Summary
Este estudio demuestra la administración de una lesión cerebral traumática repetitiva a ratones y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales de un EGFP expresado por neuronas mediante microscopía de dos fotones.
Abstract
El objetivo de este protocolo es demostrar cómo visualizar longitudinalmente la expresión y localización de una proteína de interés dentro de tipos celulares específicos del cerebro de un animal, tras la exposición a estímulos exógenos. En este trabajo se muestra la administración de un traumatismo craneoencefálico (TCE) cerrado y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales longitudinales en ratones. A los ratones se les inyecta intracranealmente un virus adenoasociado (AAV) que expresa una proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) bajo un promotor neuronal específico. Después de 2 a 4 semanas, los ratones se someten a una lesión cerebral traumática repetitiva utilizando un dispositivo de caída de peso sobre el lugar de inyección de AAV. Dentro de la misma sesión quirúrgica, a los ratones se les implanta un poste de cabeza de metal y luego una ventana craneal de vidrio sobre el sitio de impacto de la LCT. La expresión y localización celular de EGFP se examina utilizando un microscopio de dos fotones en la misma región cerebral expuesta a un trauma en el transcurso de meses.
Introduction
Las lesiones cerebrales traumáticas (TBI, por sus siglas en inglés), que pueden ser el resultado de lesiones deportivas, colisiones de vehículos y combates militares, son un problema de salud mundial. El TCE puede provocar déficits fisiológicos, cognitivos y conductuales, y discapacidad o mortalidad de por vida 1,2. La gravedad del TCE se puede clasificar en leve, moderada y grave, siendo la gran mayoría un TCE leve (75-90%)3. Cada vez se reconoce más que el TCE, en particular la ocurrencia repetitiva de TCE, puede promover la degeneración neuronal y servir como factores de riesgo para varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (DFT) y la encefalopatía traumática crónica (ETC)4,5,6. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la neurodegeneración inducida por LCT siguen sin estar claros y, por lo tanto, representan un área activa de estudio. Para obtener información sobre cómo las neuronas responden y se recuperan de un TCE, se describe aquí un método para monitorear proteínas de interés marcadas con fluorescencia, específicamente dentro de las neuronas, mediante imágenes intravitales longitudinales en ratones después de un TCE.
Con este fin, este estudio muestra cómo combinar un procedimiento quirúrgico para la administración de TCE de cráneo cerrado que es similar al descrito previamente7,8, junto con un procedimiento quirúrgico para la implantación de una ventana craneal para la imagen intravital posterior, según lo descrito por Goldey et al9. En particular, no es factible implantar primero una ventana craneal y posteriormente realizar un TCE en la misma región, ya que es probable que el impacto de la caída de peso que induce el TCE dañe la ventana y cause daños irreparables al ratón. Por lo tanto, este protocolo fue diseñado para administrar el TCE y luego implantar la ventana craneal directamente sobre el sitio del impacto, todo dentro de la misma sesión quirúrgica. Una ventaja de combinar el TCE y el implante de la ventana craneal en una sola sesión quirúrgica es la reducción del número de veces que un ratón se somete a cirugía. Además, permite monitorear la respuesta inmediata (es decir, en la escala de tiempo de horas) a la LCT, en lugar de implantar la ventana en una sesión quirúrgica posterior (es decir, las imágenes iniciales comienzan en una escala de tiempo de días después de la LCT). La ventana craneal y la plataforma de imagen intravital también ofrecen ventajas sobre la monitorización de proteínas neuronales mediante métodos convencionales como la inmunotinción de tejidos fijos. Por ejemplo, se requieren menos ratones para la obtención de imágenes intravitales, ya que el mismo ratón se puede estudiar en múltiples puntos de tiempo, a diferencia de las cohortes separadas de ratones necesarias para puntos de tiempo discretos. Además, las mismas neuronas pueden ser monitoreadas a lo largo del tiempo, lo que permite rastrear eventos biológicos o patológicos específicos dentro de la misma célula.
Como prueba de concepto, aquí se demuestra la expresión neuronal específica de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) bajo el promotor de sinapsina10. Este enfoque puede extenderse a 1) diferentes tipos de células cerebrales mediante la utilización de otros promotores específicos del tipo de célula, como el promotor de la proteína básica de mielina (MBP) para los oligodendrocitos y el promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para los astrocitos11, 2) diferentes proteínas diana de interés mediante la fusión de sus genes con el gen EGFP, y 3) la coexpresión de múltiples proteínas fusionadas con diferentes fluoróforos. Aquí, el EGFP se empaqueta y se expresa a través de la administración de virus adenoasociados (AAV) a través de una inyección intracraneal. Se administra un traumatismo craneoencefálico cerrado mediante un dispositivo de caída de peso, seguido de la implantación de una ventana craneal. La visualización del EGFP neuronal se logra a través de la ventana craneal, utilizando microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia del EGFP in vivo. Con el láser de dos fotones, es posible penetrar más profundamente en el tejido cortical con un mínimo de fotodaño, lo que permite obtener imágenes longitudinales repetidas de las mismas regiones corticales dentro de un ratón individual durante días y hasta meses12,13,14,15. En resumen, este enfoque de combinar una cirugía de TCE con imágenes intravitales tiene como objetivo avanzar en la comprensión de los eventos moleculares que contribuyen a la patología de la enfermedad inducida por LCT16,17.
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Protocol
Todos los protocolos relacionados con los animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por el Comité del Consejo Nacional de Investigación (EE. UU.). Los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina Chan (UMMS) de la Universidad de Massachusetts (Permiso Número 202100057). En resumen, como se muestra en el esquema del estudio (Figura 1), el animal recibe una inyección de virus, un TCE, una implantación de ventana y luego imágenes intravitales en una secuencia de tiempo.
NOTA: Se han eliminado los términos comerciales. Consulte la Tabla de materiales para conocer el equipo específico utilizado.
1. Inyección intracraneal de VAA con un dispositivo estereotáxico
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Utilice un título viral de 1 x 1013 genomas virales por mililitro (vg/mL). Syn1 se refiere a Synapsin1, que es un promotor neuronal específico que permite una expresión viral restringida en las neuronas. El virus puede ser preparado internamente o subcontratado.
- Preparación para la cirugía de inyección estereotáxica para la administración de VAA
- Tijeras regulares de autoclave, un calibrador quirúrgico, tijeras quirúrgicas de resorte, pinzas quirúrgicas, pinzas para mosquitos, gasas, un aplicador con punta de algodón y una jeringa de microlitros de vidrio.
- Desinfecte el área de la cirugía con etanol al 75%. Expanda el paño quirúrgico estéril desechable para cubrir la región de la cirugía en la plataforma estereotáxica.
NOTA: Para mantener la temperatura corporal del animal durante la cirugía de inyección, utilice un aparato de calentamiento regulado por retroalimentación. - Pesa y registra el peso corporal del ratón.
- Abra la válvula del tanque de oxígeno y ajuste el flujo de oxígeno a 1,5 L/min. Abra la máquina de anestesia y ajuste el valor del nivel de isoflurano a tres.
NOTA: El gas portador puede ser aire ambiente u oxígeno al 100% en este paso. - Coloque el ratón en la cámara de inducción y déjelo reposar durante 5 minutos para lograr la anestesia completa.
- Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), retire el ratón de la cámara de inducción y coloque la cabeza del ratón en el marco estereotáxico.
- Coloque el cono de la nariz del tubo de anestesia sobre el hocico del ratón.
- Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5%, con gas portador a un caudal de 1 L/min hasta el final de la cirugía. Verifique periódicamente la frecuencia de la respiración y aplíquele un pellizco en la cola o en los dedos de los pies al menos cada 15 minutos durante la cirugía para evaluar la anestesia adecuada. Ajuste la concentración de isoflurano según corresponda para mantener la profundidad deseada de la anestesia.
- Llene una jeringa de microlitros (10 μL) con la solución de virus. Luego, fije la jeringa en la bomba de microinyector correspondiente del dispositivo estereotáxico.
- Cirugía de inyección
- Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) con una jeringa de insulina desechable y aplicar una pomada oftálmica lubricante en los ojos del ratón.
- Retira el cabello del cuero cabelludo en la parte superior de la cabeza recortándolo con unas tijeras normales 1.
- Limpie la piel del cuero cabelludo con gasas y aplicadores con punta de algodón. Desinfectar la piel con etanol al 75% primero y luego betadine. Repita esto tres veces (es decir, etanol seguido de betadine), dejando la aplicación final de betadine en la piel.
- Vuelva a comprobar la profundidad de la anestesia para asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola). Haga una incisión de ~ 1 cm con unas tijeras normales 2 a lo largo de la línea media para exponer el cráneo parietal derecho y retire el periostio con un aplicador con punta de algodón.
- Marque dos puntos en el cráneo con un rotulador en estas coordenadas: punto A: 2,5 mm posterior al Bregma y 1 mm lateral a la línea media sobre el hemisferio derecho; punto B: 2,5 mm posterior al Bregma y 2 mm lateral a la línea media sobre el hemisferio derecho.
- Taladre con cuidado dos agujeros a través del cráneo en las coordenadas marcadas con un taladro dental eléctrico con una broca fina de carburo EF4.
NOTA: Tenga cuidado de no dañar el tejido cerebral. - Ajuste el marco estereotáxico para alinear la punta de la aguja de la jeringa de microlitros con el orificio del cráneo que está 1 mm lateral a la línea media.
- Baje la aguja de la jeringa para tocar la superficie del cerebro y, a continuación, establezca esa ubicación como el punto cero (para el eje z). Baje la punta de la aguja en la corteza cerebral a una profundidad de 0,5 mm e infunda lentamente 1 μL de la solución viral a una velocidad de 200 nL/min.
- Espere 5 minutos después de que la solución del virus se inyecte completamente en el tejido cerebral antes de retirar la aguja para evitar el reflujo de la solución.
- Retire lentamente la aguja de la jeringa. Repita la inyección en el otro sitio. Suturar la incisión con una sutura quirúrgica estéril y no absorbible (calibre 6-0).
- Administrar cefazolina [500 mg/kg (333 mg/mL, generalmente ~45 μL), por vía intramuscular] y meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) después de la cirugía mientras el animal aún está anestesiado.
- Suelte el ratón del marco estereotáxico y suspenda la anestesia. Coloque al ratón en una jaula limpia sobre una manta térmica y vigile al animal hasta que esté ambulatorio (aproximadamente 15 min). Luego, transfiéralo a la jaula de origen.
- Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) y meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) de nuevo a las 8 h, 16 h y 24 h, respectivamente, después de la primera inyección de buprenorfina.
NOTA: A las 2-4 semanas después de la inyección del virus, el ratón recibe un TBI y la implantación de la ventana craneal en el mismo sitio que la inyección de AAV.
2. Administración de una inducción repetitiva de LCT
NOTA: Los parámetros del TCE se han ajustado con respecto a los informes anteriores7,8, en los que el impacto del TCE se entregó una vez. El protocolo aquí aplica el mismo parámetro, excepto que aumenta el número de impacto total a 10.
- Equipo de TBI
- Utilice un dispositivo portátil hecho a medida para la administración de un traumatismo craneoencefálico cerrado (Figura 2A) en la cabeza del ratón en el lado derecho, como se indica en la Figura 2B.
- Preparación antes de la cirugía
- Equipo quirúrgico de autoclave, que incluye tijeras regulares, un calibrador quirúrgico, tijeras quirúrgicas de resorte, pinzas quirúrgicas, pinzas para mosquitos, piezas para postes de cabeza, gasas y aplicadores con punta de algodón.
- Pesar y registrar el peso corporal del ratón 2 h antes de la cirugía. Para minimizar el edema cerebral durante la implantación de la ventana craneal, inyecte fosfato sódico de dexametasona a una dosis de 4,8 mg/kg [2 mg/ml, generalmente ~70 μl (es necesario inyectar en dos sitios)] en el músculo cuádriceps con una jeringa de insulina. Después de la inyección de dexametasona, pero antes de comenzar la cirugía de LCT, prepare las ventanas de vidrio como se indica en el paso 3.1 para su uso posterior.
- Desinfecte el escenario quirúrgico y el equipo de TBI con etanol al 75% y amplíe el paño quirúrgico estéril desechable para cubrir el escenario quirúrgico en la plataforma estereotáxica. Encienda el aparato de calefacción y el monitor de temperatura, ajustando la temperatura objetivo a 37 °C.
- Abra la válvula del tanque de oxígeno y ajuste el flujo de oxígeno a 1,5 L/min. Abra la máquina de anestesia y ajuste el valor del nivel de isoflurano a tres.
NOTA: El oxígeno 100% puro puede ayudar al animal a sobrevivir a los impactos de una lesión cerebral traumática. - Coloque el ratón en la cámara de inducción y déjelo reposar durante 5 minutos para lograr la anestesia completa.
- Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), retire el ratón de la cámara de inducción y coloque la cabeza del ratón en el marco estereotáxico.
- Coloque el cono de la nariz del tubo de anestesia sobre el hocico del ratón.
- Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5% mezclado con oxígeno puro al 100% a un caudal de 1 L/min hasta el final de la cirugía. Verifique periódicamente la frecuencia de la respiración y aplíquele un pellizco en la cola o en los dedos de los pies al menos cada 15 minutos durante la cirugía para evaluar la anestesia adecuada. Ajuste la concentración de isoflurano según corresponda para mantener la profundidad deseada de la anestesia.
- Cirugía de LCT
- Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) con jeringas de insulina desechables y aplicar pomada oftálmica en los ojos del ratón.
- Retire el vello de la parte superior de la cabeza recortando con unas tijeras 1 y luego aplicando un agente depilatorio durante 1 minuto.
PRECAUCIÓN: No aplique el producto depilatorio durante más de 3 minutos en el cuero cabelludo, ya que es un irritante de la piel. Evite que cualquier agente depilatorio entre en contacto con los ojos del ratón. - Limpie la piel del cuero cabelludo aplicando gasas y aplicadores con punta de algodón. Luego, desinfecte la piel, usando primero etanol al 75% y luego betadine. Repita esto tres veces (es decir, etanol seguido de betadine), dejando la aplicación final de betadine en la piel.
- Vuelva a comprobar la profundidad de la anestesia para asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola). Cubrir la piel con pinzas quirúrgicas 3 y hacer una incisión de 12-15 mm de largo en la línea media a partir de aproximadamente 3 mm posteriores a los ojos.
- Extirpe la piel sobre el hemisferio izquierdo y derecho del cráneo con unas tijeras de resorte 2.
- Una vez que el cráneo esté expuesto, retire el periostio frotando suavemente con un aplicador estéril con punta de algodón y enjuagando con solución salina estéril.
- Inspeccione visualmente el estado del cráneo para asegurarse de que esté intacto, a excepción de los dos pequeños orificios, que se hicieron para la cirugía de inyección de virus anterior.
- Secar la zona del cráneo y marcar el lugar del impacto del TCE en las siguientes coordenadas: 2,5 mm posterior al Bregma y 2 mm lateral desde la sutura sagital hacia la derecha (Figura 2B).
- Retire rápidamente el mouse del marco estereotáxico y coloque la cabeza en el cojín amortiguador debajo del dispositivo TBI.
- Alinee la punta del impactador con el sitio de impacto marcado.
- Levante la columna de metal tirando de la cuerda de nailon atada a 15 cm por encima de la cabeza del ratón y luego suéltela, permitiendo que el peso caiga libremente sobre la varilla del transductor, que está en contacto con la parte superior del cráneo en el sitio del TBI. No toque la cabeza del ratón cuando realice el impacto de la lesión cerebral traumática.
- Mueva el mouse sobre la manta térmica y colóquela boca arriba mientras monitorea el estado de la respiración.
- Una vez que el ratón pase de una posición supina a una posición prona, coloque el ratón en la cámara de inducción de isoflurano durante ~ 5 minutos con isoflurano al 3% mezclado con oxígeno puro al 100% a un caudal de 1,5 L/min.
- Una vez que el ratón esté completamente sedado (es decir, con una frecuencia respiratoria lenta pero constante de aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), repita los pasos 2.3.9-2.3.14 para lograr un total de 10 impactos.
NOTA: En nuestro estudio, se han encontrado diez impactos de TCE que inducen un fenotipo robusto con baja mortalidad en ratones (datos aún no publicados). Los parámetros pueden ajustarse para lograr una gravedad diferente de la lesión cerebral aumentando o disminuyendo el número de impactos y/o la altura a partir de la cual se libera el peso. Todos los parámetros están sujetos a la aprobación de la IACUC local. - Revise el cráneo bajo un microscopio quirúrgico y retire al ratón del estudio si se ha producido una fractura de cráneo.
- Para una cirugía simulada, siga los mismos procedimientos descritos anteriormente, incluida la colocación del animal debajo del impactador, pero sin administrar los impactos de la LCT.
- Después de que el ratón pase de una posición supina a una posición prona después del10º impacto de TBI, coloque el ratón en la cámara de inducción de isoflurano durante ~ 5 min. Siga los pasos 2.2.6-2.2.8 para colocar la cabeza del ratón en el marco estereotáxico para la cirugía de implantación de ventana craneal que se describe a continuación.
3. Cirugía de implantación de ventana craneal
NOTA: Los pasos de implantación de la ventana craneal que se indican a continuación se adoptaron de Goldey et al.9, y aquí se aplicaron sus especificaciones del poste de la cabeza y el pocillo de imagen.
- Preparación de la ventana
NOTA: Complete la preparación de la ventana en el paso 2.2.2 antes de comenzar la cirugía de TBI. La ventana está formada por dos cubreobjetos redondos de vidrio (uno de 3 mm y otro de 5 mm de diámetro, como se indica en la Figura 2C) que se unen entre sí mediante adhesivo óptico transparente, como se describe a continuación.- Desinfecte los cubreobjetos de vidrio sumergiéndolos en etanol al 75% durante 15 min. Saque las cubiertas de vidrio del etanol y déjelas secar sobre una superficie estéril (es decir, la tapa de una placa estéril de 24 pocillos) durante ~ 10 minutos.
- Llene una jeringa de insulina con pegamento óptico transparente evitando la formación de burbujas. Bajo el microscopio 1 (Tabla de materiales) con un aumento de 0,67x, coloque una pequeña gota (~1 μL) de pegamento óptico en el centro del cubreobjetos de 5 mm. Luego, coloque inmediatamente el cubreobjetos de 3 mm en la parte superior y céntrelo con el cubreobjetos de 5 mm.
- Aplique presión suavemente con pinzas finas para esparcir el pegamento de manera uniforme. Deseche la ventana de vidrio si se forma una burbuja o pared alrededor del cubreobjetos de 3 mm.
- Para curar el pegamento, coloque los cubreobjetos en una caja UV durante 150 s a una potencia de 20 x 100 μJ/cm2. Compruebe que los dos cubreobjetos estén bien unidos, utilizando unas pinzas 4 para empujar suavemente el lateral del portaobjetos de 3 mm. Si el cubreobjetos se mueve, vuelva a colocarlo en la caja UV durante 60 segundos más. Guarde la ventana de vidrio en una placa estéril de 24 pocillos para su uso posterior.
- Raspar la superficie del cráneo.
NOTA: A partir de aquí, realice todos los pasos de la sección 3 bajo un microscopio quirúrgico. Comience con 10x y ajústelo al aumento deseado.- Taladre suave y lentamente la superficie del cráneo con una broca de carburo FG4 a una velocidad de rotor baja (es decir, el número de salida establecido en ~ 1-2) para eliminar el periostio restante y crear una superficie rugosa del cráneo, de modo que el cemento dental se una de forma segura con el cráneo. También se puede utilizar un bisturí en lugar de un taladro como alternativa.
- Use solución salina para enjuagar y eliminar el polvo óseo de la superficie del cráneo.
- Separa los músculos.
NOTA: La separación muscular sirve para aumentar el área de superficie del hueso del cráneo expuesto que servirá como punto de contacto para el cemento dental, asegurando así la integridad estructural del implante. Este paso de separación muscular generalmente expone ~ 3 mm de la placa temporal del cráneo.- Aproximadamente a 5 mm por detrás del ojo, donde se encuentra la sutura que conecta el cráneo parietal y temporal, inserte suavemente las puntas finas cerradas (pinzas # 5/45) para separar los músculos laterales del cráneo, y mueva suavemente las puntas cerradas en la dirección posterior hasta la sutura lambdoidea.
- Separe los músculos laterales en el lado donde se producirá la implantación de la ventana craneal.
NOTA: Tenga cuidado de no separar los músculos demasiado cerca del ojo, para evitar lesionar la arteria oftálmica; de lo contrario, puede producirse una hemorragia grave y persistente. No separe los músculos del hueso occipital, ya que el ratón necesita estos músculos para levantar la cabeza. - Lave los residuos del sitio quirúrgico con solución salina y seque el área con una gasa. Se puede aplicar espuma de gel en el sitio quirúrgico para detener el sangrado.
- Implante el poste de la cabeza.
- Utilice un poste de titanio hecho a medida (Figura 2D), descrito en una publicación anterior9, para fijar la cabeza del ratón de forma segura mientras se realiza la cirugía de craneotomía y para la obtención posterior de imágenes de dos fotones.
- Use un rotulador y un calibrador quirúrgico para trazar la circunferencia de la craneotomía en el cráneo limpio y seco del lado derecho. El punto central del círculo trazado está a 2,5 mm posterior al Bregma y a 1,5 mm de la sutura sagital en el hemisferio derecho. El diámetro del círculo trazado es de unos 3,2-3,5 mm, ligeramente mayor que el cubreobjetos de vidrio de 3 mm. Asegúrese de que el círculo de craneotomía pueda cubrir los sitios de inyección del virus (los dos orificios hechos durante la inyección del virus se pueden usar como referencia) y el sitio de la lesión cerebral traumática.
- Afloje la barra de la oreja y gire la cabeza para que el plano de la craneotomía quede perfectamente horizontal, y luego apriete la barra de la oreja nuevamente.
- Use la barra de madera de un aplicador con punta de algodón para agregar dos pequeñas gotas de superpegamento en el borde delantero y trasero del poste de la cabeza.
- Coloque el poste de titanio sobre el centro de la craneotomía y ajústelo rápidamente para que descanse dentro del mismo plano donde se implantará la ventana craneal. Aplique una ligera presión hasta que el superpegamento se seque; Esto suele tardar ~30 s.
- Prepare el cemento dental en una fuente de mezcla de cerámica preenfriada (permaneciendo al menos 10 minutos en un congelador a -20 ° C): combine 300 mg de cemento en polvo, seis gotas de líquido base rápida y una gota de catalizador, y luego revuelva la mezcla hasta que esté bien mezclada (~ 15 veces).
NOTA: El cemento debe ser pastoso. Si está demasiado diluido, agregue un poco más de cemento en polvo. Si está demasiado espeso, agregue el líquido base rápido una gota a la vez hasta lograr una consistencia pastosa. - Aplique rápidamente una cantidad generosa de mezcla de cemento dental en el perímetro exterior de la circunferencia trazada y cubra cualquier superficie ósea expuesta. Sin embargo, no cubra el sitio de la craneotomía. Espere ~ 15 minutos para que el cemento dental se seque y se endurezca antes de continuar.
- Suelte la barra de la oreja y asegure el poste de la cabeza al marco de metal para asegurarse de que la cabeza sea estable para una perforación precisa a lo largo de la circunferencia de craneotomía marcada. Si hay cemento sobre el sitio de la craneotomía, use la broca de carburo FG4 para perforarlo y eliminarlo.
- Craneotomía
- Utilice un calibrador quirúrgico para verificar el diámetro del círculo marcado, como se define en el paso 3.4.2. Ajústelo según sea necesario, de modo que la ventana craneal encaje perfectamente dentro de la craneotomía.
- Con un taladro dental eléctrico, grabe y adelgace el cráneo a lo largo del exterior del círculo marcado, usando primero una broca de carburo FG4 (velocidad establecida en una de salida ~ 9-10). Esto crea una "pista" dentro de la cual se adelgaza el cráneo.
PRECAUCIÓN: Para minimizar las lesiones por calor y lograr una pista lisa, siga moviendo la broca. No taladre en el mismo lugar durante más de 2 s. - Periódicamente, deje de perforar e riegue toda el área con solución salina estéril, para reducir el calentamiento del taladro y eliminar el polvo óseo.
- Continúe adelgazando el cráneo con una broca de carburo FG1/4, como se describe en el paso 3.5.2, hasta que el cráneo sea delgado como el papel y transparente.
NOTA: Usar las dos manos para sostener el taladro puede facilitar el control del taladro y evitar insertar la broca en el cerebro. - Complete el adelgazamiento del cráneo con una broca de carburo EF4. Cuando se produce una grieta entre el colgajo óseo y el hueso del cráneo circundante, a veces se produce una liberación de líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que indica que el cráneo ha sido perforado por completo.
- Continúa adelgazando y perforando el resto del cráneo a lo largo de la pista. Evite perforar el punto donde una vasculatura obvia cruza debajo del cráneo para evitar el sangrado.
- Inserte una punta fina de pinza (pinza 1) ~ 0,5 mm a través del lugar agrietado y levante el colgajo óseo suavemente hacia arriba sin hacer mella en el cerebro subyacente.
- Después de retirar el colgajo óseo, irrigar el área de la craneotomía con solución salina. La superficie del cerebro podría ser de 1 a 2 mm más alta que el borde de la craneotomía.
- A partir de este paso, cubra siempre el cerebro expuesto con solución salina para proteger el tejido cerebral.
- El sangrado puede ocurrir al levantar el colgajo óseo en los sitios originales de inyección de AAV debido a la adhesión del tejido y el crecimiento de la vasculatura después de la cirugía de inyección. Si esto sucede, presione suavemente el sitio con un aplicador seco con punta de algodón durante ~ 2 minutos (o más según sea necesario). Se puede usar espuma de gel para detener el sangrado. No use productos químicos ni pinzas de calentamiento para detener el sangrado, ya que esto puede causar lesiones.
- Use las pinzas 1 para eliminar suavemente la materia aracnoidea visible.
- Ventana de vidrio para implantes
- Utilice las pinzas quirúrgicas 2 para levantar la ventana de vidrio estéril, con el cubreobjetos de vidrio de 3 mm hacia abajo. Coloque y ajuste la ventana de vidrio sobre el sitio de la craneotomía para asegurarse de que la ventana pueda ajustarse perfectamente al borde de la craneotomía. El cubreobjetos de vidrio de 5 mm está en la parte superior.
- Prepare el cemento dental de la siguiente manera: combine 100 mg de cemento en polvo, dos gotas de líquido base rápida y una gota de catalizador. Revuelva la mezcla hasta que esté bien mezclada (~ 15 veces). Espere ~ 6 minutos hasta que el cemento se vuelva pastoso y espeso. Si el cemento es demasiado delgado, puede filtrarse en el espacio debajo de la ventana en el paso 3.6.4 y oscurecer la ventana.
- Mientras espera que el cemento se vuelva pastoso y espeso, aplique una cantidad adecuada de presión a la ventana a través de un manipulador estereotáxico, para verificar que el cráneo pueda entrar en contacto de manera segura y hermética con la ventana de vidrio. Asegúrese de que el líquido de cemento dental en el paso 3.6.4 no llegue al espacio debajo del vidrio y, por lo tanto, oscurezca la ventana.
- Use un cepillo aplicador de precisión ajustable para agregar una pequeña cantidad de cemento a lo largo del borde de la ventana para sellar la ventana de vidrio con la calavera. Espere ~ 10 minutos para que el cemento se seque por completo y luego suelte suavemente y retire el manipulador sobre la ventana. A partir de este paso, se necesitan ~ 4 h para terminar los 10 impactos de TBI e implantar el poste de la cabeza y la ventana craneal.
- Recorte el cemento dental con el taladro dental con una broca de carburo FG4 si hay exceso de cemento cubriendo la ventana.
NOTA: El exceso de cemento alrededor de la ventana puede evitar que las lentes del objetivo de dos fotones se acerquen a la superficie de la ventana.
- Implantar bien la imagen
NOTA: Un pocillo de imágenes (Figura 2D) es un anillo de goma con un diámetro exterior de ~1,6 cm, que coincide con la superficie superior del poste de la cabeza y retiene el agua por encima de la ventana craneal para la obtención de imágenes de dos fotones.- Una vez completada la implantación de la ventana, taladre los restos de cemento dental en la superficie superior del poste de la cabeza y limpie el área con una gasa quirúrgica húmeda. Deje que el área se seque durante ~ 3 minutos.
- Use un aplicador con punta de algodón para mojar una pequeña cantidad de superpegamento y pegarlo en la superficie superior del poste de la cabeza. Coloque rápidamente el anillo de goma en el poste de la cabeza. Aplique una presión media sobre el anillo de goma durante ~ 2 minutos para garantizar un contacto cercano con el poste de la cabeza. Use superpegamento con moderación, de lo contrario, puede adherirse a la ventana de vidrio y oscurecer la imagen de dos fotones.
- Administración de analgésicos y antibióticos
- Inmediatamente después de implantar el pozo de imagen, pero antes de suspender el isoflurano, administrar cefazolina [500 mg/kg (333 mg/ml, generalmente ~45 μl), por vía intramuscular] y meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) utilizando jeringas de insulina desechables.
- Después de la administración del medicamento, suspenda la anestesia, libere al ratón del marco estereotáxico y devuélvalo a su jaula de origen, que está encima de una manta térmica.
- Vigile de cerca el ratón durante ~15 minutos hasta que sea ambulatorio.
NOTA: Aloje a los ratones individualmente, ya que pueden morder el pozo de imágenes de goma de otros ratones. Proporcione comida y gel de agua cerca del ratón en la jaula para que pueda acceder a él ad libitum. - Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) y meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) de nuevo cada 8 h después de la dosis anterior hasta 48 h después de la cirugía de implante de ventana craneal.
4. Imágenes intravitales de dos fotones
- Utilice el microscopio 2 (Tabla de Materiales), equipado con un láser multifotónico coherente sintonizable y un objetivo de aumento de 20x (NA 1.0; inmersión en agua), para obtener imágenes intravitales18. El filtro utilizado para la señal EGFP es "BP 500-550".
- Prepare el ratón de ventana craneal para la obtención de imágenes intravitales.
- A partir del día de la cirugía (designado como día 0), lleve a cabo imágenes de dos fotones en los puntos de tiempo designados después de la lesión cerebral traumática. Coloque el ratón de ventana craneal en la cámara de inducción de anestesia y administre isoflurano al 3% mezclado con gas portador a un caudal de 1,5 L/min durante 5 min.
NOTA: El gas portador puede ser aire ambiente u oxígeno al 100%. - Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (es decir, con una frecuencia respiratoria lenta pero constante de aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), retire el ratón de la cámara de inducción y sujete rápidamente el poste de la cabeza a un soporte. Deje que el torso del ratón se apoye en una placa de plástico redonda (19 cm de diámetro) que esté equipada con el soporte.
NOTA: Se colocó una almohadilla para calentar las manos debajo del torso del mouse para proporcionar soporte térmico durante la obtención de imágenes intravitales. - Aplique un ungüento oftálmico lubricante en los ojos del ratón y coloque el cono nasal del tubo de anestesia sobre el hocico del ratón. Mantenga la anestesia mediante el uso de isoflurano al 1,5% con gas portador a un caudal de 1 L/min.
- Verifique periódicamente la frecuencia de la respiración y aplíquele un pellizco en la cola o en los dedos de los pies al menos cada 15 minutos durante las imágenes para evaluar la anestesia adecuada. Ajuste la concentración de isoflurano según corresponda para mantener la profundidad deseada de la anestesia.
- Alinee la cabeza del ratón para asegurarse de que la ventana craneal esté directamente debajo de la lente del objetivo de dos fotones. Agregue un poco de agua a la imagen muy por encima de la ventana craneal. Baja el objetivo para que quede sumergido en el agua.
- A partir del día de la cirugía (designado como día 0), lleve a cabo imágenes de dos fotones en los puntos de tiempo designados después de la lesión cerebral traumática. Coloque el ratón de ventana craneal en la cámara de inducción de anestesia y administre isoflurano al 3% mezclado con gas portador a un caudal de 1,5 L/min durante 5 min.
- Obtención de imágenes intravitales de ratones ventana intracraneal
- Encienda la lámpara de mercurio del osciloscopio. Observa primero el cerebro con epifluorescencia a través del ocular.
NOTA: La vasculatura aparece de color negro. Seleccione un área en la que la ventana esté despejada. Apague la epifluorescencia, ajuste la longitud de onda del láser a 860 nm para la señal EGFP y ajuste la configuración del láser para obtener una señal óptima (es decir, brillante pero no saturada). - Establezca el modo de escaneo en Fotograma y el paso de línea en 1. Establezca el número de promedio en 16, la profundidad de bits en 8 bits, el modo como Line y el método como Mean.
- Utilice el patrón de vasculatura como un "mapa de referencia" para obtener imágenes de la misma región del cerebro para obtener imágenes longitudinales posteriores. Imagine el nivel superficial (capa I, a menos de 100 μm de la superficie meníngea) para tres planos donde la vasculatura cortical domina a través de un modo de pila z, con un intervalo interplano de 10 μm, como se indica en la Figura 3A.
- Obtenga imágenes de seis planos a nivel profundo (capa IV y V, ~400 μm más profundo que el nivel superficial), a través de un modo de apilamiento z como se indica en la Figura 3A, con un intervalo entre planos de 10 μm y una velocidad de escaneo de 8.
- Después de terminar la imagen (~ 20 minutos por mouse), suspenda la anestesia, suelte al mouse de los marcos y devuélvalo a su jaula de origen que está sobre una manta térmica. Monitoree el mouse consecutivamente hasta que sea ambulatorio, lo que generalmente toma ~ 7 minutos.
- Tome imágenes longitudinales del ratón en el día 0, 1 semana y 4 meses después de la cirugía de LCT.
- Encienda la lámpara de mercurio del osciloscopio. Observa primero el cerebro con epifluorescencia a través del ocular.
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Representative Results
Como prueba de concepto de este protocolo, se inyectaron partículas virales que expresan AAV-Syn1-EGFP en la corteza cerebral de ratones machos TDP-43 Q331K/Q331K (fondo C57BL/6J)19 a la edad de 3 meses. Se observa que también se pueden utilizar animales salvajes C57BL/6J, sin embargo, este estudio se llevó a cabo en ratones TDP-43 Q331K/Q331K porque el laboratorio se centra en la investigación de enfermedades neurodegenerativas. Se realizó una cirugía de LCT 4 semanas después de la inyección de AAV. En el mismo contexto quirúrgico se implantaron el poste de la cabeza y la ventana craneal. Se tomaron imágenes en serie del ratón utilizando un microscopio de dos fotones en el día 0, 1 semana y 4 meses después de la cirugía de LCT (Figura 1). En general, la cirugía de inyección duró ~ 30 minutos y la cirugía de LCT tomó ~ 1 h por ratón. Durante la cirugía de LCT, los ratones generalmente requirieron una mayor cantidad de tiempo para enderezarse de una posición supina a una posición prona después de impactos posteriores, en comparación con los impactos iniciales. Por ejemplo, un ratón podría haber necesitado 2 minutos para enderezar su posición después del primer impacto, pero requería 10 minutos para enderezar su posición después deldécimo impacto. Para la cirugía de implantación de ventana craneal, generalmente se requirieron ~ 3 h para realizar todos los pasos, pero tomó más tiempo de lo necesario si se produjo un sangrado persistente. Las imágenes de dos fotones generalmente requerían 20 minutos por ratón para adquirir todas las imágenes. Para el estudio actual que involucró a tres ratones con la expresión de EGFP, los animales no mostraron evidencia de fractura de cráneo, ni murieron durante la cirugía o hasta 4 meses después de la cirugía. Tanto la morbilidad como la tasa de fractura de cráneo fueron del 0%. Esto es consistente con la tasa de mortalidad relativamente baja (<10%) en un modelo similar de inducción de TCE pero sin implante de ventana craneal 7,8.
Se utilizó un dispositivo de caída de peso (Figura 2A), que se ha informado previamente7,8, para administrar impactos de LCT en la cabeza del ratón en el lado derecho, como se indica en la Figura 2B. Un tubo de plástico transparente (n.º 5 en la Figura 2A; 60 cm de longitud y 1,4 cm de diámetro interior) se sujetó de forma segura y vertical a un soporte metálico, y se colocó una columna impactadora de plástico (n.º 7 en la Figura 2A; 10 cm de longitud y 1,3 cm de diámetro, con una punta redonda plana de 2 mm de diámetro) en el tubo vertical. Se colocó un peso metálico de 50 g (n.º 6 en la Figura 2A) sobre el impactador y se ató con una cuerda de nailon (n.º 4 en la Figura 2A). Se colocó un cojín amortiguador (n.º 8 en la Figura 2A; 9 cm x 9 cm x 1 cm [largo x ancho x profundidad], hecho de espuma de polietileno y gasa de algodón) debajo de la cabeza del ratón para amortiguar y absorber la energía del impacto.
La ventana craneal estaba formada por dos cubreobjetos de vidrio combinados con adhesivo óptico (Figura 2C), y el cubreobjetos de vidrio de 3 mm de diámetro era el lado que tocaba la superficie cerebral. Las imágenes de dos fotones se llevaron a cabo a dos profundidades diferentes (Figura 3A) de la superficie cerebral: 1) un nivel superficial donde la vasculatura cortical era abundante y tenía un diámetro de luz relativamente grande que parecía negro, pero con escasos cuerpos celulares positivos para EGFP; y 2) un nivel más profundo donde la vasculatura era escasa y tenía un diámetro de luz pequeño, con muchas células positivas para EGFP visibles.
A las ~4 h (día 0) después de la cirugía, se realizaron imágenes de dos fotones en tres planos, con un intervalo de 10 μm a nivel superficial (capa I, a menos de 100 μm de la superficie meníngea) primero donde la vasculatura aparecía negra (indicada por las líneas rojas discontinuas en la Figura 3B), y se utilizó como mapa de referencia para la siguiente sesión de imágenes para localizar la región de imagen original. A este nivel superficial, la vasculatura cortical y los procesos neuronales fueron las estructuras predominantes que se observaron, mientras que los cuerpos celulares positivos para EGFP fueron escasos. Después de obtener imágenes dentro del nivel superficial, el enfoque se ajustó hacia abajo en ~ 400 μm, más profundo que el nivel superficial, en la corteza (capa IV y V) para obtener imágenes de los cuerpos celulares neuronales positivos para EGFP. Las imágenes se adquirieron dentro de seis planos, con un intervalo de 10 μm. La expresión de la proteína EGFP se distribuyó de forma difusa por todo el cuerpo celular, como se indica en la Figura 3C. Hubo una ocurrencia ocasional de algunos puntos de EGFP fuera de los cuerpos celulares, que podrían representar inclusiones de EGFP que se formaron con el tiempo dentro de los axones o dendritas. Este protocolo da como resultado una expresión de AAV-SYN1-EGFP ~2-3 mm alrededor del sitio de inyección, que puede definirse mediante el análisis histológico de los tejidos post-mortem.
A la semana y a los 4 meses después del TCE, se utilizó como referencia el patrón de vasculatura observado en el punto temporal del día 0 para localizar la misma región de imagen (Figura 3D,F). El patrón de vasculatura en la Figura 3D, F es similar al de la Figura 3B. El procedimiento de imagen para la 1 semana y 4 meses después del TCE fue el mismo que el descrito anteriormente para el punto de tiempo del día 0, y la expresión de EGFP se detectó en todo el cuerpo celular como antes (Figura 3E, G). La intensidad de fluorescencia a los 0 y 4 meses fue similar tanto a nivel superficial como a nivel más profundo. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia a la semana fue menor que la del día 0 y 4 meses tanto a nivel superficial como profundo, lo que podría deberse a la represión traduccional reportada para otros modelos de TCE20. En particular, la calidad de las imágenes a los 4 meses en comparación con el punto de tiempo del día 0 demuestra que la ventana craneal ha mantenido la claridad y la integridad, y que la expresión viral sigue siendo robusta 4 meses después de la cirugía para obtener imágenes intravitales efectivas. Como el EGFP se expresa como una proteína relativamente difusa, las señales de fluorescencia pueden resolverse mejor y ser discretas cuando el EGFP se fusiona con una proteína de interés.
Figura 1: Cronograma de este protocolo de imágenes intravitales. El protocolo se inicia con la inyección de virus. La lesión cerebral traumática y la cirugía de ventana craneal se realizan dentro de la misma sesión quirúrgica a las 2-4 semanas después de la inyección del virus. Las imágenes intravitales se realizan en el día 0, 1 semana, 4 meses después del TCE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagramas para el dispositivo de TBI, el sitio de impacto de TBI y la preparación de la ventana. (A) Equipo para el dispositivo TBI de caída de peso. 1: pedestal, 2: soporte, 3: abrazadera ajustable, 4: cuerda de nylon, 5: túnel de caída de peso, 6: columna de peso de metal (50 g), 7: impactador, 8: cojín amortiguador. (B) Un esquema del sitio de inyección del virus y del impacto del TCE, con las coordenadas 2,5 mm posteriores al Bregma y 2 mm laterales desde la sutura sagital a la derecha. (C) Un esquema para preparar la ventana de vidrio. Dos cubreobjetos de vidrio, de 3 mm y 5 mm de diámetro, se combinan con adhesivo óptico. (D) Imágenes del poste de cabeza de metal y del pozo de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de los planos de imagen y los datos de la imagen. (A) Se obtienen imágenes de múltiples planos a un nivel superficial donde se encuentra la vasculatura y a un nivel profundo. Las imágenes se recogen de la siguiente manera: tres planos a nivel superficial, donde la vasculatura cortical y los procesos neuronales son las estructuras predominantemente positivas para EGFP, y seis planos a nivel profundo, donde se observan predominantemente cuerpos celulares positivos para EGFP, con un intervalo de 10 μm entre los planos vecinos. Cada plano tiene un tamaño de 425,10 μm x 425,10 μm. (B) Imagen representativa de un plano en el nivel superficial en el punto de tiempo del día 0. Las líneas rojas discontinuas indican el contorno de la vasculatura que se puede utilizar como referencia para localizar el lugar original de la imagen para los puntos de tiempo posteriores. (C) Imagen representativa de un avión en el nivel profundo en el punto de tiempo del día 0 poco después de un traumatismo craneoencefálico. (D) Imagen representativa de un plano en el nivel superficial en el punto de tiempo de 1 semana. Las líneas rojas discontinuas denotan la vasculatura, similar al contorno del día 0 en la Figura 3B, lo que confirma que las imágenes de dos fotones se llevaron a cabo en un lugar similar el día 0 y 1 semana después del TCE. (E) Imagen representativa en el nivel profundo en el punto de tiempo de 1 semana después de la lesión cerebral traumática. (F) Igual que B y D, a los 4 meses después de la lesión cerebral traumática. (G) Igual que C y E, a los 4 meses después de la lesión cerebral traumática. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, se combinaron la inyección de AAV, la administración de TBI y un poste de cabeza con implante de ventana craneal para el análisis de imágenes longitudinales de neuronas marcadas con EGFP dentro de la corteza cerebral del ratón (capas IV y V) para observar los efectos de TBI en las neuronas corticales. Este estudio señala que el sitio de TCE elegido aquí, por encima del hipocampo, proporciona una superficie relativamente plana y amplia para la implantación de la ventana craneal. Por el contrario, el cráneo es relativamente estrecho anterior a este sitio y, por lo tanto, es difícil asegurar que el poste de la cabeza haga contacto efectivo con la superficie del cráneo. Si bien en este estudio solo se utilizó el modelo de ratón TDP-43Q331K/Q331K , teniendo en cuenta la investigación del laboratorio centrada en la ELA y la DFT19, este protocolo debería ser aplicable a la mayoría de las otras cepas de ratón. Además de etiquetar las neuronas como se describe aquí, se pueden utilizar varias estrategias para etiquetar otros tipos de células para la obtención de imágenes intravitales. Un enfoque consiste en expresar las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente de una manera específica para cada célula, utilizando el sistema de recombinación Cre-Lox en ratones modificados genéticamente21. Otro enfoque consiste en emplear ciertos serotipos virales para la transducción celular específica de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente. El parto específico del sitio se puede lograr realizando la inyección intracraneal en el lugar deseado en el cerebro. La eficiencia y facilidad con la que se pueden expresar proteínas específicas de células a través de la transducción viral para la obtención de imágenes intravitales es una ventaja sobre la creación de modelos de ratones transgénicos.
Para los protocolos quirúrgicos, hay varios pasos críticos que deben realizarse cuidadosamente. Al perforar agujeros en el cráneo para inyectar virus al comienzo del protocolo, se debe tener cuidado de no dañar el tejido debajo del cráneo. Si se produce daño tisular durante la perforación del cráneo, habrá inflamación, adhesión tisular y angiogénesis alrededor del sitio de la lesión, lo que aumentará el riesgo de sangrado durante la craneotomía para la implantación de la ventana craneal. Para la administración del TCE con el dispositivo de caída de peso, el presente estudio colocó un cojín debajo de la cabeza del ratón para amortiguar la fuerza de impacto del TCE y, por lo tanto, disminuir la posibilidad de una fractura de cráneo. No se observó ningún movimiento obvio de la cabeza en las direcciones de rotación y aceleración, lo que apoya la idea de que este modelo de TCE tiene una probabilidad relativamente baja de lesión axonal por difusión. Curiosamente, Foda et al. utilizaron un dispositivo similar de caída de peso para construir una lesión por LCT de cráneo cerrado en ratas, y se colocó un cojín de espuma más grande y suave (12 cm de grosor) debajo de la cabeza de la rata para que pudiera moverse fácilmente en respuesta a la fuerza de impacto de LCT en la dirección de rotación con aceleración, lo que resultó en una lesión axonal por difusión22. Una de las ventajas del modelo TBI de caída de peso guiado por tubo es que la gravedad del trauma se puede modular cambiando la altura de caída de peso (es decir, una altura más alta para una fuerza mayor) y/o repitiendo el número de veces que se realiza el impacto. Por ejemplo, Flierl et al. utilizaron un dispositivo de caída de peso similar al del presente estudio para inducir un traumatismo craneoencefálico en ratones; el peso del metal fue de 333 g, lo que indujo un TCE leve cuando se deja caer desde una altura de 2 cm y un TCE grave cuando se deja caer desde una altura de 3 cm23. El paso de craneotomía antes de la implantación de la ventana también debe realizarse con cuidado, para evitar dañar el tejido cerebral debajo del cráneo. Mover periódicamente la broca a una región diferente del cráneo ayuda a evitar la perforación excesiva en el mismo lugar, lo que puede provocar un calentamiento excesivo, daño tisular y sangrado; Además, el riego frecuente con solución salina también puede enfriar el sitio de perforación. Al implantar la ventana de vidrio, es importante alinear el plano de vidrio de manera que sea paralelo al plano de la superficie del cráneo; Una ventana ajustada dentro del cráneo evita la fuga del líquido del cemento dental en el espacio entre la ventana y el cerebro.
Si la ventana está borrosa en el día 0 después de la cirugía de LCT, pero se detectan señales fluorescentes, el cemento dental puede haber entrado en el espacio entre la ventana y el cerebro, formando así una capa de cemento que cubre la superficie del cerebro y oscurece la emisión de fluorescencia. En esta situación, se puede retirar la ventana y el cemento dental utilizando el método de perforación descrito en el paso 3.5 del protocolo, y luego implantar una nueva ventana de vidrio en el sitio original, como se describe en detalle por Goldey et al.9. Si la ventana se vuelve borrosa en una etapa posterior durante el proceso de obtención de imágenes longitudinales, se puede intentar eliminar posibles residuos frotando suavemente la ventana con un aplicador con punta de algodón. Si esto no resuelve el problema, puede deberse a un nuevo crecimiento del hueso y las meninges debajo de la ventana de vidrio. En este caso, se puede retirar la ventana y perforar para extraer el hueso regenerado y/o separar las meninges, seguido de la implantación de una nueva ventana de vidrio en el sitio original, como lo describen Goldey et al.9. Como se muestra en los resultados, la expresión y fluorescencia de EGFP es robusta durante un período de tiempo de ~ 4 meses después de la lesión cerebral traumática. Se puede esperar una disminución de la señal de fluorescencia dentro de la primera semana después de la lesión cerebral traumática, lo que probablemente se deba a la represión traduccional inducida por la lesión cerebral traumática que causa una reducción temporal en la síntesis global de proteínas20.
Para mantener una alta calidad de imagen y lograr imágenes en múltiples planos, los ratones se sometieron a anestesia con isoflurano para limitar el movimiento. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la anestesia puede afectar los resultados del estudio. Por ejemplo, se ha reportado que los ratones bajo anestesia con isoflurano exhiben diferente actividad microglial en respuesta al fotodaño en comparación con los ratones despiertos24. Para las imágenes de dos fotones, la velocidad de escaneo y el número de escaneos para el promedio de la señal (establecido como "número", en "promedio") son los principales factores que pueden determinar la resolución de la imagen. Para optimizar la resolución, se puede reducir la velocidad de escaneo y aumentar el número promedio, sin embargo, una velocidad más lenta y un número promedio más alto aumentan el tiempo de imagen para un campo de visión particular y pueden causar blanqueamiento de fotos. El presente estudio tiene como objetivo lograr imágenes crónicas a largo plazo en el mismo animal en la misma ubicación cerebral. Para evitar un posible fotoblanqueo y lograr una resolución suficiente, se llevaron a cabo imágenes de dos fotones a una velocidad de escaneo de 8 con un número promedio de 16.
Un enfoque alternativo a la realización de una craneotomía e implantación de una ventana de vidrio es adelgazar el cráneo, en la medida en que sea transparente y "delgado como el papel" para la obtención de imágenes en vivo25,26,27. La ventana delgada del cráneo puede mantener la integridad del cráneo y, por lo tanto, evitar la inflamación inducida por la operación quirúrgica. Por lo tanto, se puede preferir el enfoque de ventana de cráneo delgado para imágenes en vivo con marcadores relevantes para la inflamación y/o durante un período de tiempo relativamente más corto (es decir, ~ 14 días después de la cirugía, como se informó25). Para la obtención de imágenes a largo plazo (es decir, 4 meses, como se describe aquí) de los procesos neurodegenerativos crónicos, además de evaluar los efectos agudos del TCE en el mismo animal, se recomienda utilizar una ventana de vidrio implantada mediante un método de craneotomía.
Como se mencionó en la introducción, existen varias ventajas notables de las imágenes intravitales para estudiar diversos eventos biológicos y patológicos en el cerebro de los mamíferos. Sin embargo, este protocolo también tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, la lesión cerebral por contragolpe describe la contusión o hematoma cerebral alejado, generalmente opuesto al sitio de contacto de la fuerza28,29,30. En el presente estudio, los impactos del TCE se administraron al lóbulo parietal; La lesión de contrecoup sería esperable ventralmente e inaccesible a las imágenes intravitales. Un análisis histológico podría utilizarse como un enfoque complementario para examinar más a fondo los fenotipos de interés fuera del sitio de impacto cubierto por la ventana craneal. Además, la sobreexpresión exógena de ciertas proteínas también puede inducir toxicidad o patología. En el presente estudio, se observaron algunos puntos ocasionales de EGFP, que pueden representar acumulaciones debidas a la sobreexpresión de proteínas. Por lo tanto, se recomienda incluir una proteína de control negativo (p. ej., EGFP o RFP solas) en el diseño del estudio para abordar esta posibilidad, particularmente si la proteína de interés es propensa a formar estructuras punteadas. El número de proteínas que se pueden estudiar simultáneamente está limitado por los láseres y las capacidades del sistema de dos fotones. Es posible obtener imágenes de más de un fluoróforo (por ejemplo, EGFP, RFP, etc.) mediante microscopía de dos fotones, aunque las capacidades de multiplexación con microscopios convencionales de campo amplio y confocales a menudo permiten analizar más proteínas dentro de una sola muestra de tejido. Por último, es importante incluir un control simulado que reciba los mismos procedimientos que el animal con LCT, excepto los impactos de pérdida de peso. La cirugía de implante de ventana craneal es una operación invasiva y puede causar algunos cambios locales, como inflamación y presión intracraneal alterada, que podrían afectar el proceso de TCE. Un control simulado ayuda al experimentador a evaluar los fenotipos que se deben al impacto frente a los procedimientos quirúrgicos.
En resumen, este protocolo introduce un método para obtener imágenes longitudinales de proteínas específicamente en las neuronas de la corteza cerebral del ratón en respuesta a un TCE. Este protocolo puede modificarse para analizar la expresión y localización de varias proteínas específicas de la célula en respuesta al TCE. El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque para estudiar las consecuencias inmediatas y a largo plazo del TCE en el cerebro de los mamíferos.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Miguel Sena-Esteves, de la Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts, por regalar el virus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, y a Debra Cameron, de la Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts, por dibujar el boceto del cráneo de los ratones. También agradecemos a los miembros actuales y pasados de los laboratorios Bosco, Schafer y Henninger por sus sugerencias y apoyo. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa (W81XWH202071/PRARP) para DAB, DS y NH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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