Summary
Denne studien demonstrerer levering av en repeterende traumatisk hjerneskade på mus og samtidig implantasjon av et kranialvindu for etterfølgende intravital avbildning av en nevronuttrykt EGFP ved bruk av to-foton mikroskopi.
Abstract
Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man langsgående visualiserer uttrykket og lokaliseringen av et protein av interesse innenfor bestemte celletyper i et dyrs hjerne, ved eksponering for eksogene stimuli. Her vises administrering av en lukket hodeskalle traumatisk hjerneskade (TBI) og samtidig implantasjon av et kranialvindu for etterfølgende langsgående intravital avbildning hos mus. Mus injiseres intrakranielt med et adenoassosiert virus (AAV) som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under en nevronspesifikk promotor. Etter 2 til 4 uker blir musene utsatt for en repeterende TBI ved hjelp av et vekttapsapparat over AAV-injeksjonsstedet. Innenfor samme kirurgiske økt blir musene implantert med en metallstolpe og deretter et glasskranialvindu over TBI-påvirkningsstedet. Ekspresjonen og cellulær lokalisering av EGFP undersøkes ved hjelp av et to-foton mikroskop i samme hjernegruppe utsatt for traumer i løpet av måneder.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI), som kan skyldes sportsskader, kjøretøykollisjoner og militærkamp, er et verdensomspennende helseproblem. TBI kan føre til fysiologiske, kognitive og atferdsmessige underskudd, og livslang funksjonshemming eller dødelighet 1,2. TBI-alvorlighetsgraden kan klassifiseres som mild, moderat og alvorlig, de aller fleste er mild TBI (75%-90%)3. Det blir stadig mer anerkjent at TBI, spesielt repeterende forekomster av TBI, kan fremme nevronal degenerasjon og tjene som risikofaktorer for flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateralsklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og kronisk traumatisk encefalopati (CTE)4,5,6. Imidlertid forblir de molekylære mekanismene som ligger til grunn for TBI-indusert nevrodegenerasjon uklare, og representerer dermed et aktivt studieområde. For å få innsikt i hvordan nevroner reagerer på og gjenoppretter fra TBI, er en metode for overvåking av fluorescerende merkede proteiner av interesse, spesielt i nevroner, ved langsgående intravital avbildning i mus etter TBI beskrevet her.
For dette formål viser denne studien hvordan man kombinerer en kirurgisk prosedyre for administrering av lukket skalle TBI som ligner på det som tidligere er rapportert7,8, sammen med en kirurgisk prosedyre for implantasjon av et kranialvindu for nedstrøms intravital avbildning, som beskrevet av Goldey et al9. Spesielt er det ikke mulig å implantere et kranialvindu først og deretter utføre en TBI i samme region, da virkningen av vektfallet som induserer TBI sannsynligvis vil skade vinduet og forårsake uopprettelig skade på musen. Derfor ble denne protokollen designet for å administrere TBI og deretter implantere kranialvinduet direkte over slagstedet, alt innenfor samme kirurgiske økt. En fordel med å kombinere både TBI og kranialvinduimplantasjon i en enkelt kirurgisk økt er en reduksjon i antall ganger en mus blir utsatt for kirurgi. Videre tillater det en å overvåke den umiddelbare responsen (dvs. på tidsskalaen for timer) til TBI, i motsetning til å implantere vinduet ved en senere kirurgisk økt (dvs. innledende bildebehandling som starter på en tidsskala på dager etter TBI). Kranialvinduet og den intravitale bildebehandlingsplattformen gir også fordeler i forhold til overvåking av nevronproteiner ved konvensjonelle metoder som immunfarging av faste vev. For eksempel kreves færre mus for intravital avbildning, da samme mus kan studeres på flere tidspunkter, i motsetning til separate kohorter av mus som trengs for diskrete tidspunkter. Videre kan de samme nevronene overvåkes over tid, slik at man kan spore spesifikke biologiske eller patologiske hendelser i samme celle.
Som et bevis på konsept er det nevronspesifikke uttrykket av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under synapsinpromotoren demonstrert her10. Denne tilnærmingen kan utvides til 1) forskjellige hjernecelletyper ved å benytte andre celletypespesifikke promotorer, for eksempel myelinbasisk protein (MBP) promotor for oligodendrocytter og glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter for astrocytter11, 2) forskjellige målproteiner av interesse ved å fusjonere sine gener med EGFP-genet, og 3) co-uttrykke flere proteiner fusjonert til forskjellige fluoroforer. Her pakkes EGFP og uttrykkes via adenoassosiert virus (AAV) levering gjennom en intrakraniell injeksjon. En lukket hodeskalle TBI administreres ved hjelp av en vektdråpeanordning, etterfulgt av implantasjon av et kranialvindu. Visualisering av neuronal EGFP oppnås gjennom kranialvinduet, ved bruk av to-foton mikroskopi for å oppdage EGFP-fluorescens in vivo. Med to-foton laseren er det mulig å trenge dypere inn i kortikale vev med minimal fotodamage, noe som muliggjør gjentatt langsgående avbildning av de samme kortikale områdene i en individuell mus i dager og opp til måneder12,13,14,15. I sum har denne tilnærmingen til å kombinere en TBI-kirurgi med intravital bildebehandling som mål å fremme forståelsen av molekylære hendelser som bidrar til TBI-indusert sykdomspatologi16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrerelaterte protokoller ble utført i samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals utgitt av National Research Council (US) Committee. Protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (tillatelsesnummer 202100057). Kort sagt, som vist i skjematisk studie (figur 1), mottar dyret en virusinjeksjon, en TBI, en vindusimplantasjon og deretter intravital avbildning i en tidssekvens.
MERK: Kommersielle vilkår er fjernet. Se materialfortegnelsen for det spesifikke utstyret som brukes.
1. Intrakraniell injeksjon av AAV ved hjelp av et stereotaktisk apparat
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Bruk en viral titer på 1 x 1013 virale genomer per milliliter (vg / ml). Syn1 refererer til Synapsin1, som er en nevronspesifikk promotor som muliggjør begrenset virusuttrykk i nevroner. Viruset kan tilberedes internt eller outsources.
- Forberedelse til stereotaktisk injeksjonskirurgi for administrering av AAV
- Autoklav vanlig saks, en kirurgisk tykkelse, kirurgisk fjærsaks, kirurgisk tang, myggtang, gasbind, en bomullstippet applikator og en mikrolitersprøyte i glass.
- Desinfiser operasjonsområdet ved hjelp av 75% etanol. Utvid den disponible sterile kirurgiske gardinen for å dekke operasjonsområdet på den stereotaksiske plattformen.
MERK: For å opprettholde dyrets kroppstemperatur under injeksjonsoperasjonen, bruk et tilbakemeldingsregulert varmeapparat. - Vei og registrer musens kroppsvekt.
- Åpne oksygentankventilen og juster oksygenstrømmen til 1,5 l/min. Åpne anestesimaskinen og sett isoflurannivåverdien til tre.
MERK: Bærergassen kan enten være romluft eller 100% oksygen i dette trinnet. - Sett musen inn i induksjonskammeret og la den holde seg i 5 minutter for å oppnå full anestesi.
- Når musen er fullstendig bedøvet (dvs. langsom, men jevn pustefrekvens ved omtrent en syklus per 2 s, kombinert med fravær av en haleklypekrefleks), fjern musen fra induksjonskammeret og plasser musehodet i den stereotaktiske rammen.
- Plasser bedøvelsesslangens nesekegle over musens snute.
- Oppretthold anestesi med 1,5 % isofluran med bærergass med en strømningshastighet på 1 l/min frem til slutten av operasjonen. Kontroller regelmessig pustefrekvensen, og lever en hale eller tåklemme minst hvert 15. minutt gjennom hele operasjonen for å vurdere passende anestesi. Juster isoflurankonsentrasjonen etter behov for å opprettholde ønsket anestesidybde.
- Fyll en mikroliter sprøyte (10 μL) med virusoppløsningen. Fest deretter sprøyten på den matchede mikroinjektorpumpen til den stereotaksiske enheten.
- Injeksjon kirurgi
- Administrer buprenorfin (1 mg/kg, subkutant) ved hjelp av en insulinsprøyte til engangsbruk og påfør oftalmisk smøremiddelsalve på musens øyne.
- Fjern håret fra hodebunnen på toppen av hodet ved å trimme med vanlig saks 1.
- Rengjør hodebunnen huden med gasbind og bomull tipped applikatorer. Desinfiser huden med 75% etanol først og deretter betadin. Gjenta dette tre ganger (dvs. etanol etterfulgt av betadin), og la den endelige applikasjonen av betadin på huden.
- Kontroller bedøvelsesdybden på nytt for å sikre at musen er fullstendig bedøvet (dvs. langsomme, men jevne pustefrekvenser ved omtrent en syklus per 2 s, kombinert med fravær av haleklypekrefleks). Lag et ~ 1 cm snitt med vanlig saks 2 langs midtlinjen for å avsløre høyre parietalskalle, og fjern periosteum ved hjelp av en bomullstippet applikator.
- Merk to punkter på skallen ved hjelp av en markørpenn ved disse koordinatene: punkt A: 2,5 mm bakenfor Bregma og 1 mm lateralt til midtlinjen over høyre halvkule; punkt B: 2,5 mm bakenfor Bregma og 2 mm lateralt for midtlinjen over høyre halvkule.
- Bor forsiktig to hull gjennom skallen på de merkede koordinatene ved hjelp av et elektrisk tannbor med en fin EF4-karbidbit.
MERK: Vær forsiktig så du ikke skader hjernevevet. - Juster den stereotaktiske rammen for å justere den mikroliters sprøytenålespissen til skallehullet som er 1 mm lateralt til midtlinjen.
- Senk sprøytenålen for å berøre hjerneoverflaten, og angi deretter stedet som nullpunkt (for z-aksen). Senk nålespissen ned i hjernebarken til en dybde på 0,5 mm, og tilfør langsomt 1 μL av virusoppløsningen med en hastighet på 200 nL/min.
- Vent 5 minutter etter at virusoppløsningen er fullstendig injisert i hjernevevet før du trekker ut nålen for å forhindre tilbakestrømning av oppløsningen.
- Trekk sprøytekanylen langsomt ut. Gjenta injeksjonen på det andre stedet. Sutur snittet med en steril, ikke-absorberbar kirurgisk sutur (6-0 gauge).
- Administrer cefazolin [500 mg / kg (333 mg / ml, vanligvis ~ 45 μL), intramuskulært] og meloksikam (5 mg / kg, subkutant) etter kirurgi mens dyret fortsatt er bedøvet.
- Frigjør musen fra den stereotaksiske rammen og avbryt anestesi. Plasser musen i et rent bur over et varmeteppe, og overvåk dyret til det er ambulerende (ca. 15 min). Deretter overfører du til hjemmeburet.
- Gi buprenorfin (1 mg/kg, subkutant) og meloksikam (5 mg/kg, subkutant) igjen henholdsvis 8 timer, 16 timer og 24 timer etter første buprenorfininjeksjon.
MERK: 2-4 uker etter virusinjeksjon får musen TBI- og kranialvinduimplantasjon på samme sted som AAV-injeksjonen.
2. Administrering av en repeterende TBI-induksjon
MERK: TBI-parametrene er justert fra tidligere rapporter7,8, der TBI-effekten ble levert en gang. Protokollen her bruker samme parameter, bortsett fra å øke det totale innvirkningstallet til 10.
- TBI-utstyr
- Bruk en spesialbygd bærbar enhet for administrering av en TBI med lukket hodeskalle (figur 2A) til musehodet på høyre side, som angitt i figur 2B.
- Forberedelse før kirurgi
- Autoklavkirurgisk utstyr, inkludert vanlig saks, en kirurgisk tykkelse, kirurgisk vårsaks, kirurgisk tang, myggtang, hodepoststykker, gasbind og bomullstippede applikatorer.
- Vei og registrer musens kroppsvekt 2 timer før operasjonen. For å minimere hjerneødem under implantasjon av kranialvindu, injiser natriumfosfat deksametason i en dose på 4,8 mg/kg [2 mg/ml, vanligvis ~70 μl (må injiseres på to steder)] i quadriceps-muskelen ved hjelp av en insulinsprøyte. Etter injeksjon av deksametason, men før TBI-kirurgi påbegynnes, klargjør glassvinduene som angitt i trinn 3.1 for senere bruk.
- Desinfiser kirurgisk stadium og TBI-utstyr ved hjelp av 75% etanol, og utvid engangs steril kirurgisk drapering for å dekke operasjonsstadiet på den stereotaksiske plattformen. Slå på varmeapparatet og temperaturmonitoren, og still måltemperaturen til 37 °C.
- Åpne oksygentankventilen og juster oksygenstrømmen til 1,5 l/min. Åpne anestesimaskinen og sett isoflurannivåverdien til tre.
MERK: 100% rent oksygen kan hjelpe dyret til å overleve TBI-påvirkningene. - Sett musen inn i induksjonskammeret og la den holde seg i 5 minutter for å oppnå full anestesi.
- Når musen er fullstendig bedøvet (dvs. langsom, men jevn pustefrekvens ved omtrent en syklus per 2 s, kombinert med fravær av en haleklypekrefleks), fjern musen fra induksjonskammeret og plasser musehodet i den stereotaktiske rammen.
- Plasser bedøvelsesslangens nesekegle over musens snute.
- Oppretthold anestesi med 1,5 % isofluran blandet med 100 % rent oksygen ved en strømningshastighet på 1 l/min frem til slutten av operasjonen. Kontroller regelmessig pustefrekvensen, og lever en hale eller tåklemme minst hvert 15. minutt gjennom hele operasjonen for å vurdere passende anestesi. Juster isoflurankonsentrasjonen etter behov for å opprettholde ønsket anestesidybde.
- TBI-kirurgi
- Administrer buprenorfin (1 mg/kg, subkutant) ved hjelp av insulinsprøyter til engangsbruk og påfør oftalmisk salve på musens øyne.
- Fjern håret fra toppen av hodet ved å trimme med saks 1, og deretter bruke hårfjerningsmiddel i 1 min.
FORSIKTIG: Ikke bruk hårfjerningsmiddelproduktet i mer enn 3 minutter i hodebunnen, da det er hudirriterende. Unngå å få noe hårfjerningsmiddel på musens øyne. - Rengjør hodebunnen huden ved å bruke gasbind og bomull-tipped applikatorer. Deretter desinfiserer huden, bruker 75% etanol først og deretter betadin. Gjenta dette tre ganger (dvs. etanol etterfulgt av betadin), og la den endelige applikasjonen av betadin på huden.
- Kontroller bedøvelsesdybden på nytt for å sikre at musen er fullstendig bedøvet (dvs. langsomme, men jevne pustefrekvenser ved omtrent en syklus per 2 s, kombinert med fravær av haleklypekrefleks). Telt huden med kirurgisk tang 3, og lag et 12-15 mm langt midtlinjesnitt som starter ca. 3 mm bakover fra øynene.
- Excise huden over venstre og høyre halvkule av skallen ved hjelp av vårsaks 2.
- Når skallen er utsatt, fjern periosteum ved å gni forsiktig med en steril bomullstippet applikator og skylle med sterilt saltvann.
- Visuelt inspiser tilstanden til skallen for å sikre at den er intakt, bortsett fra de to små hullene, som ble laget for den forrige virusinjeksjonsoperasjonen.
- Tørk skalleområdet og merk TBI-nedslagsstedet med følgende koordinater: 2,5 mm bakenfor Bregma og 2 mm lateralt fra sagittalsuturen til høyre (figur 2B).
- Fjern musen raskt fra den stereotaksiske rammen og plasser hodet på bufferputen under TBI-enheten.
- Juster kollisjonsspissen etter det markerte nedslagsstedet.
- Løft metallsøylen ved å trekke den tethered nylonstrengen til 15 cm over musehodet og slipp den deretter, slik at vekten faller fritt på transduserstangen, som er i kontakt med skalletoppen på TBI-stedet. Ikke berør musehodet når du leverer TBI-effekten.
- Flytt musen på varmeteppet, og legg den på ryggen mens du overvåker pustestatusen.
- Når musen retter seg fra liggende til utsatt stilling, plasser musen i isofluran induksjonskammer i ~5 min med 3% isofluran blandet med 100% rent oksygen ved en strømningshastighet på 1,5 l / min.
- Når musen er fullstendig bedøvet (dvs. langsom, men jevn pustefrekvens ved omtrent en syklus per 2 s, kombinert med fravær av en haleklyperefleks), gjenta trinn 2.3.9-2.3.14 for å oppnå totalt 10 støt.
MERK: Ti TBI-påvirkninger har vist seg å indusere robust fenotype med lav musedødelighet i vår studie (data ikke publisert ennå). Parametrene kan justeres for å oppnå en annen alvorlighetsgrad av hjerneskade ved å øke eller redusere antall slag og/eller høyden som vekten frigjøres fra. Alle parametere er underlagt godkjenning av lokale IACUC. - Sjekk skallen under et kirurgisk mikroskop, og fjern musen fra studien hvis en kraniebrudd har oppstått.
- For en sham kirurgi, følg de samme prosedyrene som beskrevet ovenfor, inkludert plassering av dyret under påvirkningen, men uten å levere TBI-påvirkningene.
- Etter at musen har rettigheter seg fra liggende til utsatt stilling etter 10 TBI-påvirkningen, plasser musen i isofluraninduksjonskammeret i ~ 5 minutter. Følg trinn 2.2.6-2.2.8 for å plassere musehodet på den stereotaksiske rammen for kranialvinduimplantasjonsoperasjonen beskrevet nedenfor.
3. Kirurgi for implantasjon av kranialvindu
MERK: Kranialvinduimplantasjonstrinnene nedenfor ble adoptert fra Goldey et al.9, og deres spesifikasjoner av hodestolpen og bildebrønnen ble brukt her.
- Forberedelse av vindu
MERK: Fullfør vindusforberedelsen i trinn 2.2.2 før du starter TBI-operasjonen. Vinduet er laget av to runde glassdeksler (en 3 mm og en 5 mm i diameter, som indikert i figur 2C) som er forbundet med gjennomsiktig optisk lim, som beskrevet nedenfor.- Desinfiser glassdekslene ved å senke dem i 75% etanol i 15 minutter. Ta glassdekslene ut av etanolen og la dem tørke på en steril overflate (dvs. lokket på en steril 24-brønnsplate) i ~ 10 minutter.
- Fyll en insulinsprøyte med gjennomsiktig optisk lim samtidig som du unngår bobledannelse. Under mikroskop 1 (materialfortegnelse) ved 0,67x forstørrelse, sett en liten dråpe (~ 1 μL) optisk lim i midten av 5 mm dekselet. Deretter plasserer du umiddelbart 3 mm dekselet på toppen, og sentrerer det med 5 mm dekselet.
- Påfør trykk forsiktig med fin tang for å spre limet jevnt. Kast glassvinduet hvis det dannes en boble eller vegg rundt 3 mm dekselet.
- For å herde limet, plasser dekslene i en UV-boks i 150 s med en effekt på 20 x 100 μJ / cm2. Kontroller at de to dekslene sitter godt sammen, ved å bruke tang 4 til å skyve forsiktig på siden av 3 mm-glippen. Hvis dekselet beveger seg, plasser det tilbake i UV-boksen i ytterligere 60 s. Oppbevar glassvinduet i en steril 24-brønns plate for senere bruk.
- Grov skalleoverflaten.
MERK: Herfra utfører du alle trinnene i seksjon 3 under et kirurgisk mikroskop. Start med 10x, og juster til ønsket forstørrelse.- Bor forsiktig og sakte overflaten av skallen ved hjelp av en FG4-karbidbit med lav rotorhastighet (dvs. utgangsnummer satt til ~ 1-2) for å fjerne gjenværende periosteum og skape en grov skalleoverflate, slik at tannsementen binder seg sikkert med skallen. En skalpell kan også brukes her i stedet for en drill som et alternativ.
- Bruk saltvann til å skylle og fjerne beinstøv fra skalleoverflaten.
- Skill musklene.
MERK: Muskelseparasjon tjener til å øke overflaten av det eksponerte skallebenet som vil fungere som et kontaktpunkt for tannsementen, og dermed sikre implantatets strukturelle integritet. Dette muskelseparasjonstrinnet eksponerer vanligvis ~ 3 mm av den temporale skalleplaten.- Ved ca. 5 mm bakenfor øyet, hvor suturen som forbinder parietale og temporale skallen er plassert, sett forsiktig inn de lukkede fine spissene (#5/45 tang) for å skille sidemuskulaturen fra skallen, og beveg forsiktig de lukkede spissene i bakre retning til lambdoidsuturen.
- Separat sidemuskulaturen på siden der implantasjon av kranialvinduet vil oppstå.
MERK: Vær forsiktig så du ikke skiller musklene for nær øyet, for å unngå å skade den oftalmiske arterien; Ellers kan alvorlig og vedvarende blødning oppstå. Ikke skill muskler fra oksepitalbenet, da musen krever at disse musklene løfter hodet. - Vask bort rusk fra operasjonsstedet med saltvann og tørk området med gasbind. Gelskum kan påføres operasjonsstedet for å stoppe blødningen.
- Implanter hodeposten.
- Bruk en skreddersydd titanhodepost (figur 2D), beskrevet i en tidligere publikasjon9, for å feste musehodet sikkert mens du utfører kraniotomioperasjonen, og for påfølgende to-foton avbildning.
- Bruk en markørpenn og en kirurgisk tykkelse for å spore omkretsen av kraniotomien på den rene og tørre skallen på høyre side. Midtpunktet til den sporede sirkelen er 2, 5 mm bakre til Bregma og 1, 5 mm av sagittal suturen på høyre halvkule. Diameteren på den sporede sirkelen er ca. 3, 2-3, 5 mm, litt større enn 3 mm glassdekselet. Forsikre deg om at kraniotomisirkelen kan dekke virusinjeksjonsstedene (de to hullene som ble laget mens du injiserer viruset, kan brukes som referanse) og TBI-stedet.
- Løsne ørestangen og roter hodet slik at kraniotomiplanet er helt horisontalt, og stram deretter ørestangen igjen.
- Bruk trepinnen på en bomullstippet applikator for å legge til to små dråper superlim på for- og bakkanten av hodestolpen.
- Plasser titanhodeposten over midten av kraniotomien, og juster den raskt for å hvile i samme plan som der kranialvinduet skal implanteres. Påfør lett trykk til superlimet er tørket; Dette tar vanligvis ~ 30 s.
- Forbered dental sement i en forkjølt keramisk blandefat (opphold minst 10 minutter i en -20 ° C fryser): kombiner 300 mg sementpulver, seks dråper rask base væske og en dråpe katalysator, og rør deretter blandingen til grundig blandet (~ 15 ganger).
MERK: Sementen må være deigaktig. Hvis den er for tynn, rør inn litt mer sementpulver. Hvis den er for tykk, rør inn hurtigbasevæske en dråpe om gangen til en deigaktig konsistens oppnås. - Påfør raskt en sjenerøs mengde dental sementblanding på utsiden av den sporede omkretsen, og dekk enhver eksponert beinoverflate. Dekk imidlertid ikke til kraniotomiområdet. La ~15 min for tannsementen tørke og herde før du fortsetter.
- Slipp ørestangen og fest hodepinnen til metallrammen for å sikre at hodet er stabilt for presis boring langs den markerte kraniotomiomkretsen. Hvis det er sement over kraniotomistedet, bruk FG4-karbidbiten til å bore og fjerne den.
- Kraniotomi
- Bruk en kirurgisk tykkelse for å verifisere diameteren på den markerte sirkelen, som definert i trinn 3.4.2. Juster etter behov, slik at kranialvinduet passer godt inne i kraniotomien.
- Bruk en elektrisk tannbor, ets og tynn skallen langs utsiden av den markerte sirkelen, ved hjelp av en FG4-karbidbit først (hastighet satt til en utgang ~ 9-10). Dette skaper et "spor" for å tynne skallen.
FORSIKTIG: For å minimere varmeskader og oppnå et jevnt spor, fortsett å flytte borekronen. Ikke bor samme sted i mer enn 2 s. - Stopp boringen med jevne mellomrom og vanne hele området med sterilt saltvann, for å redusere oppvarmingen fra boret og for å vaske bort beinstøvet.
- Fortsett å tynne skallen ved hjelp av en FG1/4 karbidbit, som beskrevet i trinn 3.5.2, til skallen er papirtynn og gjennomsiktig.
MERK: Bruk av to hender til å holde boret kan gjøre det lettere å kontrollere boret og unngå å sette borkronen inn i hjernen. - Fullfør skalletynningen ved hjelp av en EF4-karbidbit. Når det oppstår en sprekk mellom beinklaffen og det omkringliggende skallebenet, er det noen ganger en frigjøring av cerebral spinalvæske (CSF), noe som indikerer at skallen er fullstendig boret gjennom.
- Fortsett tynning og boring gjennom resten av skallen langs sporet. Unngå å bore gjennom det punktet hvor en åpenbar vaskulatur krysser under skallen for å forhindre blødning.
- Sett inn en fin tangspiss (tang 1) ~0,5 mm gjennom det sprukne stedet, og løft benklaffen forsiktig oppover uten å rykke inn den underliggende hjernen.
- Etter at beinklaffen er fjernet, skyll kraniotomiområdet med saltvann. Hjerneoverflaten kan være 1-2 mm høyere enn kraniotomikanten.
- Fra dette trinnet, må du alltid dekke den eksponerte hjernen med saltvann for å beskytte hjernevevet.
- Det kan blø når benlappen løftes på de opprinnelige AAV-injeksjonsstedene på grunn av vevsadhesjon og vaskulaturvekst etter injeksjonsoperasjonen. Hvis dette skjer, trykk forsiktig på stedet med en tørr bomullstippet applikator i ~ 2 min (eller lenger etter behov). Gelskum kan brukes til å stoppe blødningen. Ikke bruk kjemikalier eller varmetang for å stoppe blødningen, da dette kan forårsake skade.
- Bruk tang 1 for å forsiktig fjerne det synlige araknoidale stoffet.
- Implantat glass vindu
- Bruk den kirurgiske tangen 2 til å plukke opp det sterile glassvinduet, med 3 mm glassdekselet vendt ned. Plasser og juster glassvinduet over kraniotomiområdet for å sikre at vinduet kan passe godt til kraniotomikanten. 5 mm glassdeksel er på toppen.
- Forbered dental sement som følger: kombiner 100 mg sementpulver, to dråper rask basevæske og en dråpe katalysator. Rør blandingen til den er grundig blandet (~15 ganger). Vent ~6 min til sementen blir deigaktig og tykk. Hvis sementen er for tynn, kan den sive inn i rommet under vinduet i trinn 3.6.4 og skjule vinduet.
- Mens du venter på at sementen blir pastaaktig og tykk, må du bruke et tilstrekkelig trykk på vinduet gjennom en stereotaksisk manipulator for å kontrollere at skallen kan komme i kontakt med glassvinduet sikkert og tett. Sørg for at tannsementvæsken i trinn 3.6.4 ikke når rommet under glasset og dermed skjuler vinduet.
- Bruk en justerbar presisjonsapplikatorbørste for å legge til en liten mengde sement langs vinduskanten for å forsegle glassvinduet med skallen. Vent i ~ 10 min for å la sementen tørke helt, og slipp deretter forsiktig og fjern manipulatoren over vinduet. Fra og med dette trinnet tar det ~ 4 timer å fullføre de 10 TBI-støtene og implantere hodestolpen og kranialvinduet.
- Trim tannsementen ved hjelp av tannboret med en FG4-karbidbit hvis det er overflødig sement som dekker vinduet.
MERK: Overdreven sement rundt vinduet kan forhindre at objektivlinsene med to foton nærmer seg vindusoverflaten.
- Implantere bildebrønnen
MERK: En avbildningsbrønn (figur 2D) er en gummiring med en utvendig diameter på ~ 1,6 cm, som samsvarer med hodepostens toppoverflate og holder vann over kranialvinduet for to-foton avbildning.- Etter at vindusimplantasjonen er fullført, bor du bort tannsementrestene på hodepostens toppoverflate, og rengjør området med vått kirurgisk gasbind. La området tørke i ~3 min.
- Bruk en applikator med bomullstipp til å dyppe en liten mengde superlim og lim den på hodestolpens toppoverflate. Legg gummiringen raskt på hodestolpen. Påfør middels trykk på gummiringen i ~ 2 min for å sikre nær kontakt med hodestolpen. Bruk superlim sparsomt, ellers kan det feste seg til glassvinduet og skjule to-foton bildebehandling.
- Analgetisk og antibiotikaadministrasjon
- Umiddelbart etter implantering av bildebrønnen, men før isofluran er avsluttet, skal cefazolin [500 mg/kg (333 mg/ml, vanligvis ~45 μL) administreres intramuskulært] og meloksikam (5 mg/kg, subkutant) ved bruk av insulinsprøyter til engangsbruk.
- Etter legemiddeladministrasjon, avbryt anestesien, slipp musen fra den stereotaksiske rammen, og returner musen til hjemmeburet, som ligger over et varmeteppe.
- Overvåk musen nøye i ~15 min til den er ambulerende.
MERK: Hus musene individuelt, da de kan bite gummiavbildningen godt av andre mus. Gi mat og vanngel nær musen i buret for tilgang ad libitum. - Administrer buprenorfin (1 mg/kg, subkutant) og meloksikam (5 mg/kg, subkutant) igjen hver 8. time etter forrige dose inntil 48 timer etter implantasjonsoperasjonen i kranievinduet.
4. Intravital to-foton bildebehandling
- Bruk mikroskop 2 (materialfortegnelse), utstyrt med en justerbar sammenhengende multifotonlaser og et 20x forstørrelsesmål (NA 1.0; vann-nedsenking), for intravital avbildning18. Filteret som brukes til EGFP-signalet er "BP 500-550".
- Forbered kranialvindumusen for intravital avbildning.
- Fra og med operasjonsdagen (betegnet som dag 0), utfør to-foton avbildning på designede tidspunkter etter TBI. Plasser vindusmusen i anestesiinduksjonskammeret og administrer 3 % isofluran blandet med bærergass med en strømningshastighet på 1,5 l/min i 5 minutter.
MERK: Bærergassen kan enten være romluft eller 100% oksygen. - Når musen er fullstendig bedøvet (dvs. langsom, men jevn pustefrekvens ved omtrent en syklus per 2 s, kombinert med fravær av en haleklypekrefleks), fjern musen fra induksjonskammeret og klem hodepinnen raskt til en brakett. La musens torso ligge på en rund plastplate (19 cm diameter) som er utstyrt med braketten.
MERK: En håndvarm pute ble plassert under musens torso for å gi varmestøtte under intravital avbildning. - Påfør smøremiddel oftalmisk salve på musens øyne og plasser anestesirørets nesekegle over musens snute. Oppretthold anestesi ved å bruke 1,5 % isofluran med bærergass ved en strømningshastighet på 1 l/min.
- Kontroller pustefrekvensen regelmessig, og lever en hale- eller tåklemme minst hvert 15. minutt gjennom avbildningen for å vurdere passende anestesi. Juster isoflurankonsentrasjonen etter behov for å opprettholde ønsket anestesidybde.
- Juster musehodet for å sikre at kranialvinduet er rett under den to-foton objektivlinsen. Tilsett litt vann i avbildningen godt over kranialvinduet. Senk målet slik at det blir nedsenket i vannet.
- Fra og med operasjonsdagen (betegnet som dag 0), utfør to-foton avbildning på designede tidspunkter etter TBI. Plasser vindusmusen i anestesiinduksjonskammeret og administrer 3 % isofluran blandet med bærergass med en strømningshastighet på 1,5 l/min i 5 minutter.
- Intravital avbildning av intrakranielle vindusmus
- Slå på omfanget kvikksølvlampe. Se hjernen med epifluorescens gjennom okularet først.
MERK: Vaskulaturen ser svart ut. Velg et område der vinduet er klart. Slå av epifluorescens, sett laserbølgelengden til 860 nm for EGFP-signalet, og juster laserinnstillingen for optimalt (dvs. lyst, men ikke mettet) signal. - Sett skannemodus til Ramme og linjetrinnet til 1. Sett gjennomsnittstallet til 16, bitdybden til 8-bit, modusen som linje og metoden som middelverdi.
- Bruk vaskulaturmønsteret som et "referansekart" for å avbilde den samme hjernegruppen for senere langsgående avbildning. Se for deg det overfladiske nivået (lag I, mindre enn 100 μm fra meningealoverflaten) for tre plan der den kortikale vaskulaturen dominerer gjennom en z-stack-modus, med et interplanintervall på 10 μm, som angitt i figur 3A.
- Bilde seks plan på dypt nivå (lag IV og V, ~400 μm dypere enn overflatisk nivå), gjennom en z-stack-modus som angitt i figur 3A, med et intervall på 10 μm og en skannehastighet på 8.
- Etter å ha fullført avbildningen (~ 20 min per mus), avbryt anestesien, slipp musen fra rammene og sett den tilbake til hjemmeburet som ligger over et varmeteppe. Overvåk musen fortløpende til den er ambulerende, noe som vanligvis tar ~ 7 min.
- Langsgående bilde musen på dag 0, 1 uke og 4 måneder etter TBI-operasjonen.
- Slå på omfanget kvikksølvlampe. Se hjernen med epifluorescens gjennom okularet først.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som bevis på konsept for denne protokollen ble virale partikler som uttrykker AAV-Syn1-EGFP injisert i hjernebarken hos mannlige TDP-43Q331K / Q331K-mus (C57BL/6J-bakgrunn)19 i en alder av 3 måneder. Det bemerkes at villtype C57BL/6J dyr også kan brukes, men denne studien ble utført i TDP-43 Q331K/ Q331K mus fordi laboratoriet er fokusert på nevrodegenerativ sykdomsforskning. TBI-operasjon ble utført 4 uker etter AAV-injeksjon. Innenfor samme kirurgiske omgivelser ble hodestolpe og kranialvindu implantert. Musen ble serieavbildet med tofotonmikroskop dag 0, 1 uke og 4 måneder etter TBI-kirurgi (figur 1). Generelt tok injeksjonsoperasjonen ~ 30 min, og TBI-operasjonen tok ~ 1 time per mus. Under TBI-operasjonen krevde musene generelt lengre tid for å rette seg fra en liggende stilling til en utsatt stilling etter påfølgende påvirkninger, sammenlignet med de første påvirkningene. For eksempel kan en mus ha krevd 2 min for å rette posisjonen etter det første støtet, men krevde 10 minutter for å rette posisjonenetter det 10. støtet. For kranial vindu implantasjon kirurgi, ~ 3 h var vanligvis nødvendig for å utføre alle trinnene, men tok lengre tid enn nødvendig hvis vedvarende blødning oppstod. To-foton avbildning krevde vanligvis 20 min per mus for å skaffe alle bildene. For den nåværende studien som involverte tre mus med uttrykk for EGFP, viste dyrene ikke tegn på kraniebrudd, og de døde heller ikke under operasjonen eller før 4 måneder etter operasjonen. Både sykeligheten og kraniebruddraten var 0 %. Dette stemmer overens med den relativt lave (<10%) dødeligheten i en lignende modell for å indusere TBI, men uten et kranialvinduimplantat 7,8.
En vektfallenhet (figur 2A), som tidligere er rapportert7,8, ble brukt til å levere TBI-støt på musehodet på høyre side, som angitt i figur 2B. Et gjennomsiktig plastrør (nr. 5 i figur 2A; 60 cm i lengde og 1,4 cm i indre diameter) ble sikkert og vertikalt festet til en metallbrakett, og en plastkollisjonskolonne (nr. 7 i figur 2A; 10 cm i lengde og 1,3 cm i diameter, med en flat rund spiss på 2 mm i diameter) ble plassert i det vertikale røret. En metallvekt på 50 g (nr. 6 i figur 2A) ble plassert over kollisjonen og bundet med en nylonstreng (nr. 4 i figur 2A). En bufferpute (nr. 8 i figur 2A; 9 cm x 9 cm x 1 cm [lengde x bredde x dybde], laget av polyetylenskum og bomullsgasbind) ble plassert under musehodet for å bufre og absorbere kollisjonsenergien.
Kranialvinduet var laget av to glassdeksler kombinert med optisk lim (figur 2C), og glassdekselet på 3 mm diameter var siden som berørte hjerneoverflaten. Tofotonavbildning ble utført på to forskjellige dyp (figur 3A) fra hjerneoverflaten: 1) et overflatisk nivå der den kortikale vaskulaturen var rikelig og hadde en relativt stor lumendiameter som virket svart, men med sparsomme EGFP-positive cellelegemer; og 2) et dypere nivå der vaskulaturen var sparsom og hadde en liten lumendiameter, med mange EGFP-positive celler synlige.
Ved ~4 timer (dag 0) etter operasjonen ble tofotonavbildning utført i tre plan, med et intervall på 10 μm på overflatisk nivå (lag I, mindre enn 100 μm fra meningealoverflaten) først der vaskulaturen virket svart (indikert med de stiplede røde linjene i figur 3B), og ble brukt som referansekart for neste bildeøkt for å lokalisere det opprinnelige bildeområdet. På dette overfladiske nivået var de kortikale vaskulatur- og nevronprosessene de dominerende strukturene som kunne observeres, mens de EGFP-positive cellelegemene var sparsomme. Etter avbildning på overfladisk nivå ble fokuset justert nedover med ~400 μm, dypere enn det overfladiske nivået, inn i cortex (lag IV og V) for å avbilde EGFP-positive nevroncellelegemer. Bildene ble tatt innenfor seks plan, med et intervall på 10 μm. EGFP-proteinuttrykk ble diffust fordelt gjennom hele cellekroppen, som angitt i figur 3C. Det var sporadisk forekomst av noen EGFP-puncta utenfor cellelegemene, noe som kunne representere EGFP-inneslutninger som ble dannet over tid i aksoner eller dendritter. Denne protokollen resulterer i AAV-SYN1-EGFP-ekspresjon ~2-3 mm rundt injeksjonsstedet, som kan defineres ved histologisk analyse av post mortem-vev.
Ved 1 uke og 4 måneder etter TBI ble vaskulaturmønsteret observert på dag 0 brukt som referanse for å lokalisere samme bildeområde (figur 3D, F). Vaskulaturmønsteret i figur 3D,F ligner det i figur 3B. Bildeprosedyren for 1 uke og 4 måneder etter TBI var den samme som beskrevet ovenfor for dag 0-tidspunktet, og EGFP-uttrykk ble påvist i hele cellekroppen som tidligere (figur 3E,G). Fluorescensintensiteten på dag 0 og 4 måneder var lik både på overfladisk og dypere nivå. Imidlertid var fluorescensintensiteten ved 1 uke lavere enn på dag 0 og 4 måneder på både overfladiske og dype nivåer, noe som kan skyldes translasjonsundertrykkelsen rapportert for andre TBI-modeller20. Spesielt viser kvaliteten på bildene ved 4 måneder sammenlignet med dag 0 at kranialvinduet har opprettholdt klarhet og integritet, og at virusuttrykket fortsatt er robust 4 måneder etter operasjonen for effektiv intravital avbildning. Som EGFP uttrykker som et relativt diffust protein, kan fluorescenssignalene bli bedre løst og diskret når EGFP er fusjonert til et protein av interesse.
Figur 1: Tidslinjen for denne intravitale bildebehandlingsprotokollen. Protokollen innledes med virusinjeksjon. TBI og kranialvinduskirurgi utføres i samme operasjonsøkt 2-4 uker etter virusinjeksjon. Intravital bildebehandling utføres på dag 0, 1 uke, 4 måneder etter TBI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Diagrammer for TBI-enheten, TBI-nedslagsstedet og klargjøring av vindu. (A) Utstyr for TBI-enheten med vektfall. 1: sokkel, 2: brakett, 3: justerbar klemme, 4: nylonstreng, 5: vektfallende tunnel, 6: metallvektkolonne (50 g), 7: slagor, 8: bufferpute. (B) Et skjema over virusinjeksjonen og TBI-nedslagsstedet, med koordinatene 2,5 mm bakenfor Bregma og 2 mm lateralt fra sagittalsuturen til høyre. (C) Et skjema for klargjøring av glassvinduet. To glassdeksel, 3 mm og 5 mm i diameter, kombineres ved hjelp av optisk lim. (D) Bilder av metallhodestolpen og avbildningsbrønnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av avbildningsplan og bildedata . (A) Flere plan avbildes på et overfladisk nivå der vaskulaturen befinner seg og et dypt nivå. Bildene samles som følger: tre plan på overfladisk nivå, hvor kortikal vaskulatur og nevronprosesser er de dominerende EGFP-positive strukturer, og seks plan på dypt nivå, hvor EGFP-positive cellelegemer hovedsakelig observeres, med et 10 μm intervall mellom naboplanene. Hvert fly har en størrelse på 425,10 μm x 425,10 μm. (B) Representativt bilde av et fly på overfladisk nivå ved dag 0 tidspunkt. De stiplede røde linjene indikerer vaskulaturomrisset som kan brukes som referanse for å finne det opprinnelige avbildningsstedet for etterfølgende tidspunkter. (C) Representativt bilde av et fly i det dype nivået på dagen 0 tidspunkt kort tid etter TBI. (D) Representativt bilde av et fly på overfladisk nivå på 1 ukes tidspunkt. De stiplede røde linjene angir vaskulaturen, lik omrisset på dag 0 i figur 3B, og bekrefter at tofotonavbildningen ble utført på et lignende sted på dag 0 og 1 uke etter TBI. (E) Representativt bilde i det dype nivået på 1 ukes tidspunkt etter TBI. (F) Samme som B og D, 4 måneder etter TBI. (g) Samme som C og E, 4 måneder etter TBI. Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble AAV-injeksjon, TBI-administrasjon og en hodepost med kranialvinduimplantasjon kombinert for langsgående bildeanalyse av EGFP-merkede nevroner i musehjernebarken (lag IV og V) for å observere effekten av TBI på kortikale nevroner. Denne studien bemerker at TBI-stedet som er valgt her, over hippocampus, gir en relativt flat og bred overflate for implantasjon av kranialvinduet. Omvendt er skallen relativt smal foran dette stedet, og derfor er det vanskelig å sikre at hodepinnen effektivt kommer i kontakt med overflaten av skallen. Mens bare TDP-43 Q331K/ Q331K musemodell ble brukt i denne studien, med tanke på laboratoriets forskning med fokus på ALS og FTD19, bør denne protokollen gjelde for de fleste andre musestammer. I tillegg til å merke nevroner som beskrevet her, kan ulike strategier brukes til å merke andre celletyper for intravital avbildning. En tilnærming er å uttrykke de genetisk kodede fluorescerende proteinene på en cellespesifikk måte, ved hjelp av Cre-Lox-rekombinasjonssystemet i genmodifiserte mus21. En annen tilnærming er å benytte visse virale serotyper for cellespesifikk transduksjon av genetisk kodede fluorescerende proteiner. Stedsspesifikk levering kan oppnås ved å utføre den intrakranielle injeksjonen på ønsket sted i hjernen. Effektiviteten og lettheten som man kan uttrykke cellespesifikke proteiner via viral transduksjon for intravital avbildning er en fordel i forhold til å lage transgene musemodeller.
For operasjonsprotokollene er det flere kritiske trinn som må utføres nøye. Når man borer hull på skallen for virusinjeksjon i starten av protokollen, må man være forsiktig med å skade vevet under skallen. Hvis vevskader oppstår under boring på skallen, vil det være betennelse, vevsadhesjon og angiogenese rundt skadestedet, og dermed øke risikoen for blødning under kraniotomi for kranialvinduimplantasjon. For administrering av TBI med vektdråpeenheten, plasserte denne studien en pute under musehodet for å bufre TBI-slagkraften, og dermed redusere sjansen for kraniebrudd. Ingen åpenbare hodebevegelser på rotasjonsretninger og akselerasjon ble observert, noe som støtter oppfatningen om at denne TBI-modellen har en relativt lav sjanse for diffusjonsaksonal skade. Interessant nok brukte Foda et al. en lignende vektdråpeanordning for å konstruere en lukket skalle TBI-skade på rotter, og en større, myk skumpute (12 cm tykk) ble plassert under rottehodet slik at den lett kunne bevege seg som svar på TBI-slagkraften på rotasjonsretning med akselerasjon, og dermed resultere i diffusjonsaksonal skade22. En av fordelene med den rørveiledende vektfall-TBI-modellen er at alvorlighetsgraden av traumet kan moduleres ved å endre vektfallhøyden (dvs. en høyere høyde for en større kraft) og / eller gjenta antall ganger virkningen leveres. For eksempel brukte Flierl et al. en lignende vektdråpeenhet som den nåværende studien for å indusere TBI på mus; vekten av metallet var 333 g, noe som induserte en mild TBI når den falt fra en høyde på 2 cm og en alvorlig TBI når den falt fra en høyde på 3 cm23. Kraniotomitrinnet før vindusimplantasjon må også utføres nøye for å unngå å skade hjernevevet under skallen. Periodisk flytting av borekronen til et annet område på skallen bidrar til å unngå overboring på samme sted, noe som kan føre til overdreven oppvarming, vevskader og blødninger; Videre kan ofte vanning med saltvann også avkjøle borestedet. Når du implanterer glassvinduet, er det viktig å justere glassplanet slik at det er parallelt med skalleoverflateplanet; Et tettsittende vindu i skallen forhindrer lekkasje av tannsementvæsken inn i rommet mellom vinduet og hjernen.
Hvis vinduet er uklart på dag 0 etter TBI-operasjonen, men fluorescerende signaler oppdages, kan tannsementen ha kommet inn i rommet mellom vinduet og hjernen, og danner dermed et sementlag som dekker hjerneoverflaten og skjuler fluorescensutslippet. I denne situasjonen kan man fjerne vinduet og tannsementen ved hjelp av boremetoden beskrevet i protokolltrinn 3.5, og deretter implantere et nytt glassvindu på det opprinnelige stedet, som beskrevet i detalj av Goldey et al.9. Hvis vinduet blir uklart på et senere stadium under den langsgående bildeprosessen, kan man forsøke å fjerne potensielle rusk ved å forsiktig gni vinduet med en bomullstippet applikator. Hvis dette ikke løser problemet, kan det skyldes gjenvekst av beinet og hjernehinnene under glassvinduet. I dette tilfellet kan man fjerne vinduet og bore for å fjerne det gjengrodde beinet og/eller pinsen fra hverandre og fjerne hjernehinnene, etterfulgt av implantasjon av et nytt glassvindu på det opprinnelige stedet, som beskrevet av Goldey et al.9. Som vist i resultatene er EGFP-uttrykk og fluorescens robust over et tidsforløp på ~ 4 måneder etter TBI. Man kan forvente en reduksjon av fluorescenssignal innen den første uken etter TBI, noe som sannsynligvis skyldes TBI-indusert translasjonsundertrykkelse som forårsaker en midlertidig reduksjon i global proteinsyntese20.
For å opprettholde høy bildekvalitet og oppnå avbildning i flere plan, ble mus under isoflurananestesi for å begrense bevegelsen. Det er imidlertid viktig å merke seg at anestesi kan påvirke studieresultatene. For eksempel har det blitt rapportert at mus under isoflurananestesi utviser forskjellig mikrogliaaktivitet som respons på fotodamage sammenlignet med våkne mus24. For to-foton bildebehandling er skannehastigheten og antall skanninger for signalgjennomsnitt (angitt som "nummer", under "gjennomsnitt") de viktigste faktorene som kan bestemme bildeoppløsningen. For å optimalisere oppløsningen kan man redusere skannehastigheten og øke gjennomsnittstallet, men en lavere hastighet og høyere gjennomsnittstall øker bildetiden for et bestemt synsfelt og kan forårsake fotobleking. Den nåværende studien tar sikte på å oppnå kronisk langsiktig avbildning på samme dyr på samme hjerneplassering. For å unngå potensiell fotobleking samtidig som man oppnådde tilstrekkelig oppløsning, ble to-foton avbildning utført med en skannehastighet på 8 med et gjennomsnitt på 16.
En alternativ tilnærming til å utføre en kraniotomi og implantere et glassvindu er å tynne skallen, i den grad den er gjennomsiktig og "papirtynn" for live imaging25,26,27. Det tynne skallevinduet kan opprettholde skalleens intakthet, og dermed unngå betennelsen indusert av den kirurgiske operasjonen. Derfor kan tynnskallevindutilnærmingen foretrekkes for levende avbildning med betennelsesrelevante markører og/eller over en relativt kortere periode (dvs. ~14 dager etter operasjonen, som rapportert25). For langtidsavbildning (dvs. 4 måneder, som beskrevet her) av kroniske neurodegenerative prosesser, i tillegg til å vurdere de akutte effektene av TBI på samme dyr, anbefales det å bruke et glassvindu implantert ved en kraniotomimetode.
Som nevnt innledningsvis er det flere bemerkelsesverdige fordeler med intravital avbildning for å studere ulike biologiske og patologiske hendelser i pattedyrhjernen. Det er imidlertid også noen begrensninger i denne protokollen. For eksempel beskriver contrecoup hjerneskade hjernekontusjonen eller hematomet fjernt fra, vanligvis motsatt av, kraften som kontakter stedet28,29,30. I denne studien ble TBI-påvirkningene levert til isselappen; Contrecoup skade forventes ventralt og utilgjengelig for intravital imaging. En histologisk analyse kan brukes som en komplementær tilnærming for å undersøke fenotyper av interesse utenfor nedslagsstedet som dekkes av kranialvinduet. I tillegg kan eksogen overekspresjon av visse proteiner også indusere toksisitet eller patologi. I denne studien ble det observert noen sporadiske EGFP puncta, noe som kan representere akkumuleringer på grunn av proteinoverekspresjon. Derfor anbefales det å inkludere et negativt kontrollprotein (f.eks. EGFP eller RFP alene) i studiedesignet for å adressere denne muligheten, spesielt hvis proteinet av interesse er tilbøyelig til å danne punkteringsstrukturer. Antallet proteiner som man kan studere samtidig er begrenset av lasere og evner i to-foton systemet. Det kan være mulig å avbilde mer enn en fluorofor (f.eks. EGFP, RFP, etc.) ved to-foton mikroskopi, selv om multipleksingsfunksjoner med konvensjonelle bredfelts- og konfokale mikroskoper ofte tillater analyser av flere proteiner i en enkelt vevsprøve. Til slutt er det viktig å inkludere en svindelkontroll som mottar alle de samme prosedyrene som TBI-dyret, bortsett fra vekttapspåvirkningene. Kranialvinduimplantasjonskirurgi er en invasiv operasjon og kan forårsake noen lokale endringer, for eksempel betennelse og endret intrakranielt trykk, noe som kan påvirke TBI-prosessen. En sham kontroll hjelper eksperimentalist vurdere fenotyper som skyldes virkningen versus kirurgiske prosedyrer.
Oppsummert introduserer denne protokollen en metode for å langsgående bilde proteiner spesifikt i nevronene i musens hjernebark som svar på TBI. Denne protokollen kan modifiseres for å analysere ekspresjon og lokalisering av forskjellige cellespesifikke proteiner som respons på TBI. Målet med denne protokollen er å gi en tilnærming for å studere de umiddelbare og langsiktige konsekvensene av TBI i pattedyrhjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det oppgis ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Miguel Sena-Esteves ved University of Massachusetts Chan Medical School for å gi bort AAV (PHP.eB)-Syn1-EGFP-viruset, og Debra Cameron ved University of Massachusetts Chan Medical School for å tegne mushodeskalleskissen. Vi takker også nåværende og tidligere medlemmer av Bosco, Schafer og Henninger laboratorier for deres forslag og støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Department of Defense (W81XWH202071/PRARP) til DAB, DS og NH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
