Summary
Это исследование демонстрирует доставку повторяющейся черепно-мозговой травмы мышам и одновременную имплантацию краниального окна для последующей прижизненной визуализации нейрон-экспрессируемого EGFP с помощью двухфотонной микроскопии.
Abstract
Целью этого протокола является демонстрация того, как лонгитюдно визуализировать экспрессию и локализацию интересующего белка в определенных типах клеток мозга животного при воздействии экзогенных стимулов. Здесь показано введение закрытой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и одновременная имплантация краниального окна для последующей продольной прижизненной визуализации у мышей. Мышам внутричерепно вводят аденоассоциированный вирус (AAV), экспрессирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) под действием нейронно-специфического промотора. Через 2-4 недели мышей подвергают повторной ЧМТ с использованием устройства для сброса веса над местом инъекции AAV. Во время одного хирургического сеанса мышам имплантируют металлический подголовник, а затем стеклянное краниальное окно над местом удара ЧМТ. Экспрессия и клеточная локализация EGFP исследуется с помощью двухфотонного микроскопа в одной и той же области мозга, подвергшейся травме в течение нескольких месяцев.
Introduction
Черепно-мозговая травма (ЧМТ), которая может возникнуть в результате спортивных травм, столкновений транспортных средств и военных действий, является проблемой здравоохранения во всем мире. ЧМТ может привести к физиологическим, когнитивным и поведенческим нарушениям, а также к пожизненной инвалидности или смертности 1,2. Тяжесть ЧМТ можно классифицировать как легкую, умеренную и тяжелую, в подавляющем большинстве случаев это легкая ЧМТ (75%-90%)3. Все чаще признается, что ЧМТ, особенно повторяющиеся случаи ЧМТ, могут способствовать дегенерации нейронов и служить факторами риска развития ряда нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА), боковой амиотрофический склероз (БАС), лобно-височную деменцию (ЛВД) и хроническую травматическую энцефалопатию (ХТЭ)4,5,6. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе нейродегенерации, вызванной ЧМТ, остаются неясными и, таким образом, представляют собой активную область исследований. Чтобы получить представление о том, как нейроны реагируют на ЧМТ и восстанавливаются после нее, в данной статье описан метод мониторинга флуоресцентно меченых белков, представляющих интерес, особенно внутри нейронов, с помощью продольной прижизненной визуализации у мышей после ЧМТ.
С этой целью в данном исследовании показано, как сочетать хирургическую процедуру для введения закрытой черепно-мозговой ЧМТ, аналогичную той, о которой сообщалось ранее7,8, с хирургической процедурой имплантации краниального окна для последующей прижизненной визуализации, как описано Goldey et al9. Примечательно, что невозможно сначала имплантировать краниальное окно, а затем выполнить ЧМТ в той же области, так как воздействие падения веса, которое вызывает ЧМТ, может повредить окно и нанести непоправимый вред мыши. Таким образом, этот протокол был разработан для проведения ЧМТ, а затем имплантации краниального окна непосредственно над местом удара, и все это в рамках одного хирургического сеанса. Преимуществом сочетания ЧМТ и имплантации краниального окна в одном хирургическом сеансе является сокращение количества операций, которые мышь подвергается хирургическому вмешательству. Кроме того, это позволяет отслеживать немедленный ответ (т.е. в течение нескольких часов) на ЧМТ, в отличие от имплантации окна на более позднем хирургическом сеансе (т.е. первичная визуализация, начинающаяся в течение нескольких дней после ЧМТ). Краниальное окно и платформа прижизненной визуализации также имеют преимущества по сравнению с мониторингом белков нейронов традиционными методами, такими как иммуноокрашивание фиксированных тканей. Например, для прижизненной визуализации требуется меньшее количество мышей, так как одна и та же мышь может быть изучена в несколько временных точек, в отличие от отдельных когорт мышей, необходимых для дискретных моментов времени. Кроме того, одни и те же нейроны могут контролироваться с течением времени, что позволяет отслеживать конкретные биологические или патологические события в одной и той же клетке.
В качестве доказательства концепции здесь демонстрируется нейрон-специфическая экспрессия усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под промотором синапсина10. Этот подход может быть распространен на: 1) различные типы клеток головного мозга путем использования других специфических промоторов клеточного типа, таких как промотор основного белка миелина (MBP) для олигодендроцитов и промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) для астроцитов11, 2) различные белки-мишени, представляющие интерес, путем слияния их генов с геном EGFP, и 3) коэкспрессия нескольких белков, объединенных с различными флуорофорами. Здесь EGFP упаковывается и экспрессируется путем доставки аденоассоциированного вируса (AAV) через внутричерепную инъекцию. ЧМТ с закрытым черепом проводится с помощью устройства для снижения веса с последующей имплантацией краниального окна. Визуализация нейронального EGFP достигается через краниальное окно с помощью двухфотонной микроскопии для обнаружения флуоресценции EGFP in vivo. С помощью двухфотонного лазера можно проникнуть глубже в кортикальную ткань с минимальным фотоповреждением, что позволяет проводить повторную продольную визуализацию одних и тех же областей коры у отдельной мыши в течение нескольких дней и месяцев12,13,14,15. Таким образом, этот подход, сочетающий операцию ЧМТ с прижизненной визуализацией, направлен на углубление понимания молекулярных событий, которые способствуют патологии, вызванной ЧМТ16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы, связанные с животными, были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Комитетом Национального исследовательского совета (США). Протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинской школы Чана Массачусетского университета (UMMS) (разрешение No 202100057). Вкратце, как показано на схеме исследования (рис. 1), животное получает инъекцию вируса, ЧМТ, имплантацию окна, а затем прижизненную визуализацию во временной последовательности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие условия были удалены. Пожалуйста, обратитесь к таблице материалов для конкретного используемого оборудования.
1. Внутричерепная инъекция ААВ с помощью стереотаксического устройства
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Используйте титр вируса 1 x 1013 вирусных геномов на миллилитр (vg/мл). Syn1 относится к Synapsin1, который является нейронно-специфическим промотором, позволяющим ограничить экспрессию вируса в нейронах. Вирус может быть подготовлен собственными силами или на аутсорсинге.
- Подготовка к стереотаксической инъекционной операции для введения AAV
- Обычные ножницы для автоклава, хирургический штангенциркуль, хирургические пружинные ножницы, хирургические щипцы, щипцы от комаров, марля, аппликатор с ватным наконечником и стеклянный шприц на микролитр.
- Продезинфицируйте операционную зону, используя 75% этанол. Расширьте одноразовую стерильную хирургическую простыню, чтобы покрыть операционную область на стереотаксической платформе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания температуры тела животного во время инъекционной операции используйте нагревательный аппарат с обратной связью. - Взвесьте и запишите массу тела мыши.
- Откройте вентиль кислородного баллона и отрегулируйте расход кислорода до 1,5 л/мин. Откройте наркозный аппарат и установите значение уровня изофлурана равным трем.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе газом-носителем может быть либо комнатный воздух, либо 100% кислород. - Поместите мышь в индукционную камеру и оставьте на 5 минут, чтобы добиться полной анестезии.
- После того, как мышь будет полностью обезболена (т.е. медленная, но стабильная частота дыхания примерно один цикл в 2 с, в сочетании с отсутствием рефлекса сжатия хвоста), извлеките мышь из индукционной камеры и поместите голову мыши в стереотаксическую рамку.
- Поместите носовой конус наркозной трубки на морду мыши.
- Поддерживайте анестезию с использованием 1,5% изофлурана с газом-носителем со скоростью потока 1 л/мин до конца операции. Периодически проверяйте частоту дыхания и щипайте хвост или палец ноги не реже чем каждые 15 минут во время операции, чтобы оценить соответствующую анестезию. Отрегулируйте концентрацию изофлурана соответствующим образом, чтобы поддерживать желаемую глубину анестезии.
- Наполните микролитровый шприц (10 мкл) раствором вируса. Затем закрепите шприц на соответствующей микроинъекторной помпе стереотаксического устройства.
- Инъекционная хирургия
- Ввести бупренорфин (1 мг/кг, подкожно) с помощью одноразового инсулинового шприца и нанести лубрикантную офтальмологическую мазь на глаза мыши.
- Удалите волосы с кожи головы на макушке, подравнивая обычными ножницами 1.
- Очистите кожу головы с помощью марли и аппликаторов с ватным наконечником. Продезинфицируйте кожу, используя сначала 75% этанол, а затем бетадин. Повторите это три раза (т.е. этанол с последующим бетадином), оставляя окончательное нанесение бетадина на кожу.
- Еще раз проверьте глубину анестезии, чтобы убедиться, что мышь полностью обезболена (т.е. медленная, но устойчивая частота дыхания примерно один цикл в 2 с, в сочетании с отсутствием рефлекса сжатия хвоста). Сделайте надрез ~1 см обычными ножницами 2 по средней линии, чтобы обнажить правый теменной череп, и удалите надкостницу с помощью аппликатора с ватным наконечником.
- Отметьте маркером две точки на черепе по этим координатам: точка А: 2,5 мм кзаднее брёгмы и 1 мм латеральнее средней линии над правым полушарием; точка В: 2,5 мм кзади от брегмы и 2 мм латеральнее средней линии над правым полушарием.
- Осторожно просверлите два отверстия в черепе по отмеченным координатам с помощью электрической бормашины с мелким твердосплавным сверлом EF4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить ткани мозга. - Отрегулируйте стереотаксическую рамку, чтобы выровнять кончик иглы микролитрового шприца с отверстием черепа, которое находится на 1 мм латеральнее средней линии.
- Опустите иглу шприца так, чтобы она коснулась поверхности мозга, а затем установите это место в качестве нулевой точки (для оси Z). Опустите кончик иглы в кору головного мозга на глубину 0,5 мм и медленно влейте 1 мкл раствора вируса со скоростью 200 нл/мин.
- Подождите 5 минут после того, как раствор вируса будет полностью введен в ткани мозга, прежде чем извлекать иглу, чтобы предотвратить обратный поток раствора.
- Медленно извлеките иглу шприца. Повторите инъекцию в другом месте. Зашить разрез стерильным нерассасывающимся хирургическим шовным материалом (калибр 6-0).
- Вводят цефазолин [500 мг/кг (333 мг/мл, обычно ~45 мкл), внутримышечно] и мелоксикам (5 мг/кг, подкожно) после операции, пока животное еще находится под наркозом.
- Освободите мышь от стереотаксической рамки и прекратите анестезию. Поместите мышь в чистую клетку над одеялом с подогревом и наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не станет амбулаторным (примерно 15 минут). Затем перенесите в домашнюю клетку.
- Бупренорфин (1 мг/кг, подкожно) и мелоксикам (5 мг/кг, подкожно) вводят повторно через 8 ч, 16 ч и 24 ч соответственно после первой инъекции бупренорфина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 2-4 недели после инъекции вируса мышь получает ЧМТ и имплантацию краниального окна в том же месте, что и инъекция AAV.
2. Проведение повторной индукции ЧМТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры ЧМТ скорректированы по сравнению с предыдущими отчетами7,8, в которых воздействие ЧМТ было нанесено однократно. Протокол здесь применяет тот же параметр, за исключением того, что общее число последствий увеличивается до 10.
- Оборудование для ЧМТ
- Используйте специально разработанное портативное устройство для введения закрытой черепно-мозговой ЧМТ (Рисунок 2A) на голову мыши с правой стороны, как показано на Рисунке 2B.
- Подготовка перед операцией
- Оборудование для автоклавной хирургии, включая обычные ножницы, хирургический штангенциркуль, хирургические пружинные ножницы, хирургические щипцы, противомоскитные щипцы, наконечники, марлю и аппликаторы с ватными наконечниками.
- Взвесьте и запишите массу тела мыши за 2 часа до операции. Чтобы свести к минимуму отек мозга при имплантации краниального окна, вводят дексаметазона натрия фосфат в дозе 4,8 мг/кг [2 мг/мл, обычно ~70 мкл (нужно вводить в два места)] в четырехглавую мышцу с помощью инсулинового шприца. После инъекции дексаметазона, но до начала операции по удалению ЧМТ, подготовьте стеклянные окна, как указано в шаге 3.1, для последующего использования.
- Продезинфицируйте операционный этап и оборудование для ЧМТ с использованием 75% этилового спирта и расширьте одноразовую стерильную хирургическую простыню, чтобы покрыть операционный этап на стереотаксической платформе. Включите нагревательный прибор и монитор температуры, установив целевую температуру на 37 °C.
- Откройте вентиль кислородного баллона и отрегулируйте расход кислорода до 1,5 л/мин. Откройте наркозный аппарат и установите значение уровня изофлурана равным трем.
ПРИМЕЧАНИЕ: 100% чистый кислород может помочь животному пережить последствия ЧМТ. - Поместите мышь в индукционную камеру и оставьте на 5 минут, чтобы добиться полной анестезии.
- После того, как мышь будет полностью обезболена (т.е. медленная, но стабильная частота дыхания примерно один цикл в 2 с, в сочетании с отсутствием рефлекса сжатия хвоста), извлеките мышь из индукционной камеры и поместите голову мыши в стереотаксическую рамку.
- Поместите носовой конус наркозной трубки на морду мыши.
- Поддерживайте анестезию с использованием 1,5% изофлурана, смешанного со 100% чистым кислородом, со скоростью потока 1 л/мин до конца операции. Периодически проверяйте частоту дыхания и щипайте хвост или палец ноги не реже чем каждые 15 минут во время операции, чтобы оценить соответствующую анестезию. Отрегулируйте концентрацию изофлурана соответствующим образом, чтобы поддерживать желаемую глубину анестезии.
- Операция ЧМТ
- Ввести бупренорфин (1 мг/кг, подкожно) с помощью одноразовых инсулиновых шприцев и нанести офтальмологическую мазь на глаза мыши.
- Удалите волосы с макушки путем подравнивания ножницами 1, а затем нанесения депиляционного средства на 1 мин.
ВНИМАНИЕ: Не наносите средство для депиляции более чем на 3 минуты на кожу головы, так как оно раздражает кожу. Избегайте попадания депиляционного средства на глаза мыши. - Очистите кожу головы с помощью марли и аппликаторов с ватным наконечником. Затем продезинфицируйте кожу, используя сначала 75% этанол, а затем бетадин. Повторите это три раза (т.е. этанол с последующим бетадином), оставляя окончательное нанесение бетадина на кожу.
- Еще раз проверьте глубину анестезии, чтобы убедиться, что мышь полностью обезболена (т.е. медленная, но устойчивая частота дыхания примерно один цикл в 2 с, в сочетании с отсутствием рефлекса сжатия хвоста). Наложите на кожу хирургические щипцы 3 и сделайте разрез по средней линии длиной 12-15 мм, начиная примерно в 3 мм от глаз.
- Иссеките кожу над левым и правым полушарием черепа с помощью пружинных ножниц 2.
- После того, как череп обнажен, удалите надкостницу, осторожно потерев стерильным аппликатором с ватным наконечником и промыв стерильным физиологическим раствором.
- Визуально осмотрите состояние черепа, чтобы убедиться, что он не поврежден, за исключением двух небольших отверстий, которые были сделаны для предыдущей операции по инъекции вируса.
- Высушите область черепа и отметьте место удара ЧМТ в следующих координатах: 2,5 мм кзади от брегмы и 2 мм латеральнее сагиттального шва справа (рис. 2Б).
- Быстро извлеките мышь из стереотаксической рамки и поместите голову на буферную подушку под устройством ЧМТ.
- Совместите наконечник ударника с отмеченным местом удара.
- Поднимите металлическую колонку, потянув за привязанную нейлоновую веревку на 15 см выше головы мыши, а затем отпустите ее, позволив весу свободно упасть на стержень датчика, который соприкасается с верхней частью черепа в месте ЧМТ. Не прикасайтесь к головке мыши при нанесении удара ЧМТ.
- Переместите мышь на одеяло с подогревом и положите ее на спину, контролируя состояние дыхания.
- Как только мышь перейдет из положения лежа на спине, поместите мышь в индукционную камеру изофлурана на ~5 минут с 3% изофлураном, смешанным со 100% чистым кислородом со скоростью потока 1,5 л/мин.
- После того, как мышь будет полностью усыплена (т.е. медленная, но устойчивая частота дыхания примерно один цикл в 2 с, в сочетании с отсутствием рефлекса сжатия хвоста), повторите шаги 2.3.9-2.3.14, чтобы получить в общей сложности 10 ударов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем исследовании было обнаружено, что десять ударов ЧМТ вызывают устойчивый фенотип с низкой смертностью мышей (данные еще не опубликованы). Параметры могут быть скорректированы для достижения различной тяжести черепно-мозговой травмы путем увеличения или уменьшения количества ударов и/или высоты, с которой сбрасывается вес. Все параметры подлежат согласованию с местным IACUC. - Проверьте череп под хирургическим микроскопом и отстраните мышь от исследования, если произошел перелом черепа.
- Для фиктивной операции выполните те же процедуры, что описаны выше, включая помещение животного под ударный механизм, но без нанесения ударов ЧМТ.
- После того, как мышь перейдет из положения лежа на спине в положение лежа на животе после10-го удара ЧМТ, поместите мышь в индукционную камеру изофлурана на ~5 мин. Выполните шаги 2.2.6-2.2.8, чтобы поместить голову мыши на стереотаксическую раму для операции по имплантации краниального окна, описанной ниже.
3. Операция по имплантации краниального окна
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже этапы имплантации краниального окна были заимствованы у Goldey et al.9, и их спецификации подголовника и отверстия для визуализации были применены здесь.
- Подготовка окон
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом операции ЧМТ завершите подготовку окна, описанную в шаге 2.2.2. Окно изготовлено из двух круглых стеклянных накладок (один диаметром 3 мм и один диаметром 5 мм, как показано на рисунке 2C), которые соединены между собой прозрачным оптическим клеем, как описано ниже.- Продезинфицируйте стеклянные покровные стекла, погрузив их в 75% этанол на 15 минут. Выньте стеклянные покровные стекла из этанола и оставьте их сохнуть на стерильной поверхности (например, на крышке стерильной 24-луночной пластины) в течение ~10 минут.
- Наполните инсулиновый шприц прозрачным оптическим клеем, избегая образования пузырьков. Под микроскопом 1 (таблица материалов) при 0,67-кратном увеличении нанесите маленькую каплю (~1 мкл) оптического клея в центр 5-миллиметрового покровного стекла. Затем сразу же положите покровное стекло толщиной 3 мм сверху и центрируйте его по центру с покровным стеклом толщиной 5 мм.
- Аккуратно надавите тонкими щипцами, чтобы равномерно распределить клей. Выбросьте стеклянное окно, если вокруг 3-миллиметровой крышки образуется пузырь или стенка.
- Для отверждения клея поместите покровные стекла в УФ-бокс на 150 с при мощности 20 x 100 мкДж/см2. Убедитесь, что два покровных стекла надежно закреплены, осторожно подтолкнув щипцами 4 к боковой стороне 3-миллиметрового накладки. Если покровное стекло перемещается, поместите его обратно в УФ-бокс еще на 60 секунд. Храните стеклянное окно в стерильной 24-луночной тарелке для последующего использования.
- Шероховатая поверхность черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента выполняйте все шаги, описанные в разделе 3, под операционным микроскопом. Начните с 10-кратного увеличения и отрегулируйте желаемое увеличение.- Осторожно и медленно просверлите поверхность черепа твердосплавным сверлом FG4 с низкой скоростью вращения ротора (т. е. выходное число установлено на ~1-2), чтобы удалить оставшуюся надкостницу и создать шероховатую поверхность черепа, чтобы стоматологический цемент надежно сцепился с черепом. В качестве альтернативы здесь также можно использовать скальпель вместо дрели.
- Используйте физиологический раствор, чтобы смыть и очистить поверхность черепа от костной пыли.
- Разделите мышцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение мышц служит для увеличения площади поверхности обнаженной кости черепа, которая будет служить точкой контакта для стоматологического цемента, тем самым обеспечивая структурную целостность имплантата. Этот этап разделения мышц обычно обнажает ~3 мм височной пластины черепа.- Примерно на 5 мм позади глаза, где находится шов, соединяющий теменный и височный череп, осторожно введите закрытые тонкие кончики (щипцы #5/45), чтобы отделить боковые мышцы от черепа, и осторожно переместите закрытые кончики в заднем направлении до лямбдовидного шва.
- Отделите боковые мышцы на той стороне, где будет происходить имплантация краниального окна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не разъединяйте мышцы слишком близко к глазу, чтобы не повредить глазную артерию; В противном случае может возникнуть сильное и постоянное кровотечение. Не отделяйте мышцы от затылочной кости, так как мышь нуждается в этих мышцах, чтобы поднять голову. - Смойте мусор с места операции с помощью физиологического раствора и высушите область марлей. Гелевая пена может быть нанесена на место операции, чтобы остановить кровотечение.
- Имплантируйте подголовник.
- Используйте изготовленный по индивидуальному заказу титановый подголовник (рис. 2D), описанный в предыдущей публикации9, для надежной фиксации головы мыши во время операции трепанации черепа и для последующей двухфотонной визуализации.
- С помощью маркера и хирургического штангенциркуля проведите окружность трепанации черепа на чистом и сухом черепе с правой стороны. Центральная точка обведенной окружности находится на расстоянии 2,5 мм кзади от брегмы и 1,5 мм от сагиттального шва на правом полушарии. Диаметр обведенной окружности составляет около 3,2-3,5 мм, что немного больше, чем стеклянное покровное стекло толщиной 3 мм. Убедитесь, что круг трепанации черепа может охватывать места инъекции вируса (два отверстия, сделанные при введении вируса, могут быть использованы в качестве эталона) и место ЧМТ.
- Ослабьте амбушюру и поверните головку так, чтобы плоскость трепанации черепа была идеально горизонтальной, а затем снова затяните ушную планку.
- Используйте деревянную палочку аппликатора с хлопчатобумажным наконечником, чтобы добавить две небольшие капли суперклея на передний и задний края подголовника.
- Расположите титановый подголовник над центром трепанации черепа и быстро отрегулируйте его так, чтобы он находился в той же плоскости, где будет имплантировано краниальное окно. Слегка надавливайте до тех пор, пока суперклей не высохнет; Обычно это занимает ~30 с.
- Приготовьте стоматологический цемент в предварительно охлажденной керамической посуде (оставаясь не менее 10 минут в морозильной камере при температуре -20 °C): смешайте 300 мг цементного порошка, шесть капель быстроосновной жидкости и одну каплю катализатора, а затем перемешайте смесь до полного перемешивания (~15 раз).
ПРИМЕЧАНИЕ: Цемент должен быть пастообразным. Если он слишком жидкий, добавьте еще немного цементного порошка. Если он слишком густой, добавьте быструю базовую жидкость по одной капле за раз, пока не будет достигнута пастообразная консистенция. - Быстро нанесите большое количество стоматологической цементной смеси на внешний периметр обведенной окружности и покройте любую открытую поверхность кости. Однако не закрывайте место трепанации черепа. Подождите ~15 минут, пока стоматологический цемент высохнет и затвердеет, прежде чем продолжить.
- Отпустите амбушюру и закрепите подголовник на металлической раме, чтобы обеспечить устойчивость головки для точного сверления по отмеченной окружности трепанации черепа. Если на месте трепанации черепа есть цемент, просверлите и удалите его твердосплавным сверлом FG4.
- Трепанация черепа
- Используйте хирургический штангенциркуль для проверки диаметра отмеченного круга, как определено в шаге 3.4.2. При необходимости отрегулируйте так, чтобы краниальное окно плотно прилегало к краниотомии.
- С помощью электрической бормашины вытравите и утончите череп по внешней стороне отмеченного круга, сначала используя твердосплавную коронку FG4 (скорость установлена на выходе ~9-10). Это создает «дорожку», внутри которой прореживается череп.
ВНИМАНИЕ: Чтобы свести к минимуму тепловую травму и добиться гладкой траектории, продолжайте перемещать сверло. Не сверлите одно и то же место более 2 с. - Периодически прекращайте сверление и орошайте всю область стерильным физиологическим раствором, чтобы уменьшить нагрев от сверла и смыть костную пыль.
- Продолжайте утончать череп с помощью твердосплавной коронки FG1/4, как описано в шаге 3.5.2, пока череп не станет тонким, как бумага, и прозрачным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование двух рук для удержания сверла может облегчить управление дрелью и избежать вставки сверла в мозг. - Завершите истончение черепа с помощью твердосплавной коронки EF4. Когда между костным лоскутом и окружающей костью черепа возникает трещина, иногда происходит выделение спинномозговой жидкости (ликвора), что указывает на то, что череп полностью просверлен.
- Продолжайте прореживать и сверлить остальную часть черепа вдоль дорожки. Избегайте сверления в точке, где очевидная сосудистая сеть пересекается под черепом, чтобы предотвратить кровотечение.
- Введите тонкий кончик щипцов (щипцы 1) ~0,5 мм через треснувшее место и осторожно приподнимите костный лоскут вверх, не оставляя вдавливаний на нижележащий мозг.
- После удаления костного лоскута орошите область краниотомии физиологическим раствором. Поверхность мозга может быть на 1-2 мм выше края трепанации черепа.
- Начиная с этого этапа, всегда покрывайте открытый мозг физиологическим раствором, чтобы защитить ткани мозга.
- Кровотечение может возникнуть при поднятии костного лоскута в местах первоначальной инъекции AAV из-за адгезии тканей и роста сосудов после инъекционной операции. Если это произошло, осторожно прижмите это место сухим аппликатором с ватным наконечником в течение ~2 минут (или дольше по мере необходимости). Для остановки кровотечения можно использовать гелевую пену. Не используйте химикаты или нагревательные щипцы, чтобы остановить кровотечение, так как это может привести к травме.
- Используйте щипцы 1, чтобы аккуратно удалить видимое паутинное вещество.
- Стеклянное окно имплантата
- С помощью хирургического щипца 2 возьмите стерильное стеклянное окно стеклянным стеклом толщиной 3 мм вниз. Разместите и отрегулируйте стеклянное окно над местом трепанации черепа, чтобы убедиться, что окно может плотно прилегать к краю трепанации черепа. Сверху находится стеклянная накладка толщиной 5 мм.
- Приготовьте стоматологический цемент следующим образом: смешайте 100 мг цементного порошка, две капли жидкости быстрого основания и одну каплю катализатора. Перемешайте смесь до полного перемешивания (~15 раз). Подождите ~6 минут, пока цемент не станет пастообразным и густым. Если цемент слишком жидкий, он может просочиться в пространство под окном в шаге 3.6.4 и затенить окно.
- Ожидая, пока цемент станет пастообразным и густым, приложите достаточное давление к окну через стереотаксический манипулятор, чтобы убедиться, что череп может надежно и плотно соприкасаться со стеклянным окном. Следите за тем, чтобы жидкость для стоматологического цемента, описанная в шаге 3.6.4, не попала в пространство под стеклом и, таким образом, не заслонила окно.
- Используйте регулируемую точную кисть-аппликатор, чтобы добавить небольшое количество цемента вдоль края окна, чтобы закрыть стеклянное окно с черепом. Подождите ~10 минут, чтобы цемент полностью высох, а затем осторожно отпустите и снимите манипулятор над окном. На этом этапе требуется ~4 часа, чтобы закончить 10 ударов ЧМТ и имплантировать стойку головы и окно черепа.
- Обрежьте стоматологический цемент с помощью стоматологической дрели с твердосплавным сверлом FG4, если окно покрыто излишками цемента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное количество цемента вокруг окна может помешать двухфотонным линзам объектива приблизиться к поверхности окна.
- Имплантация визуализирующей лунки
ПРИМЕЧАНИЕ: Яма для визуализации (рис. 2D) представляет собой резиновое кольцо с наружным диаметром ~1,6 см, которое соответствует верхней поверхности стойки и удерживает воду над краниальным окном для двухфотонной визуализации.- После того, как имплантация окна будет завершена, просверлите остатки стоматологического цемента на верхней поверхности стойки и очистите область влажной хирургической марлей. Дайте участку высохнуть в течение ~3 минут.
- С помощью аппликатора с хлопчатобумажным наконечником смочите небольшое количество суперклея и наклейте его на верхнюю поверхность стойки. Быстро наденьте резиновое кольцо на стойку головы. Приложите среднее давление к резиновому кольцу в течение ~2 мин, чтобы обеспечить плотный контакт с передней стойкой. Используйте суперклей экономно, иначе он может прилипнуть к стеклянному окну и затруднить двухфотонное изображение.
- Обезболивающие и антибиотики
- Сразу после имплантации визуализации, но до прекращения приема изофлурана, вводят цефазолин [500 мг/кг (333 мг/мл, обычно ~45 мкл) внутримышечно] и мелоксикам (5 мг/кг, подкожно) с помощью одноразовых инсулиновых шприцев.
- После введения препарата прекратите анестезию, освободите мышь от стереотаксической рамки и верните мышь в домашнюю клетку, которая находится над нагревательным одеялом.
- Внимательно наблюдайте за мышью в течение ~15 минут, пока она не станет подвижной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размещайте мышей поодиночке, так как они могут хорошо укусить резину других мышей. Обеспечьте корм и гель воды рядом с мышью в клетке для доступа к ней вволю. - Бупренорфин (1 мг/кг, подкожно) и мелоксикам (5 мг/кг, подкожно) повторно каждые 8 ч после предыдущей дозы до 48 ч после операции по имплантации краниального окна.
4. Прижизненная двухфотонная визуализация
- Для прижизненной визуализации используют микроскоп 2 (таблица материалов), оснащенный перестраиваемым когерентным многофотонным лазером и объективом с 20-кратным увеличением (NA 1,0; погружение в воду)18. Фильтр, используемый для сигнала EGFP, - "BP 500-550".
- Подготовьте мышь из краниального окна к прижизненной визуализации.
- Начиная со дня операции (обозначаемого как день 0), выполняйте двухфотонную визуализацию в определенные моменты времени после ЧМТ. Поместите мышь с краниальным окном в наркозную индукционную камеру и введите 3% изофлуран, смешанный с газом-носителем, со скоростью потока 1,5 л/мин в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Газом-носителем может быть как комнатный воздух, так и 100% кислород. - После того, как мышь будет полностью обезболена (т.е. медленная, но стабильная частота дыхания примерно один цикл в 2 с, в сочетании с отсутствием рефлекса сжатия хвоста), извлеките мышь из индукционной камеры и быстро зажмите подголовник к кронштейну. Пусть туловище мыши лежит на круглой пластиковой пластине (диаметр 19 см), оснащенной кронштейном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Под туловище мыши была помещена теплая подушечка для рук, чтобы обеспечить тепловую поддержку во время прижизненной визуализации. - Нанесите лубрикантную офтальмологическую мазь на глаза мыши и поместите носовой конус анестезиологической трубки на морду мыши. Поддерживайте анестезию, используя 1,5% изофлуран с газом-носителем со скоростью потока 1 л/мин.
- Периодически проверяйте частоту дыхания и щипайте хвост или палец ноги не реже чем каждые 15 минут на протяжении всей визуализации, чтобы оценить соответствующую анестезию. Отрегулируйте концентрацию изофлурана соответствующим образом, чтобы поддерживать желаемую глубину анестезии.
- Выровняйте голову мыши так, чтобы черепное окно находилось прямо под двухфотонной линзой объектива. Добавьте немного воды в отверстие для визуализации над краниальным окном. Опустите объектив так, чтобы он погрузился в воду.
- Начиная со дня операции (обозначаемого как день 0), выполняйте двухфотонную визуализацию в определенные моменты времени после ЧМТ. Поместите мышь с краниальным окном в наркозную индукционную камеру и введите 3% изофлуран, смешанный с газом-носителем, со скоростью потока 1,5 л/мин в течение 5 мин.
- Прижизненная визуализация внутричерепных оконных мышей
- Включите ртутную лампу прицела. Сначала осмотрите мозг с эпифлуоресценцией через глаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистая сеть выглядит черной. Выберите область, в которой окно свободно. Отключите эпифлуоресценцию, установите длину волны лазера на 860 нм для сигнала EGFP и отрегулируйте настройку лазера для оптимального (т. е. яркого, но не насыщенного) сигнала. - Установите режим сканирования на Рамка , а шаг линии на 1. Установите число усреднения равным 16, битовую глубину — 8-битной, режим — Line, а метод — Mean.
- Используйте сосудистую сеть в качестве «эталонной карты» для визуализации той же области мозга для последующей продольной визуализации. Изобразите поверхностный уровень (слой I, менее 100 мкм от поверхности менингея) для трех плоскостей, в которых кортикальная сосудистая сеть доминирует в режиме z-стека с межплоскостным интервалом 10 мкм, как показано на рисунке 3A.
- Изображение шести плоскостей на глубоком уровне (слои IV и V, ~400 мкм глубже поверхностного уровня) в режиме z-стека, как показано на рисунке 3A, с межплоскостным интервалом 10 мкм и скоростью сканирования 8.
- После завершения визуализации (~20 минут на мышь) прекратите анестезию, освободите мышь от рамок и верните ее в домашнюю клетку, которая находится над одеялом с подогревом. Наблюдайте за мышью последовательно, пока она не станет амбулаторной, что обычно занимает ~7 минут.
- Продольное изображение мыши на 0-й день, через 1 неделю и 4 месяца после операции ЧМТ.
- Включите ртутную лампу прицела. Сначала осмотрите мозг с эпифлуоресценцией через глаз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве доказательства концепции этого протокола вирусные частицы, экспрессирующие AAV-Syn1-EGFP, были введены в кору головного мозга самцов мышей TDP-43Q331K/Q331K (C57BL/6J фон)19 в возрасте 3 месяцев. Отмечается, что животные дикого типа C57BL/6J также могут быть использованы, однако это исследование было проведено на мышах TDP-43 Q331K/Q331K, поскольку лаборатория сосредоточена на исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Операция ЧМТ была проведена через 4 недели после инъекции AAV. В тех же хирургических условиях были имплантированы оголовье и краниальное окно. Мышь была последовательно сфотографирована с помощью двухфотонного микроскопа на 0-й день, через 1 неделю и 4 месяца после операции по удалению ЧМТ (рис. 1). В целом, инъекционная операция заняла ~30 минут, а операция ЧМТ заняла ~1 час на мышь. Во время операции ЧМТ мышам, как правило, требовалось больше времени, чтобы выпрямиться из положения лежа на спине в положение лежа после последующих ударов, по сравнению с первоначальными ударами. Например, мыши может потребоваться 2 минуты, чтобы выровнять свое положение после первого удара, но 10 минут, чтобы выровнять свое положение после10-го удара. Для операции по имплантации краниального окна обычно требуется ~3 часа для выполнения всех этапов, но это занимает больше времени, чем необходимо, если возникало постоянное кровотечение. Двухфотонная визуализация обычно требовала 20 минут на каждую мышь, чтобы получить все изображения. В текущем исследовании с участием трех мышей с экспрессией EGFP у животных не было обнаружено признаков перелома черепа, и они не умерли во время операции или в течение 4 месяцев после операции. Как заболеваемость, так и частота переломов черепа составляли 0%. Это согласуется с относительно низким (<10%) уровнем смертности в аналогичной модели индуцирования ЧМТ, но без имплантата краниального окна 7,8.
Устройство для сброса веса (рис. 2А), о котором ранее сообщалось 7,8, использовалось для нанесения ударов ЧМТ на голову мыши с правой стороны, как показано на рисунке 2Б. Прозрачная пластиковая трубка (No 5 на рисунке 2А; 60 см в длину и 1,4 см во внутреннем диаметре) была надежно и вертикально закреплена на металлическом кронштейне, а в вертикальную трубку помещена пластиковая ударная колонна (No 7 на рисунке 2А; длиной 10 см и диаметром 1,3 см с плоским круглым наконечником диаметром 2 мм). Металлический груз весом 50 г (No 6 на рис. 2А) был помещен над ударным механизмом и привязан нейлоновой веревкой (No 4 на рисунке 2А). Под голову мыши была помещена буферная подушка (No 8 на рисунке 2А; 9 см x 9 см x 1 см [длина x ширина x глубина], изготовленная из вспененного полиэтилена и ватной марли) для буферизации и поглощения энергии удара.
Краниальное окно было изготовлено из двух стеклянных покровных стекол, соединенных оптическим клеем (рис. 2В), причем стеклянное покровное стекло диаметром 3 мм являлось стороной, касающейся поверхности мозга. Двухфотонная визуализация проводилась на двух разных глубинах (рис. 3А) от поверхности мозга: 1) поверхностный уровень, где кортикальная сосудистая сеть была обильной и имела относительно большой диаметр просвета, который казался черным, но с разреженными EGFP-положительными клеточными телами; и 2) более глубокий уровень, где сосудистая сеть была разреженной и имела небольшой диаметр просвета, с большим количеством EGFP-положительных клеток.
Через ~4 ч (0-й день) после операции двухфотонная визуализация проводилась в трех плоскостях с интервалом 10 мкм на поверхностном уровне (слой I, менее 100 мкм от поверхности менингеальной оболочки), где сосудистая сеть казалась черной (обозначена пунктирными красными линиями на рисунке 3B), и использовалась в качестве эталонной карты для следующего сеанса визуализации для определения исходной области визуализации. На этом поверхностном уровне кортикальные сосудистые и нейронные процессы были преобладающими структурами, которые можно было наблюдать, в то время как EGFP-позитивные клеточные тела были разреженными. После визуализации на поверхностном уровне фокус был скорректирован вниз на ~400 мкм, глубже, чем поверхностный уровень, в кору головного мозга (слой IV и V) для визуализации тел EGFP-положительных нейрональных клеток. Изображения были получены в шести плоскостях с интервалом 10 мкм. Экспрессия белка EGFP была диффузно распределена по всему телу клетки, как показано на рисунке 3C. Время от времени наблюдалось появление некоторых EGFP puncta вне клеточных тел, которые могли представлять собой включения EGFP, которые формировались с течением времени внутри аксонов или дендритов. Этот протокол приводит к экспрессии AAV-SYN1-EGFP ~2-3 мм вокруг места инъекции, что может быть определено путем гистологического анализа посмертных тканей.
Через 1 неделю и 4 месяца после ЧМТ в качестве эталона для определения местоположения той же области визуализации использовали сосудистый паттерн, наблюдаемый в момент времени 0-го дня (рис. 3D, F). Структура сосудистой сети на рисунке 3D, F аналогична той, что изображена на рисунке 3B. Процедура визуализации в течение 1 недели и 4 месяцев после ЧМТ была такой же, как описана выше, для точки времени 0-го дня, и экспрессия EGFP была обнаружена по всему телу клетки, как и раньше (рис. 3E, G). Интенсивность флуоресценции на 0-й и 4-й день была одинаковой как на поверхностном, так и на более глубоком уровнях. Тем не менее, интенсивность флуоресценции через 1 неделю была ниже, чем на 0-й день и 4-й месяц как на поверхностном, так и на глубоком уровнях, что может быть связано с трансляционной репрессией, о которой сообщалось для других моделей ЧМТ20. Примечательно, что качество изображений через 4 месяца по сравнению с точкой времени 0-го дня демонстрирует, что краниальное окно сохранило четкость и целостность, и что экспрессия вируса все еще сильна через 4 месяца после операции для эффективной прижизненной визуализации. Поскольку EGFP экспрессируется как относительно диффузный белок, флуоресцентные сигналы могут быть лучше разрешены и дискретны, когда EGFP сливается с интересующим белком.
Рисунок 1: График выполнения этого протокола прижизненной визуализации. Протокол инициируется внедрением вируса. ЧМТ и операция на окне черепа проводятся в рамках одного сеанса операции через 2-4 недели после инъекции вируса. Прижизненная визуализация проводится на 0 день, 1 неделю, 4 месяца после ЧМТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схемы устройства ЧМТ, места удара ЧМТ и подготовки окна . (A) Оборудование для устройства для снижения веса ЧМТ. 1: пьедестал, 2: кронштейн, 3: регулируемый зажим, 4: нейлоновая струна, 5: туннель для сброса веса, 6: металлическая колонна (50 г), 7: ударник, 8: буферная подушка. (Б) Схема места инъекции вируса и ЧМТ с координатами 2,5 мм кзади от брегмы и 2 мм латеральнее сагиттального шва справа. (C) Схема подготовки стеклянного окна. Два стеклянных накладки диаметром 3 мм и 5 мм соединяются с помощью оптического клея. (D) Фотографии металлической стойки головы и колодца для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схема плоскостей изображения и данных изображения . (А) Несколько плоскостей визуализируются на поверхностном уровне, где расположена сосудистая сеть, и на глубоком уровне. Изображения собираются следующим образом: три плоскости на поверхностном уровне, где кортикальные сосудистые и нейрональные процессы являются преобладающими EGFP-положительными структурами, и шесть плоскостей на глубоком уровне, где преимущественно наблюдаются EGFP-положительные клеточные тела, с интервалом 10 мкм между соседними плоскостями. Каждая плоскость имеет размер 425,10 мкм x 425,10 мкм. (Б) Репрезентативное изображение самолета на поверхностном уровне в момент времени дня 0. Пунктирными красными линиями обозначен контур сосудистой сети, который может быть использован в качестве ориентира для определения местоположения исходного места визуализации в последующие моменты времени. (C) Репрезентативное изображение самолета на глубоком уровне в момент времени 0-го дня вскоре после ЧМТ. (D) Репрезентативное изображение самолета на поверхностном уровне в 1 недельный момент времени. Пунктирные красные линии обозначают сосудистую сеть, аналогично контуру на день 0 на рисунке 3B, подтверждая, что двухфотонная визуализация была проведена в аналогичном месте на 0-й день и 1-ю неделю после ЧМТ. (E) Репрезентативное изображение на глубоком уровне через 1 неделю после ЧМТ. (F) То же, что и B и D, через 4 месяца после ЧМТ. (G) То же, что и C и E, через 4 месяца после ЧМТ. Масштабная линейка: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании инъекция AAV, введение ЧМТ и имплантация краниального окна были объединены для анализа продольной визуализации EGFP-меченных нейронов в коре головного мозга мыши (слои IV и V) для наблюдения за влиянием ЧМТ на нейроны коры головного мозга. В этом исследовании отмечается, что выбранное здесь место ЧМТ, над гиппокампом, обеспечивает относительно плоскую и широкую поверхность для имплантации краниального окна. И наоборот, череп относительно узкий кпереди от этого участка, и поэтому трудно гарантировать, что стойка головы будет эффективно контактировать с поверхностью черепа. Несмотря на то, что в этом исследовании использовалась только модель мышей TDP-43 Q331K/Q331K , учитывая лабораторные исследования, посвященные БАС и FTD19, этот протокол должен быть применим к большинству других линий мышей. В дополнение к мечению нейронов, как описано здесь, можно использовать различные стратегии для маркировки других типов клеток для прижизненной визуализации. Один из подходов заключается в экспрессии генетически кодируемых флуоресцентных белков клеточно-специфичным образом с использованием рекомбинационной системы Cre-Lox у генетически модифицированных мышей21. Другой подход заключается в использовании определенных серотипов вирусов для клеточно-специфической трансдукции генетически кодируемых флуоресцентных белков. Сайт-специфическая доставка может быть достигнута путем выполнения внутричерепной инъекции в нужное место в головном мозге. Эффективность и легкость, с которой можно экспрессировать клеточно-специфические белки с помощью вирусной трансдукции для прижизненной визуализации, является преимуществом по сравнению с созданием трансгенных мышиных моделей.
Протоколы хирургического вмешательства включают в себя несколько критических этапов, которые необходимо тщательно выполнить. При сверлении отверстий на черепе для инъекции вируса в начале протокола нужно быть осторожным, чтобы не повредить ткани под черепом. Если повреждение тканей происходит во время сверления черепа, будет возникать воспаление, адгезия тканей и ангиогенез вокруг места травмы, тем самым увеличивая риск кровотечения во время трепанации черепа для имплантации краниального окна. Для проведения ЧМТ с помощью устройства для сброса веса, в настоящем исследовании под голову мыши помещалась подушка, чтобы смягчить силу удара ЧМТ и, таким образом, снизить вероятность перелома черепа. Не наблюдалось явного движения головы в направлении вращения и ускорения, что подтверждает мнение о том, что эта модель ЧМТ имеет относительно низкую вероятность диффузионного повреждения аксонов. Интересно, что Foda et al. использовали аналогичное устройство для сброса веса для создания закрытой черепно-мозговой травмы на крысах, и под голову крысы была помещена более крупная мягкая поролоновая подушка (толщиной 12 см), чтобы она могла легко двигаться в ответ на силу удара TBI в направлении вращения с ускорением, что привело к диффузионной аксональной травме22. Одним из преимуществ модели ЧМТ с трубчатым падением груза является то, что тяжесть травмы может быть скорректирована путем изменения высоты падения веса (т.е. более высокой высоты для большей силы) и/или повторения количества ударов по телу. Например, Flierl et al. использовали аналогичное устройство для снижения веса, как и в настоящем исследовании, для индуцирования ЧМТ у мышей; вес металла составлял 333 г, что вызывало легкую ЧМТ при падении с высоты 2 см и тяжелую ЧМТ при падении с высоты 3 см23. Этап трепанации черепа перед имплантацией окна также должен быть выполнен осторожно, чтобы не повредить ткани мозга под черепом. Периодическое перемещение сверла в другую область черепа помогает избежать чрезмерного сверления в одном и том же месте, что может привести к чрезмерному нагреву, повреждению тканей и кровотечению; Кроме того, частое орошение солевым раствором также может охладить место бурения. При имплантации стеклянного окна важно выровнять плоскость стекла таким образом, чтобы она была параллельна плоскости поверхности черепа; Плотно прилегающее окно в черепе предотвращает утечку жидкости стоматологического цемента в пространство между окном и мозгом.
Если окно размыто на 0-й день после операции ЧМТ, но обнаружены флуоресцентные сигналы, возможно, стоматологический цемент попал в пространство между окном и мозгом, тем самым образуя слой цемента, который покрывает поверхность мозга и скрывает флуоресцентное излучение. В этой ситуации можно удалить окно и стоматологический цемент с помощью метода сверления, описанного в шаге протокола 3.5, а затем имплантировать новое стеклянное окно на исходное место, как подробно описано Goldey et al.9. Если на последующем этапе в процессе продольного изображения окно становится размытым, можно попытаться удалить возможный мусор, аккуратно потерев окно аппликатором с ватным наконечником. Если это не решит проблему, это может быть связано с повторным ростом кости и мозговых оболочек под стеклянным окном. В этом случае можно удалить окно и сверлить для удаления отросшей кости и/или выщипнуть и удалить мозговые оболочки с последующей имплантацией нового стеклянного окна на исходное место, как описано Goldey et al.9. Как показано в результатах, экспрессия и флуоресценция EGFP устойчивы в течение ~4 месяцев после ЧМТ. Можно ожидать снижения сигнала флуоресценции в течение первой недели после ЧМТ, что, вероятно, связано с трансляционной репрессией, индуцированной ЧМТ, которая вызывает временное снижение глобального синтеза белка20.
Чтобы сохранить высокое качество визуализации и получить изображение в нескольких плоскостях, мышей вводили под наркозом изофлураном, чтобы ограничить движения. Однако важно отметить, что анестезия может повлиять на результаты исследования. Например, сообщалось, что мыши, находящиеся под наркозом изофлураном, проявляют различную активность микроглии в ответ на фотоповреждение по сравнению с бодрствующими мышами24. Для двухфотонной визуализации скорость сканирования и количество сканирований для усреднения сигнала (задается как «число», в разделе «усреднение») являются основными факторами, определяющими разрешение изображения. Для оптимизации разрешения можно уменьшить скорость сканирования и увеличить число усреднения, однако более низкая скорость и более высокое число усреднения увеличивают время визуализации для определенного поля зрения и могут привести к обесцвечиванию фотографий. Настоящее исследование направлено на получение хронической долговременной визуализации одного и того же животного в одном и том же месте мозга. Чтобы избежать потенциального обесцвечивания фотографий при достижении достаточного разрешения, двухфотонная визуализация проводилась со скоростью сканирования 8 со средним числом 16.
Альтернативным подходом к выполнению трепанации черепа и имплантации стеклянного окна является истончение черепа до такой степени, чтобы он стал прозрачным и «тонким, как бумага» для визуализации в реальном времени25,26,27. Тонкое окно черепа может сохранить целостность черепа и, таким образом, избежать воспаления, вызванного хирургической операцией. Таким образом, подход «окно тонкого черепа» может быть предпочтительным для визуализации в реальном времени с маркерами, относящимися к воспалению, и/или в течение относительно короткого периода времени (т.е. ~14 дней после операции, как сообщается25). Для длительной визуализации (т.е. 4 месяца, как описано здесь) хронических нейродегенеративных процессов, помимо оценки острых последствий ЧМТ у одного и того же животного, рекомендуется использовать стеклянное окно, имплантированное методом трепанации черепа.
Как упоминалось во введении, существует несколько заметных преимуществ прижизненной визуализации для изучения различных биологических и патологических явлений в мозге млекопитающих. Однако у этого протокола есть и некоторые ограничения. Например, черепно-мозговая травма описывает ушиб головного мозга или гематому, удаленную от, обычно противоположную, месту контакта с силой28,29,30. В настоящем исследовании удары ЧМТ были нанесены на теменную долю; Ожидается, что повреждение будет вентрально и недоступно для прижизненной визуализации. Гистологический анализ может быть использован в качестве дополнительного подхода для дальнейшего изучения фенотипов, представляющих интерес за пределами места удара, покрытого краниальным окном. Кроме того, экзогенная гиперэкспрессия определенных белков также может индуцировать токсичность или патологию. В настоящем исследовании наблюдались некоторые случайные EGFP puncta, которые могут представлять собой скопления из-за гиперэкспрессии белка. Таким образом, рекомендуется включить в дизайн исследования белок с отрицательным контролем (например, только EGFP или RFP), чтобы устранить эту возможность, особенно если интересующий белок склонен к образованию точечных структур. Количество белков, которые можно изучать одновременно, ограничено лазерами и возможностями двухфотонной системы. С помощью двухфотонной микроскопии можно получить изображение более чем одного флуорофора (например, EGFP, RFP и т. д.), хотя возможности мультиплексирования с обычными широкопольными и конфокальными микроскопами часто позволяют анализировать больше белков в одном образце ткани. Наконец, важно включить фиктивный контроль, который проходит все те же процедуры, что и животное с ЧМТ, за исключением воздействия на снижение веса. Операция по имплантации краниального окна является инвазивной операцией и может вызвать некоторые местные изменения, такие как воспаление и изменение внутричерепного давления, которые могут повлиять на процесс ЧМТ. Фиктивный контроль помогает экспериментатору оценить фенотипы, обусловленные воздействием, по сравнению с хирургическими процедурами.
Таким образом, этот протокол представляет метод продольного изображения белков в нейронах коры головного мозга мыши в ответ на ЧМТ. Этот протокол может быть модифицирован для анализа экспрессии и локализации различных клеточно-специфических белков в ответ на ЧМТ. Целью данного протокола является предоставление подхода к изучению непосредственных и долгосрочных последствий ЧМТ в мозге млекопитающих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов не декларируется.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Мигеля Сена-Эстевеса из Медицинской школы Чана Массачусетского университета за дарение вируса AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP и Дебру Кэмерон из Медицинской школы Чана Массачусетского университета за рисунок эскиза черепа мыши. Мы также благодарим нынешних и бывших сотрудников лабораторий Bosco, Schafer и Henninger за их предложения и поддержку. Эта работа финансировалась Министерством обороны (W81XWH202071/PRARP) для DAB, DS и NH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
