Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصوير داخل الجسم لتعبير البروتين الفلوري في الفئران المصابة بإصابة دماغية رضحية مغلقة الجمجمة ونافذة الجمجمة باستخدام مجهر ثنائي الفوتون

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64701
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Neurobiology, University of Massachusetts Chan Medical School

Summary

توضح هذه الدراسة تسليم إصابة دماغية رضحية متكررة للفئران وزرع متزامن لنافذة الجمجمة للتصوير اللاحق داخل الجسم ل EGFP المعبر عنه بالخلايا العصبية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون.

Abstract

الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية التصور الطولي للتعبير عن وتوطين بروتين مهم داخل أنواع معينة من خلايا دماغ الحيوان ، عند التعرض للمنبهات الخارجية. هنا ، يتم عرض إدارة إصابة الدماغ الرضحية المغلقة في الجمجمة (TBI) والزرع المتزامن لنافذة الجمجمة للتصوير الطولي اللاحق داخل الجسم في الفئران. يتم حقن الفئران داخل الجمجمة بفيروس مرتبط بالغدي (AAV) يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP) تحت محفز عصبي محدد. بعد 2 إلى 4 أسابيع ، تتعرض الفئران لإصابات الدماغ الرضية المتكررة باستخدام جهاز إنقاص الوزن فوق موقع حقن AAV. في نفس الجلسة الجراحية ، يتم زرع الفئران بعمود رأس معدني ثم نافذة زجاجية في الجمجمة فوق موقع تأثير إصابات الدماغ الرضية. يتم فحص التعبير والتوطين الخلوي ل EGFP باستخدام مجهر ثنائي الفوتون في نفس منطقة الدماغ المعرضة للصدمة على مدار أشهر.

Introduction

إصابات الدماغ الرضحية (TBI) ، والتي يمكن أن تنجم عن الإصابات الرياضية وتصادم المركبات والقتال العسكري ، هي مصدر قلق صحي في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي TBI إلى عجز فسيولوجي ومعرفي وسلوكي ، وإعاقة أو وفيات مدى الحياة 1,2. يمكن تصنيف شدة إصابات الدماغ الرضية على أنها خفيفة ومتوسطة وشديدة ، والغالبية العظمى منها خفيفة إصابات الدماغ الرضية (75٪ -90٪)3. من المعترف به بشكل متزايد أن إصابات الدماغ الرضية ، وخاصة التكرار لإصابات الدماغ الرضية ، يمكن أن تعزز تنكس الخلايا العصبية وتعمل كعوامل خطر للعديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ، والاعتلال الدماغي الرضحي المزمن (CTE)4،5،6. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنكس العصبي الناجم عن إصابات الدماغ الرضية لا تزال غير واضحة ، وبالتالي تمثل مجالا نشطا للدراسة. للحصول على نظرة ثاقبة حول كيفية استجابة الخلايا العصبية والتعافي من إصابات الدماغ الرضية ، يتم وصف طريقة لمراقبة البروتينات ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية ، وتحديدا داخل الخلايا العصبية ، عن طريق التصوير الطولي داخل الجسم في الفئران بعد إصابات الدماغ الرضية هنا.

تحقيقا لهذه الغاية ، توضح هذه الدراسة كيفية الجمع بين إجراء جراحي لإدارة إصابات الدماغ الرضية المغلقة في الجمجمة يشبه ما تم الإبلاغ عنه سابقا 7,8 ، جنبا إلى جنب مع إجراء جراحي لزرع نافذة الجمجمة للتصوير داخل المصب ، كما وصفه Goldey etal 9. والجدير بالذكر أنه ليس من الممكن زرع نافذة الجمجمة أولا ثم إجراء إصابات الدماغ الرضية في نفس المنطقة ، حيث من المحتمل أن يؤدي تأثير انخفاض الوزن الذي يحفز إصابات الدماغ الرضية إلى إتلاف النافذة والتسبب في ضرر لا يمكن إصلاحه للفأر. لذلك ، تم تصميم هذا البروتوكول لإدارة إصابات الدماغ الرضية ثم زرع نافذة الجمجمة مباشرة فوق موقع التأثير ، كل ذلك خلال نفس الجلسة الجراحية. تتمثل ميزة الجمع بين كل من إصابات الدماغ الرضية وزرع نافذة الجمجمة في جلسة جراحية واحدة في تقليل عدد المرات التي يخضع فيها الفأر لعملية جراحية. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح للمرء بمراقبة الاستجابة الفورية (أي على مقياس زمني للساعات) لإصابات الدماغ الرضية ، بدلا من زرع النافذة في جلسة جراحية لاحقة (أي التصوير الأولي الذي يبدأ على مقياس زمني من الأيام بعد إصابات الدماغ الرضية). توفر نافذة الجمجمة ومنصة التصوير داخل الجسم أيضا مزايا على مراقبة البروتينات العصبية بالطرق التقليدية مثل التلوين المناعي للأنسجة الثابتة. على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى عدد أقل من الفئران للتصوير داخل الجسم ، حيث يمكن دراسة نفس الفأر في نقاط زمنية متعددة ، على عكس مجموعات منفصلة من الفئران اللازمة لنقاط زمنية منفصلة. علاوة على ذلك ، يمكن مراقبة نفس الخلايا العصبية بمرور الوقت ، مما يسمح للمرء بتتبع أحداث بيولوجية أو مرضية محددة داخل نفس الخلية.

كدليل على المفهوم ، يتم توضيح التعبير الخاص بالخلايا العصبية لبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP) تحت مروج المشبك هنا10. يمكن توسيع هذا النهج ليشمل 1) أنواع مختلفة من خلايا الدماغ من خلال استخدام محفزات أخرى محددة من نوع الخلية ، مثل مروج البروتين الأساسي للمايلين (MBP) للخلايا قليلة التغصن ومحفز البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) للخلايا النجمية11 ، 2) البروتينات المستهدفة المختلفة ذات الأهمية عن طريق دمج جيناتها مع جين EGFP ، و 3) المشاركة في التعبير عن بروتينات متعددة تنصهر في فلوروفورات مختلفة. هنا ، يتم تعبئة EGFP والتعبير عنه عن طريق توصيل الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) من خلال الحقن داخل الجمجمة. يتم إعطاء إصابات الدماغ الرضية المغلقة باستخدام جهاز إنقاص الوزن ، يليه زرع نافذة الجمجمة. يتم تحقيق تصور EGFP العصبي من خلال نافذة الجمجمة ، باستخدام المجهر ثنائي الفوتون للكشف عن مضان EGFP في الجسم الحي. باستخدام ليزر الفوتون الثنائي ، من الممكن اختراق الأنسجة القشرية بشكل أعمق مع الحد الأدنى من التلف الضوئي ، مما يسمح بالتصوير الطولي المتكرر لنفس المناطق القشرية داخل فأر فردي لأيام وحتىأشهر 12،13،14،15. باختصار ، يهدف هذا النهج المتمثل في الجمع بين جراحة TBI والتصوير داخل الجسم إلى تعزيز فهم الأحداث الجزيئية التي تساهم في أمراض الأمراض التي يسببها TBI16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع البروتوكولات المتعلقة بالحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر الذي نشرته لجنة المجلس القومي للبحوث (الولايات المتحدة). تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان (UMMS) (تصريح رقم 202100057). باختصار ، كما هو موضح في مخطط الدراسة (الشكل 1) ، يتلقى الحيوان حقنة فيروس ، وإصابات الدماغ الرضية ، وزرع نافذة ، ثم التصوير داخل الجسم في تسلسل زمني.

ملاحظة: تمت إزالة الشروط التجارية. يرجى الرجوع إلى جدول المواد لمعرفة المعدات المحددة المستخدمة.

1. الحقن داخل الجمجمة من AAV باستخدام جهاز تجسيمي

  1. AAV (PHP.eB) -Syn1-EGFP
    1. استخدم عيار فيروسي من 1 × 1013 جينوم فيروسي لكل ملليلتر (vg / mL). يشير Syn1 إلى Synapsin1 ، وهو محفز خاص بالخلايا العصبية يسمح بالتعبير الفيروسي المقيد في الخلايا العصبية. يمكن تحضير الفيروس داخليا أو الاستعانة بمصادر خارجية.
  2. التحضير لجراحة الحقن التجسيمي لإدارة AAV
    1. مقص الأوتوكلاف العادي ، الفرجار الجراحي ، مقص الربيع الجراحي ، ملقط جراحي ، ملقط البعوض ، شاش ، قضيب ذو رأس قطني ، وحقنة زجاجية ميكرولتر.
    2. تعقيم منطقة الجراحة باستخدام 75٪ من الإيثانول. قم بتوسيع الستارة الجراحية المعقمة التي تستخدم لمرة واحدة لتغطية منطقة الجراحة على منصة التجسيم.
      ملاحظة: للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء جراحة الحقن ، استخدم جهاز تسخين منظم التغذية المرتدة.
    3. وزن وتسجيل وزن جسم الماوس.
    4. افتح صمام خزان الأكسجين واضبط تدفق الأكسجين على 1.5 لتر / دقيقة. افتح جهاز التخدير واضبط قيمة مستوى الأيزوفلوران على ثلاثة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الغاز الحامل إما هواء الغرفة أو أكسجين 100٪ في هذه الخطوة.
    5. ضع الماوس في غرفة الحث واتركه لمدة 5 دقائق لتحقيق التخدير الكامل.
    6. بمجرد تخدير الفأر بالكامل (أي معدلات التنفس البطيئة ولكن الثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وضع رأس الماوس في الإطار المجسم.
    7. ضع مخروط أنف أنبوب التخدير فوق خطم الفأر.
    8. الحفاظ على التخدير باستخدام 1.5٪ إيزوفلوران ، مع الغاز الناقل بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة حتى نهاية الجراحة. تحقق بشكل دوري من وتيرة التنفس ، وقم بقرص الذيل أو إصبع القدم كل 15 دقيقة على الأقل طوال الجراحة لتقييم التخدير المناسب. اضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الاقتضاء للحفاظ على عمق التخدير المطلوب.
    9. املأ حقنة ميكرولتر (10 ميكرولتر) بمحلول الفيروس. ثم ، ثبت المحقنة على مضخة الحاقن الدقيقة المتطابقة لجهاز التجسيم.
  3. جراحة الحقن
    1. تطبيق البوبرينورفين (1 ملغ/كغ، تحت الجلد) باستخدام حقنة أنسولين يمكن التخلص منها وتطبيق مرهم مزلق للعين على عيني الفأر.
    2. إزالة الشعر من فروة الرأس في أعلى الرأس عن طريق التشذيب بالمقص العادي 1.
    3. نظف جلد فروة الرأس باستخدام أدوات التطبيق ذات الشاش والقطن. تطهير الجلد باستخدام 75٪ من الإيثانول أولا ثم البيتادين. كرر هذا ثلاث مرات (أي الإيثانول متبوعا بالبيتادين) ، مع ترك التطبيق النهائي للبيتادين على الجلد.
    4. أعد التحقق من عمق التخدير للتأكد من أن الفأر مخدر بالكامل (أي معدلات تنفس بطيئة ولكن ثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل). قم بعمل شق ~ 1 سم باستخدام مقص عادي 2 على طول خط الوسط لفضح الجمجمة الجدارية اليمنى ، وقم بإزالة السمحاق باستخدام قضيب ذو رأس قطني.
    5. ضع علامة على نقطتين على الجمجمة باستخدام قلم تحديد عند هذه الإحداثيات: النقطة A: 2.5 مم خلف Bregma و 1 مم جانبي لخط الوسط فوق نصف الكرة الأيمن. النقطة B: 2.5 مم خلف Bregma و 2 مم جانبي لخط الوسط فوق نصف الكرة الأيمن.
    6. احفر ثقبين بعناية عبر الجمجمة عند الإحداثيات المحددة باستخدام مثقاب أسنان كهربائي مع لقمة كربيد EF4 دقيقة.
      ملاحظة: احرص على عدم إتلاف أنسجة المخ.
    7. اضبط الإطار التجسيمي لمحاذاة طرف إبرة حقنة الميكرولتر مع فتحة الجمجمة التي تكون جانبية بمقدار 1 مم إلى خط الوسط.
    8. اخفض إبرة المحقنة للمس سطح الدماغ ، ثم اضبط هذا الموقع كنقطة الصفر (للمحور z). اخفض طرف الإبرة في قشرة الدماغ إلى عمق 0.5 مم ، وغرس ببطء 1 ميكرولتر من محلول الفيروس بسرعة 200 نانولتر / دقيقة.
    9. انتظر 5 دقائق بعد حقن محلول الفيروس بالكامل في أنسجة المخ قبل سحب الإبرة لمنع ارتجاع المحلول.
    10. اسحب إبرة الحقنة ببطء. كرر الحقن في الموقع الآخر. خياطة الشق بخياطة جراحية معقمة غير قابلة للامتصاص (مقياس 6-0).
    11. تطبيق سيفازولين [500 ملغ/كغ (333 ملغ/مل، عادة ~45 ميكرولتر)، في العضل]، وميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) بعد الجراحة بينما لا يزال الحيوان مخدرا.
    12. حرر الماوس من الإطار التجسيمي وتوقف عن التخدير. ضع الماوس في قفص نظيف فوق بطانية التدفئة ، وراقب الحيوان حتى يصبح متنقلا (حوالي 15 دقيقة). ثم نقل إلى قفص المنزل.
    13. يجب تطبيق البوبرينورفين (1 ملغ/ كغ، تحت الجلد) وميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) مرة أخرى عند 8 ساعات، 16 ساعة، و24 ساعة على التوالي، بعد حقن البوبرينورفين الأول.
      ملاحظة: في 2-4 أسابيع بعد حقن الفيروس ، يتلقى الفأر إصابات الدماغ الرضية وزرع نافذة الجمجمة في نفس موقع حقن AAV.

2. إعطاء تحريض TBI المتكرر

ملاحظة: تم تعديل معلمات TBI من التقارير السابقة 7,8 ، حيث تم تسليم تأثير TBI مرة واحدة. يطبق البروتوكول هنا نفس المعلمة ، باستثناء زيادة رقم التأثير الإجمالي إلى 10.

  1. معدات TBI
    1. استخدم جهازا محمولا مصمما خصيصا لإدارة TBI مغلق الجمجمة (الشكل 2A) إلى رأس الماوس على الجانب الأيمن ، كما هو موضح في الشكل 2B.
  2. التحضير قبل الجراحة
    1. معدات جراحة الأوتوكلاف ، بما في ذلك المقص العادي ، والفرجار الجراحي ، ومقص الربيع الجراحي ، والملقط الجراحي ، وملقط البعوض ، وقطع عمود الرأس ، والشاش ، وأدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية.
    2. وزن وتسجيل وزن جسم الفأر 2 ساعة قبل الجراحة. لتقليل وذمة الدماغ أثناء زرع نافذة الجمجمة ، حقن ديكساميثازون فوسفات الصوديوم بجرعة 4.8 ملغ / كغ [2 ملغ / مل ، عادة ~ 70 ميكرولتر (تحتاج إلى الحقن في موقعين)] في عضلة رباعية الرؤوس باستخدام حقنة الأنسولين. بعد حقن ديكساميثازون ، ولكن قبل البدء في جراحة TBI ، قم بإعداد النوافذ الزجاجية كما هو موضح في الخطوة 3.1 لاستخدامها لاحقا.
    3. تطهير المرحلة الجراحية ومعدات إصابات الدماغ الرضية باستخدام 75٪ من الإيثانول ، وتوسيع الستارة الجراحية المعقمة التي تستخدم لمرة واحدة لتغطية مرحلة الجراحة على المنصة المجسمة. قم بتشغيل جهاز التسخين ومراقبة درجة الحرارة ، واضبط درجة الحرارة المستهدفة على 37 درجة مئوية.
    4. افتح صمام خزان الأكسجين واضبط تدفق الأكسجين على 1.5 لتر / دقيقة. افتح جهاز التخدير واضبط قيمة مستوى الأيزوفلوران على ثلاثة.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد الأكسجين النقي بنسبة 100٪ الحيوان على النجاة من تأثيرات إصابات الدماغ الرضية.
    5. ضع الماوس في غرفة الحث واتركه لمدة 5 دقائق لتحقيق التخدير الكامل.
    6. بمجرد تخدير الفأر بالكامل (أي معدلات التنفس البطيئة ولكن الثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وضع رأس الماوس في الإطار المجسم.
    7. ضع مخروط أنف أنبوب التخدير فوق خطم الفأر.
    8. الحفاظ على التخدير باستخدام 1.5٪ إيزوفلوران ممزوج بأكسجين نقي 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة حتى نهاية الجراحة. تحقق بشكل دوري من وتيرة التنفس ، وقم بقرص الذيل أو إصبع القدم كل 15 دقيقة على الأقل طوال الجراحة لتقييم التخدير المناسب. اضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الاقتضاء للحفاظ على عمق التخدير المطلوب.
  3. جراحة إصابات الدماغ الرضية
    1. تطبيق البوبرينورفين (1 ملغ/كغ، تحت الجلد) باستخدام محاقن الأنسولين التي تستخدم لمرة واحدة وتطبيق مرهم العيون على عيون الفأر.
    2. قم بإزالة الشعر من أعلى الرأس عن طريق التشذيب بالمقص 1 ، ثم تطبيق عامل إزالة الشعر لمدة دقيقة واحدة.
      تنبيه: لا تضع منتج عامل إزالة الشعر لأكثر من 3 دقائق على فروة الرأس ، لأنه مهيج للجلد. تجنب وضع أي عامل مزيل للشعر على عيون الفأر.
    3. نظف جلد فروة الرأس عن طريق وضع أدوات تطبيق الشاش والقطن. ثم قم بتطهير الجلد باستخدام 75٪ إيثانول أولا ثم بيتادين. كرر هذا ثلاث مرات (أي الإيثانول متبوعا بالبيتادين) ، مع ترك التطبيق النهائي للبيتادين على الجلد.
    4. أعد التحقق من عمق التخدير للتأكد من أن الفأر مخدر بالكامل (أي معدلات تنفس بطيئة ولكن ثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل). خيمة الجلد بالملقط الجراحي 3 ، وجعل شق خط الوسط بطول 12-15 مم يبدأ حوالي 3 مم من الخلف من العينين.
    5. استئصال الجلد على نصف الكرة الأيسر والأيمن من الجمجمة باستخدام مقص الربيع 2.
    6. بمجرد انكشاف الجمجمة ، قم بإزالة السمحاق عن طريق فركه برفق باستخدام قضيب معقم ذي رأس قطني وغسله بمحلول ملحي معقم.
    7. فحص حالة الجمجمة بصريا للتأكد من أنها سليمة ، باستثناء الثقبين الصغيرين ، اللذين تم إجراؤهما لجراحة حقن الفيروس السابقة.
    8. جفف منطقة الجمجمة وحدد موقع ارتطام TBI عند الإحداثيات التالية: 2.5 مم خلف Bregma و 2 مم جانبي من الدرز السهمي إلى اليمين (الشكل 2B).
    9. قم بإزالة الماوس بسرعة من الإطار التجسيمي وضع الرأس على وسادة العازلة أسفل جهاز TBI.
    10. قم بمحاذاة طرف الصدمة مع موقع الارتطام المحدد.
    11. ارفع العمود المعدني عن طريق سحب خيط النايلون المربوط إلى 15 سم فوق رأس الماوس ثم حرره ، مما يسمح للوزن بالسقوط بحرية على قضيب محول الطاقة ، الذي يتلامس مع قمة الجمجمة في موقع TBI. لا تلمس رأس الماوس عند توصيل تأثير TBI.
    12. حرك الماوس على بطانية التدفئة ، وضعه على ظهره أثناء مراقبة حالة التنفس.
    13. بمجرد أن يصحح الماوس نفسه من وضع الاستلقاء إلى وضعية الانبطاح ، ضع الماوس في غرفة تحريض الأيزوفلوران لمدة ~ 5 دقائق مع 3٪ إيزوفلوران ممزوج بأكسجين نقي 100٪ بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة.
    14. بمجرد تخدير الفأر بالكامل (أي معدلات التنفس البطيئة ولكن الثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، كرر الخطوات 2.3.9-2.3.14 لتحقيق ما مجموعه 10 تأثيرات.
      ملاحظة: تم العثور على عشرة تأثيرات TBI للحث على النمط الظاهري القوي مع انخفاض معدل وفيات الفئران في دراستنا (البيانات لم تنشر بعد). يمكن تعديل المعلمات لتحقيق شدة مختلفة من إصابات الدماغ عن طريق زيادة أو تقليل عدد التأثيرات و / أو الارتفاع الذي يتم إطلاق الوزن منه. تخضع جميع المعلمات لموافقة IACUC المحلية.
    15. افحص الجمجمة تحت المجهر الجراحي ، وقم بإزالة الفأر من الدراسة إذا حدث كسر في الجمجمة.
    16. بالنسبة للجراحة الوهمية ، اتبع نفس الإجراءات الموضحة أعلاه ، بما في ذلك وضع الحيوان تحت الصدمة ، ولكن دون تقديم تأثيرات إصابات الدماغ الرضية.
    17. بعد حقوق الماوس نفسه من وضع ضعيف إلى وضع الانبطاح بعد تأثير TBI 10 ، ضع الماوس في غرفة تحريض isoflurane لمدة ~ 5 دقائق. اتبع الخطوات 2.2.6-2.2.8 لوضع رأس الماوس على الإطار التجسيمي لجراحة زرع نافذة الجمجمة الموضحة أدناه.

3. جراحة زرع نافذة الجمجمة

ملاحظة: تم اعتماد خطوات زرع نافذة الجمجمة أدناه من Goldey et al.9 ، وتم تطبيق مواصفاتها الخاصة بعمود الرأس وبئر التصوير هنا.

  1. إعداد النافذة
    ملاحظة: أكمل إعداد النافذة في الخطوة 2.2.2 قبل البدء في جراحة إصابات الدماغ الرضية. النافذة مصنوعة من غطاءين زجاجيين دائريين (أحدهما بقطر 3 مم والآخر 5 مم ، كما هو موضح في الشكل 2C) مرتبطان ببعضهما البعض بواسطة مادة لاصقة بصرية شفافة ، كما هو موضح أدناه.
    1. عقم أغطية الزجاج عن طريق غمرها في 75٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة. أخرج الغطاء الزجاجي من الإيثانول واتركه حتى يجف على سطح معقم (أي غطاء صفيحة معقمة من 24 بئرا) لمدة ~ 10 دقائق.
    2. املأ حقنة الأنسولين بغراء بصري شفاف مع تجنب تكوين الفقاعة. تحت المجهر 1 (جدول المواد) عند تكبير 0.67x ، ضع قطرة صغيرة (~ 1 ميكرولتر) من الغراء البصري في وسط غطاء 5 مم. بعد ذلك ، ضع على الفور غطاء الغطاء مقاس 3 مم في الأعلى ، وقم بتوسيطه باستخدام غطاء 5 مم.
    3. اضغط برفق باستخدام ملقط ناعم لنشر الغراء بالتساوي. تخلص من النافذة الزجاجية إذا تشكلت فقاعة أو جدار حول انزلاق الغطاء مقاس 3 مم.
    4. لعلاج الغراء ، ضع أغطية الأغطية في صندوق الأشعة فوق البنفسجية لمدة 150 ثانية بقوة 20 × 100 μJ / سم2. تأكد من أن سلكي الغطاء مرتبطان بإحكام ، باستخدام ملقط 4 لدفع جانب الانزلاق 3 مم برفق. إذا تحرك غطاء الغطاء ، فضعه مرة أخرى في صندوق الأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية إضافية. قم بتخزين النافذة الزجاجية في لوحة معقمة من 24 بئرا لاستخدامها لاحقا.
  2. خشن سطح الجمجمة.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا ، نفذ جميع الخطوات الواردة في القسم 3 تحت المجهر الجراحي. ابدأ ب 10x ، واضبط على التكبير المطلوب.
    1. قم بحفر سطح الجمجمة برفق وببطء باستخدام لقمة كربيد FG4 بسرعة دوارة منخفضة (أي رقم الإخراج مضبوط على ~ 1-2) لإزالة السمحاق المتبقي وإنشاء سطح جمجمة خشن ، بحيث يرتبط الأسمنت السني بإحكام مع الجمجمة. يمكن أيضا استخدام المشرط هنا بدلا من المثقاب كبديل.
    2. استخدم محلول ملحي لطرد وإزالة غبار العظام من سطح الجمجمة.
  3. افصل العضلات.
    ملاحظة: يعمل فصل العضلات على زيادة مساحة سطح عظم الجمجمة المكشوف الذي سيكون بمثابة نقطة اتصال لأسمنت الأسنان ، وبالتالي ضمان السلامة الهيكلية للزرع. عادة ما تكشف خطوة فصل العضلات هذه ~ 3 مم من صفيحة الجمجمة الصدغية.
    1. في حوالي 5 مم خلف العين ، حيث يوجد الخيط الذي يربط الجمجمة الجدارية والصدغية ، أدخل الأطراف الدقيقة المغلقة برفق (# 5/45 ملقط) لفصل العضلات الجانبية عن الجمجمة ، وحرك الأطراف المغلقة برفق في الاتجاه الخلفي حتى خياطة لامبويد.
    2. افصل العضلات الجانبية على الجانب الذي سيحدث فيه زرع نافذة الجمجمة.
      ملاحظة: احرص على عدم فصل العضلات قريبة جدا من العين, لتجنب إصابة الشريان العيني; خلاف ذلك ، قد يحدث نزيف حاد ومستمر. لا تفصل العضلات عن العظم القذالي ، لأن الفأر يتطلب هذه العضلات لرفع رأسه.
    3. اغسل الحطام من موقع الجراحة باستخدام محلول ملحي وجفف المنطقة بالشاش. يمكن تطبيق رغوة الجل على موقع الجراحة لوقف النزيف.
  4. زرع عمود الرأس.
    1. استخدم عمود رأس من التيتانيوم مصنوع خصيصا (الشكل 2 د) ، الموصوف في منشور سابق9 ، لإصلاح رأس الماوس بشكل آمن أثناء إجراء جراحة حج القحف ، وللتصوير اللاحق ثنائي الفوتون.
    2. استخدم قلم تحديد وفرجار جراحي لتتبع محيط حج القحف على الجمجمة النظيفة والجافة على الجانب الأيمن. النقطة المركزية للدائرة المتتبعة هي 2.5 مم خلف Bregma و 1.5 مم من الدرز السهمي في نصف الكرة الأيمن. يبلغ قطر الدائرة المتتبعة حوالي 3.2-3.5 مم ، وهو أكبر قليلا من الغطاء الزجاجي 3 مم. تأكد من أن دائرة حج القحف يمكن أن تغطي مواقع حقن الفيروس (يمكن استخدام الثقبين اللذين تم إجراؤهما أثناء حقن الفيروس كمرجع) وموقع TBI.
    3. قم بفك شريط الأذن وتدوير الرأس بحيث تكون طائرة حج القحف أفقية تماما ، ثم شد شريط الأذن مرة أخرى.
    4. استخدمي العصا الخشبية لأداة التطبيق ذات الرأس القطني لإضافة قطرتين صغيرتين من الغراء الفائق إلى الحافة الأمامية والخلفية لعمود الرأس.
    5. ضع عمود الرأس المصنوع من التيتانيوم فوق مركز حج القحف ، واضبطه بسرعة للراحة داخل نفس المستوى حيث سيتم زرع نافذة الجمجمة. ضع ضغطا خفيفا حتى يجف الغراء الفائق ؛ هذا عادة ما يستغرق ~ 30 ثانية.
    6. تحضير الأسمنت السني في طبق خلط سيراميك مبرد مسبقا (البقاء لمدة 10 دقائق على الأقل في الفريزر -20 درجة مئوية): يمزج 300 مجم من مسحوق الأسمنت وست قطرات من السائل الأساسي السريع وقطرة واحدة من المحفز ، ثم يقلب الخليط حتى يمتزج جيدا (~ 15 مرة).
      ملاحظة: يجب أن يكون الأسمنت فطيرا. إذا كان رقيقا جدا ، حرك القليل من مسحوق الأسمنت. إذا كان سميكا جدا ، قلبي في سائل قاعدة سريعة قطرة واحدة في كل مرة حتى يتحقق تناسق فطيرة.
    7. ضع كمية وفيرة من خليط الأسمنت السني بسرعة على المحيط الخارجي للمحيط المتتبع ، وقم بتغطية أي سطح عظمي مكشوف. ومع ذلك ، لا تغطي موقع حج القحف. اترك ~ 15 دقيقة حتى يجف الأسمنت السني ويتصلب قبل المتابعة.
    8. حرر قضيب الأذن وقم بتثبيت عمود الرأس بالإطار المعدني للتأكد من أن الرأس مستقر للحفر الدقيق على طول محيط حج القحف المحدد. إذا كان هناك أسمنت فوق موقع حج القحف ، فاستخدم لقمة كربيد FG4 لحفرها وإزالتها.
  5. حج القحف
    1. استخدم الفرجار الجراحي للتحقق من قطر الدائرة المحددة ، كما هو محدد في الخطوة 3.4.2. اضبط حسب الضرورة ، بحيث تتناسب نافذة الجمجمة بشكل مريح داخل حج القحف.
    2. باستخدام مثقاب الأسنان الكهربائي ، قم بحفر الجمجمة ورقفها على طول الجزء الخارجي من الدائرة المحددة ، باستخدام بت كربيد FG4 أولا (تم ضبط السرعة على الإخراج ~ 9-10). هذا يخلق "مسارا" يتم من خلاله ترقق الجمجمة.
      تنبيه: لتقليل الإصابة الحرارية وتحقيق مسار سلس ، استمر في تحريك لقمة الحفر. لا تحفر نفس المكان لأكثر من 2 ثانية.
    3. بشكل دوري ، توقف عن الحفر وقم بري المنطقة بأكملها بمحلول ملحي معقم ، لتقليل التسخين من المثقاب وغسل غبار العظام.
    4. استمر في ترقق الجمجمة باستخدام لقمة كربيد FG1 / 4 ، كما هو موضح في الخطوة 3.5.2 ، حتى تصبح الجمجمة رقيقة وشفافة.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي استخدام اليدين لحمل المثقاب إلى تسهيل التحكم في المثقاب وتجنب إدخال لقمة الحفر في الدماغ.
    5. أكمل ترقق الجمجمة باستخدام بت كربيد EF4. عندما يحدث صدع بين السديلة العظمية وعظم الجمجمة المحيط ، في بعض الأحيان يكون هناك إطلاق للسائل الشوكي الدماغي (CSF) ، مما يشير إلى أن الجمجمة قد تم حفرها بالكامل.
    6. استمر في التخفيف والحفر عبر بقية الجمجمة على طول المسار. تجنب الحفر من خلال النقطة التي تتقاطع فيها الأوعية الدموية الواضحة تحت الجمجمة لمنع النزيف.
    7. أدخل طرف ملقط ناعم (ملقط 1) ~ 0.5 مم من خلال المكان المتصدع ، وارفع رفرف العظم برفق لأعلى دون وضع مسافة بادئة للدماغ الأساسي.
    8. بعد إزالة رفرف العظام ، قم بري منطقة حج القحف بالمحلول الملحي. يمكن أن يكون سطح الدماغ أعلى بمقدار 1-2 مم من حافة حج القحف.
    9. بدءا من هذه الخطوة ، قم دائما بتغطية الدماغ المكشوف بمحلول ملحي لحماية أنسجة المخ.
    10. قد يحدث النزيف عند رفع رفرف العظم في مواقع حقن AAV الأصلية بسبب التصاق الأنسجة ونمو الأوعية الدموية بعد جراحة الحقن. إذا حدث هذا ، فاضغط برفق على الموقع باستخدام قضيب قطني جاف لمدة ~ 2 دقيقة (أو أطول حسب الحاجة). يمكن استخدام رغوة الجل لوقف النزيف. لا تستخدم المواد الكيميائية أو ملقط التدفئة لوقف النزيف ، لأن هذا يمكن أن يسبب إصابة.
    11. استخدم الملقط 1 لإزالة المادة العنكبوتية المرئية برفق.
  6. نافذة زجاجية مزروعة
    1. استخدم الملقط الجراحي 2 لالتقاط النافذة الزجاجية المعقمة ، مع توجيه الغطاء الزجاجي مقاس 3 مم لأسفل. ضع النافذة الزجاجية واضبطها فوق موقع حج القحف للتأكد من أن النافذة يمكن أن تتناسب بشكل مريح مع حافة حج القحف. الغطاء الزجاجي 5 مم في الأعلى.
    2. تحضير الأسمنت الأسنان على النحو التالي: الجمع بين 100 ملغ من مسحوق الأسمنت ، وقطرتين من السائل الأساسي السريع ، وقطرة واحدة من المحفز. حرك الخليط حتى يمتزج جيدا (~ 15 مرة). انتظر ~ 6 دقائق حتى يصبح الأسمنت فطيرة وسميكة. إذا كان الأسمنت رقيقا جدا ، فقد يتسرب إلى المساحة الموجودة أسفل النافذة في الخطوة 3.6.4 ويحجب النافذة.
    3. أثناء انتظار أن يصبح الأسمنت فطيرة وسميكة ، قم بتطبيق كمية كافية من الضغط على النافذة من خلال مناور تجسيمي ، للتحقق من أن الجمجمة يمكنها الاتصال بالنافذة الزجاجية بشكل آمن وإحكام. تأكد من أن سائل الأسمنت السني في الخطوة 3.6.4 لن يصل إلى المساحة الموجودة أسفل الزجاج وبالتالي يحجب النافذة.
    4. استخدم فرشاة تطبيق دقيقة قابلة للتعديل لإضافة كمية صغيرة من الأسمنت بجانب حافة النافذة لإغلاق النافذة الزجاجية بالجمجمة. انتظر لمدة ~ 10 دقائق حتى يجف الأسمنت تماما ، ثم حرر المناور برفق وقم بإزالته أعلى النافذة. اعتبارا من هذه الخطوة ، يستغرق الأمر ~ 4 ساعات لإنهاء تأثيرات 10 TBI وزرع عمود الرأس ونافذة الجمجمة.
    5. قم بقص الأسمنت السني باستخدام مثقاب الأسنان باستخدام لقمة كربيد FG4 إذا كان هناك أسمنت زائد يغطي النافذة.
      ملاحظة: قد يمنع الأسمنت المفرط حول النافذة العدسات الشيئية ثنائية الفوتون من الاقتراب من سطح النافذة.
  7. زرع بئر التصوير
    ملاحظة: بئر التصوير (الشكل 2D) عبارة عن حلقة مطاطية بقطر خارجي ~ 1.6 سم ، تتطابق مع السطح العلوي لعمود الرأس وتحمل الماء فوق نافذة الجمجمة للتصوير ثنائي الفوتون.
    1. بعد اكتمال عملية زرع النافذة ، قم بحفر حطام الأسمنت السني على السطح العلوي للعمود الأمامي ، ونظف المنطقة باستخدام شاش جراحي مبلل. اترك المنطقة تجف لمدة ~ 3 دقائق.
    2. استخدمي أداة تطبيق قطنية لغمس كمية صغيرة من الغراء الفائق ولصقها على السطح العلوي لعمود الرأس. ضع الحلقة المطاطية بسرعة على عمود الرأس. ضع ضغطا متوسطا على الحلقة المطاطية لمدة ~ 2 دقيقة لضمان الاتصال الوثيق بعمود الرأس. استخدم superglue باعتدال ، وإلا فإنه يمكن أن يلتصق بالنافذة الزجاجية ويحجب التصوير ثنائي الفوتون.
  8. إعطاء المسكنات والمضادات الحيوية
    1. مباشرة بعد زرع التصوير جيدا، ولكن قبل التوقف عن تناول الأيزوفلوران، يتم تطبيق سيفازولين [500 ملغ/كغ (333 ملغ/مل، عادة ~45 ميكرولتر)، في العضل]، وميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) باستخدام محاقن الأنسولين التي تستخدم لمرة واحدة.
    2. بعد تناول الدواء ، توقف عن التخدير ، وحرر الماوس من الإطار التجسيمي ، وأعد الماوس إلى قفصه المنزلي ، الموجود فوق بطانية التدفئة.
    3. راقب الماوس عن كثب لمدة ~ 15 دقيقة حتى يصبح متنقلا.
      ملاحظة: إيواء الفئران بشكل فردي ، لأنها قد تعض بئر التصوير المطاطي للفئران الأخرى. توفير الغذاء وهلام الماء بالقرب من الماوس في القفص للوصول إلى ad libitum.
    4. تطبيق البوبرينورفين (1 ملغ/كغ، تحت الجلد) وميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) مرة أخرى كل 8 ساعات بعد الجرعة السابقة حتى 48 ساعة بعد جراحة زرع نافذة الجمجمة.

4. التصوير ثنائي الفوتون داخل الجسم

  1. استخدم المجهر 2 (جدول المواد) ، المجهز بليزر متعدد الفوتونات متماسك قابل للضبط وهدف تكبير 20x (NA 1.0 ؛ غمر الماء) ، للتصوير داخل الجسم18. المرشح المستخدم لإشارة EGFP هو "BP 500-550".
  2. إعداد الماوس نافذة الجمجمة للتصوير داخل الجسم.
    1. بدءا من يوم الجراحة (المحدد في اليوم 0) ، قم بإجراء تصوير ثنائي الفوتون في نقاط زمنية مصممة بعد إصابات الدماغ الرضية. ضع فأرة النافذة القحفية في غرفة تحريض التخدير ، وقم بتطبيق 3٪ إيزوفلوران ممزوج بالغاز الناقل بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الغاز الناقل إما هواء الغرفة أو أكسجين 100٪.
    2. بمجرد تخدير الفأر بالكامل (أي معدلات التنفس البطيئة ولكن الثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وقم بتثبيت عمود الرأس بسرعة على قوس. دع جذع الماوس يوضع على صفيحة بلاستيكية مستديرة (قطرها 19 سم) مزودة بالحامل.
      ملاحظة: تم وضع وسادة دافئة يدويا أسفل جذع الماوس لتوفير الدعم الحراري أثناء التصوير داخل الجسم.
    3. ضع مرهم مزلق للعين على عيون الفأر وضع مخروط أنف أنبوب التخدير فوق خطم الفأر. الحفاظ على التخدير باستخدام 1.5٪ إيزوفلوران مع الغاز الناقل بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة.
    4. تحقق بشكل دوري من وتيرة التنفس ، وقم بقرص الذيل أو إصبع القدم كل 15 دقيقة على الأقل طوال التصوير لتقييم التخدير المناسب. اضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الاقتضاء للحفاظ على عمق التخدير المطلوب.
    5. قم بمحاذاة رأس الماوس للتأكد من أن نافذة الجمجمة تقع مباشرة أسفل العدسة الشيئية ثنائية الفوتون. أضف بعض الماء إلى التصوير فوق نافذة الجمجمة. خفض الهدف بحيث يتم غمرها في الماء.
  3. التصوير داخل الجسم لفئران النافذة داخل الجمجمة
    1. قم بتشغيل مصباح الزئبق النطاقي. عرض الدماغ مع epifluorescence من خلال العين أولا.
      ملاحظة: تظهر الأوعية الدموية باللون الأسود. حدد منطقة تكون فيها النافذة واضحة. قم بإيقاف تشغيل epifluorescence ، واضبط الطول الموجي لليزر على 860 نانومتر لإشارة EGFP ، واضبط إعداد الليزر للحصول على إشارة مثالية (أي ساطعة ولكن غير مشبعة).
    2. اضبط وضع المسح الضوئي على Frame وخطوة الخط على 1. اضبط متوسط الرقم على 16 ، وعمق البت على 8 بت ، والوضع على أنه خط ، والطريقة على أنها متوسط.
    3. استخدم نمط الأوعية الدموية ك "خريطة مرجعية" لتصوير نفس منطقة الدماغ للتصوير الطولي اللاحق. تخيل المستوى السطحي (الطبقة الأولى ، أقل من 100 ميكرومتر من سطح السحائي) لثلاث مستويات حيث تهيمن الأوعية الدموية القشرية من خلال وضع z-stack ، مع فاصل زمني بين المستويات يبلغ 10 ميكرومتر ، كما هو موضح في الشكل 3A.
    4. صورة ست طائرات على المستوى العميق (الطبقة الرابعة والخامسة ، ~ 400 ميكرومتر أعمق من المستوى السطحي) ، من خلال وضع z-stack كما هو موضح في الشكل 3A ، مع فاصل زمني بين المستويات يبلغ 10 ميكرومتر وسرعة مسح 8.
    5. بعد الانتهاء من التصوير (~ 20 دقيقة لكل ماوس) ، توقف عن التخدير ، وحرر الماوس من الإطارات ، وأعده إلى قفصه المنزلي الموجود فوق بطانية التدفئة. راقب الماوس على التوالي حتى يصبح متنقلا ، والذي يستغرق عادة ~ 7 دقائق.
    6. قم بتصوير الماوس طوليا في اليوم 0 و 1 أسبوع و 4 أشهر بعد جراحة إصابات الدماغ الرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كدليل على مفهوم هذا البروتوكول ، تم حقن الجسيمات الفيروسية التي تعبر عن AAV-Syn1-EGFP في قشرة الدماغ لذكور الفئران TDP-43 Q331K/ Q331K (خلفية C57BL / 6J) 19 في عمر 3 أشهر. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن أيضا استخدام الحيوانات البرية C57BL / 6J ، ولكن تم إجراء هذه الدراسة في الفئران TDP-43 Q331K/ Q331K لأن المختبر يركز على أبحاث الأمراض التنكسية العصبية. تم إجراء جراحة TBI بعد 4 أسابيع من حقن AAV. في نفس الإعداد الجراحي ، تم زرع عمود الرأس ونافذة الجمجمة. تم تصوير الفأر بشكل متسلسل باستخدام مجهر ثنائي الفوتون في اليوم 0 وأسبوع واحد و 4 أشهر بعد جراحة TBI (الشكل 1). بشكل عام ، استغرقت جراحة الحقن ~ 30 دقيقة ، واستغرقت جراحة TBI ~ 1 ساعة لكل ماوس. أثناء جراحة TBI ، احتاجت الفئران عموما إلى فترة أطول من الوقت لتصحيح نفسها من وضع الاستلقاء إلى وضعية الانبطاح بعد التأثيرات اللاحقة ، مقارنة بالتأثيرات الأولية. على سبيل المثال ، قد يتطلب الماوس دقيقتين لتصحيح موضعه بعد الاصطدام الأول ، ولكنه يتطلب 10 دقائق لتصحيح موضعهبعد الاصطدام العاشر. بالنسبة لجراحة زرع نافذة الجمجمة ، كانت ~ 3 ساعات مطلوبة عادة لأداء جميع الخطوات ، ولكنها استغرقت وقتا أطول من اللازم في حالة حدوث نزيف مستمر. يتطلب التصوير ثنائي الفوتون عادة 20 دقيقة لكل ماوس للحصول على جميع الصور. بالنسبة للدراسة الحالية التي شملت ثلاثة فئران مع التعبير عن EGFP ، لم تظهر الحيوانات دليلا على كسر في الجمجمة ، ولم تموت أثناء الجراحة أو حتى 4 أشهر بعد الجراحة. كان كل من معدل المراضة وكسور الجمجمة 0٪. وهذا يتفق مع معدل الوفيات المنخفض نسبيا (<10٪) في نموذج مماثل لإحداث إصابات الدماغ الرضية ولكن بدون زرع نافذة الجمجمة 7,8.

تم استخدام جهاز إنقاص الوزن (الشكل 2 أ) ، الذي تم الإبلاغ عنه سابقا 7,8 ، لتوصيل تأثيرات إصابات الدماغ الرضية على رأس الماوس على الجانب الأيمن ، كما هو موضح في الشكل 2 ب. تم تثبيت أنبوب بلاستيكي شفاف (رقم 5 في الشكل 2 أ ؛ طوله 60 سم وقطره الداخلي 1.4 سم) بشكل آمن وعمودي على قوس معدني ، وتم وضع عمود تصادم بلاستيكي (رقم 7 في الشكل 2 أ ؛ طوله 10 سم وقطره 1.3 سم ، مع طرف دائري مسطح قطره 2 مم) في الأنبوب الرأسي. تم وضع وزن معدني 50 جم (رقم 6 في الشكل 2 أ) فوق الصدمة وربطه بخيط من النايلون (رقم 4 في الشكل 2 أ). تم وضع وسادة عازلة (رقم 8 في الشكل 2 أ ؛ 9 سم × 9 سم × 1 سم [الطول × العرض × العمق] ، مصنوعة من رغوة البولي إيثيلين وشاش القطن) تحت رأس الماوس لتخزين وامتصاص طاقة التأثير.

كانت نافذة الجمجمة مصنوعة من غطاءين زجاجيين مدمجين بواسطة مادة لاصقة بصرية (الشكل 2C) ، وكان الغطاء الزجاجي الذي يبلغ قطره 3 مم هو الجانب الذي يلامس سطح الدماغ. تم إجراء تصوير ثنائي الفوتون على عمقين مختلفين (الشكل 3 أ) من سطح الدماغ: 1) مستوى سطحي حيث كانت الأوعية الدموية القشرية وفيرة ولها قطر تجويف كبير نسبيا ظهر أسود ، ولكن مع أجسام خلايا إيجابية متفرقة EGFP ؛ و 2) مستوى أعمق حيث كانت الأوعية الدموية متناثرة ولها قطر تجويف صغير ، مع ظهور العديد من الخلايا الإيجابية EGFP.

في ~ 4 ساعات (اليوم 0) بعد الجراحة ، تم إجراء تصوير ثنائي الفوتون على ثلاث طائرات ، بفاصل 10 ميكرومتر على المستوى السطحي (الطبقة الأولى ، أقل من 100 ميكرومتر من السطح السحائي) أولا حيث ظهرت الأوعية الدموية سوداء (يشار إليها بالخطوط الحمراء المتقطعة في الشكل 3 ب) ، وتم استخدامها كخريطة مرجعية لجلسة التصوير التالية لتحديد منطقة التصوير الأصلية. في هذا المستوى السطحي ، كانت الأوعية الدموية القشرية والعمليات العصبية هي الهياكل السائدة التي يمكن ملاحظتها ، في حين أن أجسام الخلايا الإيجابية EGFP كانت متناثرة. بعد التصوير داخل المستوى السطحي ، تم تعديل التركيز لأسفل بمقدار ~ 400 ميكرومتر ، أعمق من المستوى السطحي ، في القشرة (الطبقة الرابعة والخامسة) لتصوير أجسام الخلايا العصبية الإيجابية EGFP. تم الحصول على الصور في غضون ست طائرات ، بفاصل 10 ميكرومتر. تم توزيع تعبير بروتين EGFP بشكل منتشر في جميع أنحاء جسم الخلية ، كما هو موضح في الشكل 3C. كان هناك حدوث عرضي لبعض نقاط EGFP خارج أجسام الخلايا ، والتي يمكن أن تمثل شوائب EGFP التي تشكلت بمرور الوقت داخل المحاور العصبية أو الزوائد الشجيرية. ينتج عن هذا البروتوكول تعبير AAV-SYN1-EGFP ~ 2-3 مم يحيط بموقع الحقن ، والذي يمكن تحديده عن طريق التحليل النسيجي لأنسجة ما بعد الوفاة.

في 1 أسبوع و 4 أشهر بعد TBI ، تم استخدام نمط الأوعية الدموية الذي لوحظ في اليوم 0 نقطة زمنية كمرجع لتحديد نفس منطقة التصوير (الشكل 3D ، F). نمط الأوعية الدموية في الشكل 3D ، F مشابه لتلك الموجودة في الشكل 3B. كان إجراء التصوير لمدة 1 أسبوع و 4 أشهر بعد إصابات الدماغ الرضية هو نفسه الموصوف أعلاه لليوم 0 نقطة زمنية ، وتم الكشف عن تعبير EGFP في جميع أنحاء جسم الخلية كما كان من قبل (الشكل 3E ، G). كانت شدة التألق في اليوم 0 و 4 أشهر متشابهة على المستويين السطحي والأعمق. ومع ذلك ، كانت شدة التألق في أسبوع 1 أقل من تلك الموجودة في اليوم 0 و 4 أشهر على المستويين السطحي والعميق ، والتي يمكن أن تكون بسبب القمع الانتقالي المبلغ عنه لنماذج TBI الأخرى20. والجدير بالذكر أن جودة الصور في 4 أشهر مقارنة باليوم 0 نقطة زمنية توضح أن نافذة الجمجمة حافظت على الوضوح والنزاهة ، وأن التعبير الفيروسي لا يزال قويا بعد 4 أشهر من الجراحة للتصوير الفعال داخل الجسم. كما يعبر EGFP كبروتين منتشر نسبيا ، قد يتم حل إشارات التألق بشكل أفضل وسرية عندما يتم دمج EGFP مع بروتين مهم.

Figure 1
الشكل 1: الجدول الزمني لبروتوكول التصوير داخل الأحيائية هذا. يبدأ البروتوكول بحقن الفيروس. يتم إجراء جراحة TBI ونافذة الجمجمة في نفس جلسة الجراحة في 2-4 أسابيع بعد حقن الفيروس. يتم إجراء التصوير داخل الجسم في اليوم 0 ، 1 أسبوع ، 4 أشهر بعد إصابات الدماغ الرضية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الرسوم البيانية لجهاز TBI وموقع تأثير TBI وإعداد النافذة . (أ) معدات جهاز إصابات الدماغ الرضية لإنقاص الوزن. 1: قاعدة التمثال ، 2: قوس ، 3: مشبك قابل للتعديل ، 4: خيط نايلون ، 5: نفق إسقاط الوزن ، 6: عمود وزن معدني (50 جم) ، 7: صدم ، 8: وسادة عازلة. (ب) رسم تخطيطي لحقن الفيروس وموقع ارتطام إصابات الدماغ الرضية، إحداثياته 2.5 مم خلف بريجما و 2 مم جانبي من الدرز السهمي إلى اليمين. (ج) رسم تخطيطي لتحضير النافذة الزجاجية. يتم الجمع بين زلتين من الغطاء الزجاجي ، قطرهما 3 مم و 5 مم ، باستخدام مادة لاصقة بصرية. (د) صور لعمود الرأس المعدني وبئر التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: رسم تخطيطي لمستويات التصوير وبيانات الصورة . (أ) يتم تصوير مستويات متعددة على مستوى سطحي حيث توجد الأوعية الدموية ومستوى عميق. يتم جمع الصور على النحو التالي: ثلاث طائرات على المستوى السطحي ، حيث تكون الأوعية الدموية القشرية والعمليات العصبية هي الهياكل الإيجابية السائدة ل EGFP ، وست طائرات على المستوى العميق ، حيث يتم ملاحظة أجسام الخلايا الإيجابية EGFP في الغالب ، مع فاصل 10 ميكرومتر بين الطائرات المجاورة. يبلغ حجم كل مستوى 425.10 ميكرومتر × 425.10 ميكرومتر. (ب) صورة تمثيلية لمستوى سطحي عند النقطة الزمنية لليوم 0. تشير الخطوط الحمراء المتقطعة إلى مخطط الأوعية الدموية الذي يمكن استخدامه كمرجع لتحديد مكان التصوير الأصلي للنقاط الزمنية اللاحقة. (ج) صورة تمثيلية لطائرة في المستوى العميق في اليوم 0 نقطة زمنية بعد فترة وجيزة من إصابات الدماغ الرضية. (د) صورة تمثيلية لطائرة في المستوى السطحي عند نقطة زمنية 1 أسبوع. تشير الخطوط الحمراء المتقطعة إلى الأوعية الدموية ، على غرار المخطط التفصيلي في اليوم 0 في الشكل 3B ، مما يؤكد أن التصوير ثنائي الفوتون تم إجراؤه في موقع مماثل في اليوم 0 و 1 أسبوع بعد إصابات الدماغ الرضية. (E) صورة تمثيلية في المستوى العميق عند النقطة الزمنية 1 أسبوع بعد TBI. (و) نفس B و D ، في 4 أشهر بعد إصابات الدماغ الرضية. (ز) نفس C و E ، بعد 4 أشهر من إصابات الدماغ الرضية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة ، تم الجمع بين حقن AAV ، وإدارة TBI ، وعمود الرأس مع زرع نافذة الجمجمة لتحليل التصوير الطولي للخلايا العصبية التي تحمل علامة EGFP داخل قشرة دماغ الفأر (الطبقات الرابعة والخامسة) لمراقبة آثار TBI على الخلايا العصبية القشرية. تشير هذه الدراسة إلى أن موقع TBI المختار هنا ، فوق الحصين ، يوفر سطحا مستويا وعريضا نسبيا لزرع نافذة الجمجمة. على العكس من ذلك ، فإن الجمجمة ضيقة نسبيا أمام هذا الموقع ، وبالتالي من الصعب التأكد من أن عمود الرأس سيتصل بشكل فعال بسطح الجمجمة. بينما تم استخدام نموذج الماوس TDP-43 Q331K/ Q331K فقط في هذه الدراسة ، مع الأخذ في الاعتبار أبحاث المختبر التي تركز على ALS و FTD19 ، يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق على معظم سلالات الفئران الأخرى. بالإضافة إلى تسمية الخلايا العصبية كما هو موضح هنا ، يمكن استخدام استراتيجيات مختلفة لتسمية أنواع الخلايا الأخرى للتصوير داخل الجسم. تتمثل إحدى الطرق في التعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا بطريقة خاصة بالخلية ، باستخدام نظام إعادة التركيب Cre-Lox في الفئران المعدلة وراثيا21. نهج آخر هو استخدام بعض الأنماط المصلية الفيروسية لنقل الخلايا الخاصة بالبروتينات الفلورية المشفرة وراثيا. يمكن تحقيق التسليم الخاص بالموقع عن طريق إجراء الحقن داخل الجمجمة في الموقع المطلوب في الدماغ. تعد الكفاءة والسهولة التي يمكن للمرء من خلالها التعبير عن البروتينات الخاصة بالخلايا عن طريق النقل الفيروسي للتصوير داخل الجسم ميزة على إنشاء نماذج الفئران المعدلة وراثيا.

بالنسبة لبروتوكولات الجراحة ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يجب تنفيذها بعناية. عند حفر ثقوب على الجمجمة لحقن الفيروس في بداية البروتوكول ، يحتاج المرء إلى توخي الحذر من إتلاف الأنسجة الموجودة أسفل الجمجمة. إذا حدث تلف في الأنسجة أثناء الحفر على الجمجمة ، فسيكون هناك التهاب ، والتصاق الأنسجة ، وتكوين الأوعية الدموية حول موقع الإصابة ، مما يزيد من خطر النزيف أثناء حج القحف لزرع نافذة الجمجمة. لإدارة إصابات الدماغ الرضية باستخدام جهاز إنقاص الوزن ، وضعت الدراسة الحالية وسادة تحت رأس الفأر لتخزين قوة تأثير إصابات الدماغ الرضية ، وبالتالي تقليل فرصة حدوث كسر في الجمجمة. لم يلاحظ أي حركة رأس واضحة في اتجاهات الدوران والتسارع ، مما يدعم فكرة أن نموذج TBI هذا لديه فرصة منخفضة نسبيا لانتشار الإصابة المحورية. ومن المثير للاهتمام ، أن فودا وآخرون استخدموا جهازا مشابها لإسقاط الوزن لبناء إصابة TBI مغلقة في الجمجمة على الفئران ، وتم وضع وسادة إسفنجية ناعمة أكبر (بسمك 12 سم) تحت رأس الجرذ بحيث يمكن أن تتحرك بسهولة استجابة لقوة تأثير TBI على اتجاه الدوران مع التسارع ، مما أدى إلى إصابة محورية منتشرة22. تتمثل إحدى مزايا نموذج TBI لانخفاض الوزن الموجه بالأنبوب في أنه يمكن تعديل شدة الصدمة عن طريق تغيير ارتفاع انخفاض الوزن (أي ارتفاع أعلى لقوة أكبر) و / أو تكرار عدد المرات التي يتم فيها تسليم التأثير. على سبيل المثال ، استخدم Flierl et al. جهاز إنقاص الوزن مشابها للدراسة الحالية للحث على إصابات الدماغ الرضية على الفئران. كان وزن المعدن 333 جم ، مما أدى إلى إصابات الدماغ الرضية الخفيفة عند سقوطها من ارتفاع 2 سم وإصابات الدماغ الرضية الشديدة عند سقوطها من ارتفاع 3 سم23. يجب أيضا إجراء خطوة حج القحف قبل زرع النافذة بعناية ، لتجنب إتلاف أنسجة المخ تحت الجمجمة. يساعد تحريك مثقاب الحفر بشكل دوري إلى منطقة مختلفة على الجمجمة على تجنب الإفراط في الحفر في نفس المكان ، مما قد يؤدي إلى التسخين المفرط وتلف الأنسجة والنزيف ؛ علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي الري المتكرر بالمحلول الملحي إلى تبريد موقع الحفر. عند زرع النافذة الزجاجية ، من المهم محاذاة المستوى الزجاجي بحيث يكون موازيا لمستوى سطح الجمجمة ؛ تمنع النافذة الدافئة التي تتناسب مع الجمجمة تسرب سائل الأسمنت السني إلى الفراغ بين النافذة والدماغ.

إذا كانت النافذة ضبابية في اليوم 0 بعد جراحة TBI ، ولكن تم اكتشاف إشارات الفلورسنت ، فقد يكون الأسمنت السني قد دخل الفراغ بين النافذة والدماغ ، وبالتالي تشكيل طبقة أسمنتية تغطي سطح الدماغ وتحجب انبعاث التألق. في هذه الحالة ، يمكن للمرء إزالة النافذة والأسمنت السني باستخدام طريقة الحفر الموضحة في خطوة البروتوكول 3.5 ، ثم زرع نافذة زجاجية جديدة في الموقع الأصلي ، كما هو موضح بالتفصيل بواسطة Goldey et al.9. إذا أصبحت النافذة ضبابية في مرحلة لاحقة أثناء عملية التصوير الطولي ، فيمكن للمرء محاولة إزالة الحطام المحتمل عن طريق فرك النافذة برفق باستخدام قضيب ذي رأس قطني. إذا لم يؤد ذلك إلى حل المشكلة ، فقد يكون ذلك بسبب إعادة نمو العظام والسحايا تحت النافذة الزجاجية. في هذه الحالة ، يمكن للمرء إزالة النافذة والحفر لإزالة العظم المعاد نموه و / أو الملقط بعيدا وإزالة السحايا ، يليه زرع نافذة زجاجية جديدة في الموقع الأصلي ، كما هو موضح من قبل Goldey et al.9. كما هو موضح في النتائج ، فإن تعبير EGFP والتألق قويان على مدار فترة زمنية ~ 4 أشهر بعد إصابات الدماغ الرضية. يمكن للمرء أن يتوقع انخفاضا في إشارة التألق خلال الأسبوع الأول بعد إصابات الدماغ الرضية ، والذي من المحتمل أن يكون بسبب القمع الانتقالي الناجم عن إصابات الدماغ الرضية الذي يسبب انخفاضا مؤقتا في تخليق البروتين العالمي20.

للحفاظ على جودة التصوير العالية وتحقيق التصوير في مستويات متعددة ، كانت الفئران تحت تخدير الأيزوفلوران للحد من الحركة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن التخدير قد يؤثر على نتائج الدراسة. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن الفئران الخاضعة لتخدير الأيزوفلوران تظهر نشاطا مختلفا للخلايا الدبقية الصغيرة استجابة للتلف الضوئي مقارنة بالفئران المستيقظة24. بالنسبة للتصوير ثنائي الفوتون ، تعد سرعة المسح وعدد عمليات المسح لمتوسط الإشارة (المحددة ك "رقم" ، ضمن "المتوسط") هي العوامل الرئيسية التي يمكن أن تحدد دقة الصورة. لتحسين الدقة ، يمكن للمرء تقليل سرعة المسح وزيادة متوسط الرقم ، ومع ذلك ، فإن السرعة الأبطأ ورقم المتوسط الأعلى يزيد من وقت التصوير لمجال رؤية معين وقد يتسبب في تبييض الصورة. تهدف الدراسة الحالية إلى إنجاز تصوير مزمن طويل الأمد على نفس الحيوان في نفس موقع الدماغ. لتجنب تبييض الصور المحتمل مع تحقيق دقة كافية ، تم إجراء تصوير ثنائي الفوتون بسرعة مسح 8 بمتوسط عدد 16.

هناك طريقة بديلة لإجراء حج القحف وزرع نافذة زجاجية وهي ترقق الجمجمة ، إلى الحد الذي تكون فيه شفافة و "رقيقة الورق" للتصوير المباشر25،26،27. يمكن لنافذة الجمجمة الرقيقة الحفاظ على سلامة الجمجمة ، وبالتالي تجنب الالتهاب الناجم عن العملية الجراحية. لذلك ، قد يفضل نهج نافذة الجمجمة الرقيقة للتصوير المباشر بعلامات ذات صلة بالالتهاب و / أو على مدى فترة زمنية أقصر نسبيا (أي ~ 14 يوما بعد الجراحة ، كما ورد25). للتصوير طويل المدى (أي 4 أشهر ، كما هو موضح هنا) للعمليات التنكسية العصبية المزمنة ، بالإضافة إلى تقييم الآثار الحادة لإصابات الدماغ الرضية على نفس الحيوان ، يوصى باستخدام نافذة زجاجية مزروعة بطريقة حج القحف.

كما هو مذكور في المقدمة ، هناك العديد من المزايا البارزة للتصوير داخل الجسم لدراسة الأحداث البيولوجية والمرضية المختلفة في دماغ الثدييات. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على هذا البروتوكول أيضا. على سبيل المثال ، تصف إصابة الدماغ contrecoup كدمة الدماغ أو الورم الدموي البعيد عن ، عادة عكس موقع الاتصالبالقوة 28،29،30. في هذه الدراسة ، تم تسليم تأثيرات TBI إلى الفص الجداري. من المتوقع حدوث إصابة كونتريكوبة بطنيا ولا يمكن الوصول إليها للتصوير داخل الجسم. يمكن استخدام التحليل النسيجي كنهج تكميلي لمواصلة فحص الأنماط الظاهرية ذات الأهمية خارج موقع الارتطام الذي تغطيه نافذة الجمجمة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي الإفراط في التعبير الخارجي لبعض البروتينات أيضا إلى حدوث سمية أو أمراض. في هذه الدراسة ، لوحظت بعض نقاط EGFP العرضية ، والتي قد تمثل تراكمات بسبب الإفراط في التعبير عن البروتين. لذلك ، يوصى بتضمين بروتين التحكم السلبي (على سبيل المثال ، EGFP أو RFP وحده) في تصميم الدراسة لمعالجة هذا الاحتمال ، خاصة إذا كان البروتين محل الاهتمام عرضة لتشكيل هياكل مثقوبة. عدد البروتينات التي يمكن للمرء دراستها في وقت واحد محدود بالليزر وقدرات نظام الفوتونين. قد يكون من الممكن تصوير أكثر من فلوروفور واحد (على سبيل المثال ، EGFP ، RFP ، إلخ) بواسطة المجهر ثنائي الفوتون ، على الرغم من أن قدرات تعدد الإرسال باستخدام المجاهر التقليدية واسعة المجال ومتحدة البؤر غالبا ما تسمح بتحليل المزيد من البروتينات داخل عينة نسيج واحدة. أخيرا ، من المهم تضمين عنصر تحكم وهمي يتلقى جميع الإجراءات نفسها مثل TBI ، باستثناء تأثيرات انخفاض الوزن. جراحة زرع نافذة الجمجمة هي عملية جراحية ويمكن أن تسبب بعض التغييرات المحلية ، مثل الالتهاب والضغط داخل الجمجمة المتغير ، مما قد يؤثر على عملية إصابات الدماغ الرضية. يساعد التحكم الوهمي التجريبيين على تقييم الأنماط الظاهرية الناتجة عن التأثير مقابل العمليات الجراحية.

باختصار ، يقدم هذا البروتوكول طريقة لتصوير البروتينات طوليا على وجه التحديد في الخلايا العصبية لقشرة دماغ الفأر استجابة لإصابات الدماغ الرضية. يمكن تعديل هذا البروتوكول لتحليل التعبير عن البروتينات المختلفة الخاصة بالخلايا وتوطينها استجابة لإصابات الدماغ الرضية. الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نهج لدراسة العواقب الفورية والطويلة الأجل لإصابات الدماغ الرضية في دماغ الثدييات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتور ميغيل سينا إستيفيس من كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان لإهدائه فيروس AAV (PHP.eB) -Syn1-EGFP ، وديبرا كاميرون في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان لرسم رسم جمجمة الفئران. كما نشكر الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبرات Bosco و Schafer و Henninger على اقتراحاتهم ودعمهم. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع (W81XWH202071 / PRARP) إلى DAB و DS و NH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable Precision Applicator Brushes Parkell S379
BD insulin syringe BD NDC/HRI#08290-3284-38 5/16" x 31G
Betadine Purdue NDC67618-151-17 including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Cefazolin HIKMA Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish Parkell SKU: S387 For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators ZORO catlog #: G9531702
Catalyst Parkell S371 full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder Parkell S396 Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill Foredom H.MH-130
Dental drill controller Foredom HP4-310
Dexamethasone Phoenix NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit Microcopy Lot# C150113 Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal Fisher Scientific 04355223EA 75%
FG1/4 carbide bit Microcopy Lot# C150413 Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit Microcopy Lot# C150309 Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost N/A N/A Custom-manufactured
Heating apparatus CWE TC-1000 Mouse equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket CVS pharmacy E12107 extra heating device and be used after surgery
Isoflurane Pivetal NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber Vetequip 89012-688 induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine Vetequip 911103
Isoflurane volatilizing machine holder Vetequip 901801
Leica surgical microscope Leica LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment Picetal NDC 46066-753-55
Marker pen Delasco SMP-BK
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller World Precision Instruments micro4 and UMP3
Microliter syringe Hamilton Hamilton 80014 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps CAROLINA Item #:625314 Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent McKesson Corporation N/A Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1 Nikon SMZ745 Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2 Zeiss LSM 7 MP two-photon microscope
Multiphoton laser Coherent Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture Harvard Apparatus catlog# 59-6860 6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA 81
No-Snag Needle Holder CAROLINA Item #: 567912
Quick base liquid Parkell S398 "B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1 Eurostat eurostat es5-300
Regular scissor 2 World Precision Instruments No. 501759-G
Round cover glass 1 Warner instruments CS-5R Cat# 64-0700 for 5 mm of diameter
Round cover glass 2 Warner instruments CS-3R Cat# 64-0720 for 3 mm of diameter
Rubber rings Orings-Online Item # OO-014-70-50 O-Rings
Saline Bioworld L19102411PR
Spring scissor 1 World Precision Instruments No. 91500-09 tip straight
Spring scissor 2 World Precision Instruments No. 91501-09 tip curved
Stereotaxic platform KOPF Model 900LS
Super glue Henkel Item #: 1647358
surgical Caliper World Precision Instruments No. 501200
Surgical forceps 1 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical forceps 2 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 0103-5-PO style 5, straight
Surgical forceps 3 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 72912
Surgical forceps 4 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical gauze ZORO catlog #: G0593801
Surgical lamp Leica Leica KL300 LED
UV box Spectrolinker XL-1000 also called UV crosslinker
Vaporguard Vetequip 931401
Vetbond Tissue Adhesive 3M Animal Care Part Number:014006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

Tags

التصوير داخل الجسم ، تعبير البروتين الفلوري ، الفئران ، إصابات الدماغ الرضحية في الجمجمة المغلقة ، نافذة الجمجمة ، مجهر ثنائي الفوتون ، بروتين مهم ، محفزات خارجية ، حقن داخل الجمجمة ، فيروس مرتبط بالغدي (AAV) ، بروتين فلورسنت أخضر محسن (EGFP) ، مروج خاص بالخلايا العصبية ، جهاز إنقاص الوزن ، عمود رأس معدني ، نافذة زجاجية في الجمجمة ، التعبير والتوطين الخلوي ، التصور الطولي
التصوير داخل الجسم لتعبير البروتين الفلوري في الفئران المصابة بإصابة دماغية رضحية مغلقة الجمجمة ونافذة الجمجمة باستخدام مجهر ثنائي الفوتون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhong, J., Gunner, G., Henninger,… More

Zhong, J., Gunner, G., Henninger, N., Schafer, D. P., Bosco, D. A. Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope. J. Vis. Exp. (194), e64701, doi:10.3791/64701 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter