) toe met behulp van een insulinespuit voor eenmalig gebruik en breng oogzalf aan op de ogen van de muis.
- Verwijder het haar van de hoofdhuid bovenop het hoofd door te knippen met een gewone schaar 1.
- Reinig de hoofdhuid met gaas en wattenstaafjes. Desinfecteer de huid eerst met 75% ethanol en daarna met betadine. Herhaal dit drie keer (d.w.z. ethanol gevolgd door betadine), waarbij u de laatste toepassing van betadine op de huid laat zitten.
- Controleer de anesthesiediepte opnieuw om er zeker van te zijn dat de muis volledig verdoofd is (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex). Maak een incisie van ~ 1 cm met een gewone schaar 2 langs de middellijn om de rechter pariëtale schedel bloot te leggen en verwijder het periosteum met een applicator met wattenstaafje.
- Markeer twee punten op de schedel met een markeerstift op deze coördinaten: punt A: 2,5 mm posterieur van de Bregma en 1 mm lateraal van de middellijn over de rechterhersenhelft; punt B: 2,5 mm posterieur van de Bregma en 2 mm lateraal van de middellijn over de rechterhersenhelft.
- Boor voorzichtig twee gaten door de schedel op de gemarkeerde coördinaten met behulp van een elektrische tandartsboor met een fijne EF4-hardmetalen boor.
OPMERKING: Pas op dat u het hersenweefsel niet beschadigt. - Pas het stereotaxische frame aan om de punt van de microliter-spuitnaald uit te lijnen met het schedelgat dat zich 1 mm lateraal van de middellijn bevindt.
- Laat de naald van de spuit zakken om het hersenoppervlak aan te raken en stel die locatie vervolgens in als het nulpunt (voor de z-as). Laat de punt van de naald in de hersenschors zakken tot een diepte van 0,5 mm en laat langzaam 1 μL van de virusoplossing trekken met een snelheid van 200 nL/min.
- Wacht 5 minuten nadat de virusoplossing volledig in het hersenweefsel is geïnjecteerd voordat u de naald terugtrekt om terugstroming van de oplossing te voorkomen.
- Trek de naald van de spuit langzaam terug. Herhaal de injectie op de andere plaats. Hecht de incisie met een steriele, niet-resorbeerbare chirurgische hechting (6-0 gauge).
- Dien cefazoline [500 mg/kg (333 mg/ml, meestal ~45 μL), intramusculair] en meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) toe na de operatie terwijl het dier nog onder narcose is.
- Haal de muis uit het stereotaxische frame en stop met de anesthesie. Plaats de muis in een schone kooi boven een verwarmingsdeken en houd het dier in de gaten totdat het ambulant is (ongeveer 15 min). Breng vervolgens over naar de thuiskooi.
- Dien buprenorfine (1 mg/kg, subcutaan) en meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) opnieuw toe na respectievelijk 8 uur, 16 uur en 24 uur na de eerste injectie met buprenorfine.
OPMERKING: 2-4 weken na de virusinjectie krijgt de muis TBI en schedelvensterimplantatie op dezelfde plaats als de AAV-injectie.
2. Toediening van een repetitieve TBI-inductie
LET OP: De TBI-parameters zijn aangepast ten opzichte van eerdere rapporten7,8, waarin de TBI-impact eenmaal is geleverd. Het protocol past hier dezelfde parameter toe, behalve dat het totale impactgetal wordt verhoogd tot 10.
- TBI-apparatuur
- Gebruik een op maat gemaakt draagbaar apparaat voor de toediening van een TBI met gesloten schedel (Figuur 2A) aan de rechterkop van de muis, zoals aangegeven in Figuur 2B.
- Voorbereiding voor de operatie
- Apparatuur voor autoclaafchirurgie, waaronder een gewone schaar, een chirurgische schuifmaat, een chirurgische veerschaar, een chirurgische pincet, een muggenpincet, hoofdpaalstukken, gaas en applicators met wattenstaafjes.
- Weeg en registreer het lichaamsgewicht van de muis 2 uur voor de operatie. Om hersenoedeem tijdens de implantatie van het schedelvenster tot een minimum te beperken, injecteert u dexamethasonnatriumfosfaat in een dosis van 4,8 mg/kg [2 mg/ml, meestal ~70 μl (moet op twee plaatsen worden geïnjecteerd)] in de quadricepsspier met behulp van een insulinespuit. Na de injectie met dexamethason, maar voordat u met een TBI-operatie begint, bereidt u de glazen vensters voor zoals aangegeven in stap 3.1 voor later gebruik.
- Desinfecteer de chirurgische fase en TBI-apparatuur met 75% ethanol en breid het steriele chirurgische wegwerplaken uit om de operatiefase op het stereotaxische platform te bedekken. Schakel het verwarmingsapparaat en de temperatuurbewaking in en stel de doeltemperatuur in op 37 °C.
- Open de klep van de zuurstoftank en stel de zuurstofstroom in op 1.5 l/min. Open het anesthesieapparaat en stel de waarde van het isofluraanniveau in op drie.
OPMERKING: 100% zuivere zuurstof kan het dier helpen de TBI-effecten te overleven. - Plaats de muis in de inductiekamer en laat deze 5 minuten blijven om volledige anesthesie te bereiken.
- Zodra de muis volledig is verdoofd (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex), haalt u de muis uit de inductiekamer en plaatst u de muiskop in het stereotaxische frame.
- Plaats de neuskegel van de anesthesieslang over de snuit van de muis.
- Handhaaf de anesthesie met 1,5% isofluraan gemengd met 100% zuivere zuurstof met een stroomsnelheid van 1 l/min tot het einde van de operatie. Controleer regelmatig de ademhalingsfrequentie en knijp tijdens de operatie ten minste elke 15 minuten in de staart of teen om de juiste anesthesie te beoordelen. Pas de isofluraanconcentratie indien nodig aan om de gewenste diepte van de anesthesie te behouden.
- TBI-operatie
- Dien buprenorfine (1 mg/kg, subcutaan) toe met behulp van insulinespuiten voor eenmalig gebruik en breng oogzalf aan op de ogen van de muis.
- Verwijder het haar van de bovenkant van het hoofd door te knippen met een schaar 1 en vervolgens gedurende 1 minuut ontharingsmiddel aan te brengen.
LET OP: Breng het ontharingsmiddel niet langer dan 3 minuten op de hoofdhuid aan, omdat het irriterend is voor de huid. Zorg ervoor dat er geen ontharingsmiddel op de ogen van de muis komt. - Reinig de hoofdhuid door gaasjes en applicators met wattenstaafjes aan te brengen. Desinfecteer vervolgens de huid, eerst met 75% ethanol en daarna met betadine. Herhaal dit drie keer (d.w.z. ethanol gevolgd door betadine), waarbij u de laatste toepassing van betadine op de huid laat zitten.
- Controleer de anesthesiediepte opnieuw om er zeker van te zijn dat de muis volledig verdoofd is (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex). Tent de huid met een chirurgische pincet 3 en maak een incisie van 12-15 mm lang in de middellijn, ongeveer 3 mm achter de ogen.
- Snijd de huid over de linker- en rechterhersenhelft van de schedel met behulp van een veerschaar 2.
- Zodra de schedel zichtbaar is, verwijdert u het periosteum door zachtjes te wrijven met een steriele applicator met wattenstaafje en te spoelen met steriele zoutoplossing.
- Inspecteer visueel de toestand van de schedel om er zeker van te zijn dat deze intact is, met uitzondering van de twee kleine gaatjes, die zijn gemaakt voor de vorige virusinjectie-operatie.
- Droog het schedelgebied en markeer de TBI-inslagplaats op de volgende coördinaten: 2,5 mm posterieur van de Bregma en 2 mm lateraal van de sagittale hechting aan de rechterkant (Figuur 2B).
- Haal de muis snel uit het stereotaxische frame en plaats de kop op het bufferkussen onder het TBI-apparaat.
- Lijn de punt van het botslichaam uit met de gemarkeerde inslagplaats.
- Til de metalen kolom op door het vastgebonden nylon touw tot 15 cm boven de muizenkop te trekken en laat deze vervolgens los, zodat het gewicht vrij op de transducerstaaf kan vallen, die in contact staat met de schedeltop op de TBI-plaats. Raak de muiskop niet aan bij het toedienen van de TBI-impact.
- Beweeg de muis op de verwarmingsdeken en plaats deze op zijn rug terwijl u de ademhalingsstatus bewaakt.
- Zodra de muis zich van een rugligging naar een buikligging heeft gewikkeld, plaatst u de muis in de isofluraaninductiekamer gedurende ~5 minuten met 3% isofluraan gemengd met 100% zuivere zuurstof met een stroomsnelheid van 1.5 l/min.
- Zodra de muis volledig verdoofd is (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex), herhaalt u stap 2.3.9-2.3.14 om in totaal 10 schokken te bereiken.
OPMERKING: In onze studie (gegevens nog niet gepubliceerd) zijn tien TBI-effecten gevonden die een robuust fenotype met een lage muizensterfte induceren. De parameters kunnen worden aangepast om een andere ernst van hersenletsel te bereiken door het aantal schokken en/of de hoogte van waaruit het gewicht wordt losgelaten te verhogen of te verlagen. Alle parameters zijn onder voorbehoud van goedkeuring door de lokale IACUC. - Controleer de schedel onder een chirurgische microscoop en verwijder de muis uit het onderzoek als er een schedelbreuk is opgetreden.
- Volg voor een schijnoperatie dezelfde procedures als hierboven beschreven, inclusief plaatsing van het dier onder de impactor, maar zonder de TBI-effecten toe te dienen.
- Nadat de muis zichzelf na de 10e TBI-impact van rugligging naar buikligging heeft verplaatst, plaatst u de muis gedurende ~5 minuten in de isofluraaninductiekamer. Volg de stappen 2.2.6-2.2.8 om de muiskop op het stereotaxische frame te plaatsen voor de hieronder beschreven schedelraamimplantatie.
3. Implantatiechirurgie van het schedelvenster
OPMERKING: De onderstaande stappen voor het implanteren van schedelvensters zijn overgenomen van Goldey et al.9 en hun specificaties van de hoofdpost en de beeldvormingsput zijn hier toegepast.
- Voorbereiding van het raam
OPMERKING: Voltooi de venstervoorbereiding in stap 2.2.2 voordat u met de TBI-operatie begint. Het raam is gemaakt van twee ronde glazen dekglaasjes (één met een diameter van 3 mm en één met een diameter van 5 mm, zoals aangegeven in figuur 2C) die met elkaar zijn verbonden door middel van transparante optische lijm, zoals hieronder beschreven.- Ontsmet de glazen dekglaasjes door ze gedurende 15 minuten onder te dompelen in 75% ethanol. Haal de glazen dekglaasjes uit de ethanol en laat ze ~10 minuten drogen op een steriel oppervlak (d.w.z. het deksel van een steriele plaat met 24 putjes).
- Vul een insulinespuit met transparante optische lijm en vermijd luchtbelvorming. Breng onder microscoop 1 (Tabel met materialen) bij een vergroting van 0,67x een kleine druppel (~1 μL) optische lijm aan in het midden van het dekglaasje van 5 mm. Plaats vervolgens onmiddellijk het dekglaasje van 3 mm erop en centreer het met het dekglaasje van 5 mm.
- Oefen voorzichtig druk uit met een fijne pincet om de lijm gelijkmatig te verdelen. Gooi de glazen ruit weg als er zich een luchtbel of muur vormt rond het 3 mm dekglaasje.
- Om de lijm uit te harden, plaatst u de dekglaasjes gedurende 150 s in een UV-doos met een vermogen van 20 x 100 μJ/cm2. Controleer of de twee dekglaasjes goed vastzitten door met een pincet 4 voorzichtig tegen de zijkant van de 3 mm-slip te duwen. Als het dekglaasje beweegt, plaats het dan nog eens 60 seconden terug in de UV-box. Bewaar de glazen ruit in een steriele plaat met 24 putjes voor later gebruik.
- Ruw het schedeloppervlak.
OPMERKING: Voer vanaf hier alle stappen in sectie 3 uit onder een chirurgische microscoop. Begin met 10x en pas aan de gewenste vergroting aan.- Boor voorzichtig en langzaam in het oppervlak van de schedel met een FG4-hardmetalen bit met een lage rotorsnelheid (d.w.z. het uitgangsnummer ingesteld op ~1-2) om het resterende periosteum te verwijderen en een ruw schedeloppervlak te creëren, zodat het tandcement stevig met de schedel bindt. Als alternatief kan hier ook een scalpel worden gebruikt in plaats van een boormachine.
- Gebruik zoutoplossing om botstof van het schedeloppervlak te spoelen en te verwijderen.
- Scheid de spieren.
OPMERKING: Spierscheiding dient om het oppervlak van het blootgestelde schedelbot te vergroten dat zal dienen als contactpunt voor het tandcement, waardoor de structurele integriteit van het implantaat wordt gegarandeerd. Deze spierscheidingsstap legt meestal ~3 mm van de temporale schedelplaat bloot.- Op ongeveer 5 mm achter het oog, waar de hechting die de pariëtale en temporale schedel verbindt, zich bevindt, brengt u voorzichtig de gesloten fijne uiteinden (#5/45 pincet) in om de laterale spieren van de schedel te scheiden, en beweegt u de gesloten uiteinden voorzichtig in de achterste richting tot aan de lambdoïde hechting.
- Scheid de laterale spieren aan de kant waar implantatie van het schedelvenster zal plaatsvinden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de spieren niet te dicht bij het oog scheidt, om te voorkomen dat u de oogslagader verwondt; anders kunnen ernstige en aanhoudende bloedingen optreden. Scheid de spieren niet van het achterhoofdsbeen, omdat de muis deze spieren nodig heeft om zijn hoofd op te heffen. - Spoel het vuil van de operatieplaats weg met zoutoplossing en droog het gebied af met gaas. Gelschuim kan op de operatieplaats worden aangebracht om het bloeden te stoppen.
- Implanteer de hoofdpost.
- Gebruik een op maat gemaakte titanium koppaal (Figuur 2D), beschreven in een eerdere publicatie9, om de muizenkop stevig vast te zetten tijdens het uitvoeren van de craniotomie-operatie en voor daaropvolgende beeldvorming met twee fotonen.
- Gebruik een markeerstift en een chirurgische schuifmaat om de omtrek van de craniotomie op de schone en droge schedel aan de rechterkant te traceren. Het middelpunt van de getraceerde cirkel ligt 2,5 mm achter de Bregma en 1,5 mm van de sagittale hechting op de rechterhersenhelft. De diameter van de getraceerde cirkel is ongeveer 3,2-3,5 mm, iets groter dan het glazen dekglaasje van 3 mm. Zorg ervoor dat de craniotomiecirkel de virusinjectieplaatsen kan bedekken (de twee gaten die tijdens het injecteren van het virus zijn gemaakt, kunnen als referentie worden gebruikt) en de TBI-plaats.
- Maak de oorbalk los en draai het hoofd zodat het craniotomievlak perfect horizontaal is en draai de oorbalk vervolgens weer vast.
- Gebruik het houten stokje van een applicator met wattenstaafje om twee kleine druppels secondelijm aan te brengen aan de voor- en achterkant van de headpost.
- Plaats de titanium hoofdpost over het midden van de craniotomie en pas deze snel aan om binnen hetzelfde vlak te rusten als waar het schedelvenster zal worden geïmplanteerd. Oefen lichte druk uit totdat de secondelijm is opgedroogd; Dit duurt meestal ~30 s.
- Bereid tandheelkundig cement voor in een voorgekoelde keramische mengschaal (minstens 10 minuten in een vriezer van -20 °C): combineer 300 mg cementpoeder, zes druppels snelle basisvloeistof en een druppel katalysator en roer het mengsel tot het goed gemengd is (~15 keer).
NOTITIE: Het cement moet pasteus zijn. Als het te dun is, roer er dan wat meer cementpoeder door. Als het te dik is, roer er dan druppel voor druppel de snelle basisvloeistof door tot een pasteuze consistentie is bereikt. - Breng snel een ruime hoeveelheid tandheelkundig cementmengsel aan op de buitenomtrek van de getraceerde omtrek en bedek elk blootliggend botoppervlak. Bedek echter niet de plaats van de craniotomie. Wacht ~15 minuten om het tandcement te drogen en uit te harden voordat u verder gaat.
- Maak de oorstang los en bevestig de hoofdpen aan het metalen frame om ervoor te zorgen dat de kop stabiel staat voor nauwkeurig boren langs de gemarkeerde craniotomieomtrek. Als er cement op de craniotomieplaats zit, gebruik dan de FG4-carbide om te boren en te verwijderen.
- Craniotomie
- Gebruik een chirurgische schuifmaat om de diameter van de gemarkeerde cirkel te controleren, zoals gedefinieerd in stap 3.4.2. Pas indien nodig aan, zodat het schedelvenster precies in de craniotomie past.
- Gebruik een elektrische tandartsboor om de schedel langs de buitenkant van de gemarkeerde cirkel te etsen en te verdunnen, eerst met behulp van een FG4-hardmetalen bit (snelheid ingesteld op een output ~9-10). Dit creëert een "spoor" waarbinnen de schedel kan worden uitgedund.
LET OP: Om hitteletsel tot een minimum te beperken en een gladde baan te krijgen, moet u de boor blijven bewegen. Boor niet langer dan 2 s op dezelfde plaats. - Stop regelmatig met boren en irrigeer het hele gebied met steriele zoutoplossing, om de opwarming van de boor te verminderen en het botstof weg te spoelen.
- Ga door met het uitdunnen van de schedel met een hardmetalen bit FG1/4, zoals beschreven in stap 3.5.2, totdat de schedel flinterdun en transparant is.
NOTITIE: Het gebruik van twee handen om de boor vast te houden, kan het gemakkelijker maken om de boor te besturen en te voorkomen dat de boor in de hersenen wordt gestoken. - Voltooi het uitdunnen van de schedel met een EF4-hardmetalen bit. Wanneer er een scheur ontstaat tussen de botflap en het omringende schedelbot, komt er soms cerebrale spinale vloeistof (CSF) vrij, wat aangeeft dat de schedel volledig is doorboord.
- Ga door met het uitdunnen en boren door de rest van de schedel langs het spoor. Vermijd het boren door het punt waar een duidelijk vaatstelsel onder de schedel doorkruist om bloedingen te voorkomen.
- Steek een fijne pincetpunt (pincet 1) ~0,5 mm door de gebarsten plaats en til de botflap voorzichtig omhoog zonder de onderliggende hersenen in te deuken.
- Nadat de botflap is verwijderd, irrigeert u het craniotomiegebied met zoutoplossing. Het hersenoppervlak kan 1-2 mm hoger zijn dan de craniotomierand.
- Bedek vanaf deze stap altijd de blootgestelde hersenen met zoutoplossing om het hersenweefsel te beschermen.
- Bloedingen kunnen optreden bij het optillen van de botflap op de oorspronkelijke AAV-injectieplaatsen als gevolg van de weefseladhesie en vasculatuurgroei na de injectieoperatie. Als dit gebeurt, druk dan zachtjes op de plek met een droge applicator met wattenstaafje gedurende ~2 minuten (of langer als dat nodig is). Gelschuim kan worden gebruikt om het bloeden te stoppen. Gebruik geen chemicaliën of een verwarmingstang om het bloeden te stoppen, omdat dit letsel kan veroorzaken.
- Gebruik de pincet 1 om de zichtbare spinachtige materie voorzichtig te verwijderen.
- Implantaat glazen venster
- Gebruik de chirurgische pincet 2 om het steriele glazen venster op te pakken, met het glazen dekglaasje van 3 mm naar beneden gericht. Plaats en pas het glazen venster aan boven de craniotomieplaats om ervoor te zorgen dat het venster goed aansluit op de craniotomierand. Bovenop zit het glazen dekglaasje van 5 mm.
- Bereid tandheelkundig cement als volgt voor: combineer 100 mg cementpoeder, twee druppels snelle basisvloeistof en een druppel katalysator. Roer het mengsel tot alles goed gemengd is (~15 keer). Wacht ~6 min tot het cement pasteus en dik wordt. Als het cement te dun is, kan het in stap 3.6.4 in de ruimte onder het raam sijpelen en het raam verduisteren.
- Terwijl u wacht tot het cement pasteus en dik wordt, oefent u voldoende druk uit op het raam via een stereotaxische manipulator, om te controleren of de schedel veilig en stevig contact kan maken met het glazen raam. Zorg ervoor dat de tandcementvloeistof in stap 3.6.4 de ruimte onder het glas niet bereikt en zo het raam aan het zicht onttrekt.
- Gebruik een verstelbare precisie-applicatorborstel om een kleine hoeveelheid cement langs de raamrand toe te voegen om het glazen raam met de schedel af te dichten. Wacht ~10 minuten om het cement volledig te laten drogen en laat dan voorzichtig de manipulator boven het raam los en verwijder deze. Vanaf deze stap duurt het ~4 uur om de 10 TBI-inslagen te voltooien en de hoofdstijl en het schedelvenster te implanteren.
- Snijd het tandcement bij met behulp van de tandartsboor met een FG4-hardmetalen bit als er overtollig cement op het raam zit.
NOTITIE: Overmatig cement rond het raam kan voorkomen dat de objectieflenzen met twee fotonen het raamoppervlak naderen.
- Implanteren van de beeldvormingsput
OPMERKING: Een beeldvormingsput (Figuur 2D) is een rubberen ring met een buitendiameter van ~1,6 cm, die overeenkomt met het bovenoppervlak van de hoofdpost en water boven het schedelvenster vasthoudt voor beeldvorming met twee fotonen.- Nadat de raamimplantatie is voltooid, boort u het tandheelkundig cementpuin op het bovenoppervlak van de hoofdpaal weg en reinigt u het gebied met nat chirurgisch gaas. Laat het gebied ~3 minuten drogen.
- Gebruik een applicator met wattenstaafje om een kleine hoeveelheid secondelijm te dopen en plak deze op het bovenoppervlak van de hoofdpost. Plaats de rubberen ring snel op de headpost. Oefen gedurende ~2 minuten gemiddelde druk uit op de rubberen ring om nauw contact met de headpost te garanderen. Gebruik spaarzaam secondelijm, anders kan het zich aan het glazen venster hechten en de beeldvorming van twee fotonen verdoezelen.
- Pijnstillende en antibioticatoediening
- Onmiddellijk na het implanteren van de beeldvormingsput, maar voordat u stopt met isofluraan, dient u cefazoline [500 mg/kg (333 mg/ml, meestal ~45 μL), intramusculair] en meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) toe met behulp van insulinespuiten voor eenmalig gebruik.
- Stop na toediening van het geneesmiddel de anesthesie, laat de muis los van het stereotaxische frame en breng de muis terug naar zijn thuiskooi, die zich boven een verwarmingsdeken bevindt.
- Houd de muis gedurende ~15 minuten nauwlettend in de gaten totdat deze ambulant is.
OPMERKING: Huisvest de muizen individueel, omdat ze de rubberen beeldvorming van andere muizen goed kunnen bijten. Zorg voor voedsel en watergel in de buurt van de muis in de kooi voor toegang ad libitum. - Dien buprenorfine (1 mg/kg, subcutaan) en meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) opnieuw toe om de 8 uur na de vorige dosis tot 48 uur na de implantatieoperatie van het schedelvenster.
4. Intravitale beeldvorming met twee fotonen
- Gebruik microscoop 2 (Materiaaltabel), uitgerust met een afstembare coherente multifotonenlaser en een objectief met een vergroting van 20x (NA 1.0; onderdompeling in water), voor intravitale beeldvorming18. Het filter dat wordt gebruikt voor het EGFP-signaal is "BP 500-550".
- Bereid de craniale venstermuis voor op intravitale beeldvorming.
- Voer vanaf de dag van de operatie (aangeduid als dag 0) beeldvorming met twee fotonen uit op ontworpen tijdstippen na TBI. Plaats de craniale venstermuis in de anesthesie-inductiekamer en dien gedurende 5 minuten 3% isofluraan gemengd met draaggas toe met een stroomsnelheid van 1.5 l/min.
NOTITIE: Het draaggas kan kamerlucht of 100% zuurstof zijn. - Zodra de muis volledig verdoofd is (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex), haalt u de muis uit de inductiekamer en klemt u de hoofdpaal snel vast aan een beugel. Laat de romp van de muis op een ronde plastic plaat (19 cm diameter) liggen die is voorzien van de beugel.
OPMERKING: Er werd een handwarm kussentje onder de romp van de muis geplaatst om warmteondersteuning te bieden tijdens intravitale beeldvorming. - Breng oogzalf aan op de ogen van de muis en plaats de neuskegel van de anesthesieslang over de snuit van de muis. Handhaaf de anesthesie door 1,5% isofluraan te gebruiken met draaggas met een debiet van 1 l/min.
- Controleer regelmatig de ademhalingsfrequentie en knijp tijdens de beeldvorming ten minste elke 15 minuten in de staart of teen om de juiste anesthesie te beoordelen. Pas de isofluraanconcentratie indien nodig aan om de gewenste diepte van de anesthesie te behouden.
- Lijn de muiskop uit om ervoor te zorgen dat het schedelvenster zich direct onder de objectieflens met twee fotonen bevindt. Voeg wat water toe aan de beeldvormingsput boven het schedelvenster. Laat het objectief zakken zodat het in het water wordt ondergedompeld.
- Voer vanaf de dag van de operatie (aangeduid als dag 0) beeldvorming met twee fotonen uit op ontworpen tijdstippen na TBI. Plaats de craniale venstermuis in de anesthesie-inductiekamer en dien gedurende 5 minuten 3% isofluraan gemengd met draaggas toe met een stroomsnelheid van 1.5 l/min.
- Intravitale beeldvorming van intracraniële venstermuizen
- Zet de kwiklamp van de scoop aan. Bekijk eerst de hersenen met epifluorescentie door het oog.
OPMERKING: Het vaatstelsel ziet er zwart uit. Selecteer een gebied waar het venster vrij is. Schakel de epifluorescentie uit, stel de lasergolflengte in op 860 nm voor het EGFP-signaal en pas de laserinstelling aan voor een optimaal (d.w.z. helder maar niet verzadigd) signaal. - Stel de scanmodus in op Frame en de lijnstap op 1. Stel het gemiddelde getal in op 16, de bitdiepte op 8-bits, de modus op Line en de methode op Mean.
- Gebruik het vasculatuurpatroon als een "referentiekaart" om hetzelfde hersengebied in beeld te brengen voor latere longitudinale beeldvorming. Stel het oppervlakkige niveau voor (laag I, minder dan 100 μm van het meningeale oppervlak) voor drie vlakken waar de corticale vasculatuur domineert door middel van een z-stack-modus, met een interplane-interval van 10 μm, zoals aangegeven in figuur 3A.
- Beeld zes vlakken op diep niveau (laag IV en V, ~400 μm dieper dan het oppervlakkige niveau), door een z-stack-modus zoals aangegeven in figuur 3A, met een interplane-interval van 10 μm en een scansnelheid van 8.
- Na het beëindigen van de beeldvorming (~20 min per muis), stopt u met de anesthesie, laat u de muis los van de frames en plaatst u hem terug in zijn thuiskooi die zich boven een verwarmingsdeken bevindt. Houd de muis achtereenvolgens in de gaten totdat deze ambulant is, wat meestal ~7 minuten duurt.
- Longitudinaal beeld van de muis op dag 0, 1 week en 4 maanden na de TBI-operatie.
- Zet de kwiklamp van de scoop aan. Bekijk eerst de hersenen met epifluorescentie door het oog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als proof of concept voor dit protocol werden virale deeltjes die AAV-Syn1-EGFP tot expressie brengen, geïnjecteerd in de hersenschors van mannelijke TDP-43 Q331K/Q331K-muizen (C57BL/6J-achtergrond)19 op de leeftijd van 3 maanden. Opgemerkt wordt dat wildtype C57BL/6J-dieren ook kunnen worden gebruikt, maar deze studie werd uitgevoerd bij TDP-43 Q331K/Q331K-muizen omdat het laboratorium zich richt op onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. 4 weken na de AAV-injectie werd een TBI-operatie uitgevoerd. Binnen dezelfde chirurgische setting werden de hoofdstijl en het schedelvenster geïmplanteerd. De muis werd serieel in beeld gebracht met behulp van een microscoop met twee fotonen op dag 0, 1 week en 4 maanden na de TBI-operatie (Figuur 1). Over het algemeen duurde de injectieoperatie ~ 30 minuten en de TBI-operatie ~ 1 uur per muis. Tijdens de TBI-operatie hadden de muizen over het algemeen meer tijd nodig om zichzelf recht te zetten van een rugligging naar een buikligging na volgende schokken, vergeleken met de eerste schokken. Een muis kan bijvoorbeeld 2 minuten nodig hebben gehad om zijn positie recht te zetten na deeerste impact, maar 10 minuten nodig hebben gehad om zijn positie recht te zetten na de 10e impact. Voor craniale raamimplantatiechirurgie was meestal ~ 3 uur nodig om alle stappen uit te voeren, maar het duurde langer dan nodig was als er aanhoudende bloedingen optraden. Beeldvorming met twee fotonen vereiste meestal 20 minuten per muis om alle beelden te verkrijgen. Voor de huidige studie met drie muizen met de expressie van EGFP, vertoonden de dieren geen tekenen van een schedelfractuur, noch stierven ze tijdens de operatie of tot 4 maanden na de operatie. Zowel de morbiditeit als het percentage schedelfracturen waren 0%. Dit komt overeen met het relatief lage sterftecijfer (<10%) in een vergelijkbaar model van het induceren van TBI, maar zonder een craniaal raamimplantaat 7,8.
Een apparaat voor het afvallen van gewichten (Figuur 2A), dat eerderis gerapporteerd 7,8, werd gebruikt om TBI-effecten toe te dienen op het hoofd van de muis aan de rechterkant, zoals aangegeven in Figuur 2B. Een doorzichtige plastic buis (nr. 5 in figuur 2A; 60 cm lang en 1,4 cm in binnendiameter) werd stevig en verticaal vastgeklemd op een metalen beugel, en een plastic botskolom (nr. 7 in figuur 2A; 10 cm lang en 1,3 cm in diameter, met een platte ronde punt van 2 mm in diameter) werd in de verticale buis geplaatst. Een metalen gewicht van 50 g (nr. 6 in figuur 2A) werd boven het botslichaam geplaatst en vastgemaakt met een nylon koord (nr. 4 in figuur 2A). Een bufferkussen (nr. 8 in figuur 2A; 9 cm x 9 cm x 1 cm [lengte x breedte x diepte], gemaakt van polyethyleenschuim en katoengaas) werd onder de muizenkop geplaatst om de impactenergie te bufferen en te absorberen.
Het schedelvenster was gemaakt van twee glazen dekglaasjes gecombineerd met optische lijm (Figuur 2C), en het glazen dekglaasje met een diameter van 3 mm was de zijde die het hersenoppervlak raakte. Beeldvorming met twee fotonen werd uitgevoerd op twee verschillende diepten (Figuur 3A) vanaf het hersenoppervlak: 1) een oppervlakkig niveau waar de corticale vasculatuur overvloedig aanwezig was en een relatief grote lumendiameter had die zwart leek, maar met schaarse EGFP-positieve cellichamen; en 2) een dieper niveau waar het vaatstelsel schaars was en een kleine lumendiameter had, met veel EGFP-positieve cellen zichtbaar.
Om ~4 uur (dag 0) na de operatie werd beeldvorming met twee fotonen uitgevoerd op drie vlakken, met een interval van 10 μm op het oppervlakkige niveau (laag I, minder dan 100 μm van het meningeale oppervlak) eerst waar het vaatstelsel zwart leek (aangegeven door de rode stippellijnen in figuur 3B), en werd gebruikt als referentiekaart voor de volgende beeldvormingssessie om het oorspronkelijke beeldvormingsgebied te lokaliseren. Op dit oppervlakkige niveau waren de corticale vasculatuur en neuronale processen de overheersende structuren die konden worden waargenomen, terwijl de EGFP-positieve cellichamen schaars waren. Na beeldvorming binnen het oppervlakkige niveau, werd de focus naar beneden bijgesteld met ~400 μm, dieper dan het oppervlakkige niveau, in de cortex (laag IV en V) om de EGFP-positieve neuronale cellichamen in beeld te brengen. Beelden werden verkregen binnen zes vlakken, met een interval van 10 μm. EGFP-eiwitexpressie was diffuus verdeeld over het cellichaam, zoals aangegeven in figuur 3C. Er was af en toe een optreden van enkele EGFP-puncta buiten de cellichamen, die EGFP-insluitsels zouden kunnen vertegenwoordigen die zich in de loop van de tijd hebben gevormd in axonen of dendrieten. Dit protocol resulteert in AAV-SYN1-EGFP-expressie ~2-3 mm rond de injectieplaats, die kan worden gedefinieerd door histologische analyse van postmortale weefsels.
1 week en 4 maanden na TBI werd het vasculatuurpatroon dat werd waargenomen op het tijdstip van dag 0 gebruikt als referentie om hetzelfde beeldvormingsgebied te lokaliseren (Figuur 3D,F). Het vasculatuurpatroon in figuur 3D,F is vergelijkbaar met dat in figuur 3B. De beeldvormingsprocedure voor de 1 week en 4 maanden na TBI was dezelfde als hierboven beschreven voor het tijdstip van dag 0, en EGFP-expressie werd zoals voorheen in het hele cellichaam gedetecteerd (Figuur 3E,G). De fluorescentie-intensiteit op dag 0 en 4 maanden was vergelijkbaar op zowel het oppervlakkige als het diepere niveau. De fluorescentie-intensiteit na 1 week was echter lager dan die van dag 0 en 4 maanden op zowel de oppervlakkige als de diepe niveaus, wat te wijten zou kunnen zijn aan de translationele repressie die werd gerapporteerd voor andere TBI-modellen20. Met name de kwaliteit van de beelden na 4 maanden in vergelijking met het tijdstip van dag 0 toont aan dat het schedelvenster de helderheid en integriteit heeft behouden en dat de virale expressie 4 maanden na de operatie nog steeds robuust is voor effectieve intravitale beeldvorming. Omdat EGFP tot expressie komt als een relatief diffuus eiwit, kunnen de fluorescentiesignalen beter worden opgelost en discreet wanneer EGFP wordt gefuseerd met een eiwit van belang.
Figuur 1: De tijdlijn voor dit intravitale beeldvormingsprotocol. Het protocol wordt geïnitieerd met virusinjectie. TBI en craniale raamchirurgie worden uitgevoerd binnen dezelfde operatiesessie 2-4 weken na virusinjectie. Intravitale beeldvorming wordt uitgevoerd op dag 0, 1 week, 4 maanden na TBI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Diagrammen voor het TBI-apparaat, de TBI-impactlocatie en de voorbereiding van het venster. (A) Apparatuur voor het TBI-apparaat met gewichtsval. 1: voetstuk, 2: beugel, 3: verstelbare klem, 4: nylon touw, 5: tunnel voor het laten vallen van gewichten, 6: metalen gewichtskolom (50 g), 7: impactor, 8: bufferkussen. (B) Een schema van de virusinjectie en de plaats van de TBI-inslag, met de coördinaten 2,5 mm posterieur van de Bregma en 2 mm lateraal van de sagittale hechting aan de rechterkant. (C) Een schema voor de voorbereiding van het glazen raam. Twee glasdekglaasjes met een diameter van 3 mm en 5 mm worden met optische lijm gecombineerd. (D) Foto's van de metalen koppaal en beeldvormingsput. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schema van beeldvlakken en de beeldgegevens . (A) Meerdere vlakken worden afgebeeld op een oppervlakkig niveau waar het vaatstelsel zich bevindt en een diep niveau. De beelden worden als volgt verzameld: drie vlakken op oppervlakkig niveau, waar de corticale vasculatuur en neuronale processen de overheersende EGFP-positieve structuren zijn, en zes vlakken op het diepe niveau, waar EGFP-positieve cellichamen overwegend worden waargenomen, met een interval van 10 μm tussen de aangrenzende vlakken. Elk vlak heeft een afmeting van 425,10 μm x 425,10 μm. (B) Representatief beeld van een vlak in het oppervlakkige niveau op het tijdstip van dag 0. De rode stippellijnen geven de omtrek van het vaatstelsel aan die als referentie kan worden gebruikt om de oorspronkelijke beeldvormingsplaats voor volgende tijdstippen te lokaliseren. (C) Representatief beeld van een vliegtuig in het diepe niveau op het tijdstip van dag 0 kort na TBI. (D) Representatief beeld van een vliegtuig in het oppervlakkige niveau op het tijdstip van 1 week. De rode stippellijnen geven het vaatstelsel aan, vergelijkbaar met de omtrek op dag 0 in figuur 3B, wat bevestigt dat de beeldvorming met twee fotonen op dag 0 en 1 week na TBI op een vergelijkbare locatie werd uitgevoerd. (E) Representatief beeld in het diepe niveau op het tijdstip van 1 week na TBI. (F) Hetzelfde als B en D, 4 maanden na TBI. (G) Zelfde als C en E, 4 maanden na TBI. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werden AAV-injectie, TBI-toediening en een hoofdpost met schedelvensterimplantatie gecombineerd voor longitudinale beeldvormingsanalyse van EGFP-gelabelde neuronen in de hersenschors van muizen (lagen IV en V) om de effecten van TBI op corticale neuronen te observeren. Deze studie merkt op dat de TBI-locatie die hier is gekozen, boven de hippocampus, een relatief vlak en breed oppervlak biedt voor implantatie van het schedelvenster. Omgekeerd is de schedel relatief smal aan de voorkant van deze plaats, en daarom is het moeilijk om ervoor te zorgen dat de hoofdpost effectief contact maakt met het oppervlak van de schedel. Hoewel in deze studie alleen het TDP-43Q331K/Q331K-muismodel werd gebruikt, zou dit protocol, gezien het onderzoek van het laboratorium dat zich richt op ALS en FTD19, van toepassing moeten zijn op de meeste andere muizenstammen. Naast het labelen van neuronen zoals hier beschreven, kunnen verschillende strategieën worden gebruikt om andere celtypen te labelen voor intravitale beeldvorming. Een benadering is om de genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten op een celspecifieke manier tot expressie te brengen, met behulp van het Cre-Lox-recombinatiesysteem in genetisch gemodificeerde muizen21. Een andere benadering is om bepaalde virale serotypen te gebruiken voor celspecifieke transductie van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten. Plaatsspecifieke toediening kan worden bereikt door de intracraniële injectie op de gewenste locatie in de hersenen uit te voeren. De efficiëntie en het gemak waarmee men celspecifieke eiwitten tot expressie kan brengen via virale transductie voor intravitale beeldvorming is een voordeel ten opzichte van het maken van transgene muismodellen.
Voor de operatieprotocollen zijn er meerdere kritieke stappen die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd. Bij het boren van gaten in de schedel voor virusinjectie aan het begin van het protocol, moet men voorzichtig zijn met het beschadigen van het weefsel onder de schedel. Als er weefselbeschadiging optreedt tijdens het boren in de schedel, zal er sprake zijn van ontsteking, weefseladhesie en angiogenese rond de plaats van de verwonding, waardoor het risico op bloedingen tijdens de craniotomie voor implantatie van het schedelvenster toeneemt. Voor toediening van de TBI met het weight-drop-apparaat plaatste de huidige studie een kussen onder de muizenkop om de TBI-impactkracht te bufferen en daarmee de kans op een schedelfractuur te verkleinen. Er werden geen duidelijke hoofdbewegingen op rotatierichtingen en versnelling waargenomen, wat het idee ondersteunt dat dit TBI-model een relatief lage kans heeft op diffusie-axonaal letsel. Interessant is dat Foda et al. een soortgelijk apparaat voor het laten vallen van gewichten gebruikten om een TBI-verwonding met gesloten schedel bij ratten te construeren, en een groter, zacht schuimkussen (12 cm dik) werd onder de kop van de rat geplaatst, zodat het gemakkelijk kon bewegen als reactie op de TBI-impactkracht in de rotatierichting met versnelling, wat resulteerde in diffusie-axonaal letsel22. Een van de voordelen van het TBI-model voor gewichtsval met buisgeleiding is dat de ernst van het trauma kan worden gemoduleerd door de hoogte van de gewichtsval te veranderen (d.w.z. een hogere hoogte voor een grotere kracht) en/of het aantal keren dat de impact wordt toegediend te herhalen. Flierl et al. gebruikten bijvoorbeeld een soortgelijk apparaat voor gewichtsval als de huidige studie om TBI bij muizen te induceren; het gewicht van het metaal was 333 g, wat een milde TBI veroorzaakte bij een val van een hoogte van 2 cm en een ernstige TBI bij een val van een hoogte van 3 cm23. De craniotomiestap voorafgaand aan de implantatie van het venster moet ook zorgvuldig worden uitgevoerd om beschadiging van het hersenweefsel onder de schedel te voorkomen. Door de boor regelmatig naar een ander gebied op de schedel te verplaatsen, wordt voorkomen dat er op dezelfde plek te veel wordt geboord, wat kan leiden tot overmatige verhitting, weefselbeschadiging en bloedingen; Verder kan veelvuldig irrigeren met zoutoplossing ook de boorlocatie koelen. Bij het implanteren van het glazen venster is het belangrijk om het glasvlak zo uit te lijnen dat het evenwijdig is aan het schedeloppervlak; Een goed passend venster in de schedel voorkomt lekkage van de tandcementvloeistof in de ruimte tussen het raam en de hersenen.
Als het venster wazig is op dag 0 na de TBI-operatie, maar fluorescerende signalen worden gedetecteerd, kan het tandcement de ruimte tussen het raam en de hersenen zijn binnengedrongen, waardoor een cementlaag wordt gevormd die het hersenoppervlak bedekt en de fluorescentie-emissie verdoezelt. In deze situatie kan men het raam en het tandcement verwijderen met behulp van de boormethode beschreven in protocolstap 3.5, en vervolgens een nieuw glazen raam implanteren op de oorspronkelijke locatie, zoals in detail beschreven door Goldey et al.9. Als het venster in een later stadium tijdens het longitudinale beeldvormingsproces wazig wordt, kan men proberen mogelijk vuil te verwijderen door zachtjes over het venster te wrijven met een applicator met wattenstaafjes. Als dit het probleem niet oplost, kan dit te wijten zijn aan hergroei van het bot en de hersenvliezen onder het glazen raam. In dit geval kan men het venster verwijderen en boren om het opnieuw gegroeide bot te verwijderen en/of uit elkaar te epileren en de hersenvliezen te verwijderen, gevolgd door implantatie van een nieuw glazen raam op de oorspronkelijke plaats, zoals beschreven door Goldey et al.9. Zoals blijkt uit de resultaten, is EGFP-expressie en fluorescentie robuust gedurende een tijdsverloop van ~4 maanden na TBI. Men kan een afname van het fluorescentiesignaal verwachten binnen de eerste week na TBI, wat waarschijnlijk te wijten is aan TBI-geïnduceerde translationele repressie die een tijdelijke vermindering van de wereldwijde eiwitsynthese veroorzaakt20.
Om een hoge beeldvormingskwaliteit te behouden en beeldvorming in meerdere vlakken te bereiken, werden muizen onder isofluraananesthesie gebracht om beweging te beperken. Het is echter belangrijk op te merken dat anesthesie de onderzoeksresultaten kan beïnvloeden. Er is bijvoorbeeld gemeld dat muizen onder isofluraan-anesthesie een andere microgliale activiteit vertonen als reactie op fotoschade in vergelijking met wakkere muizen24. Voor beeldvorming met twee fotonen zijn de scansnelheid en het aantal scans voor signaalmiddeling (ingesteld als "getal", onder "gemiddelde") de belangrijkste factoren die de beeldresolutie kunnen bepalen. Om de resolutie te optimaliseren, kan men de scansnelheid verlagen en het gemiddelde verhogen, maar een lagere snelheid en een hoger middelingsgetal verhogen de beeldvormingstijd voor een bepaald gezichtsveld en kunnen fotobleken veroorzaken. De huidige studie heeft tot doel chronische langetermijnbeeldvorming te bereiken op hetzelfde dier op dezelfde hersenlocatie. Om mogelijke verbleking van foto's te voorkomen en tegelijkertijd een voldoende resolutie te bereiken, werd beeldvorming met twee fotonen uitgevoerd met een scansnelheid van 8 met een gemiddeld getal van 16.
Een alternatieve benadering voor het uitvoeren van een craniotomie en het implanteren van een glazen raam is het verdunnen van de schedel, in de mate dat deze transparant en "flinterdun" is voor live beeldvorming25,26,27. Het dunne schedelvenster kan de intactheid van de schedel behouden en zo de ontsteking voorkomen die door de chirurgische ingreep wordt veroorzaakt. Daarom kan de benadering met een dunne schedel de voorkeur hebben voor live beeldvorming met ontstekingsrelevante markers en/of gedurende een relatief kortere periode (d.w.z. ~14 dagen na de operatie, zoals gerapporteerd25). Voor langdurige beeldvorming (d.w.z. 4 maanden, zoals hier beschreven) van chronische neurodegeneratieve processen, wordt naast het beoordelen van de acute effecten van TBI op hetzelfde dier, aanbevolen om een glazen venster te gebruiken dat is geïmplanteerd door een craniotomiemethode.
Zoals vermeld in de inleiding, zijn er verschillende opmerkelijke voordelen van intravitale beeldvorming voor het bestuderen van verschillende biologische en pathologische gebeurtenissen in de hersenen van zoogdieren. Er zijn echter ook enkele beperkingen aan dit protocol. Contrecoup hersenletsel beschrijft bijvoorbeeld de hersenkneuzing of het hematoom op afstand van, meestal tegengesteld aan, de kracht die in contact komt met de plaats 28,29,30. In de huidige studie werden de TBI-effecten afgeleverd bij de pariëtale kwab; Contrecoup-letsel zou ventraal en ontoegankelijk zijn voor intravitale beeldvorming. Een histologische analyse kan worden gebruikt als een aanvullende benadering om fenotypes van belang buiten de inslagplaats die door het schedelvenster wordt bedekt, verder te onderzoeken. Bovendien kan exogene overexpressie van bepaalde eiwitten ook toxiciteit of pathologie veroorzaken. In de huidige studie werden enkele incidentele EGFP-puncta waargenomen, die accumulaties kunnen vertegenwoordigen als gevolg van overexpressie van eiwitten. Daarom wordt aanbevolen om een negatief controle-eiwit (bijv. EGFP of RFP alleen) in de onderzoeksopzet op te nemen om deze mogelijkheid aan te pakken, vooral als het eiwit van belang vatbaar is voor de vorming van puntvormige structuren. Het aantal eiwitten dat men tegelijkertijd kan bestuderen, wordt beperkt door de lasers en mogelijkheden van het twee-fotonsysteem. Het kan mogelijk zijn om meer dan één fluorofoor (bijv. EGFP, RFP, enz.) af te beelden door middel van twee-fotonmicroscopie, hoewel multiplexing-mogelijkheden met conventionele breedveld- en confocale microscopen vaak analyses van meer eiwitten binnen een enkel weefselmonster mogelijk maken. Ten slotte is het belangrijk om een schijncontrole op te nemen die dezelfde procedures krijgt als het TBI-dier, behalve de gevolgen voor het afvallen. Schedelraamimplantatiechirurgie is een invasieve operatie en kan enkele lokale veranderingen veroorzaken, zoals ontsteking en veranderde intracraniale druk, die het TBI-proces kunnen beïnvloeden. Een schijncontrole helpt de experimentalist bij het beoordelen van fenotypes die te wijten zijn aan de impact versus de chirurgische ingrepen.
Samengevat introduceert dit protocol een methode om eiwitten in de lengterichting in beeld te brengen, specifiek in de neuronen van de hersenschors van muizen als reactie op TBI. Dit protocol kan worden aangepast om de expressie en lokalisatie van verschillende celspecifieke eiwitten als reactie op TBI te analyseren. Het doel van dit protocol is om een aanpak te bieden voor het bestuderen van de onmiddellijke en langetermijngevolgen van TBI in de hersenen van zoogdieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er worden geen belangenconflicten gemeld.
Acknowledgments
We danken Dr. Miguel Sena-Esteves van de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het schenken van het AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-virus, en Debra Cameron van de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het tekenen van de schedelschets van de muizen. We danken ook de huidige en voormalige leden van de Bosco-, Schafer- en Henninger-labs voor hun suggesties en steun. Dit werk werd gefinancierd door het ministerie van Defensie (W81XWH202071/PRARP) aan DAB, DS en NH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
