Zeitraffer-Bildgebung von Mausmakrophage Chemotaxis

Traditionell waren Makrophagen in Echtzeit-Chemotaxis-Assays schwer zu untersuchen, da sich die Zellen langsam bewegen. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, Makrophagen abzubilden, die in einem chemotaktischen Gradienten für bis zu sechs Stunden oder länger migriert werden. Im Vergleich zu Implantat-Assays wie Transfer-Assays hat diese Technik die Vorteile, dass Makrophagenmorphologie beobachtet und Parameter wie Zellgeschwindigkeit und chemotaktische Effizienz gemessen werden können.

Makrophagen sind an vielen entzündlichen Erkrankungen beteiligt, und diese Technik kann nützlich sein, um Medikamente zu studieren, die entwickelt wurden, um Chemotaxis zu hemmen. Es kann auch auf andere Zelltypen wie menschliche Monozyten angewendet werden. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, ist es am besten, die Chemotaxis-Kammern zu füllen, bevor Sie mit Zellen arbeiten.

Einer der wichtigsten Aspekte der Technik ist die Vermeidung von Luftblasen. Beginnen Sie mit dem Vorfüllen der Verbindungskanäle von ein oder zwei Chemotaxis-Dias mit modifiziertem RPMI 1640 HEPES Medium, das nach Manuskriptanweisungen vorbereitet ist. Legen Sie eine Rutsche in eine Zellkulturschale und legen Sie die Schale auf einen Aluminiumblock, der auf 37 Grad Celsius erhitzt wird.

Fügen Sie dann Stecker in die Ports eins und vier ein. Verwenden Sie eine 200 Mikroliter abgeschrägte Pipettenspitze, um 15 Mikroliter des modifizierten RPMI 1640 HEPES Medium in Füllanschluss drei zu deponieren. Als nächstes setzen Sie die Pipettenspitze in Port zwei ein und aspirieren Sie 15 Mikroliter mit einer mäßig schnellen Rate, die den Anschlusskanal sowie die beiden flankierenden Versorgungskanäle vorfüllen.

Bedecken Sie die Füllöffnungen zwei und drei mit Kappen und legen Sie die Chemotaxis-Rutsche auf einem Rack in einer geschlossenen Feuchtigkeitskammer in einem ansonsten trockenen und kohlendioxidfreien Inkubator bei 37 Grad Celsius. Um die Makrophagen zu isolieren, legen Sie einen 24 Gauge Plastikkatheter in die Peritonealhöhle einer geopferten drei bis vier Monate alten Maus ein und verwenden Sie eine fünf Milliliter Plastikspritze, um die Höhle mit der eiskalten Gepufferten Salzlösung hanks ohne Kalzium oder Magnesium zu spülen. Nach dem Sammeln des lavaged Mediums in einem Rohr zentrieren Sie es bei 300 mal G für 6,5 Minuten.

Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter des modifizierten RPMI 1640 Mediums wieder auf. Verdünnen Sie ein Aliquot der Zellen Suspension eins bis 20. Verwenden Sie dann ein Zählgerät, um die Zellen zu zählen.

Verdünnen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von 10 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter und halten Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem beheizten Aluminiumblock. Pipetdieren Sie die Zellsuspension fünf Mal nach oben und unten, um Klumpen zu reduzieren, und legen Sie vorsichtig 10 Mikroliter auf Port drei der Chemotaxis Kammer ab. Legen Sie die Pipettenspitze in Port 2, und ziehen Sie die Zellaufhängung langsam in den Verbindungskanal.

Sobald die Zellsuspension eingeführt wurde, entfernen Sie die Stecker an den Ports eins und vier, um den Strom zu verhaften, und legen Sie Kappen an allen vier Füllöffnungen. Dann legen Sie die Chemotaxis in der 37 Grad Celsius Feuchtigkeitskammer für zwei bis drei Stunden. Inspizieren Sie den Beobachtungsbereich mit einem invertierten Mikroskop.

Legen Sie dann Stecker in die Füllöffnungen eins und zwei, und überprüfen Sie, ob Füllanschluss drei nach oben mit Medium gefüllt ist, und frei von Luftblasen. Verwenden Sie bei Bedarf eine sterile Spritzennadel mit 27 Messgeräten, um Luftblasen zu lösen. Als nächstes 60 Mikroliter Medium mit einer 100 Mikroliter mechanischen Pipte aspirieren und die Spitze in Füllanschluss drei legen.

Verwenden Sie den Volumeneinstellungsring, um das Medium langsam und stetig in das Reservoir zu injizieren, bis es nach ein bis zwei Minuten die Spitze des Füllanschlusses vier erreicht. Um das zweite Reservoir zu füllen, verschieben Sie den Stecker von Port 1 und setzen Ihn langsam in Port 3 ein. 50 Mikroliter Medium ansaugen und die Pipettenspitze in Port vier geben und das Medium langsam in das zweite Reservoir injizieren, so dass es nach ein bis zwei Minuten die Spitze des Füllanschlusses eins erreicht.

Fügen Sie 495 Mikroliter Medium zu einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzu und fügen Sie fünf Mikroliter Patent blau fünf hinzu. Kurz wirbeln Sie die Mischung, dann fügen Sie 5,4 Mikroliter rekombinante Maus Komplement C5a und Wirbel wieder zu mischen. Stellen Sie sicher, dass die flache Vertiefung an der Spitze von Port eins mittelfrei ist, und legen Sie 15 Mikroliter des blauen Komplement C5a enthaltendes Medium ab.

Legen Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze in füllanschluss vier ein und drehen Sie langsam den Volumeneinstellungsring, um das Medium in das gegenüberliegende Reservoir zu ziehen. Zeichnen Sie Luft in die kurze vertikale Säule des Füllanschlusses eins, bis sich die Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle in der Mitte der Spalte befindet. Dann stecke Anschluss eins, bevor du die Pipette sanft von Port 4 anheben, um sicherzustellen, dass die Folie an Ort und Stelle bleibt, und langsam Anschluss vier stecken.

Um Zeitraffer-Bildgebung durchzuführen, legen Sie das Chemotaxis-Dia auf die Bühne eines invertierten Mikroskops, das mit einem Bühneninkubator ausgestattet ist, und stellen Sie den Beobachtungsbereich mit einer 10-Fach-Phasenkontrastobjektivlinse ab, wobei sie sich auf die Makrophagen-Lamellipodie konzentriert. Die Chemotaxis-Folie, die für die Zeitraffer-Videomikroskopie von peritonealen Makrophagen der Maus verwendet wird, verfügt über drei Chemotaxis-Kammern, von denen jede vier Füllöffnungen hat. Im Beobachtungsbereich jeder Kammer wurden Zellen ausgesät.

Und nach einer zwei- bis dreistündigen Inkubation füllten sich die Kammern langsam mit Medium. Bei der Inspektion der Zellen im Beobachtungsbereich waren bis zu zwei Drittel der Zellen ausgewaschen worden. Im Allgemeinen wurden schwach anhängliche B-1-Zellen ausgewaschen, und die übrigen Zellen waren überwiegend Makrophagen.

Um die Makrophagen von den B-Zellen zu unterscheiden, wurden frisch isolierte Zellen mit spezifischen Antikörpern beschriftet. Die Makrophagen wurden mit grüner Fluoreszenz, die B-Zellen mit Rot und die Zellkerne mit Blau beschriftet. Die Makrophagenmigration wurde untersucht, indem Komplement C5a, ein Chemoattractant, in eines der beiden Reservoirs eingeführt wurde.

Die Migrationsspuren von Makrophagen, die in einem Komplement-C5-Gradienten migriert werden, wurden aufgezeichnet. Der Startpunkt jeder Migrationsspur wurde auf X gleich Null normalisiert und Y gleich Null, um ein Migrationsdiagramm zu erstellen. Anschließend wurden die Zellgeschwindigkeit und die chemotaktische Effizienz einzelner Makrophagen berechnet.

Diese Technik war nützlich, um die Rollen von G-Protein-Untereinheiten und Rho GTPases und Makrophagenmotilität in Chemotaxis zu studieren.