Summary
Cette étude démontre l’administration d’un traumatisme crânien répétitif à des souris et l’implantation simultanée d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale ultérieure d’un EGFP exprimé par neurone à l’aide de la microscopie à deux photons.
Abstract
L’objectif de ce protocole est de démontrer comment visualiser longitudinalement l’expression et la localisation d’une protéine d’intérêt dans des types cellulaires spécifiques du cerveau d’un animal, lors d’une exposition à des stimuli exogènes. Ici, l’administration d’un traumatisme crânien (TCC) à crâne fermé et l’implantation simultanée d’une fenêtre crânienne pour une imagerie intravitale longitudinale ultérieure chez la souris sont montrées. Des souris sont injectées par voie intracrânienne avec un virus adéno-associé (AAV) exprimant une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous un promoteur neuronal spécifique. Après 2 à 4 semaines, les souris sont soumises à un traumatisme crânien répétitif à l’aide d’un dispositif de perte de poids au-dessus de l’emplacement d’injection de l’AAV. Au cours de la même séance chirurgicale, les souris sont implantées avec une tige de tête en métal, puis une fenêtre crânienne en verre sur le site d’impact du TCC. L’expression et la localisation cellulaire de l’EGFP sont examinées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la même région du cerveau exposée à un traumatisme pendant des mois.
Introduction
Les traumatismes crâniens (TCC), qui peuvent résulter de blessures sportives, de collisions de véhicules et de combats militaires, sont un problème de santé mondial. Les traumatismes crâniens peuvent entraîner des déficits physiologiques, cognitifs et comportementaux, ainsi qu’une invalidité ou une mortalité à vie 1,2. La gravité des traumatismes crâniens peut être classée comme légère, modérée et sévère, la grande majorité étant un traumatisme crânien léger (75 % à 90 %)3. Il est de plus en plus reconnu que les traumatismes crâniens, en particulier les occurrences répétitives de traumatismes crâniens, peuvent favoriser la dégénérescence neuronale et servir de facteurs de risque pour plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (DFT) et l’encéphalopathie traumatique chronique (ETC)4,5,6. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la neurodégénérescence induite par les TCC restent flous et représentent donc un domaine d’étude actif. Pour mieux comprendre comment les neurones réagissent et se rétablissent d’un traumatisme crânien, une méthode de surveillance des protéines d’intérêt marquées par fluorescence, en particulier dans les neurones, par imagerie intravitale longitudinale chez la souris après un traumatisme crânien est décrite ici.
À cette fin, cette étude montre comment combiner une intervention chirurgicale pour l’administration d’un traumatisme crânien fermé qui est similaire à ce qui a été rapporté précédemment7,8, avec une procédure chirurgicale pour l’implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale en aval, telle que décrite par Goldey et al9. Notamment, il n’est pas possible d’implanter d’abord une fenêtre crânienne et d’effectuer ensuite un TCC dans la même région, car l’impact de la perte de poids qui induit le TCC est susceptible d’endommager la fenêtre et de causer des dommages irréparables à la souris. Par conséquent, ce protocole a été conçu pour administrer le traumatisme crânien, puis implanter la fenêtre crânienne directement sur le site d’impact, le tout au cours de la même séance chirurgicale. L’un des avantages de combiner à la fois le traumatisme crânien et l’implantation de la fenêtre crânienne en une seule séance chirurgicale est la réduction du nombre de fois qu’une souris est soumise à une intervention chirurgicale. De plus, il permet de surveiller la réponse immédiate (c’est-à-dire sur une échelle de temps de quelques heures) à un traumatisme crânien, par opposition à l’implantation de la fenêtre lors d’une séance chirurgicale ultérieure (c’est-à-dire l’imagerie initiale commençant sur une échelle de temps de plusieurs jours après le traumatisme crânien). La fenêtre crânienne et la plateforme d’imagerie intravitale offrent également des avantages par rapport à la surveillance des protéines neuronales par des méthodes conventionnelles telles que l’immunomarquage des tissus fixés. Par exemple, moins de souris sont nécessaires pour l’imagerie intravitale, car la même souris peut être étudiée à plusieurs moments, par opposition à des cohortes distinctes de souris nécessaires pour des points temporels discrets. De plus, les mêmes neurones peuvent être surveillés au fil du temps, ce qui permet de suivre des événements biologiques ou pathologiques spécifiques au sein de la même cellule.
À titre de preuve de concept, l’expression neuronale spécifique de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous le promoteur de synapsine est démontrée ici10. Cette approche peut être étendue à 1) différents types de cellules cérébrales en utilisant d’autres promoteurs spécifiques au type cellulaire, tels que le promoteur de la protéine de base de la myéline (MBP) pour les oligodendrocytes et le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour les astrocytes,11, 2) différentes protéines cibles d’intérêt en fusionnant leurs gènes avec le gène EGFP, et 3) co-exprimant plusieurs protéines fusionnées à différents fluorophores. Ici, l’EGFP est conditionné et exprimé par l’administration d’un virus adéno-associé (AAV) par injection intracrânienne. Un traumatisme crânien fermé est administré à l’aide d’un dispositif de perte de poids, suivi de l’implantation d’une fenêtre crânienne. La visualisation de l’EGFP neuronal est réalisée à travers la fenêtre crânienne, en utilisant la microscopie à deux photons pour détecter la fluorescence de l’EGFP in vivo. Avec le laser à deux photons, il est possible de pénétrer plus profondément dans le tissu cortical avec un minimum de photodommages, ce qui permet une imagerie longitudinale répétée des mêmes régions corticales au sein d’une souris individuelle pendant des jours et jusqu’aux mois12,13,14,15. En somme, cette approche combinant une chirurgie de traumatisme crânien avec l’imagerie intravitale vise à faire progresser la compréhension des événements moléculaires qui contribuent à la pathologie de la maladie induite par le TCC16,17.
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Protocol
Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été mis en œuvre conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par le Comité du National Research Council (États-Unis). Les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Chan Medical School (UMMS) de l’Université du Massachusetts (numéro de permis 202100057). En bref, comme le montre le schéma de l’étude (Figure 1), l’animal reçoit une injection virale, un traumatisme crânien, une implantation par fenêtre, puis une imagerie intravitale dans une séquence temporelle.
REMARQUE : Les termes commerciaux ont été supprimés. Veuillez vous référer au tableau des matériaux pour connaître l’équipement spécifique utilisé.
1. Injection intracrânienne d’AAV à l’aide d’un dispositif stéréotaxique
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Utilisez un titre viral de 1 x 1013 génomes viraux par millilitre (vg/mL). Syn1 fait référence à Synapsin1, qui est un promoteur neuronal spécifique permettant une expression virale restreinte dans les neurones. Le virus peut être préparé en interne ou externalisé.
- Préparation à la chirurgie d’injection stéréotaxique pour l’administration d’AAV
- Autoclavez des ciseaux ordinaires, un pied à coulisse chirurgical, des ciseaux à ressort chirurgicaux, des pinces chirurgicales, des pinces à moustiques, de la gaze, un applicateur à embout en coton et une seringue en verre d’un microlitre.
- Désinfectez la zone de chirurgie en utilisant de l’éthanol à 75 %. Élargissez le champ chirurgical stérile jetable pour couvrir la région chirurgicale sur la plate-forme stéréotaxique.
REMARQUE : Pour maintenir la température corporelle de l’animal pendant la chirurgie d’injection, utilisez un appareil de chauffage régulé par rétroaction. - Pesez et notez le poids corporel de la souris.
- Ouvrez le robinet du réservoir d’oxygène et réglez le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Ouvrez l’appareil d’anesthésie et réglez la valeur du niveau d’isoflurane sur trois.
REMARQUE : Le gaz vecteur peut être soit de l’air ambiant, soit de l’oxygène à 100% dans cette étape. - Placez la souris dans la chambre d’induction et laissez-la reposer pendant 5 minutes pour obtenir une anesthésie complète.
- Une fois que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence d’un réflexe de pincement de la queue), retirez la souris de la chambre d’induction et placez la tête de souris dans le cadre stéréotaxique.
- Placez le cône nasal de la tubulure d’anesthésie sur le museau de la souris.
- Maintenir l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 1,5 %, avec un gaz vecteur à un débit de 1 L/min jusqu’à la fin de la chirurgie. Vérifiez périodiquement la fréquence respiratoire et effectuez un pincement de la queue ou des orteils au moins toutes les 15 minutes tout au long de la chirurgie pour évaluer l’anesthésie appropriée. Ajustez la concentration d’isoflurane au besoin pour maintenir la profondeur d’anesthésie souhaitée.
- Remplissez une seringue d’un microlitre (10 μL) avec la solution virale. Ensuite, fixez la seringue sur la pompe à micro-injecteur adaptée du dispositif stéréotaxique.
- Chirurgie d’injection
- Administrer de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) à l’aide d’une seringue à insuline jetable et appliquer une pommade ophtalmique lubrifiante sur les yeux de la souris.
- Retirez les cheveux du cuir chevelu sur le dessus de la tête en les coupant avec des ciseaux ordinaires 1.
- Nettoyez la peau du cuir chevelu avec de la gaze et des applicateurs à embout en coton. Désinfectez la peau en utilisant d’abord de l’éthanol à 75 %, puis de la bétadine. Répétez cette opération trois fois (c’est-à-dire à l’éthanol suivi de la bétadine), en laissant l’application finale de la bétadine sur la peau.
- Vérifiez à nouveau la profondeur de l’anesthésie pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence de réflexe de pincement de la queue). Faites une incision de ~1 cm à l’aide de ciseaux ordinaires 2 le long de la ligne médiane pour exposer le crâne pariétal droit, et retirez le périoste à l’aide d’un applicateur à embout en coton.
- Marquez deux points sur le crâne à l’aide d’un marqueur aux coordonnées suivantes : point A : 2,5 mm en arrière du Bregma et 1 mm latéralement à la ligne médiane au-dessus de l’hémisphère droit ; point B : 2,5 mm en arrière du Bregma et 2 mm latéralement à la ligne médiane au-dessus de l’hémisphère droit.
- Percez soigneusement deux trous à travers le crâne aux coordonnées marquées à l’aide d’une perceuse dentaire électrique avec une mèche en carbure EF4 fine.
REMARQUE : Veillez à ne pas endommager le tissu cérébral. - Ajustez le cadre stéréotaxique pour aligner l’extrémité de l’aiguille de la seringue microlitre sur le trou du crâne qui est à 1 mm latéralement de la ligne médiane.
- Abaissez l’aiguille de la seringue pour qu’elle touche la surface du cerveau, puis définissez cet emplacement comme point zéro (pour l’axe z). Abaissez la pointe de l’aiguille dans le cortex cérébral à une profondeur de 0,5 mm et perfusez lentement 1 μL de la solution virale à une vitesse de 200 nL/min.
- Attendez 5 minutes après que la solution virale soit complètement injectée dans le tissu cérébral avant de retirer l’aiguille pour éviter le reflux de la solution.
- Retirez lentement l’aiguille de la seringue. Répétez l’injection à l’autre endroit. Suturez l’incision à l’aide d’une suture chirurgicale stérile et non résorbable (calibre 6-0).
- Administrer de la céfazoline [500 mg/kg (333 mg/mL, habituellement ~45 μL), par voie intramusculaire] et du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) après la chirurgie alors que l’animal est encore anesthésié.
- Libérez la souris du cadre stéréotaxique et arrêtez l’anesthésie. Placez la souris dans une cage propre au-dessus d’une couverture chauffante et surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il soit ambulatoire (environ 15 min). Ensuite, transférez-vous dans la cage d’accueil.
- Administrer à nouveau de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) et du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) à 8 h, 16 h et 24 h, respectivement, après la première injection de buprénorphine.
REMARQUE : 2 à 4 semaines après l’injection du virus, la souris reçoit un TCC et une implantation de la fenêtre crânienne au même site que l’injection d’AAV.
2. Administration d’une induction répétitive d’un traumatisme crânien
NOTA : Les paramètres du TCC sont ajustés par rapport aux rapports précédents7,8, dans lesquels l’impact du TCC n’a été communiqué qu’une seule fois. Le protocole applique ici le même paramètre, sauf que le nombre total d’impact est porté à 10.
- Équipement TBI
- Utiliser un appareil portatif conçu sur mesure pour l’administration d’un traumatisme crânien à crâne fermé (figure 2A) à la tête de la souris sur le côté droit, comme indiqué à la figure 2B.
- Préparation avant la chirurgie
- Équipement chirurgical en autoclave, y compris des ciseaux ordinaires, un pied à coulisse chirurgical, des ciseaux chirurgicaux à ressort, des pinces chirurgicales, des pinces à moustiques, des pièces de poteau de tête, de la gaze et des applicateurs à embout en coton.
- Pesez et notez le poids corporel de la souris 2 h avant l’opération. Pour minimiser l’œdème cérébral lors de l’implantation de la fenêtre crânienne, injecter du phosphate sodique de dexaméthasone à une dose de 4,8 mg / kg [2 mg / mL, généralement ~ 70 μl (nécessité d’injecter à deux sites)] dans le muscle quadriceps à l’aide d’une seringue à insuline. Après l’injection de dexaméthasone, mais avant de commencer la chirurgie du traumatisme crânien, préparez les fenêtres en verre comme indiqué à l’étape 3.1 pour une utilisation ultérieure.
- Désinfectez l’appareil chirurgical et le matériel de TCC en utilisant de l’éthanol à 75 % et élargissez le champ chirurgical stérile jetable pour couvrir l’étage chirurgical sur la plate-forme stéréotaxique. Allumez l’appareil de chauffage et le moniteur de température en réglant la température cible à 37 °C.
- Ouvrez le robinet du réservoir d’oxygène et réglez le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Ouvrez l’appareil d’anesthésie et réglez la valeur du niveau d’isoflurane sur trois.
REMARQUE : L’oxygène pur à 100 % peut aider l’animal à survivre aux impacts du traumatisme crânien. - Placez la souris dans la chambre d’induction et laissez-la reposer pendant 5 minutes pour obtenir une anesthésie complète.
- Une fois que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence d’un réflexe de pincement de la queue), retirez la souris de la chambre d’induction et placez la tête de souris dans le cadre stéréotaxique.
- Placez le cône nasal de la tubulure d’anesthésie sur le museau de la souris.
- Maintenir l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 1,5 % mélangé à de l’oxygène pur à 100 % à un débit de 1 L/min jusqu’à la fin de la chirurgie. Vérifiez périodiquement la fréquence respiratoire et effectuez un pincement de la queue ou des orteils au moins toutes les 15 minutes tout au long de la chirurgie pour évaluer l’anesthésie appropriée. Ajustez la concentration d’isoflurane au besoin pour maintenir la profondeur d’anesthésie souhaitée.
- Chirurgie d’un traumatisme crânien
- Administrer de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) à l’aide de seringues à insuline jetables et appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.
- Retirez les poils du haut de la tête en les coupant avec des ciseaux 1, puis en appliquant un agent dépilatoire pendant 1 min.
ATTENTION : Ne pas appliquer le produit dépilatoire pendant plus de 3 min sur le cuir chevelu, car il s’agit d’un irritant cutané. Évitez de mettre de l’agent dépilatoire sur les yeux de la souris. - Nettoyez la peau du cuir chevelu en appliquant de la gaze et des applicateurs à embout de coton. Ensuite, désinfectez la peau, en utilisant d’abord de l’éthanol à 75%, puis de la bétadine. Répétez cette opération trois fois (c’est-à-dire à l’éthanol suivi de la bétadine), en laissant l’application finale de la bétadine sur la peau.
- Vérifiez à nouveau la profondeur de l’anesthésie pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence de réflexe de pincement de la queue). Tentez la peau avec une pince chirurgicale 3 et faites une incision médiane de 12 à 15 mm de long à partir d’environ 3 mm en arrière des yeux.
- Appliquez l’effet sur la peau sur les hémisphères gauche et droit du crâne à l’aide de ciseaux à ressort 2.
- Une fois le crâne exposé, retirez le périoste en frottant doucement avec un applicateur stérile à embout en coton et en rinçant avec une solution saline stérile.
- Inspectez visuellement l’état du crâne pour vous assurer qu’il est intact, à l’exception des deux petits trous, qui ont été faits pour la chirurgie d’injection de virus précédente.
- Séchez la zone du crâne et marquez le site d’impact du TCC aux coordonnées suivantes : 2,5 mm en arrière du Bregma et 2 mm latéralement de la suture sagittale vers la droite (Figure 2B).
- Retirez rapidement la souris du cadre stéréotaxique et placez la tête sur le coussin tampon sous le dispositif TBI.
- Alignez la pointe de l’impacteur avec le site d’impact marqué.
- Soulevez la colonne métallique en tirant sur la corde en nylon attachée à 15 cm au-dessus de la tête de la souris, puis relâchez-la, en laissant le poids tomber librement sur la tige du transducteur, qui est en contact avec le sommet du crâne à l’endroit du traumatisme crânien. Ne touchez pas la tête de la souris lors de l’impact du TBI.
- Déplacez la souris sur la couverture chauffante et placez-la sur le dos tout en surveillant l’état respiratoire.
- Une fois que la souris est passée d’une position couchée sur le dos à une position couchée, placez-la dans la chambre d’induction d’isoflurane pendant ~5 min avec 3 % d’isoflurane mélangé à de l’oxygène pur à 100 % à un débit de 1,5 L/min.
- Une fois que la souris est complètement sédatée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence d’un réflexe de pincement de la queue), répétez les étapes 2.3.9 à 2.3.14 pour obtenir un total de 10 impacts.
REMARQUE : Dix impacts de traumatismes crâniens ont été trouvés pour induire un phénotype robuste avec une faible mortalité des souris dans notre étude (données non encore publiées). Les paramètres peuvent être ajustés pour obtenir une gravité différente de la lésion cérébrale en augmentant ou en diminuant le nombre d’impacts et/ou la hauteur à partir de laquelle le poids est libéré. Tous les paramètres sont soumis à l’approbation de l’IACUC local. - Examinez le crâne au microscope chirurgical et retirez la souris de l’étude si une fracture du crâne s’est produite.
- Dans le cas d’une chirurgie simulée, suivez les mêmes procédures que celles décrites ci-dessus, y compris le placement de l’animal sous l’impacteur, mais sans lui infliger les effets du traumatisme crânien.
- Une fois que la souris est passée d’une position couchée sur le dos à une position couchée sur le ventre après le 10e impact du TCC, placez-la dans la chambre d’induction de l’isoflurane pendant ~5 min. Suivez les étapes 2.2.6 à 2.2.8 pour placer la tête de la souris sur le cadre stéréotaxique pour la chirurgie d’implantation de la fenêtre crânienne décrite ci-dessous.
3. Chirurgie d’implantation de la fenêtre crânienne
NOTE : Les étapes d’implantation de la fenêtre crânienne ci-dessous ont été adoptées de Goldey et al.9, et leurs spécifications du poteau de tête et du puits d’imagerie ont été appliquées ici.
- Préparation des fenêtres
REMARQUE : Terminez la préparation de la fenêtre à l’étape 2.2.2 avant de commencer la chirurgie du TCC. La fenêtre est constituée de deux lamelles de verre rondes (l’une de 3 mm et l’autre de 5 mm de diamètre, comme l’indique la figure 2C) qui sont reliées entre elles par un adhésif optique transparent, comme décrit ci-dessous.- Désinfectez les lamelles de verre en les immergeant dans de l’éthanol à 75 % pendant 15 min. Sortez les lamelles en verre de l’éthanol et laissez-les sécher sur une surface stérile (c’est-à-dire le couvercle d’une plaque stérile à 24 puits) pendant ~10 min.
- Remplissez une seringue à insuline de colle optique transparente tout en évitant la formation de bulles. Sous le microscope 1 (Table des matériaux) à un grossissement de 0,67x, placez une petite goutte (~1 μL) de colle optique au centre de la lamelle de 5 mm. Ensuite, placez immédiatement la lamelle de 3 mm sur le dessus et centrez-la avec la lamelle de 5 mm.
- Appliquez une pression douce à l’aide d’une pince fine pour étaler la colle uniformément. Jetez la vitre si une bulle ou un mur se forme autour de la lamelle de 3 mm.
- Pour durcir la colle, placez les lamelles dans une boîte UV pendant 150 s à une puissance de 20 x 100 μJ/cm2. Vérifiez que les deux lamelles sont bien collées, à l’aide de la pince 4, pour pousser doucement le côté de la lamelle de 3 mm. Si la lamelle bouge, remettez-la dans la boîte UV pendant 60 s supplémentaires. Rangez la fenêtre en verre dans une plaque stérile à 24 puits pour une utilisation ultérieure.
- Rugueux à la surface du crâne.
REMARQUE : À partir de là, effectuez toutes les étapes de la section 3 sous un microscope chirurgical. Commencez par 10x et ajustez au grossissement souhaité.- Percez doucement et lentement la surface du crâne à l’aide d’un foret en carbure FG4 à une faible vitesse de rotor (c’est-à-dire un numéro de sortie réglé sur ~1-2) pour enlever le périoste restant et créer une surface crânienne rugueuse, de sorte que le ciment dentaire se lie solidement au crâne. Un scalpel peut également être utilisé ici à la place d’une perceuse comme alternative.
- Utilisez une solution saline pour rincer et éliminer la poussière osseuse de la surface du crâne.
- Séparez les muscles.
REMARQUE : La séparation musculaire sert à augmenter la surface de l’os du crâne exposé qui servira de point de contact pour le ciment dentaire, assurant ainsi l’intégrité structurelle de l’implant. Cette étape de séparation musculaire expose généralement ~3 mm de la plaque crânienne temporale.- À environ 5 mm en arrière de l’œil, là où se trouve la suture reliant le crâne pariétal et temporal, insérez doucement les pointes fines fermées (pince #5/45) pour séparer les muscles latéraux du crâne, et déplacez doucement les pointes fermées dans la direction postérieure jusqu’à la suture lambdoïde.
- Séparez les muscles latéraux du côté où l’implantation de la fenêtre crânienne se produira.
REMARQUE : Veillez à ne pas séparer les muscles trop près de l’œil, pour éviter de blesser l’artère ophtalmique ; sinon, des saignements graves et persistants peuvent survenir. Ne séparez pas les muscles de l’os occipital, car la souris a besoin de ces muscles pour lever la tête. - Lavez les débris du site chirurgical à l’aide d’une solution saline et séchez la zone avec de la gaze. De la mousse de gel peut être appliquée sur le site chirurgical pour arrêter le saignement.
- Implantez la tige de tête.
- Utilisez une tige de tête en titane sur mesure (Figure 2D), décrite dans une publication précédente9, pour fixer solidement la tête de la souris lors de la chirurgie de craniotomie et pour l’imagerie à deux photons subséquente.
- À l’aide d’un marqueur et d’un pied à coulisse chirurgical, tracez la circonférence de la craniotomie sur le crâne propre et sec du côté droit. Le point central du cercle tracé est à 2,5 mm en arrière du Bregma et à 1,5 mm de la suture sagittale de l’hémisphère droit. Le diamètre du cercle tracé est d’environ 3,2 à 3,5 mm, légèrement plus grand que la lamelle de verre de 3 mm. Assurez-vous que le cercle de craniotomie peut couvrir les sites d’injection du virus (les deux trous faits lors de l’injection du virus peuvent être utilisés comme référence) et le site du TCC.
- Desserrez la barre auriculaire et faites pivoter la tête de manière à ce que le plan de la craniotomie soit parfaitement horizontal, puis serrez à nouveau la barre auriculaire.
- À l’aide du bâton de bois d’un applicateur à embout en coton, ajoutez deux petites gouttes de superglue sur les bords avant et arrière de la tête de tête.
- Positionnez la tige de tête en titane sur le centre de la craniotomie et ajustez-la rapidement pour qu’elle repose dans le même plan que celui où la fenêtre crânienne sera implantée. Appliquez une légère pression jusqu’à ce que la superglue soit sèche ; Cela prend généralement ~30 s.
- Préparez le ciment dentaire dans un plat de mélange en céramique pré-refroidi (en restant au moins 10 min dans un congélateur à -20 °C) : mélangez 300 mg de poudre de ciment, six gouttes de liquide de base rapide et une goutte de catalyseur, puis remuez le mélange jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé (~15 fois).
REMARQUE : Le ciment doit être pâteux. S’il est trop fin, ajoutez un peu plus de poudre de ciment. S’il est trop épais, incorporer le liquide de base rapide une goutte à la fois jusqu’à l’obtention d’une consistance pâteuse. - Appliquez rapidement une quantité généreuse de mélange de ciment dentaire sur le périmètre extérieur de la circonférence tracée et couvrez toute surface osseuse exposée. Cependant, ne couvrez pas le site de la craniotomie. Attendez ~15 min pour que le ciment dentaire sèche et durcisse avant de continuer.
- Relâchez la barre d’oreille et fixez la tige de tête au cadre métallique pour vous assurer que la tête est stable pour un perçage précis le long de la circonférence de craniotomie marquée. S’il y a du ciment sur le site de la craniotomie, utilisez le foret en carbure FG4 pour percer et retirer.
- Craniotomie
- Utilisez un pied à coulisse chirurgical pour vérifier le diamètre du cercle marqué, tel que défini à l’étape 3.4.2. Ajustez si nécessaire, de sorte que la fenêtre crânienne s’adapte parfaitement à l’intérieur de la craniotomie.
- À l’aide d’une perceuse dentaire électrique, gravez et amincissez le crâne le long de l’extérieur du cercle marqué, en utilisant d’abord une mèche en carbure FG4 (vitesse réglée sur une sortie ~9-10). Cela crée une « piste » à l’intérieur de laquelle amincir le crâne.
ATTENTION : Pour minimiser les blessures dues à la chaleur et obtenir une piste lisse, continuez à déplacer le foret. Ne percez pas au même endroit pendant plus de 2 s. - Périodiquement, arrêtez de forer et irriguez toute la zone avec une solution saline stérile, afin de réduire l’échauffement de la perceuse et d’éliminer la poussière d’os.
- Continuez à amincir le crâne à l’aide d’une mèche en carbure FG1/4, comme décrit à l’étape 3.5.2, jusqu’à ce que le crâne soit mince comme du papier et transparent.
REMARQUE : L’utilisation des deux mains pour tenir la perceuse peut faciliter le contrôle de la perceuse et éviter d’insérer le foret dans le cerveau. - Complétez l’éclaircissage du crâne à l’aide d’une mèche en carbure EF4. Lorsqu’une fissure se produit entre le lambeau osseux et l’os du crâne environnant, il y a parfois une libération de liquide céphalo-rachidien (LCR), indiquant que le crâne a été complètement percé.
- Continuez à éclaircir et à percer le reste du crâne le long de la piste. Évitez de percer à l’endroit où un système vasculaire évident traverse sous le crâne pour éviter les saignements.
- Insérez une pointe fine de pince (pince 1) ~0,5 mm à travers l’endroit fissuré et soulevez doucement le lambeau osseux vers le haut sans indenter le cerveau sous-jacent.
- Une fois le lambeau osseux retiré, irriguer la zone de craniotomie avec une solution saline. La surface du cerveau peut être de 1 à 2 mm plus haute que le bord de la craniotomie.
- À partir de cette étape, couvrez toujours le cerveau exposé avec une solution saline pour protéger le tissu cérébral.
- Des saignements peuvent survenir lors du soulèvement du lambeau osseux aux sites d’injection d’AAV d’origine en raison de l’adhérence tissulaire et de la croissance de la vascularisation après la chirurgie d’injection. Si cela se produit, appuyez doucement sur le site avec un applicateur à embout en coton sec pendant ~2 min (ou plus longtemps au besoin). De la mousse de gel peut être utilisée pour arrêter le saignement. N’utilisez pas de produits chimiques ou de pinces chauffantes pour arrêter le saignement, car cela pourrait causer des blessures.
- Utilisez la pince 1 pour retirer délicatement la matière arachnoïdienne visible.
- Fenêtre en verre d’implant
- Utilisez la pince chirurgicale 2 pour saisir la fenêtre en verre stérile, avec la lamelle en verre de 3 mm vers le bas. Placez et ajustez la fenêtre en verre au-dessus du site de la craniotomie pour vous assurer que la fenêtre peut s’adapter parfaitement au bord de la craniotomie. La lamelle en verre de 5 mm se trouve sur le dessus.
- Préparez le ciment dentaire comme suit : mélangez 100 mg de poudre de ciment, deux gouttes de liquide de base rapide et une goutte de catalyseur. Remuez le mélange jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé (~15 fois). Attendez ~6 min jusqu’à ce que le ciment devienne pâteux et épais. Si le ciment est trop fin, il peut s’infiltrer dans l’espace sous la fenêtre à l’étape 3.6.4 et obscurcir la fenêtre.
- En attendant que le ciment devienne pâteux et épais, appliquez une pression adéquate sur la fenêtre à l’aide d’un manipulateur stéréotaxique, pour vérifier que le crâne peut entrer en contact avec la vitre de manière sûre et serrée. Assurez-vous que le liquide de ciment dentaire de l’étape 3.6.4 n’atteindra pas l’espace sous le verre et ne masquera pas ainsi la fenêtre.
- Utilisez un pinceau applicateur de précision réglable pour ajouter une petite quantité de ciment le long du bord de la fenêtre afin de sceller la fenêtre en verre avec le crâne. Attendez ~10 min pour laisser le ciment sécher complètement, puis relâchez doucement et retirez le manipulateur au-dessus de la fenêtre. À partir de cette étape, il faut ~4 h pour terminer les 10 impacts du TCC et implanter la tête et la fenêtre crânienne.
- Coupez le ciment dentaire à l’aide de la perceuse dentaire avec une mèche en carbure FG4 s’il y a un excès de ciment recouvrant la fenêtre.
REMARQUE : Un excès de ciment autour de la fenêtre peut empêcher les lentilles d’objectif à deux photons de s’approcher de la surface de la fenêtre.
- Implanter le puits d’imagerie
REMARQUE : Un puits d’imagerie (Figure 2D) est un anneau en caoutchouc d’un diamètre extérieur de ~1,6 cm, qui correspond à la surface supérieure du poteau de tête et retient l’eau au-dessus de la fenêtre crânienne pour l’imagerie à deux photons.- Une fois l’implantation de la fenêtre terminée, percez les débris de ciment dentaire sur la surface supérieure du poteau de tête et nettoyez la zone à l’aide d’une gaze chirurgicale humide. Laissez sécher la zone pendant ~3 min.
- Utilisez un applicateur à embout en coton pour tremper une petite quantité de superglue et collez-la sur la surface supérieure de la tige de tête. Placez rapidement l’anneau en caoutchouc sur la tige de tête. Appliquez une pression moyenne sur l’anneau en caoutchouc pendant ~2 min pour assurer un contact étroit avec la tête d’affiche. Utilisez la superglue avec parcimonie, sinon elle peut adhérer à la vitre et obscurcir l’imagerie à deux photons.
- Administration d’analgésiques et d’antibiotiques
- Immédiatement après l’implantation du puits d’imagerie, mais avant d’arrêter l’isoflurane, administrer de la céfazoline [500 mg/kg (333 mg/mL, habituellement ~45 μL), par voie intramusculaire] et du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) à l’aide de seringues à insuline jetables.
- Après l’administration du médicament, arrêtez l’anesthésie, libérez la souris du cadre stéréotaxique et ramenez la souris dans sa cage d’origine, qui se trouve au-dessus d’une couverture chauffante.
- Surveillez de près la souris pendant ~15 min jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.
REMARQUE : Hébergez les souris individuellement, car elles peuvent mordre le puits d’imagerie en caoutchouc d’autres souris. Fournissez de la nourriture et de l’eau à la souris dans la cage pour qu’elle puisse y accéder ad libitum. - Administrer à nouveau de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) et du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) toutes les 8 h après la dose précédente jusqu’à 48 h après la chirurgie d’implantation de la fenêtre crânienne.
4. Imagerie intravitale à deux photons
- Utiliser le microscope 2 (Table des matériaux), équipé d’un laser multiphotonique cohérent accordable et d’un objectif à grossissement 20x (NA 1.0 ; immersion dans l’eau), pour l’imagerie intravitale18. Le filtre utilisé pour le signal EGFP est « BP 500-550 ».
- Préparez la souris à fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale.
- À partir du jour de la chirurgie (désigné comme jour 0), effectuez une imagerie à deux photons aux points de temps prévus après le traumatisme crânien. Placez la souris crânienne dans la chambre d’induction de l’anesthésie et administrez 3 % d’isoflurane mélangé à du gaz vecteur à un débit de 1,5 L/min pendant 5 min.
REMARQUE : Le gaz vecteur peut être soit de l’air ambiant, soit de l’oxygène à 100%. - Une fois que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que le rythme respiratoire est lent mais régulier à environ un cycle toutes les 2 s, associé à l’absence d’un réflexe de pincement de la queue), retirez la souris de la chambre d’induction et fixez rapidement la tige de tête à un support. Laissez reposer le torse de la souris sur une plaque ronde en plastique (19 cm de diamètre) équipée du support.
REMARQUE : Un coussinet chaud pour les mains a été placé sous le torse de la souris pour fournir un soutien thermique pendant l’imagerie intravitale. - Appliquez une pommade ophtalmique lubrifiante sur les yeux de la souris et placez le cône nasal de la tubulure d’anesthésie sur le museau de la souris. Maintenir l’anesthésie en utilisant de l’isoflurane à 1,5 % avec du gaz vecteur à un débit de 1 L/min.
- Vérifiez périodiquement la fréquence respiratoire et effectuez un pincement de la queue ou des orteils au moins toutes les 15 minutes tout au long de l’imagerie pour évaluer l’anesthésie appropriée. Ajustez la concentration d’isoflurane au besoin pour maintenir la profondeur d’anesthésie souhaitée.
- Alignez la tête de la souris pour vous assurer que la fenêtre crânienne se trouve directement sous la lentille de l’objectif à deux photons. Ajoutez un peu d’eau dans le puits d’imagerie au-dessus de la fenêtre crânienne. Abaissez l’objectif de manière à ce qu’il soit immergé dans l’eau.
- À partir du jour de la chirurgie (désigné comme jour 0), effectuez une imagerie à deux photons aux points de temps prévus après le traumatisme crânien. Placez la souris crânienne dans la chambre d’induction de l’anesthésie et administrez 3 % d’isoflurane mélangé à du gaz vecteur à un débit de 1,5 L/min pendant 5 min.
- Imagerie intravitale de souris fenêtre intracrânienne
- Allumez la lampe au mercure de l’oscilloscope. Visualisez d’abord le cerveau avec l’épifluorescence à travers l’oculaire.
REMARQUE : Le système vasculaire apparaît noir. Sélectionnez une zone où la fenêtre est dégagée. Désactivez l’épifluorescence, réglez la longueur d’onde du laser sur 860 nm pour le signal EGFP et ajustez le réglage du laser pour un signal optimal (c’est-à-dire lumineux mais pas saturé). - Définissez le mode de numérisation sur Image et le pas de ligne sur 1. Définissez le nombre de moyenne sur 16, la profondeur de bits sur 8 bits, le mode sur Line et la méthode sur Mean.
- Utilisez le modèle vasculaire comme « carte de référence » pour imager la même région du cerveau pour l’imagerie longitudinale ultérieure. Imagez le niveau superficiel (couche I, à moins de 100 μm de la surface méningée) pour trois plans où le système vasculaire cortical domine par un mode z-stack, avec un intervalle interplan de 10 μm, comme indiqué à la figure 3A.
- Imagez six plans à un niveau profond (couches IV et V, ~400 μm plus profond que le niveau superficiel), à travers un mode z-stack comme indiqué à la figure 3A, avec un intervalle interplan de 10 μm et une vitesse de balayage de 8.
- Après avoir terminé l’imagerie (~20 min par souris), arrêtez l’anesthésie, libérez la souris des cadres et remettez-la dans sa cage d’origine qui se trouve au-dessus d’une couverture chauffante. Surveillez la souris consécutivement jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire, ce qui prend généralement ~7 min.
- Imagez longitudinalement la souris au jour 0, 1 semaine et 4 mois après la chirurgie du traumatisme crânien.
- Allumez la lampe au mercure de l’oscilloscope. Visualisez d’abord le cerveau avec l’épifluorescence à travers l’oculaire.
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Representative Results
Comme preuve de concept pour ce protocole, des particules virales exprimant AAV-Syn1-EGFP ont été injectées dans le cortex cérébral de souris mâles TDP-43 Q331K/Q331K (fond C57BL/6J)19 à l’âge de 3 mois. Il est à noter que les animaux C57BL/6J de type sauvage peuvent également être utilisés, mais cette étude a été réalisée sur des souris TDP-43Q331K/Q331K car le laboratoire se concentre sur la recherche sur les maladies neurodégénératives. Une chirurgie du traumatisme crânien a été réalisée 4 semaines après l’injection d’AAV. Dans le même cadre chirurgical, le poteau de tête et la fenêtre crânienne ont été implantés. La souris a été imagée en série à l’aide d’un microscope à deux photons au jour 0, 1 semaine et 4 mois après la chirurgie du TCC (Figure 1). En général, la chirurgie d’injection a duré ~30 min, et la chirurgie du TCC a pris ~1 h par souris. Au cours de la chirurgie du traumatisme crânien, les souris ont généralement eu besoin de plus de temps pour passer d’une position couchée à une position couchée après des impacts ultérieurs, par rapport aux impacts initiaux. Par exemple, une souris peut avoir besoin de 2 minutes pour redresser sa position après le premier impact, mais de 10 minutes pour redresser sa position après le10e impact. Pour la chirurgie d’implantation de la fenêtre crânienne, ~3 h étaient généralement nécessaires pour effectuer toutes les étapes, mais prenaient plus de temps que nécessaire si des saignements persistants se produisaient. L’imagerie à deux photons nécessitait généralement 20 minutes par souris pour acquérir toutes les images. Pour la présente étude portant sur trois souris présentant l’expression de l’EGFP, les animaux n’ont pas montré de signes de fracture du crâne et ne sont pas morts pendant la chirurgie ou jusqu’à 4 mois après la chirurgie. Le taux de morbidité et de fracture du crâne était de 0 %. Ceci est cohérent avec le taux de mortalité relativement faible (<10 %) dans un modèle similaire d’induction d’un traumatisme crânien, mais sans implant de fenêtre crânienne 7,8.
Un dispositif de chute de poids (figure 2A), qui a déjà été signalé7,8, a été utilisé pour infliger des impacts de traumatisme crânien sur la tête de la souris du côté droit, comme l’indique la figure 2B. Un tube en plastique transparent (n° 5 de la figure 2A ; 60 cm de longueur et 1,4 cm de diamètre intérieur) a été solidement et verticalement fixé à un support métallique, et une colonne d’impact en plastique (n° 7 de la figure 2A ; 10 cm de longueur et 1,3 cm de diamètre, avec une pointe ronde plate de 2 mm de diamètre) a été placée dans le tube vertical. Un poids métallique de 50 g (n° 6 de la figure 2A) a été placé au-dessus de l’impacteur et attaché à l’aide d’une corde de nylon (n° 4 de la figure 2A). Un coussin tampon (n° 8 de la figure 2A ; 9 cm x 9 cm x 1 cm [longueur x largeur x profondeur], fait de mousse de polyéthylène et de gaze de coton) a été placé sous la tête de la souris pour amortir et absorber l’énergie de l’impact.
La fenêtre crânienne était constituée de deux lamelles de verre combinées par un adhésif optique (figure 2C), et la lamelle de verre de 3 mm de diamètre était le côté touchant la surface du cerveau. L’imagerie à deux photons a été réalisée à deux profondeurs différentes (Figure 3A) à partir de la surface du cerveau : 1) un niveau superficiel où la vascularisation corticale était abondante et avait un diamètre lumineux relativement grand qui apparaissait noir, mais avec des corps cellulaires positifs EGFP clairsemés ; et 2) un niveau plus profond où le système vasculaire était clairsemé et avait un petit diamètre lumineux, avec de nombreuses cellules positives à l’EGFP visibles.
À ~4 h (jour 0) après la chirurgie, l’imagerie à deux photons a été réalisée sur trois plans, avec un intervalle de 10 μm au niveau superficiel (couche I, à moins de 100 μm de la surface méningée) d’abord là où le système vasculaire est apparu noir (indiqué par les lignes rouges pointillées sur la figure 3B), et a été utilisé comme carte de référence pour la prochaine séance d’imagerie afin de localiser la région d’imagerie d’origine. À ce niveau superficiel, le système vasculaire cortical et les processus neuronaux étaient les structures prédominantes que l’on pouvait observer, tandis que les corps cellulaires positifs à l’EGFP étaient clairsemés. Après l’imagerie au niveau superficiel, la mise au point a été ajustée vers le bas de ~400 μm, plus profondément que le niveau superficiel, dans le cortex (couches IV et V) pour imager les corps cellulaires neuronaux positifs à l’EGFP. Les images ont été acquises à l’intérieur de six plans, avec un intervalle de 10 μm. L’expression de la protéine EGFP a été distribuée de manière diffuse dans tout le corps cellulaire, comme l’indique la figure 3C. Il y avait une apparition occasionnelle de certains puncta d’EGFP à l’extérieur des corps cellulaires, qui pourraient représenter des inclusions d’EGFP qui se sont formées au fil du temps dans les axones ou les dendrites. Ce protocole se traduit par une expression de l’AAV-SYN1-EGFP ~2-3 mm autour du site d’injection, qui peut être définie par l’analyse histologique des tissus post-mortem.
À 1 semaine et 4 mois après le traumatisme crânien, le schéma vasculaire observé au point temporel du jour 0 a été utilisé comme référence pour localiser la même région d’imagerie (Figure 3D,F). Le schéma vasculaire de la figure 3D,F est similaire à celui de la figure 3B. La procédure d’imagerie pour les 1 semaine et 4 mois post-TCC était la même que celle décrite ci-dessus pour le point temporel du jour 0, et l’expression de l’EGFP a été détectée dans tout le corps cellulaire comme auparavant (Figure 3E, G). L’intensité de fluorescence aux jours 0 et 4 mois était similaire aux niveaux superficiel et profond. Cependant, l’intensité de fluorescence à 1 semaine était inférieure à celle des jours 0 et 4 mois aux niveaux superficiel et profond, ce qui pourrait être dû à la répression traductionnelle rapportée pour d’autres modèles de TCC20. Notamment, la qualité des images à 4 mois par rapport au point temporel du jour 0 démontre que la fenêtre crânienne a conservé sa clarté et son intégrité, et que l’expression virale est toujours robuste 4 mois après la chirurgie pour une imagerie intravitale efficace. Comme l’EGFP s’exprime en tant que protéine relativement diffuse, les signaux de fluorescence peuvent être mieux résolus et discrets lorsque l’EGFP est fusionné à une protéine d’intérêt.
Figure 1 : Chronologie de ce protocole d’imagerie intravitale. Le protocole est initié par l’injection d’un virus. Le traumatisme crânien et la chirurgie de la fenêtre crânienne sont effectués au cours de la même séance chirurgicale à 2 à 4 semaines après l’injection du virus. L’imagerie intravitale est réalisée au jour 0, 1 semaine, 4 mois après le traumatisme crânien. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Diagrammes de l’appareil TBI, du site d’impact du TBI et de la préparation de la fenêtre. (A) Équipement pour le dispositif TBI de perte de poids. 1 : piédestal, 2 : support, 3 : pince réglable, 4 : corde en nylon, 5 : tunnel de chute de poids, 6 : colonne de poids en métal (50 g), 7 : impacteur, 8 : coussin tampon. (B) Un schéma de l’injection du virus et du site d’impact du traumatisme crânien, avec les coordonnées de 2,5 mm en arrière du Bregma et de 2 mm latéralement de la suture sagittale à droite. (C) Un schéma de préparation de la fenêtre en verre. Deux lamelles de verre de 3 mm et 5 mm de diamètre sont combinées à l’aide d’un adhésif optique. (D) Photos de la tête métallique et du puits d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Schéma des plans d’imagerie et des données d’image. (A) Plusieurs plans sont imagés à un niveau superficiel où se trouve le système vasculaire et à un niveau profond. Les images sont rassemblées comme suit : trois plans au niveau superficiel, où la vascularisation corticale et les processus neuronaux sont les structures prédominantes positives à l’EGFP, et six plans au niveau profond, où les corps cellulaires positifs à l’EGFP sont principalement observés, avec un intervalle de 10 μm entre les plans voisins. Chaque plan a une taille de 425,10 μm x 425,10 μm. (B) Image représentative d’un plan au niveau superficiel au point temporel du jour 0. Les lignes rouges en pointillés indiquent le contour du système vasculaire qui peut être utilisé comme référence pour localiser le lieu d’imagerie d’origine pour les points temporels suivants. (C) Image représentative d’un avion dans les profondeurs au point temporel du jour 0, peu après le traumatisme crânien. (D) Image représentative d’un avion au niveau superficiel au point de temps de 1 semaine. Les lignes rouges en pointillés indiquent le système vasculaire, semblable au contour du jour 0 de la figure 3B, ce qui confirme que l’imagerie à deux photons a été effectuée à un endroit similaire le jour 0 et la semaine 1 après le traumatisme crânien. (E) Image représentative au niveau profond à 1 semaine après le traumatisme crânien. (F) Identique à B et D, 4 mois après le traumatisme crânien. (G) Identique à C et E, 4 mois après le traumatisme crânien. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, l’injection d’AAV, l’administration d’un TBI et un poste de tête avec implantation de fenêtre crânienne ont été combinés pour une analyse d’imagerie longitudinale des neurones marqués à l’EGFP dans le cortex cérébral de la souris (couches IV et V) afin d’observer les effets du TBI sur les neurones corticaux. Cette étude note que le site du TCC choisi ici, au-dessus de l’hippocampe, offre une surface relativement plane et large pour l’implantation de la fenêtre crânienne. À l’inverse, le crâne est relativement étroit à l’avant de ce site, et il est donc difficile de s’assurer que la tête entrera effectivement en contact avec la surface du crâne. Bien que seul le modèle murin TDP-43Q331K/Q331K ait été utilisé dans cette étude, compte tenu des recherches du laboratoire axées sur la SLA et la FTD19, ce protocole devrait être applicable à la plupart des autres souches de souris. En plus de marquer les neurones comme décrit ici, diverses stratégies peuvent être utilisées pour marquer d’autres types de cellules pour l’imagerie intravitale. Une approche consiste à exprimer les protéines fluorescentes génétiquement codées d’une manière spécifique à la cellule, en utilisant le système de recombinaison Cre-Lox chez des souris génétiquement modifiées21. Une autre approche consiste à utiliser certains sérotypes viraux pour la transduction cellulaire spécifique de protéines fluorescentes génétiquement codées. L’administration spécifique au site peut être obtenue en effectuant l’injection intracrânienne à l’endroit souhaité dans le cerveau. L’efficacité et la facilité avec lesquelles on peut exprimer des protéines spécifiques à la cellule par transduction virale pour l’imagerie intravitale est un avantage par rapport à la création de modèles murins transgéniques.
Pour les protocoles chirurgicaux, il y a plusieurs étapes critiques qui doivent être effectuées avec soin. Lorsque l’on perce des trous sur le crâne pour l’injection du virus au début du protocole, il faut faire attention à ne pas endommager les tissus sous le crâne. Si des lésions tissulaires se produisent lors du perçage sur le crâne, il y aura une inflammation, une adhérence tissulaire et une angiogenèse autour du site de la blessure, augmentant ainsi le risque de saignement pendant la craniotomie pour l’implantation de la fenêtre crânienne. Pour l’administration du TCC avec le dispositif de perte de poids, la présente étude a placé un coussin sous la tête de la souris pour amortir la force d’impact du TCC et ainsi réduire le risque de fracture du crâne. Aucun mouvement évident de la tête sur les directions de rotation et l’accélération n’a été observé, ce qui soutient l’idée que ce modèle de TCC a un risque relativement faible de lésion axonale de diffusion. Il est intéressant de noter que Foda et al. ont utilisé un dispositif similaire de perte de poids pour construire une lésion crânienne à crâne fermé sur des rats, et un coussin en mousse souple plus grand (12 cm d’épaisseur) a été placé sous la tête du rat afin qu’il puisse facilement se déplacer en réponse à la force d’impact du TBI sur le sens de rotation avec accélération, entraînant ainsi une lésion axonale de diffusion22. L’un des avantages du modèle TBI de chute de poids par guidage par tube est que la gravité du traumatisme peut être modulée en modifiant la hauteur de chute de poids (c’est-à-dire une hauteur plus élevée pour une force plus importante) et/ou en répétant le nombre de fois que l’impact est délivré. Par exemple, Flierl et al. ont utilisé un dispositif de perte de poids similaire à celui de la présente étude pour induire un traumatisme crânien chez la souris ; le poids du métal était de 333 g, ce qui provoquait un traumatisme crânien léger lorsqu’il tombait d’une hauteur de 2 cm et un traumatisme crânien grave lorsqu’il tombait d’une hauteur de 3 cm23. L’étape de craniotomie avant l’implantation de la fenêtre doit également être effectuée avec soin, afin d’éviter d’endommager le tissu cérébral sous le crâne. Déplacer périodiquement le foret vers une autre région du crâne permet d’éviter de trop percer au même endroit, ce qui peut entraîner un échauffement excessif, des lésions tissulaires et des saignements ; De plus, l’irrigation fréquente avec une solution saline peut également refroidir le site de forage. Lors de l’implantation de la fenêtre en verre, il est important d’aligner le plan du verre de manière à ce qu’il soit parallèle au plan de la surface du crâne ; Une fenêtre bien ajustée à l’intérieur du crâne empêche la fuite du liquide de ciment dentaire dans l’espace entre la fenêtre et le cerveau.
Si la fenêtre est floue au jour 0 après la chirurgie du TCC, mais que des signaux fluorescents sont détectés, le ciment dentaire peut avoir pénétré dans l’espace entre la fenêtre et le cerveau, formant ainsi une couche de ciment qui recouvre la surface du cerveau et obscurcit l’émission de fluorescence. Dans cette situation, on peut enlever la fenêtre et le ciment dentaire en utilisant la méthode de perçage décrite à l’étape 3.5 du protocole, puis implanter une nouvelle fenêtre en verre sur le site d’origine, comme décrit en détail par Goldey et al.9. Si la fenêtre devient floue à une étape ultérieure du processus d’imagerie longitudinale, on peut tenter d’éliminer les débris potentiels en frottant doucement la fenêtre avec un applicateur à embout de coton. Si cela ne résout pas le problème, cela peut être dû à une repousse de l’os et des méninges sous la vitre. Dans ce cas, on peut retirer la fenêtre et percer pour retirer l’os repoussé et/ou séparer la pince à épiler et retirer les méninges, suivi de l’implantation d’une nouvelle fenêtre en verre sur le site d’origine, comme décrit par Goldey et al.9. Comme le montrent les résultats, l’expression et la fluorescence de l’EGFP sont robustes sur une période de ~4 mois après le TCC. On peut s’attendre à une diminution du signal de fluorescence au cours de la première semaine suivant le TCC, ce qui est probablement dû à la répression traductionnelle induite par le TCC qui provoque une réduction temporaire de la synthèse globale des protéines20.
Pour maintenir une qualité d’imagerie élevée et obtenir une imagerie dans plusieurs plans, les souris ont été anesthésiées à l’isoflurane pour limiter les mouvements. Cependant, il est important de noter que l’anesthésie peut affecter les résultats de l’étude. Par exemple, il a été rapporté que les souris sous anesthésie à l’isoflurane présentent une activité microgliale différente en réponse aux photodommages par rapport aux souris éveillées24. Pour l’imagerie à deux photons, la vitesse de balayage et le nombre de balayages pour la moyenne du signal (défini comme « nombre », sous « moyenne ») sont les principaux facteurs qui peuvent déterminer la résolution de l’image. Pour optimiser la résolution, il est possible de réduire la vitesse de balayage et d’augmenter le nombre de moyenne, cependant, une vitesse plus lente et un nombre de moyenne plus élevé augmentent le temps d’imagerie pour un champ de vision particulier et peuvent provoquer un blanchiment de la photo. La présente étude vise à réaliser une imagerie chronique à long terme sur le même animal au même endroit du cerveau. Afin d’éviter un éventuel photoblanchiment tout en obtenant une résolution suffisante, l’imagerie à deux photons a été réalisée à une vitesse de balayage de 8 avec un nombre moyen de 16.
Une autre approche de la craniotomie et de l’implantation d’une fenêtre en verre consiste à amincir le crâne, dans la mesure où il est transparent et « mince comme du papier » pour l’imagerie en direct25,26,27. La fenêtre crânienne mince permet de maintenir l’intégrité du crâne, et ainsi d’éviter l’inflammation induite par l’opération chirurgicale. Par conséquent, l’approche de la fenêtre crânienne mince peut être préférée pour l’imagerie en direct avec des marqueurs pertinents pour l’inflammation et/ou sur une période de temps relativement plus courte (c’est-à-dire ~ 14 jours après la chirurgie, comme indiqué25). Pour l’imagerie à long terme (c.-à-d. 4 mois, comme décrit ici) des processus neurodégénératifs chroniques, en plus d’évaluer les effets aigus d’un traumatisme crânien sur le même animal, il est recommandé d’utiliser une fenêtre en verre implantée par une méthode de craniotomie.
Comme mentionné dans l’introduction, l’imagerie intravitale présente plusieurs avantages notables pour l’étude de divers événements biologiques et pathologiques dans le cerveau des mammifères. Cependant, il existe également certaines limites de ce protocole. Par exemple, une lésion cérébrale contrecoup décrit la contusion cérébrale ou l’hématome éloigné, généralement opposé, de la force de contact au site28,29,30. Dans la présente étude, les effets du TCC ont été transmis au lobe pariétal ; On peut s’attendre à une blessure par contrecoup ventrale et inaccessible à l’imagerie intravitale. Une analyse histologique pourrait être utilisée comme approche complémentaire pour examiner plus en détail les phénotypes d’intérêt en dehors du site d’impact couvert par la fenêtre crânienne. De plus, la surexpression exogène de certaines protéines peut également induire une toxicité ou une pathologie. Dans la présente étude, des EGFP puncta occasionnels ont été observés, ce qui peut représenter des accumulations dues à une surexpression protéique. Par conséquent, il est recommandé d’inclure une protéine témoin négative (p. ex., EGFP ou RFP seul) dans le plan de l’étude pour tenir compte de cette possibilité, en particulier si la protéine d’intérêt est sujette à la formation de structures ponctuées. Le nombre de protéines que l’on peut étudier simultanément est limité par les lasers et les capacités du système à deux photons. Il peut être possible d’imager plus d’un fluorophore (p. ex., EGFP, RFP, etc.) par microscopie à deux photons, bien que les capacités de multiplexage avec les microscopes confocaux et à grand champ conventionnels permettent souvent d’analyser plus de protéines dans un seul échantillon de tissu. Enfin, il est important d’inclure un simulacre de contrôle qui reçoit les mêmes procédures que l’animal ayant subi un traumatisme crânien, à l’exception des impacts de perte de poids. La chirurgie d’implantation de la fenêtre crânienne est une opération invasive et peut provoquer des changements locaux, tels qu’une inflammation et une modification de la pression intracrânienne, ce qui pourrait affecter le processus de TCC. Un contrôle fictif aide l’expérimentateur à évaluer les phénotypes qui sont dus à l’impact par rapport aux interventions chirurgicales.
En résumé, ce protocole introduit une méthode permettant d’imager longitudinalement des protéines spécifiquement dans les neurones du cortex cérébral de la souris en réponse à un traumatisme crânien. Ce protocole peut être modifié pour analyser l’expression et la localisation de diverses protéines spécifiques à la cellule en réponse à un traumatisme crânien. L’objectif de ce protocole est de fournir une approche pour étudier les conséquences immédiates et à long terme des traumatismes crâniens dans le cerveau des mammifères.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’est déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Miguel Sena-Esteves de la Chan Medical School de l’Université du Massachusetts pour avoir fait don du virus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, et Debra Cameron de la Chan Medical School de l’Université du Massachusetts pour avoir dessiné le croquis du crâne des souris. Nous remercions également les membres actuels et passés des laboratoires Bosco, Schafer et Henninger pour leurs suggestions et leur soutien. Ces travaux ont été financés par le Département de la Défense (W81XWH202071/PRARP) à DAB, DS et NH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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