Summary
이 연구는 이광자 현미경을 사용하여 뉴런 발현 EGFP의 후속 생체 내 이미징을 위해 마우스에 반복적인 외상성 뇌 손상을 전달하고 두개골 창을 동시에 이식하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 외인성 자극에 노출되었을 때 동물 뇌의 특정 세포 유형 내에서 관심 단백질의 발현 및 국소화를 종단적으로 시각화하는 방법을 보여주는 것입니다. 여기에서, 폐쇄된 두개골 외상성 뇌 손상(TBI)의 투여와 마우스의 후속 종방향 생체 내 이미징을 위한 두개골 창의 동시 이식을 보여줍니다. 마우스는 신경 세포 특이적 프로모터 하에서 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 두개내로 주입합니다. 2 내지 4주 후, 마우스는 AAV 주입 위치 위에 체중 감소 장치를 사용하여 반복적인 TBI를 실시한다. 동일한 수술 세션 내에서 마우스에 금속 헤드포스트를 이식한 다음 TBI 충격 부위 위에 유리 두개골 창을 이식합니다. EGFP의 발현 및 세포 국소화는 수개월 동안 외상에 노출된 동일한 뇌 영역에서 이광자 현미경을 사용하여 검사됩니다.
Introduction
스포츠 부상, 차량 충돌 및 군사 전투로 인해 발생할 수 있는 외상성 뇌 손상(TBI)은 전 세계적으로 건강 문제입니다. TBI는 생리적, 인지적, 행동적 결핍과 평생 장애 또는 사망률로 이어질 수 있다 1,2. TBI 중증도는 경증, 중등도 및 중증으로 분류할 수 있으며, 대다수는 경증 TBI(75%-90%)3입니다. TBI, 특히 TBI의 반복적인 발생은 신경 퇴화를 촉진하고 알츠하이머병(AD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 치매(FTD) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE)을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 위험 요인으로 작용할 수 있다는 사실이 점점 더 많이 인식되고 있습니다.4,5,6. 그러나 TBI 유발 신경 퇴행의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 불분명하므로 활발한 연구 분야입니다. 뉴런이 TBI에 반응하고 TBI로부터 회복하는 방법에 대한 통찰력을 얻기 위해, TBI 후 마우스에서 종방향 생체 내 이미징에 의해 특히 뉴런 내에서 관심 있는 형광 태그 단백질을 모니터링하는 방법이 본원에 설명되어 있습니다.
이를 위해 본 연구는 이전에 보고된 것과 유사한 폐쇄형 두개골 TBI 투여를 위한 외과적 절차(7,8)와 Goldey 등(9)이 기술한 바와 같이 다운스트림 생체 내 이미징을 위한 두개골 창 이식을 위한 외과적 절차를 결합하는 방법을 보여줍니다. 특히, TBI를 유도하는 체중 감소의 영향으로 창호가 손상되고 마우스에 돌이킬 수 없는 손상을 입힐 가능성이 높기 때문에 두개골 창을 먼저 이식한 후 동일한 부위에 TBI를 수행하는 것은 불가능합니다. 따라서 이 프로토콜은 TBI를 투여한 다음 동일한 수술 세션 내에서 충격 부위 바로 위에 두개골 창을 이식하도록 설계되었습니다. 한 번의 수술 세션에서 TBI와 두개골 창 이식을 결합하는 것의 장점은 마우스가 수술을 받는 횟수를 줄일 수 있다는 것입니다. 또한 TBI에 대한 즉각적인 반응(즉, 시간 척도)을 모니터링할 수 있으며, 이후 수술 세션(즉, TBI 후 며칠 동안 초기 이미징을 시작하는 것)에서 창을 이식하는 것과는 대조적입니다. 두개골 창 및 생체 내 이미징 플랫폼은 또한 고정 조직의 면역 염색과 같은 기존 방법으로 신경 단백질을 모니터링하는 것보다 이점을 제공합니다. 예를 들어, 개별 시점에 필요한 별도의 마우스 코호트와 달리 동일한 마우스를 여러 시점에서 연구할 수 있기 때문에 생체 내 이미징에 더 적은 수의 마우스가 필요합니다. 또한 시간이 지남에 따라 동일한 뉴런을 모니터링할 수 있으므로 동일한 세포 내에서 특정 생물학적 또는 병리학적 사건을 추적할 수 있습니다.
개념 증명으로서, 시냅신 프로모터 하에서 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 뉴런 특이적 발현이 여기10에 입증되어 있다. 이 접근법은 1) 희소돌기아교세포에 대한 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터 및 성상교세포에 대한 신경교세포의 섬유산성 단백질(GFAP) 프로모터와 같은 다른 세포 유형 특이적 프로모터를 활용하여 다른 뇌세포 유형으로 확장할 수 있으며, 2) 유전자를 EGFP 유전자와 융합하여 관심 있는 다른 표적 단백질을 활용하고, 3) 서로 다른 형광단에 융합된 여러 단백질을 동시 발현할 수 있습니다. 여기서 EGFP는 두개내 주사를 통한 아데노 관련 바이러스(AAV) 전달을 통해 패키징되고 발현됩니다. 폐쇄형 두개골 TBI는 체중 감량 장치를 사용하여 투여된 후 두개골 창을 이식합니다. 신경 세포 EGFP의 시각화는 두개골 창을 통해 이루어지며, 생체 내에서 EGFP 형광을 검출하기 위해 이광자 현미경을 사용합니다. 2광자 레이저를 사용하면 광손상을 최소화하면서 피질 조직 깊숙이 침투할 수 있어 며칠 및 최대 12,13,14,15개월 동안 개별 마우스 내에서 동일한 피질 영역의 반복적인 세로 이미징이 가능합니다. 요컨대, TBI 수술과 생체 내 영상을 결합하는 이러한 접근법은 TBI 유발 질환 병리학에 기여하는 분자 사건에 대한 이해를 증진시키는 것을 목표로 한다16,17.
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Protocol
모든 동물 관련 프로토콜은 미국 국립연구위원회(National Research Council) 위원회에서 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 매사추세츠 대학교 챈 의과대학(UMMS)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(허가 번호 202100057)의 승인을 받았습니다. 간단히 말해서, 연구 개략도(그림 1)에서 볼 수 있듯이 동물은 바이러스 주입, TBI, 창 이식 및 시간 순서에 따라 생체 내 이미징을 받습니다.
참고: 상업 용어가 제거되었습니다. 사용되는 특정 장비에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
1. 입체 장치를 이용한 AAV의 두개내 주사
- AAV(PHP.eB)-syn1-EGFP
- 밀리리터당 1 x 1013 바이러스 게놈(vg/mL)의 바이러스 역가를 사용합니다. Syn1은 뉴런에서 제한된 바이러스 발현을 허용하는 뉴런 특이적 프로모터인 Synapsin1을 나타냅니다. 바이러스는 사내에서 준비하거나 아웃소싱할 수 있습니다.
- AAV 투여를 위한 입체 주사 수술 준비
- 오토클레이브 일반 가위, 수술용 캘리퍼스, 수술용 스프링 가위, 수술용 집게, 모기 집게, 거즈, 면 팁 어플리케이터 및 유리 마이크로리터 주사기.
- 75% 에탄올을 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 일회용 멸균 수술용 드레이프를 확장하여 입체 플랫폼의 수술 영역을 덮습니다.
알림: 주입 수술 중 동물의 체온을 유지하려면 피드백 조절 가열 장치를 사용하십시오. - 쥐의 몸무게를 측정하고 기록합니다.
- 산소 탱크 밸브를 열고 산소 유량을 1.5L/min으로 조정합니다. 마취기를 열고 이소플루란 수치 값을 3으로 설정합니다.
알림: 이 단계에서 운반 가스는 실내 공기 또는 100% 산소일 수 있습니다. - 마우스를 유도 챔버에 넣고 완전히 마취할 때까지 5분 동안 그대로 두십시오.
- 마우스가 완전히 마취되면(즉, 꼬리 꼬집기 반사가 없는 상태에서 2초당 약 1주기의 느리지만 꾸준한 호흡 속도) 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 마우스 헤드를 입체 프레임에 놓습니다.
- 마취 튜브 노즈 콘을 쥐의 위에 놓습니다.
- 수술이 끝날 때까지 1.5% 이소플루란을 사용하여 마취를 유지하고 캐리어 가스를 1L/min 유속으로 유지합니다. 주기적으로 호흡 빈도를 확인하고 수술 내내 최소 15분마다 꼬리 또는 발가락 꼬집음을 전달하여 적절한 마취를 평가합니다. 원하는 마취 깊이를 유지하기 위해 이소플루란 농도를 적절하게 조정합니다.
- 마이크로리터 주사기(10μL)에 바이러스 용액을 채웁니다. 그런 다음 주사기를 입체 장치의 일치하는 마이크로 인젝터 펌프에 고정합니다.
- 주사 수술
- 일회용 인슐린 주사기를 사용하여 부프레노르핀(1mg/kg, 피하)을 투여하고 쥐의 눈에 윤활제 안과 연고를 바릅니다.
- 일반 가위로 다듬어 머리 위의 두피 털을 제거합니다 1.
- 거즈와 면 팁 어플리케이터로 두피 피부를 청소하십시오. 먼저 75% 에탄올을 사용한 다음 베타딘을 사용하여 피부를 소독합니다. 이것을 세 번 반복하고(즉, 에탄올 다음에 베타딘을 바르고) 베타딘을 피부에 마지막으로 바릅니다.
- 마취 깊이를 다시 확인하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다(즉, 꼬리 꼬집기 반사가 없는 상태에서 2초당 약 1주기의 느리지만 안정적인 호흡 속도). 정중선을 따라 일반 가위2를 사용하여 ~1cm를 절개하여 오른쪽 정수리 두개골을 노출시키고 면 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 골막을 제거합니다.
- 이 좌표에서 마커 펜을 사용하여 두개골의 두 점을 표시하십시오 : 점 A : 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 오른쪽 반구의 정중선 측면 1mm; 점 B: 브레그마에서 후방으로 2.5mm, 우반구에서 정중선으로 측면으로 2mm.
- 미세한 EF4 카바이드 비트가 있는 전기 치과용 드릴을 사용하여 표시된 좌표에서 두개골을 통해 두 개의 구멍을 조심스럽게 뚫습니다.
알림: 뇌 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오. - 스테레오택시 프레임을 조정하여 마이크로리터 주사기 바늘 끝을 정중선에서 측면으로 1mm 떨어진 두개골 구멍에 맞춥니다.
- 주사기 바늘을 내려 뇌 표면에 닿게 한 다음 해당 위치를 영점(z축의 경우)으로 설정합니다. 바늘 끝을 뇌 피질에 0.5mm 깊이로 내리고 1μL의 바이러스 용액을 분당 200nL의 속도로 천천히 주입합니다.
- 바이러스 용액이 뇌 조직에 완전히 주입된 후 5분 정도 기다렸다가 용액의 역류를 방지하기 위해 바늘을 빼냅니다.
- 주사기 바늘을 천천히 빼냅니다. 다른 부위에 주입을 반복하십시오. 멸균되고 흡수되지 않는 수술용 봉합사(6-0 게이지)로 절개 부위를 봉합합니다.
- 수술 후 동물이 마취된 상태에서 세파졸린[500mg/kg(333mg/mL, 보통 ~45μL), 근육주사] 및 멜록시캄(5mg/kg, 피하)을 투여합니다.
- 입체 프레임에서 마우스를 떼어내고 마취를 중단합니다. 온열 담요 위의 깨끗한 케이지에 쥐를 넣고 보행할 때까지 동물을 모니터링합니다(약 15분). 그런 다음 홈 케이지로 옮깁니다.
- 첫 번째 부프레노르핀 주사 후 부프레노르핀(1mg/kg, 피하)과 멜록시캄(5mg/kg, 피하)을 각각 8시간, 16시간, 24시간에 다시 투여합니다.
알림: 바이러스 주입 후 2-4주가 지나면 마우스는 AAV 주사와 동일한 부위에 TBI 및 두개골 창 이식을 받습니다.
2. 반복적인 TBI 유도 관리
참고: TBI 매개변수는 TBI 영향이 한 번 전달된 이전 보고서 7,8에서 조정되었습니다. 여기서 프로토콜은 총 영향 수를 10으로 늘리는 것을 제외하고는 동일한 매개 변수를 적용합니다.
- TBI 장비
- 그림 2B와 같이 닫힌 두개골 TBI(그림 2A)를 오른쪽 마우스 헤드에 투여하기 위해 맞춤형 휴대용 장치를 사용합니다.
- 수술 전 준비 사항
- 일반 가위, 수술용 캘리퍼스, 수술용 스프링 가위, 수술용 집게, 모기 집게, 헤드포스트 조각, 거즈 및 면 팁 어플리케이터를 포함한 오토클레이브 수술 장비.
- 수술 2시간 전에 쥐의 체중을 측정하고 기록하십시오. 두개골 창 이식 중 뇌부종을 최소화하려면 인슐린 주사기를 사용하여 대퇴사두근에 4.8mg/kg[2mg/mL, 일반적으로 ~70μl(두 부위에 주사해야 함)]의 용량으로 덱사메타손 인산나트륨을 주사합니다. 덱사메타손 주사 후 TBI 수술을 시작하기 전에 나중에 사용할 수 있도록 3.1단계에 표시된 대로 유리창을 준비합니다.
- 75% 에탄올을 사용하여 수술 단계와 TBI 장비를 소독하고 일회용 멸균 수술 드레이프를 확장하여 입체 플랫폼에서 수술 단계를 덮습니다. 난방 기구와 온도 모니터를 켜고 목표 온도를 37°C로 설정합니다.
- 산소 탱크 밸브를 열고 산소 유량을 1.5L/min으로 조정합니다. 마취기를 열고 이소플루란 수치 값을 3으로 설정합니다.
알림: 100% 순수 산소는 동물이 TBI 충격에서 살아남는 데 도움이 될 수 있습니다. - 마우스를 유도 챔버에 넣고 완전히 마취할 때까지 5분 동안 그대로 두십시오.
- 마우스가 완전히 마취되면(즉, 꼬리 꼬집기 반사가 없는 상태에서 2초당 약 1주기의 느리지만 꾸준한 호흡 속도) 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 마우스 헤드를 입체 프레임에 놓습니다.
- 마취 튜브 노즈 콘을 쥐의 위에 놓습니다.
- 1.5% 이소플루란과 100% 순수 산소를 혼합하여 1L/min의 유속으로 수술이 끝날 때까지 마취를 유지합니다. 주기적으로 호흡 빈도를 확인하고 수술 내내 최소 15분마다 꼬리 또는 발가락 꼬집음을 전달하여 적절한 마취를 평가합니다. 원하는 마취 깊이를 유지하기 위해 이소플루란 농도를 적절하게 조정합니다.
- TBI 수술
- 일회용 인슐린 주사기를 사용하여 부프레노르핀(1mg/kg, 피하)을 투여하고 쥐의 눈에 안과 연고를 바릅니다.
- 가위 1로 다듬은 후 제모제를 1분 동안 도포하여 정수리의 털을 제거합니다.
주의: 제모제 제품은 피부 자극 물질이므로 두피에 3분 이상 바르지 마십시오. 제모제가 쥐의 눈에 묻지 않도록 하십시오. - 거즈와 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두피 피부를 청소하십시오. 그런 다음 먼저 75% 에탄올을 사용한 다음 베타딘을 사용하여 피부를 소독합니다. 이것을 세 번 반복하고(즉, 에탄올 다음에 베타딘을 바르고) 베타딘을 피부에 마지막으로 바릅니다.
- 마취 깊이를 다시 확인하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다(즉, 꼬리 꼬집기 반사가 없는 상태에서 2초당 약 1주기의 느리지만 안정적인 호흡 속도). 수술용 겸자3로 피부를 덮고 눈에서 약 3mm 후방에서 시작하여 12-15mm 길이의 정중선을 절개합니다.
- 봄 가위를 사용하여 두개골의 좌반구와 우반구의 피부를 절제합니다 2.
- 두개골이 노출되면 멸균 면봉 어플리케이터로 부드럽게 문지르고 멸균 식염수로 씻어내어 골막을 제거합니다.
- 두개골의 상태를 육안으로 검사하여 이전 바이러스 주입 수술을 위해 만들어진 두 개의 작은 구멍을 제외하고는 손상되지 않았는지 확인합니다.
- 두개골 부위를 건조시키고 TBI 충격 부위를 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 시상 봉합사에서 오른쪽 측면 2mm 좌표로 표시합니다(그림 2B).
- 입체 프레임 프레임에서 마우스를 빠르게 제거하고 TBI 장치 아래의 완충 쿠션에 헤드를 놓습니다.
- 임팩터 팁을 표시된 충격 부위에 맞춥니다.
- 묶인 나일론 끈을 마우스 머리 위 15cm까지 당겨 금속 기둥을 들어 올렸다가 놓으면 무게가 TBI 사이트의 두개골 상단과 접촉하는 변환기 막대에 자유롭게 떨어질 수 있습니다. TBI 충격을 전달할 때 마우스 헤드를 만지지 마십시오.
- 마우스를 가열 담요 위로 옮기고 호흡 상태를 모니터링하면서 등을 대고 놓습니다.
- 마우스가 누운 자세에서 엎드린 자세로 똑바로 서면, 1.5L/min 유속으로 3% 순수 산소와 100% 이소플루란을 혼합하여 마우스를 이소플루란 유도 챔버에 ~5분 동안 넣습니다.
- 마우스가 완전히 진정되면(즉, 꼬리 꼬집기 반사가 없는 상태에서 2초당 약 1주기의 느리지만 안정적인 호흡 속도) 2.3.9-2.3.14단계를 반복하여 총 10회의 충격을 가합니다.
참고: 우리 연구에서 10개의 TBI 충격이 낮은 마우스 사망률로 강력한 표현형을 유도하는 것으로 밝혀졌습니다(데이터는 아직 발표되지 않음). 파라미터는 충격의 횟수 및/또는 무게가 방출되는 높이를 증가 또는 감소시킴으로써 뇌 손상의 상이한 중증도를 달성하도록 조정될 수 있다. 모든 매개변수는 현지 IACUC의 승인을 받아야 합니다. - 수술용 현미경으로 두개골을 확인하고 두개골 골절이 발생한 경우 연구에서 마우스를 제거합니다.
- 가짜 수술의 경우, TBI 충격을 전달하지 않고 임팩터 아래에 동물을 배치하는 것을 포함하여 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 따르십시오.
- 10번째 TBI 충격 후 마우스가 앙와위에서 엎드린 자세로 스스로 움직인 후 마우스를 이소플루란 유도 챔버에 ~5분 동안 넣습니다. 2.2.6-2.2.8 단계에 따라 아래에 설명된 두개골 창 이식 수술을 위해 마우스 머리를 입체 프레임에 놓습니다.
3. 두개골 창 이식 수술
참고: 아래의 두개골 창 이식 단계는 Goldey et al.9에서 채택되었으며 헤드 포스트 및 이미징 웰의 사양이 여기에 적용되었습니다.
- 창 준비
알림: TBI 수술을 시작하기 전에 2.2.2단계의 창 준비를 완료하십시오. 이 창은 아래에 설명된 대로 투명 광학 접착제로 결합된 두 개의 원형 유리 커버슬립( 그림 2C에 표시된 대로 직경 3mm 및 5mm 1개)으로 만들어집니다.- 유리 커버슬립을 75% 에탄올에 15분 동안 담가 소독합니다. 에탄올에서 유리 커버슬립을 꺼내 멸균 표면(즉, 멸균 24웰 플레이트의 뚜껑)에서 ~10분 동안 건조시킵니다.
- 인슐린 주사기에 투명한 광학 접착제를 채우고 기포가 형성되지 않도록 합니다. 현미경 1(재료 표)에서 0.67x 배율로 광학 접착제를 1mm 커버슬립 중앙에 작은 방울(~5μL)로 떨어뜨립니다. 그런 다음 즉시 3mm 커버슬립을 맨 위에 놓고 5mm 커버슬립으로 중앙에 놓습니다.
- 접착제가 고르게 펴지도록 미세한 집게를 사용하여 부드럽게 압력을 가합니다. 3mm 커버 슬립 주위에 기포나 벽이 형성되면 유리창을 버리십시오.
- 접착제를 경화시키려면 커버슬립을 20 x 100μJ/cm2의 전력으로 UV 상자에 150초 동안 넣습니다. 집게 4를 사용하여 3mm 슬립의 측면을 부드럽게 밀어 두 개의 커버슬립이 단단히 접착되었는지 확인합니다. 커버슬립이 움직이면 UV 상자에 다시 넣고 60초 동안 더 기다립니다. 나중에 사용할 수 있도록 유리창을 멸균 24웰 플레이트에 보관하십시오.
- 두개골 표면을 거칠게 합니다.
알림: 이제부터 수술용 현미경으로 섹션 3의 모든 단계를 수행합니다. 10배에서 시작하여 원하는 배율로 조정합니다.- FG4 카바이드 비트를 사용하여 낮은 로터 속도(즉, 출력 번호가 ~1-2로 설정됨)로 두개골 표면을 부드럽고 천천히 뚫어 남아 있는 골막을 제거하고 거친 두개골 표면을 만들어 치과용 시멘트가 두개골과 단단히 결합되도록 합니다. 대안으로 드릴 대신 메스를 사용할 수도 있습니다.
- 식염수를 사용하여 두개골 표면에서 뼛가루를 씻어내고 제거합니다.
- 근육을 분리하십시오.
알림: 근육 분리는 치과용 시멘트의 접촉점 역할을 할 노출된 두개골 뼈의 표면적을 증가시켜 임플란트의 구조적 무결성을 보장하는 역할을 합니다. 이 근육 분리 단계는 일반적으로 측두골판의 ~3mm를 노출시킵니다.- 두정골과 측두골을 연결하는 봉합사가 있는 눈 뒤쪽 약 5mm에서 닫힌 미세한 끝(#5/45 겸자)을 부드럽게 삽입하여 측면 근육을 두개골에서 분리하고 닫힌 끝을 Lambdoid 봉합사까지 뒤쪽 방향으로 부드럽게 움직입니다.
- 두개골 창 이식이 이루어지는 쪽의 측면 근육을 분리합니다.
알림: 안구 동맥이 손상되지 않도록 근육을 눈에 너무 가깝게 분리하지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 심각하고 지속적인 출혈이 발생할 수 있습니다. 쥐가 머리를 들기 위해 이 근육이 필요하므로 후두골에서 근육을 분리하지 마십시오. - 식염수를 사용하여 수술 부위의 이물질을 씻어내고 거즈로 해당 부위를 말립니다. 수술 부위에 젤 폼을 도포하여 출혈을 멈출 수 있습니다.
- 헤드포스트를 이식합니다.
- 이전 간행물9에 설명된 맞춤형 티타늄 헤드포스트(그림 2D)를 사용하여 개두술 수술을 수행하는 동안 마우스 헤드를 단단히 고정하고 후속 이광자 이미징을 수행합니다.
- 마커 펜과 수술용 캘리퍼스를 사용하여 오른쪽의 깨끗하고 건조한 두개골의 개두술 둘레를 추적합니다. 추적된 원의 중심점은 브레그마에서 2.5mm 후방이고 오른쪽 반구의 시상 봉합사에서 1.5mm 떨어져 있습니다. 추적 된 원의 직경은 약 3.2-3.5mm로 3mm 유리 커버 슬립보다 약간 큽니다. 개두술 원이 바이러스 주입 부위(바이러스를 주입하는 동안 만들어진 두 개의 구멍은 참조로 사용할 수 있음)와 TBI 부위를 덮을 수 있는지 확인합니다.
- 이어 바를 풀고 개두면이 완벽한 수평이 되도록 헤드를 돌린 다음 이어 바를 다시 조입니다.
- 면봉 어플리케이터의 나무 막대기를 사용하여 헤드포스트의 앞면과 뒷면 가장자리에 초강력 접착제 두 방울을 떨어뜨립니다.
- 티타늄 헤드포스트를 개두술의 중앙에 놓고 두개골 창이 이식될 위치와 동일한 평면 내에 놓이도록 빠르게 조정합니다. 초강력 접착제가 마를 때까지 가벼운 압력을 가하십시오. 일반적으로 ~30초가 걸립니다.
- 미리 냉각된 세라믹 혼합 접시에 치과용 시멘트를 준비합니다(-10°C 냉동실에서 최소 20분 유지): 시멘트 분말 300mg, 퀵 베이스 액체 6방울, 촉매 1방울을 섞은 다음 혼합물이 완전히 섞일 때까지 저어줍니다(~15회).
알림: 시멘트는 반죽이어야 합니다. 너무 묽으면 시멘트 가루를 조금 더 저어줍니다. 너무 걸쭉하면 반죽 같은 농도가 될 때까지 한 번에 한 방울씩 퀵 베이스 액체를 저어줍니다. - 추적된 둘레의 바깥쪽 둘레에 넉넉한 양의 치과용 시멘트 혼합물을 빠르게 바르고 노출된 뼈 표면을 덮습니다. 그러나 개두술 부위를 덮지 마십시오. 계속하기 전에 치과용 시멘트가 건조되고 굳을 때까지 ~15분 동안 기다리십시오.
- 이어 바를 풀고 헤드포스트를 금속 프레임에 고정하여 표시된 개두술 둘레를 따라 정확한 드릴링을 위해 헤드가 안정적인지 확인합니다. 개두술 부위에 시멘트가 있는 경우 FG4 카바이드 비트를 사용하여 구멍을 뚫고 제거합니다.
- 개두술
- 수술용 캘리퍼스를 사용하여 3.4.2단계에 정의된 대로 표시된 원의 직경을 확인합니다. 두개골 창이 개두술 내부에 꼭 맞도록 필요에 따라 조정합니다.
- 전기 치과용 드릴을 사용하여 FG4 카바이드 비트를 먼저 사용하여 표시된 원의 바깥쪽을 따라 두개골을 에칭하고 얇게 만듭니다(속도는 출력 ~9-10으로 설정됨). 이것은 두개골을 얇게 할 수 있는 "트랙"을 만듭니다.
주의 : 열 부상을 최소화하고 부드러운 트랙을 얻으려면 드릴 비트를 계속 움직이십시오. 같은 장소를 2초 이상 뚫지 마십시오. - 주기적으로 드릴링을 중지하고 멸균 식염수로 전체 영역을 관개하여 드릴의 열을 줄이고 뼈 먼지를 씻어냅니다.
- 두개골이 종이처럼 얇고 투명해질 때까지 1단계에서 설명한 대로 FG4/3.5.2 카바이드 비트를 사용하여 두개골을 계속 얇게 만듭니다.
알림: 두 손으로 드릴을 잡으면 드릴을 더 쉽게 제어할 수 있고 드릴 비트가 뇌에 삽입되는 것을 방지할 수 있습니다. - EF4 카바이드 비트를 사용하여 두개골 솎아내기를 완료합니다. 뼈 피판과 주변 두개골 뼈 사이에 균열이 생기면 때때로 뇌척수액(CSF)이 방출되어 두개골이 완전히 뚫렸음을 나타냅니다.
- 트랙을 따라 두개골의 나머지 부분을 계속 얇게 만들고 드릴링합니다. 출혈을 방지하기 위해 두개골 아래를 가로지르는 명백한 혈관 조직을 뚫지 마십시오.
- 갈라진 부위에 미세한 집게 팁(집게 1)~0.5mm를 삽입하고 밑에 있는 뇌가 움푹 들어가지 않도록 뼈 피판을 부드럽게 위로 들어 올립니다.
- 뼈 피판을 제거한 후 개두술 부위에 식염수를 뿌립니다. 뇌 표면은 개두술 가장자리보다 1-2mm 높을 수 있습니다.
- 이 단계부터 뇌 조직을 보호하기 위해 노출된 뇌를 항상 식염수로 덮으십시오.
- 원래 AAV 주사 부위에서 뼈 피판을 들어 올리면 주입 수술 후 조직 유착과 혈관 성장에 의해 출혈이 발생할 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 마른 면 팁 어플리케이터로 해당 부위를 ~2분(또는 필요에 따라 더 길게) 부드럽게 누릅니다. 젤 폼은 출혈을 멈추는 데 사용할 수 있습니다. 출혈을 멈추기 위해 화학 약품이나 가열 집게를 사용하면 부상을 입을 수 있으므로 사용하지 마십시오.
- 집게1을 사용하여 눈에 보이는 지주막 물질을 부드럽게 제거합니다.
- 임플란트 유리창
- 수술용 겸자 2를 사용하여 3mm 유리 커버슬립이 아래를 향하도록 하여 멸균 유리창을 들어올립니다. 개두술 부위 위에 유리창을 놓고 조정하여 창이 개두술 가장자리에 꼭 맞도록 합니다. 5mm 유리 커버슬립이 상단에 있습니다.
- 다음과 같이 치과용 시멘트를 준비합니다: 시멘트 분말 100mg, 퀵 베이스 액체 2방울, 촉매 1방울을 혼합합니다. 혼합물이 완전히 섞일 때까지 저어줍니다(~15회). 시멘트가 반죽처럼 두꺼워지고 걸쭉해질 때까지 ~6분 정도 기다립니다. 시멘트가 너무 묽으면 3.6.4단계에서 창 아래 공간으로 스며들어 창을 가릴 수 있습니다.
- 시멘트가 반죽되고 두꺼워질 때까지 기다리는 동안 입체 조작기를 통해 창에 적절한 양의 압력을 가하여 두개골이 유리창에 안전하고 단단히 접촉할 수 있는지 확인합니다. 3.6.4단계의 치과용 시멘트 액체가 유리 아래 공간에 도달하여 창을 가리지 않도록 하십시오.
- 조정 가능한 정밀 어플리케이터 브러시를 사용하여 창 가장자리를 따라 소량의 시멘트를 추가하여 유리창을 두개골로 밀봉합니다. 시멘트가 완전히 마를 때까지 ~10분 동안 기다린 다음 창 위의 매니퓰레이터를 부드럽게 풀어 제거합니다. 이 단계에서 4TBI 충격을 완료하고 헤드포스트와 두개골 창을 이식하는 데 ~10시간이 걸립니다.
- 창을 덮고 있는 과도한 시멘트가 있는 경우 FG4 카바이드 비트가 있는 치과용 드릴을 사용하여 치과용 시멘트를 다듬습니다.
알림: 창 주변의 과도한 시멘트는 이광자 대물 렌즈가 창 표면에 접근하는 것을 방해할 수 있습니다.
- 이미징 웰 이식
참고: 이미징 웰(그림 2D)은 외경이 ~1.6cm인 고무 링으로, 헤드포스트 상단 표면과 일치하고 이광자 이미징을 위해 두개골 창 위에 물을 담습니다.- 창 이식이 완료된 후 헤드포스트 상단 표면의 치과용 시멘트 파편을 뚫고 젖은 수술용 거즈를 사용하여 해당 부위를 청소합니다. 해당 부위를 ~3분 동안 건조시킵니다.
- 면 팁 어플리케이터를 사용하여 소량의 초강력 접착제를 담그고 헤드 포스트 상단 표면에 붙입니다. 고무 링을 헤드포스트에 빠르게 놓습니다. 헤드포스트와 밀착되도록 고무 링에 ~2분 동안 중간 압력을 가합니다. 초강력 접착제를 아껴서 사용하지 않으면 유리창에 달라붙어 이광자 이미징을 가릴 수 있습니다.
- 진통제 및 항생제 투여
- 이미징을 잘 이식한 직후, 이소플루란을 중단하기 전에 일회용 인슐린 주사기를 사용하여 세파졸린[500mg/kg(333mg/mL, 보통 ~45μL), 근육 주사] 및 멜록시캄(5mg/kg, 피하)을 투여합니다.
- 약물 투여 후 마취를 중단하고 마우스를 입체 프레임에서 풀어 놓고 마우스를 난방 담요 위에 있는 홈 케이지로 되돌립니다.
- 보행이 가능할 때까지 ~15분 동안 마우스를 면밀히 모니터링합니다.
알림: 쥐는 다른 쥐의 고무 이미징 우물을 물 수 있으므로 쥐를 개별적으로 수용하십시오. 애드리비텀(ad libitum)에 접근할 수 있도록 케이지에 있는 쥐 가까이에 음식과 물 젤을 제공합니다. - 두개창 이식 수술 후 48시간까지 이전 투여 후 8시간마다 부프레노르핀(1mg/kg, 피하)과 멜록시캄(5mg/kg, 피하)을 다시 투여합니다.
4. 생체 내 이광자 이미징
- 생체 내 이미징을 위해 조정 가능한 코히어런트 다광자 레이저와 20x 배율 대물렌즈(NA 1.0, 물 침수)가 장착된 현미경 2(재료 표)를 사용합니다18. EGFP 신호에 사용되는 필터는 "BP 500-550"입니다.
- 생체 내 이미징을 위해 두개골 창 마우스를 준비합니다.
- 수술 당일(0일로 지정)부터 TBI 이후 설계된 시점에 이광자 이미징을 수행합니다. 두개골 창 마우스를 마취 유도 챔버에 넣고 캐리어 가스와 혼합된 3% 이소플루란을 1.5L/min 유속으로 5분 동안 투여합니다.
알림: 운반 가스는 실내 공기 또는 100% 산소일 수 있습니다. - 마우스가 완전히 마취되면(즉, 꼬리 꼬집기 반사가 없는 상태에서 2초당 약 1주기의 느리지만 안정적인 호흡 속도) 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 헤드포스트를 브래킷에 빠르게 고정합니다. 마우스의 몸통을 브래킷이 장착된 둥근 플라스틱 판(직경 19cm) 위에 놓습니다.
알림: 생체 내 이미징 중에 열을 지원하기 위해 손으로 따뜻하게 한 패드를 마우스의 몸통 아래에 배치했습니다. - 쥐의 눈에 윤활제 안과 연고를 바르고 마취 튜브 노즈 콘을 쥐의 주둥이에 놓습니다. 1L/min 유속으로 캐리어 가스와 함께 1.5% 이소플루란을 사용하여 마취를 유지합니다.
- 주기적으로 호흡 빈도를 확인하고 영상 촬영 내내 최소 15분마다 꼬리 또는 발가락 꼬집을 전달하여 적절한 마취를 평가합니다. 원하는 마취 깊이를 유지하기 위해 이소플루란 농도를 적절하게 조정합니다.
- 마우스 헤드를 정렬하여 두개골 창이 이광자 대물렌즈 바로 아래에 있는지 확인합니다. 두개골 창 위의 이미징에 약간의 물을 추가합니다. 대물렌즈가 물에 잠기도록 내립니다.
- 수술 당일(0일로 지정)부터 TBI 이후 설계된 시점에 이광자 이미징을 수행합니다. 두개골 창 마우스를 마취 유도 챔버에 넣고 캐리어 가스와 혼합된 3% 이소플루란을 1.5L/min 유속으로 5분 동안 투여합니다.
- 두개내 윈도우 마우스의 생체 내 이미징
- 스코프 수은 램프를 켭니다. 먼저 안구를 통해 형광 상층광으로 뇌를 봅니다.
알림: 혈관 구조가 검은색으로 나타납니다. 창이 깨끗한 영역을 선택합니다. epifluorescence를 끄고, EGFP 신호에 대해 레이저 파장을 860nm로 설정하고, 최적의(즉, 밝지만 포화되지 않은) 신호에 대한 레이저 설정을 조정합니다. - 스캔 모드를 프레임 으로 설정하고 라인 단계를 1로 설정합니다. 평균 숫자를 16으로, 비트 심도를 8비트로, 모드를 Line으로, 메서드를 Mean으로 설정합니다.
- 혈관 패턴을 "참조 맵"으로 사용하여 후속 종방향 이미징을 위해 동일한 뇌 영역을 이미지화합니다. 그림 3A에 표시된 대로 면간 간격이 10μm인 z-stack 모드를 통해 피질 혈관이 우세한 3개의 평면에 대한 표면 수준(수막 표면에서 100μm 미만인 층 I)을 이미지화합니다.
- 그림 3A에 표시된 대로 면간 간격이 10μm이고 스캔 속도가 8인 z-스택 모드를 통해 깊은 수준(레이어 IV 및 V, 표면 수준보다 ~400μm 깊이)에서 6개의 평면을 이미지화합니다.
- 이미징을 마친 후(마우스당 ~20분) 마취를 중단하고 프레임에서 마우스를 분리한 다음 가열 담요 위에 있는 홈 케이지로 되돌립니다. 보행이 가능할 때까지 마우스를 연속적으로 모니터링하며 일반적으로 ~7분이 소요됩니다.
- TBI 수술 후 0일, 1주일, 4개월에 마우스를 종단적으로 이미지화합니다.
- 스코프 수은 램프를 켭니다. 먼저 안구를 통해 형광 상층광으로 뇌를 봅니다.
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Representative Results
이 프로토콜에 대한 개념 증명으로, AAV-Syn1-EGFP를 발현하는 바이러스 입자를 생후 3개월에 수컷 TDP-43 Q331K/Q331K 마우스(C57BL/6J 배경)19의 뇌 피질에 주입했습니다. 야생형 C57BL/6J 동물도 사용할 수 있지만, 이 연구는 실험실이 신경퇴행성 질환 연구에 중점을 두고 있기 때문에 TDP-43 Q331K/Q331K 마우스에서 수행되었습니다. TBI 수술은 AAV 주사 후 4주 후에 시행되었습니다. 동일한 수술 환경에서 헤드포스트와 두개골 창이 이식되었습니다. 마우스는 TBI 수술 후 0일, 1주일, 4개월에 이광자 현미경을 사용하여 연속적으로 이미지화되었습니다(그림 1). 일반적으로 주사 수술은 ~ 30 분이 걸렸고 TBI 수술은 마우스 당 ~ 1 시간이 걸렸습니다. TBI 수술 동안, 쥐는 일반적으로 초기 충격에 비해 후속 충격 후 앙와위 자세에서 엎드린 자세로 자신을 바로잡는 데 더 많은 시간이 필요했습니다. 예를 들어, 마우스는 첫 번째 충격 후 위치를 바로잡는 데 2분이 걸렸지만 10번째 충격 후 위치를 바로잡는 데 10분이 걸렸을 수 있습니다. 두개골 창 이식 수술의 경우 일반적으로 모든 단계를 수행하는 데 ~3시간이 필요했지만 지속적인 출혈이 발생하면 필요 이상으로 오래 걸렸습니다. 2광자 이미징은 일반적으로 모든 이미지를 획득하는 데 마우스당 20분이 걸렸습니다. EGFP가 발현된 쥐 3마리를 대상으로 한 이번 연구에서 동물은 두개골 골절의 증거를 보이지 않았으며, 수술 중 또는 수술 후 4개월까지 사망하지 않았습니다. 이환율과 두개골 골절률은 모두 0%였다. 이는 TBI를 유도하는 유사한 모델에서 상대적으로 낮은 사망률(<10%)과 일치하지만 두개골 창 임플란트가 없는 경우 7,8.
이전에보고된 중량 강하 장치(그림 2A)(그림 2A)는 그림 2B에 표시된 대로 오른쪽의 마우스 헤드에 TBI 충격을 전달하는 데 사용되었습니다. 투명한 플라스틱 튜브(그림 2A의 5번, 길이 60cm, 내경 1.4cm)를 금속 브래킷에 수직으로 단단히 고정하고, 플라스틱 임팩터 컬럼(그림 2A의 7번, 길이 10cm, 직경 1.3cm, 직경 2mm의 평평한 원형 팁)을 수직 튜브에 배치했습니다. 50g의 금속 추(그림 2A의 6번)를 임팩터 위에 놓고 나일론 끈(그림 2A의 4번)으로 묶었습니다. 버퍼 쿠션(그림 2A의 8번; 폴리에틸렌 폼과 면 거즈로 만들어진 9cm x 9cm x 1cm[길이 x 너비 x 깊이])을 마우스 헤드 아래에 배치하여 충격 에너지를 완충하고 흡수했습니다.
두개골 창은 광학 접착제로 결합된 두 개의 유리 커버슬립으로 만들어졌고(그림 2C), 직경 3mm의 유리 커버슬립은 뇌 표면에 닿는 면이었습니다. 2광자 이미징은 뇌 표면에서 두 개의 다른 깊이(그림 3A)에서 수행되었습니다: 1) 피질 혈관이 풍부하고 검은색으로 보이는 비교적 큰 내강 직경을 갖는 표면 수준이지만 희박한 EGFP 양성 세포체; 2) 혈관이 희박하고 내강 직경이 작고 많은 EGFP 양성 세포가 보이는 더 깊은 수준.
수술 후 ~4시간(0일)에, 혈관계가 검은색으로 보이는 표면 수준(수막 표면에서 100μm 미만인 층 I)에서 10μm 간격으로 3개의 평면에서 이광자 이미징을 수행했으며( 그림 3B에서 빨간색 점선으로 표시됨) 원래 이미징 영역을 찾기 위한 다음 이미징 세션의 참조 맵으로 사용되었습니다. 이 피상적인 수준에서는 대뇌 피질 혈관 구조와 신경 세포가 관찰할 수 있는 지배적인 구조인 반면, EGFP 양성 세포체는 드물었습니다. 표면 수준 내에서 이미징한 후 초점을 표면 수준보다 더 깊은 ~400μm만큼 피질(레이어 IV 및 V)로 아래쪽으로 조정하여 EGFP 양성 신경 세포체를 이미지화했습니다. 이미지는 10μm 간격으로 6면 내에서 획득되었습니다. EGFP 단백질 발현은 그림 3C에 표시된 바와 같이 세포체 전체에 확산적으로 분포되었습니다. 세포체 외부에서 일부 EGFP 반점이 가끔 발생했는데, 이는 축삭돌기 또는 수상돌기 내에서 시간이 지남에 따라 형성된 EGFP 내포물을 나타낼 수 있습니다. 이 프로토콜은 주사 부위를 둘러싼 AAV-SYN1-EGFP 발현을 ~2-3mm로 유도하며, 이는 사후 조직의 조직학적 분석으로 정의할 수 있습니다.
TBI 후 1주 4개월에 0일 시점에서 관찰된 혈관 구조 패턴을 동일한 이미징 영역을 찾기 위한 참조로 사용했습니다(그림 3D,F). 그림 3D,F의 혈관 패턴은 그림 3B의 패턴과 유사합니다. TBI 후 1주 및 4개월의 이미징 절차는 0일 시점에 대해 위에서 설명한 것과 동일했으며, 이전과 같이 세포체 전체에서 EGFP 발현이 검출되었습니다(그림 3E,G). 0일과 4개월의 형광 강도는 표재성 수준과 심부 수준 모두에서 유사했습니다. 그러나, 1주일의 형광 강도는 표재성 및 심층 수준 모두에서 0일 및 4개월의 형광 강도보다 낮았으며, 이는 다른 TBI 모델(20)에 대해 보고된 번역 억제에 기인할 수 있다. 특히, 0일 시점과 비교하여 4개월의 이미지 품질은 두개골 창이 선명도와 무결성을 유지했으며 효과적인 생체 내 이미징을 위해 수술 후 4개월이 지난 후에도 바이러스 발현이 여전히 견고하다는 것을 보여줍니다. EGFP는 상대적으로 확산된 단백질로 발현되기 때문에 EGFP가 관심 단백질에 융합될 때 형광 신호가 더 잘 분리되고 눈에 잘 띄지 않을 수 있습니다.
그림 1: 이 생체 내 이미징 프로토콜의 타임라인. 프로토콜은 바이러스 주입으로 시작됩니다. TBI와 두개골 창 수술은 바이러스 주입 후 2-4 주에 동일한 수술 세션 내에서 수행됩니다. 생체 내 영상은 TBI 후 0일, 1주일, 4개월에 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TBI 장치, TBI 충격 부위 및 창 준비에 대한 다이어그램. (A) 웨이트 드롭 TBI 장치용 장비. 1 : 받침대, 2 : 브래킷, 3 : 조정 가능한 클램프, 4 : 나일론 스트링, 5 : 웨이트 드롭 터널, 6 : 금속 웨이트 컬럼 (50g), 7 : 임팩터, 8 : 완충 쿠션. (B) 바이러스 주입 및 TBI 충격 부위의 개략도, 좌표는 브레그마 후방 2.5mm, 시상 봉합사에서 오른쪽 측면 2mm입니다. (C) 유리창을 준비하기 위한 개략도. 직경 3mm 및 5mm의 유리 커버 슬립 2개가 광학 접착제를 사용하여 결합됩니다. (D) 금속 헤드 포스트 및 이미징 웰의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미징 평면과 이미지 데이터의 개략도. (A) 여러 평면은 혈관이 위치한 표면 수준과 깊은 수준에서 이미지화됩니다. 이미지는 다음과 같이 수집됩니다: 피질 혈관 및 신경 돌기가 우세한 EGFP 양성 구조인 표면 수준의 3개 평면과 EGFP 양성 세포체가 주로 관찰되는 심부 수준의 6개 평면, 인접 평면 사이에 10μm 간격. 각 평면의 크기는 425.10 μm x 425.10 μm입니다. (B) 0일 시점에서 표면 수준의 평면을 대표하는 이미지. 빨간색 점선은 후속 시점에 대한 원래 이미징 위치를 찾기 위한 참조로 사용할 수 있는 혈관 조직 윤곽을 나타냅니다. (C) TBI 직후 0일 시점에서 깊은 수준에 있는 비행기의 대표 이미지. (D) 1주일 시점의 표면 수준에서 비행기의 대표 이미지. 빨간색 점선은 그림 3B의 0일째 윤곽선과 유사한 혈관 조직을 나타내며, TBI 후 0일과 1주일에 유사한 위치에서 이광자 이미징이 수행되었음을 확인합니다. (E) TBI 이후 1주일 시점의 심층적인 대표 이미지. (F) TBI 후 4개월에 B 및 D와 동일합니다. (G) TBI 후 4개월에 C 및 E와 동일합니다. 눈금 막대: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 AAV 주입, TBI 투여 및 두개골 창 이식이 있는 헤드포스트를 결합하여 쥐 뇌 피질(레이어 IV 및 V) 내 EGFP 표지 뉴런의 종단 이미징 분석을 통해 TBI가 피질 뉴런에 미치는 영향을 관찰했습니다. 이 연구는 여기에서 선택한 TBI 부위가 해마 위에 두개골 창 이식을 위한 비교적 평평하고 넓은 표면을 제공한다는 점에 주목합니다. 반대로, 두개골은 이 부위의 앞쪽이 상대적으로 좁기 때문에 헤드포스트가 두개골 표면에 효과적으로 접촉하도록 하기 어렵습니다. 이 연구에서는 TDP-43 Q331K/Q331K 마우스 모델만 사용되었지만, ALS 및 FTD19에 초점을 맞춘 실험실의 연구를 고려할 때 이 프로토콜은 대부분의 다른 마우스 균주에 적용할 수 있어야 합니다. 여기에 설명된 대로 뉴런을 라벨링하는 것 외에도 다양한 전략을 사용하여 생체 내 이미징을 위해 다른 세포 유형을 라벨링할 수 있습니다. 한 가지 접근법은 유전자 변형 마우스에서 Cre-Lox 재조합 시스템을 사용하여 세포 특이적 방식으로 유전적으로 인코딩된 형광 단백질을 발현하는 것이다21. 또 다른 접근법은 유전적으로 인코딩된 형광 단백질의 세포 특이적 transduction을 위해 특정 바이러스 혈청형을 사용하는 것입니다. 부위별 전달은 뇌의 원하는 위치에서 두개내 주사를 수행하여 달성할 수 있습니다. 생체 내 이미징을 위한 바이러스 transduction을 통해 세포 특이적 단백질을 발현할 수 있는 효율성과 용이성은 형질전환 마우스 모델을 만드는 것보다 유리합니다.
수술 프로토콜의 경우 신중하게 수행해야 하는 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 프로토콜 시작 시 바이러스 주입을 위해 두개골에 구멍을 뚫을 때 두개골 아래 조직이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 두개골을 뚫는 동안 조직 손상이 발생하면 손상 부위 주변에 염증, 조직 유착, 혈관신생이 발생하여 두개창 이식을 위한 개두술 시 출혈의 위험이 높아집니다. 체중 감소 장치로 TBI를 투여하기 위해 본 연구는 TBI 충격력을 완충하여 두개골 골절 가능성을 줄이기 위해 마우스 머리 아래에 쿠션을 배치했습니다. 회전 방향과 가속도에 대한 명백한 머리 움직임은 관찰되지 않았으며, 이는 이 TBI 모델이 확산 축삭 손상의 가능성이 상대적으로 낮다는 개념을 뒷받침합니다. 흥미롭게도, Foda et al.은 쥐에게 닫힌 두개골 TBI 손상을 구성하기 위해 유사한 체중 감소 장치를 사용했으며, 더 크고 부드러운 폼 쿠션 (12cm 두께)을 쥐 머리 아래에 배치하여 가속도에 따른 회전 방향의 TBI 충격력에 반응하여 쉽게 움직일 수 있도록 하여 확산 축삭 손상을 초래했습니다22. 튜브 가이딩 분동 강하 TBI 모델의 장점 중 하나는 분동 강하 높이(즉, 더 큰 힘의 경우 더 높은 높이)를 변경하거나 충격이 전달되는 횟수를 반복하여 외상의 심각성을 조절할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, Flierl et al.은 생쥐에서 TBI를 유도하기 위해 본 연구와 유사한 체중 감소 장치를 사용했습니다. 금속의 무게는 333g으로 2cm 높이에서 떨어뜨렸을 때 경미한 TBI를 유발하고 3cm 높이에서 떨어뜨렸을 때 심한 TBI를 유발했다23. 창문 이식 전 개두술 단계도 두개골 아래의 뇌 조직이 손상되지 않도록 신중하게 수행해야 합니다. 드릴 비트를 두개골의 다른 영역으로 주기적으로 이동하면 과도한 가열, 조직 손상 및 출혈을 초래할 수 있는 동일한 지점에서 과도한 드릴링을 방지하는 데 도움이 됩니다. 또한 식염수로 자주 관개하면 시추 현장을 냉각시킬 수도 있습니다. 유리창을 이식할 때 유리면이 두개골 표면면과 평행하도록 정렬하는 것이 중요합니다. 두개골 안쪽에 꼭 맞는 창문은 치과용 시멘트 액체가 창문과 뇌 사이의 공간으로 누출되는 것을 방지합니다.
TBI 수술 후 0일째에 창은 흐릿하지만 형광 신호가 감지되면 치과용 시멘트가 창과 뇌 사이의 공간으로 들어가 뇌 표면을 덮고 형광 방출을 가리는 시멘트 층을 형성했을 수 있습니다. 이러한 상황에서, 프로토콜 단계 3.5에 기술된 드릴링 방법을 사용하여 창과 치과용 시멘트를 제거한 다음, Goldey et al.9에 의해 상세히 기술된 바와 같이, 원래의 위치에 새로운 유리창을 이식할 수 있다. 종방향 이미징 과정에서 후속 단계에서 창이 흐려지면 면봉 어플리케이터로 창을 부드럽게 문질러 잠재적인 파편을 제거할 수 있습니다. 이렇게 해도 문제가 해결되지 않으면 유리창 아래의 뼈와 수막이 다시 자라기 때문일 수 있습니다. 이 경우 창문을 제거하고 드릴로 다시 자란 뼈 및/또는 핀셋을 제거하고 수막을 제거한 다음 Goldey et al.9의 설명에 따라 원래 위치에 새 유리창을 이식할 수 있습니다. 결과에서 볼 수 있듯이 EGFP 발현 및 형광은 TBI 후 ~4개월의 시간 경과에 걸쳐 견고합니다. TBI 후 첫 주 이내에 형광 신호의 감소를 예상할 수 있는데, 이는 전체 단백질 합성의 일시적인 감소를 유발하는 TBI 유도 번역 억제 때문일 수있습니다 20.
높은 이미징 품질을 유지하고 여러 평면에서 이미징을 달성하기 위해 마우스는 움직임을 제한하기 위해 이소플루란 마취를 받았습니다. 그러나 마취가 연구 결과에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 이소플루란 마취 하의 마우스는 깨어 있는 마우스와 비교하여 광손상에 반응하여 상이한 미세아교세포 활성을 나타내는 것으로 보고되었다24. 이광자 이미징의 경우 신호 평균화를 위한 스캔 속도와 스캔 횟수("평균화"에서 "숫자"로 설정)가 이미지 해상도를 결정할 수 있는 주요 요소입니다. 해상도를 최적화하기 위해 스캔 속도를 줄이고 평균 수치를 높일 수 있지만, 속도가 느려지고 평균 수치가 높을수록 특정 시야에 대한 이미징 시간이 늘어나고 사진 표백이 발생할 수 있습니다. 본 연구는 동일한 뇌 위치에서 동일한 동물에 대한 만성 장기 이미징을 달성하는 것을 목표로 합니다. 충분한 해상도를 달성하면서 잠재적인 사진 표백을 방지하기 위해 2광자 이미징을 스캐닝 속도 8, 평균 16으로 수행했습니다.
개두술을 시행하고 유리창을 이식하는 또 다른 접근법은 두개골이 투명하고 살아있는 이미징을 위해 "종이처럼 얇아지는" 정도까지 두개골을 얇게 만드는 것이다25,26,27. 얇은 두개골 창은 두개골의 온전함을 유지할 수 있으므로 외과 수술로 인한 염증을 피할 수 있습니다. 그러므로, 얇은 두개골 창 접근법은 염증 관련 마커를 사용한 실시간 이미징 및/또는 비교적 짧은 기간(즉, 수술 후 ~14일, 보고된바와 같이25)에 걸쳐 선호될 수 있다. 만성 신경 퇴행성 과정의 장기 이미징 (즉, 여기에 설명 된대로 4 개월)의 경우 동일한 동물에 대한 TBI의 급성 영향을 평가하는 것 외에도 개두술 방법으로 이식 된 유리창을 사용하는 것이 좋습니다.
서론에서 언급했듯이 포유류 뇌의 다양한 생물학적 및 병리학적 사건을 연구하기 위한 생체 내 영상에는 몇 가지 주목할 만한 이점이 있습니다. 그러나 이 프로토콜에도 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, contrecoup brain injury는 일반적으로 힘과 접촉하는 부위(28,29,30)로부터 멀리 떨어진 뇌 타박상 또는 혈종을 설명한다. 본 연구에서 TBI 영향은 두정엽에 전달되었습니다. contrecoup 손상은 복부 손상이 예상되며 생체 내 영상에 접근할 수 없습니다. 조직학적 분석은 두개골 창으로 덮인 충격 부위 외부의 관심 표현형을 추가로 검사하기 위한 보완적 접근 방식으로 사용될 수 있습니다. 또한, 특정 단백질의 외인성 과발현은 독성 또는 병리를 유발할 수도 있습니다. 본 연구에서는 일부 간헐적인 EGFP 반점이 관찰되었는데, 이는 단백질 과발현으로 인한 축적을 나타낼 수 있습니다. 따라서 특히 관심 단백질이 반점 구조를 형성하기 쉬운 경우 이러한 가능성을 해결하기 위해 연구 설계에 음성 대조군 단백질(예: EGFP 또는 RFP 단독)을 포함하는 것이 좋습니다. 동시에 연구할 수 있는 단백질의 수는 레이저와 이광자 시스템의 기능에 의해 제한됩니다. 이광자 현미경으로 두 개 이상의 형광단(예: EGFP, RFP 등)을 이미지화하는 것이 가능할 수 있지만, 기존의 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용한 멀티플렉싱 기능을 사용하면 단일 조직 샘플 내에서 더 많은 단백질을 분석할 수 있는 경우가 많습니다. 마지막으로, 체중 감소 충격을 제외하고는 TBI 동물과 동일한 절차를 모두 받는 가짜 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 두개골 창 이식 수술은 침습적 수술이며 TBI 과정에 영향을 미칠 수 있는 염증 및 두개내 압력 변화와 같은 일부 국소적 변화를 유발할 수 있습니다. 가짜 대조군은 실험자가 충격과 수술 절차로 인한 표현형을 평가하는 데 도움이 됩니다.
요약하면, 이 프로토콜은 TBI에 반응하여 쥐 뇌 피질의 뉴런에서 단백질을 특이적으로 세로로 이미지화하는 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 TBI에 반응하여 다양한 세포 특이적 단백질의 발현 및 국소화를 분석하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 포유류 뇌에서 TBI의 즉각적이고 장기적인 결과를 연구하기 위한 접근 방식을 제공하는 것입니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않습니다.
Acknowledgments
AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP 바이러스를 기증해 주신 University of Massachusetts Chan Medical School의 Miguel Sena-Esteves 박사님과 생쥐 두개골 스케치를 그려주신 University of Massachusetts Chan Medical School의 Debra Cameron 박사님께 감사드립니다. 또한 Bosco, Schafer 및 Henninger 연구소의 현재 및 이전 구성원의 제안과 지원에 감사드립니다. 이 작업은 국방부(W81XWH202071/PRARP)에서 DAB, DS 및 NH에 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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