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Biochemistry

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

Published: November 1, 2018 doi: 10.3791/58224
Automatic Translation
*1,3, *1,3, 1,3, 1,3, 2,3, 1,3, 1,3
1Institute of Medical Biochemistry, Center for Molecular Biology of Inflammation, University of Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster, 3Cluster of Excellence 'Cells in Motion', University of Münster
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि बाध्यकारी समानताएं और लेबल मुक्त फॉस्फोलिपिड-बाध्यकारी प्रोटीन की बातचीत के मोड को एक साथ एक साथ मापने के द्वारा मैटीरियल ठोस समर्थित bilayers (SLB) के साथ निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है मौजूद बड़े पैमाने पर और प्रोटीन के viscoelastic गुण A2 annexin ।

Abstract

अपव्ययी क्वार्ट्ज क्रिस्टल microbalance तकनीक एक सरल और लेबल मुक्त दृष्टिकोण को एक साथ मापने के लिए बड़े पैमाने पर और अवशोषित/सेंसर सतहों पर मैटीरियल द्रव्यमान का viscoelastic गुण, बातचीत की माप की अनुमति ठोस समर्थित सतहों के साथ प्रोटीन की, ऐसे लिपिड bilayers के रूप में, वास्तविक समय में और एक उच्च संवेदनशीलता के साथ. Annexins फॉस्फोलिपिड-बाध्यकारी प्रोटीन है कि reversibly कैल्शियम आयनों के समंवय के माध्यम से नकारात्मक आरोप लगाया headgroups के साथ बातचीत के एक अत्यधिक संरक्षित समूह हैं । यहाँ, हम एक क्वार्ट्ज सेंसर की सतह पर तैयार planar लिपिड bilayers के लिए annexin A2 (AnxA2) की बाइंडिंग को मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया था एक प्रोटोकॉल का वर्णन करें । इस प्रोटोकॉल को सुदृढ़ और reproducible डेटा प्राप्त करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जाता है और इसमें विस्तृत चरण-दर-चरण वर्णन शामिल होता है. विधि अंय झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन और bilayer रचनाओं के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

सेलुलर झिल्ली अत्यधिक गतिशील और जटिल संरचनाओं हैं । झिल्ली लिपिड के यौगिक मिश्रण, साथ में बाह्य और/या अभिन्न रूप से जुड़े झिल्ली प्रोटीन, फार्म microdomains के लिए इकट्ठा । इन झिल्ली microdomains के समंवित गति-स्थानिक संगठन कुंजी शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल है1। झिल्ली microdomain गतिशीलता झिल्ली लिपिड के परस्पर क्रिया द्वारा संचालित कर रहे हैं, साथ ही परिधीय झिल्ली प्रोटीन की क्षमता को पहचानने और लिपिड microdomains में समृद्ध के साथ बातचीत करने के लिए । विशिष्ट लिपिड के लिए प्रोटीन की भर्ती अक्सर लिपिड मान्यता मॉड्यूल के माध्यम से प्राप्त होता है, जैसे pleckstrin समरूपता (पीएच) या C2 डोमेन2,3. मॉडल झिल्ली का उपयोग कर भौतिक विश्लेषणात्मक तरीकों बुनियादी आणविक स्तर पर इन प्रक्रियाओं को नियंत्रित सिद्धांतों को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

Annexins, एक बड़े multigene-परिवार, अपने को नकारात्मक चार्ज झिल्ली लिपिड, मुख्य रूप से phosphatidylserine (पी एस), एक Ca2 +-नियंत्रित तरीके से बाइंड करने की क्षमता के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है2। annexin परिवार की दूसरी पहचान एक संरक्षित संरचनात्मक खंड की उपस्थिति है, annexin दोहराने, कि चार या आठ बार मौजूद है और सीए2 बंदरगाह +-और फॉस्फोलिपिड-बाध्यकारी साइटों4। ca2 +-निर्भर लिपिड बातचीत भावना के लिए एक सही स्थिति में annexins स्थानों और 2 सीए दे+-मध्यस्थता लक्ष्य झिल्ली को संकेतन. लगातार, annexins कोलेस्ट्रॉल में समृद्ध microdomains के गठन के लिए प्रेरित करने में सक्षम हैं, phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4, 5) पी2), और पी एस, दोनों में सेलुलर और/या कृत्रिम झिल्ली सिस्टम5. इस प्रोटोकॉल annexin-झिल्ली एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance अपव्यय का उपयोग कर बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन (QCM-D)6,7,8.

इस microbalance में मूल घटक एक दोलन क्रिस्टल है कि सेंसर सतह के रूप में कार्य करता है । सोखना और/या सेंसर सतह के लिए अणुओं की बाध्यकारी अनुनाद आवृत्ति कम हो जाती है (f) द्रव्यमान में वृद्धि करने के लिए आनुपातिक. यदि सतह समान रूप से एक फिल्म के साथ लेपित है, अतिरिक्त पदार्थों के बंधन इस परत के संरचनात्मक अखंडता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, और viscoelasticity में इस तरह के परिवर्तन (ऊर्जा अपव्यय कारक डी) इसके अतिरिक्त पर नजर रखी जा सकता है । यह एक व्यापक तकनीक लिपिड bilayers के साथ प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए है । इस दृष्टिकोण में, लिपिड बुलबुले उचित लेपित संवेदक सतह पर अवशोषित कर रहे हैं । लिपिड bilayer गठन के अनुकूल है सिलिका पर आधारित सामग्री9,10, के रूप में बुलबुले अक्सर अन्य हाइड्रोफिलिक सतहों पर टूटना नहीं है, इस तरह के रूप में सोने11 यूवी के बाद ऑक्सीकरण-ओजोन एक्सपोजर, TiO212, या अल २हे३१३. coalescing बुलबुले का टूटना जलीय चरण विज्ञप्ति, बड़े पैमाने पर और अपव्यय में विशेषता परिवर्तन के लिए अग्रणी । पुटिका फ्यूजन द्वारा ठोस समर्थित bilayers (SLB) की पीढ़ी सरल और मजबूत है और सेलुलर झिल्ली की नकल है कि जटिल मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

अपव्यय क्वार्ट्ज क्रिस्टल microbalance एक लेबल मुक्त और संवेदनशील तकनीक है । एक प्रमुख लाभ की संभावना को कोट किसी भी सामग्री है कि सतह पर एक पर्याप्त पतली फिल्म उत्पंन करता है, इस प्रकार विविध अनुसंधान क्षेत्रों में आवेदनों की एक व्यापक रेंज प्रदान कर रहा है । प्रोटीन-झिल्ली बातचीत वास्तविक समय में मनाया जाता है, और परिणाम सीधे विश्लेषण किया जा सकता है । एक ही सेंसर सतह अनुवर्ती माप में इस्तेमाल किया जा सकता है (इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक ंयूनतम सफाई प्रदर्शन के बाद), इस प्रकार सटीक आंतरिक नियंत्रण और analytes के बीच एक तुलना के लिए अनुमति देता है ।

Protocol

नोट: बफ़र्स एक ०.२२-µm फ़िल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर किया जाना चाहिए और degassed 1 h के लिए एक निर्वात द्वारा ।

१. लिपिड पुटिका तयारी

  1. 2-एमएल ग्लास ट्यूबों का उपयोग करें । प्रत्येक लिपिड को भंग, 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (चबूतरे), और कोलेस्ट्रॉल (चौल), क्लोरोफॉर्म के मिश्रण में/ मेथनॉल (50:50 v/v) एक स्पष्ट 5 मिमी लिपिड समाधान तैयार करने के लिए । भंग 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1 '-myo-inositol-4 ', 5 '-bisphosphate) (पीआई (4, 5) पी2) क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी के मिश्रण में (20:9:1 वी/
  2. POPC/चबूतरे का वांछित दाढ़ अनुपात में भंग लिपिड का मिश्रण (80/20), POPC/PI (4, 5) p2 (95/5), POPC/चबूतरे/चौल (60/20/20), POPC/चबूतरे/पीआई (4, 5) पी2/Chol (60/17/3/20), और POPC/DOPC/चबूतरे/पीआई (4, 5) पी2/Chol (37/20/20/3/20) ( तालिका 1) 10 मिलीलीटर ग्लास ट्यूबों में ।
    नोट: कुल लिपिड की अंतिम राशि ५०० µ ग्राम है ।
  3. नाइट्रोजन की एक सूखी धारा का उपयोग कार्बनिक सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना । 3 एच के लिए एक उच्च निर्वात (lyophilization) प्रणाली पर लिपिड मिश्रण छोड़ सॉल्वैंट्स के किसी भी अवशिष्ट अंश को दूर करने के लिए ।
    नोट: यह एक सूखी स्पष्ट फिल्म में परिणाम है ।
  4. साइट्रेट बफर के 1 मिलीलीटर में लिपिड फिल्म resuspend (10 मिमी trisodium-साइट्रेट, १५० mm NaCl, पीएच ४.६) । ६० ° c पर लिपिड निलंबन गर्मी (इस तापमान के आसपास है 10 ° c के मिश्रण में सबसे अधिक पिघलने लिपिड के चरण संक्रमण तापमान से ऊपर) एक पानी स्नान में 30 मिनट के लिए, और भंवर यह जोरदार हर 5 मिनट ।
    नोट: यह बड़े, multilamellar बुलबुले (MLVs) के गठन में परिणाम है । संक्रमण तापमान के ऊपर निलंबन रखें ।
  5. पहले से गरम करना (६० डिग्री सेल्सियस पर इस मामले में) संक्रमण के तापमान (जो ४०-५० ° c यहां है) के ऊपर एक ५० एनएम व्यास ताकना आकार के साथ सुसज्जित पाली कार्बोनेट झिल्ली 30 मिनट के लिए ।
  6. पहले से गरम करना बाहर निकालना में MLV निलंबन लोड और धीरे से पाली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से 31x मिश्रण पास छोटे unilamellar बुलबुले (एसयूवी)14फार्म । संक्रमण के तापमान के ऊपर तापमान रखें ।
  7. एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक की प्रतिक्रिया पोत को एसयूवी निलंबन हस्तांतरण और साइट्रेट बफर जोड़ें (१.४ कदम देखें) को 2 मिलीलीटर अंतिम मात्रा लाने के लिए ।
    नोट: यह एक अंतिम लिपिड एकाग्रता की उपज होगी २५० µ g/

2. क्वार्ट्ज सेंसर हैंडलिंग

नोट: हमेशा एक नोचना के साथ क्वार्ट्ज सेंसर संभाल ।

  1. चार ≥ 30 मिनट के लिए एक 2% एसडीएस समाधान में एक polytetrafluoroethylene धारक में डाला सेंसर । उंहें बड़े पैमाने पर अल्ट्रा शुद्ध पानी के साथ धोने के लिए पूरी तरह से एसडीएस हटाने और उंहें सूखी आर्गन या नाइट्रोजन की एक धारा का उपयोग कर सूखी ।
  2. किसी भी दूषित पदार्थों को पूरी तरह से निकालने के लिए प्लाज्मा की सफाई व्यवस्था का प्रयोग करें । प्लाज्मा में सूखी सेंसर-सफाई चैंबर डालें, चैंबर खाली, और यह ऑक्सीजन के साथ 3x फ्लश । बारी प्लाज्मा क्लीनर पर । निम्न प्रक्रिया पैरामीटर का उपयोग करें: 1 x 10-4 Torr दबाव, उच्च रेडियो आवृत्ति (आरएफ) पावर, और प्रक्रिया समय के 10 मिनट. मशीन बंद करें और सेंसर बाहर ले ।

3. Microbalance ऑपरेशन

नोट: एक समानांतर विंयास में चार तापमान नियंत्रित प्रवाह कक्षों के साथ एक microbalance प्रणाली, एक सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा है और ८० µ एल के एक प्रवाह की दर के लिए सेट/ खुले प्रवाह मोड में, बफर फीडर जलाशय से प्राप्त टैंक में पंप था । लूप मोड में, प्राप्त टैंक एक बंद पाश उत्पन्न करने के लिए फीडर जलाशय के साथ जुड़ा हुआ था. तापमान 20 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया गया था ।

  1. ध्यान से 4 प्रवाह कक्षों में प्लाज्मा साफ सेंसर, चिमटी का उपयोग कर डॉक । पर किसी भी दबाव या कक्षों की मरोड़ और ट्यूबों कि लीक कारण हो सकता है से बचें ।
  2. 10 मिनट के लिए खुले प्रवाह मोड में साइट्रेट बफर (10 मिमी trisodium-साइट्रेट, १५० मिमी NaCl, पीएच ४.६) के साथ प्रणाली फ्लश ।
    नोट: यह वास्तव में ३.२ मिलीलीटर बफ़र की आवश्यकता होती है, लेकिन यह बफ़र (10 मिलीलीटर) की एक अतिरिक्त का उपयोग करने के लिए उचित है ।
  3. कार्यक्रम का शुभारंभ । आवृत्ति और पहले मौलिक टोन के अपव्यय में किसी भी परिवर्तन रिकॉर्डिंग शुरू (n = 1) और मकसद (एन = 3rd-13) सॉफ्टवेयर का उपयोग, जब तक आवृत्ति और अपव्यय बेसलाइन स्थिर हैं (इस के आसपास ले जाएगा ४०-६० मिनट).
    नोट: आवृत्ति शोर स्तर (पीक-से-चोटी) ०.५ हर्ट्ज से कम होना चाहिए और, अपव्यय के लिए, 0.1 से कम · 10-6, एक अधिक से अधिक बहाव के साथ (जलीय समाधान में) 1 हर्ट्ज/एच में आवृत्ति और 0.3 · 10-6/h अपव्यय में ।
  4. जब आधार रेखाएं स्थिर हैं, तो (एक छोटे ट्यूब में 2 मिलीलीटर) साइट्रेट बफर में एसयूवी निलंबन लागू होते हैं । एक प्रतिक्रिया पोत का उपयोग करना, मृत मात्रा के १.५ मिलीलीटर निकालें । फिर लूप-प्रवाह मोड में सिस्टम बंद करें । एक और 10 मिनट के लिए आवृत्ति/
    नोट: इस समय के दौरान, बुलबुले सिइओ2 सतह और फ्यूज पर फैल जाएगा करने के लिए एक सतत bilayer15,16 ( 1 आंकड़े, चित्रा 2, और चित्रा 3में चरण 2) फार्म । सेंसर की सतह पर सोखना एसयूवी दो-phased है और एक ठेठ आवृत्ति ंयूनतम और अपव्यय में अधिकतम है । एक स्थिर नई आवृत्ति/एक विशेषता आवृत्ति बदलाव के साथ (लिपिड रचना पर निर्भर करता है) से 26-29 हर्ट्ज ( तालिका 1देखें) सतह पर एक सतत bilayer इंगित करता है.
  5. जब SLB स्थिर है (चरण ३.४ देखें), equilibrate प्रणाली के साथ चल रहे बफर (10 मिमी HEPES, १५० मिमी NaCl, पीएच ७.४) आवश्यक Ca पर2 + सांद्रता (५० µ मीटर से लेकर 1 मिमी CaCl2 तक, प्रयोग पर निर्भर करता है) के लिए एक खुले प्रवाह मोड में ४० min.
  6. प्रोटीन जोड़ें (यहां, AnxA2) चल रहे बफ़र के लिए Ca2 + (३.५ चरण देखें) । एक संतुलन स्थिर राज्य तक पहुंच जाता है जब तक एक पाश प्रवाह मोड में प्रोटीन के आवेदन प्रदर्शन ( चित्रा 1, चित्रा 2, और चित्रा 3में चरण 3).
    नोट: प्रोटीन एकाग्रता 1 से ४०० एनएम के लिए सीमा हो सकती है । प्रोटीन सोखना परिणाम एक एकाग्रता पर निर्भर आवृत्ति परिवर्तन मास (प्रोटीन) सोखना को दर्शाती है ।
  7. अलग कर देना chelating Ca2 + आयनों द्वारा 5 मिमी EGTA के साथ खुले प्रवाह मोड में चल रहे बफर में (चरण 4 के आंकड़े 1 और चित्रा 2में) के साथ सीमित प्रोटीन है ।
    नोट: आवृत्ति और SLB बेसलाइन के अपव्यय की वसूली प्रोटीन बाध्यकारी की कुल reversibility इंगित करता है । एसोसिएशन-पृथक्करण चक्र अलग सांद्रता या प्रोटीन की तुलना करने के लिए दोहराया जा सकता है ।

4. Microbalance सफाई

नोट: प्रत्येक माप के बाद एक न्यूनतम सफाई प्रक्रिया निष्पादित करें ।

  1. एक सतत खुले प्रवाह मोड में ddH2ओ की ५० मिलीलीटर के साथ microbalance प्रणाली पुनर्जीवित, पानी कंटेनर से ट्यूबों को दूर, और सिस्टम शुष्क चलाने दो ।
  2. ध्यान से क्रिस्टल संवेदक निकालें और यह 2% एसडीएस polytetrafluoroethylene धारक का उपयोग कर समाधान के साथ साफ (२.१ कदम देखें) ।
  3. प्रवाह मॉड्यूल इंटीरियर के दृश्य भागों जहां संवेदक रखा गया था सूखी ।
    नोट: 10 माप की एक श्रृंखला के बाद एक गहन सफाई प्रक्रिया करते हैं ।
  4. एक सतत खुले प्रवाह (ट्यूब) मोड में ४० डिग्री सेल्सियस (सॉफ्टवेयर में सेटअप) पर एक 2% एसडीएस समाधान (५० एमएल) के साथ प्रणाली को साफ, डिटर्जेंट के साथ विस्तारित संपर्क के लिए 20 µ l/मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग कर ।
  5. १६० µ एल की एक प्रवाह दर पर सतत खुले प्रवाह मोड में ddH2ओ के २५० मिलीलीटर के साथ साफ/
    नोट: 4 महीने के बाद, निर्माता के मैनुअल के अनुसार एक व्यापक सफाई प्रक्रिया बाहर ले ।

Representative Results

गुंजयमान आवृत्ति (Δf) में कमी adsorbed द्रव्यमान (Δm), के रूप में Sauerbrey समीकरण द्वारा परिभाषित के साथ एक रैखिक तरीके से संबद्ध है । 17

Equation 1

यहां, एफ गुंजयमान आवृत्ति है, सीएफ एक निरंतर है कि दिया क्वार्ट्ज और गुंजयमान आवृत्ति की ज्यामितीय और भौतिक विशेषताओं पर निर्भर करता है, और एक सेंसर सतह क्षेत्र है ।

ज्यादातर आवेदनों में adsorbed लेयर पूरी तरह से कठोर नहीं बल्कि viscoelastic है । जिसके परिणामस्वरूप क्वार्ट्ज सेंसर दोलन का भीगा हुआ अपव्यय (D) के रूप में जाना जाता है । मॉनिटर अपव्यय परिवर्तन (ΔD) बाउंड मास18 के viscoelastic गुणों के साथ सहसंबंधी बनाना और8प्रकार के रूप में परिभाषित कर रहे हैं ।

Equation 2

यहां, ईअपव्यय एक दोलन अवधि के दौरान खो ऊर्जा है, और ईसंग्रहीत स्वतंत्र रूप से दोलन संवेदक की कुल ऊर्जा है ।

विश्लेषण और बाध्यकारी मापदंडों को बढ़ाता है, आवृत्ति isotherms प्रोटीन सांद्रता के खिलाफ संतुलन आवृत्ति पारियों (ΔΔfई) की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । ΔΔfe के रूप में परिभाषित है

Equation 3

यहां, Δft1 प्रोटीन सोखना और Δfटी 2 संतुलन राज्य की शुरुआत का प्रतिनिधित्व करता है । रैखिक वक्र फिटिंग6,8प्रकार के रूप में Langmuir समीकरण के एक पहाड़ी विस्तार का उपयोग करके किया जा सकता है ।

Equation 4

यहां, ΔΔfमैक्स प्रोटीन एकाग्रता के ΔΔfई है अधिकतम में जिसके परिणामस्वरूप (संतृप्ति) बाध्यकारी, Kd स्पष्ट पृथक्करण लगातार प्रोटीन के लिए है/झिल्ली परिसर, और n पहाड़ी गुणांक है ।

पहाड़ी गुणांक (n) बाइंडिंग की cooperativity का वर्णन करता है । n = 1 के लिए, पहाड़ी सोखना मॉडल एक सरल Langmuir isotherm (बराबर बाध्यकारी साइटों और सभी अणुओं को एक दूसरे के लिपिड bilayer को स्वतंत्र रूप से बांध) है । यदि n होइन 1, एक बाउंड ligand अन्य लाइगैंडों के लिए झिल्ली बाइंडिंग संबध बदलता है, या तो (n > 1, धनात्मक cooperativity) बढ़ाना या घटाना (n < 1, ऋणात्मक cooperativity) संबध है ।

चित्रा 1 हमारे प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह की एक योजनाबद्ध से पता चलता है के दौरान प्रतिध्वनि और आवृत्ति में बदलाव को मापने के Ca2 +-निर्भर बाध्यकारी और तरल चरण में लिपिड bilayer के लिए AnxA2 की रिहाई. एक अनुकरणीय रिकॉर्डिंग चित्रा 2में दिखाया गया है । चित्रा 2 एक आवृत्ति वक्र और चित्रा 2बी की रिकॉर्डिंग से पता चलता है अपव्यय परिवर्तन दिखाता है । liposomes के अलावा पर आवृत्ति में प्रमुख ड्रॉप (चित्रा 2एक [चरण 1]) उनके सोखना इंगित करता है । क्योंकि बफर-भरे बुलबुले कठोर नहीं हैं, लेकिन viscoelastic, अपव्यय बढ़ जाती है (चित्रा 2बी [चरण 1]) । बाद में, coalescing बुलबुले टूटना । बुलबुले के अंदर बफर के सहवर्ती रिलीज adsorbed द्रव्यमान कम हो जाती है जब तक एक स्थिर पठार तक पहुंच जाता है (चित्रा 2एक [2 कदम]) । नोट की, एक उच्च अपव्यय बदलाव में बुलबुले के अलावा, जबकि bilayer के जवाब में बदलाव बहुत SLB के कठोर समरूप प्रकृति के कारण छोटा है (चित्रा 2बी [चरण 2]) । चित्रा 2a और 2 बी में चरण 3 लिपिड के लिए AnxA2 के बंधन रिकॉर्ड, जो बड़े पैमाने पर कहते हैं, के रूप में स्पष्ट आवृत्ति बदलाव से देखा, लेकिन bilayer संरचना के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, के रूप में केवल छोटे परिवर्तन के अपव्यय में संकेत दिया । जब Ca2 + chelating एजेंट EGTA द्वारा निकाल दिया जाता है (चित्रा 1 और चित्रा 2 [चरण 4]), लिपिड फिल्म से AnxA2 dissociates. आवृत्ति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपव्यय रिकॉर्डिंग, bilayer के साथ देखा स्तरों के लिए shift केवल (चरण 2 और 4 चित्रा 2a और 2 बीमें तुलना), यह दर्शाता है कि AnxA2 बाइंडिंग पूरी तरह से Ca पर निर्भर है+ और कि लिपिड फिल्म यथावत बनी हुई है ।

AnxA2, के रूप में annexins के सबसे अधिक है, नकारात्मक चार्ज लिपिड जैसे पुनश्च पर निर्भर करता है । यह स्पष्ट रूप से देखा जाता है जब चबूतरे लिपिड bilayer (चित्रा 3) में अनुपस्थित है । चित्रा 3 एक आवृत्ति वक्र और चित्रा 3बी की रिकॉर्डिंग से पता चलता है अपव्यय परिवर्तन दिखाता है । ध्यान दें कि आवृत्ति में एक स्थिर आधार रेखा को शिफ्ट-25 हर्ट्ज, अभी तक अपव्यय बदल नहीं है (चित्रा 3बी [चरण 2]), एक उचित bilayer गठन का संकेत. हालांकि, आवृत्ति में कोई परिवर्तन नहीं(चित्रा 3ए) या अपव्यय (चित्रा 3बी) की उपस्थिति में AnxA2 के अलावा के बाद मनाया जाता है Ca2 + (चित्रा 3 ए और बी 1 [चरण ३]) या EGTA (चित्रा 3 ए और बी 1 [चरण 4]), के रूप में AnxA2 लिपिड फिल्म के साथ बातचीत नहीं कर सकते ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह के चित्रमय मॉडल । इस कार्यप्रवाह हाइड्रोफिलिक संवेदक सतह (चरण 1), पुटिका फ्यूजन/टूटना SLB गठन करने के लिए अग्रणी (चरण 2), और Ca2 +-निर्भर सोखना (चरण 3) और EGTA-निर्भर desorption के AnxA2 (चरण 4) के लिए पुटिका अवशोषण दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : अनुकरणीय रिकॉर्डिंग । इन पैनलों शो (क) 7 टोन अनुनाद आवृत्ति के समय पर निर्भर निगरानी और (ख) माप के दौरान क्वार्ट्ज सेंसर के अपव्यय बदलाव. liposomes का अनुप्रयोग आवृत्ति आधार रेखा में एक तीव्र ड्रॉप होती है, जबकि अपव्यय आधार रेखा बढ़ाता है (चरण 1) । आधार रेखा के स्थिरीकरण bilayer (चरण 2) के गठन को इंगित करता है । AnxA2 (२०० एनएम) सोखना (सीए की उपस्थिति में2 +) चबूतरे पर लिपिड bilayer काफी अपव्यय बदलने के बिना बड़े पैमाने पर कहते हैं, यह दर्शाता है कि लिपिड फिल्म परेशान (चरण 3) नहीं है । EGTA के साथ Ca2 + केलेशनथेरेपी पर आवृत्ति आधार रेखा की वसूली प्रोटीन की कुल desorption (चरण 4) इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग, प्रदर्शन कि AnxA2 चबूतरे के अभाव में SLBs के लिए बाध्य नहीं करता है । इन पैनलों liposomes के अलावा दिखाने के लिए और SLB गठन (चरण 1 और 2) । (A) आवृत्ति या (B) अपव्यय में कोई परिवर्तन नहीं AnxA2 (चरण 3; २०० एनएम, Ca2 +की उपस्थिति में) या EGTA (चरण 4) के अलावा के बाद स्पष्ट हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

संरचना ΔΔF/SLBs के गठन के बाद हर्ट्ज ΔΔD * 10-6 SLB के गठन के बाद
POPC/चबूतरे
(८०:20)		 २६.३ ± ०.२ ०.२६ ± ०.०३
POPC/PI (4, 5) P2
(९५:5)		 २६.५ ± ०.५ ०.३१ ± ०.०२
POPC/चबूतरे/चौल
(६०:20:20)		 २९.२ ± ०.२ ०.४५ ± ०.०९
POPC/चबूतरे/PI (4, 5) P2/Chol
(६०:17:3: 20)		 २९.६ ± ०.६ ०.४३ ± ०.१०
POPC/DOPC/चबूतरे/PI (4, 5) P2/Chol
(३७:20:20:3: 20)		 २९.४ ± ०.४ ०.३९ ± ०.१४

तालिका 1: लिपिड संरचना और SLB का गठन डेटा 7 .

Discussion

दोनों एक मात्रात्मक और गुणात्मक तरीके से सेलुलर झिल्ली की संरचना-समारोह संबंध के विषय में सवालों के जवाब देने के लिए, सेल जीव विज्ञान लाभ बेहद अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक के आधार पर जैव भौतिक दृष्टिकोण के उपयोग से , जिसमें परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM), भूतल plasmon अनुनाद (SPR), और यहां कार्यरत QCM-डी तकनीक शामिल हैं । हम पिछले अध्ययनों में पता चला है कि annexin प्रोटीन एक Ca2 +-निर्भर तरीके से उच्च अपनत्व के साथ स्थिर झिल्ली में बांध । यह पता लगाने संवेदनशीलता और दोलन स्थिरता का सबसे अच्छा समझौता का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि हम 7 (Δf7) की आवृत्ति और अपव्यय पारियों का उपयोग करें ।

इस तकनीक भी झिल्ली प्रोटीन संपर्क का एक मात्रात्मक विवरण परमिट । AnxA2 झिल्ली के लिए बाध्यकारी सकारात्मक cooperativity है कि संरक्षित annexin कोर डोमेन द्वारा मध्यस्थता है और कोलेस्ट्रॉल की उपस्थिति पर निर्भर करता है की विशेषता है । AnxA2 और AnxA8 के लिए प्राप्त मात्रात्मक आंकड़ों में6,8कहीं विस्तार से बताया गया है ।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं । तुरंत liposomes का उपयोग करें; अंयथा, छोटे बुलबुले कम सतह तनाव के साथ बड़ा बुलबुले में फ्यूज, लिपिड bilayer गठन के निषेध के लिए अग्रणी हो सकता है । माप के दौरान एक निरंतर तापमान बनाए रखें । एक नहीं नगण्य आवृत्ति और अपव्यय बदलाव में तापमान परिणामों में प्रत्येक छोटे विचलन । हवा के बुलबुले से बचें; अंयथा, सिस्टम अस्थिर है और एक आधार रेखा स्थापित नहीं करेगा ।

Sauerbrey समीकरण बड़े पैमाने पर परिवर्तन में मनाया आवृत्ति परिवर्तन के प्रत्यक्ष रूपांतरण की अनुमति देता है और इसलिए, व्यापक रूप से इस्तेमाल किया । हालांकि, अनुनाद आवृत्ति में परिवर्तन और जोड़ा द्रव्यमान के बीच एक रैखिक सहसंबंध की धारणा केवल सेंसर सतह पर एक कठोर और समान फिल्म बनाने घटकों के लिए सच रखती है । Sauerbrey समीकरण पानी से भरपूर प्रोटीन फिल्मों, शामिल पानी के साथ लिपिड परतों, या यहां तक कि adsorbed कोशिकाओं के रूप में viscoelastic अधिशोषक के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । यहां, अधिक जटिल गणितीय मॉडल की आवश्यकता है । इसलिए, यह एक साथ आवृत्ति और अपव्यय में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. माप के दौरान संरचनात्मक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए, ΔD बनाम Δf अनुपात की साजिश रची जा सकती है, जिसमें कोई भी संपरिवर्तन नहीं होने का संकेत देने वाली सीधी रेखा होती है ।

इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ के लिए सब्सट्रेट के रूप में सामग्री की एक बहुत व्यापक रेंज का उपयोग करने की संभावना है । इसके अलावा, यह एक विश्वसनीय और प्रत्यक्ष विधि macromolecular बातचीत की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए है, के रूप में सतह कोटिंग फिल्मों के समुचित गठन (जैसे SLB), साथ ही साथ आगे प्रोटीन-लिपिड बातचीत, ऑनलाइन निगरानी की जा सकती है ।

इस प्रोटोकॉल अंय झिल्ली-बातचीत प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, बार डोमेन प्रोटीन19, एर्म (ezrin, radixin, और moesin) प्रोटीन परिवार है कि झिल्ली में एक महत्वपूर्ण भूमिका है-cytoskeleton लिंकेज20,21 ,22, या c2 या PH डोमेन युक्त प्रोटीन. इसके अलावा, जैविक सामग्री का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक के आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला सफलतापूर्वक प्रकाशित किया गया है, इस प्रकार अधिक जटिल macromolecular सभाओं या यहां तक की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल प्रयोगात्मक मंच के रूप में QCM की स्थापना कोशिकाओं23,24.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था के तहत अनुदान SFB B04, EXC १००३, SFB 1348/A04, और SFB 1348/A11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Calciumchloride Merck 017-013-00-2 99%
Chloroform Roth 4432.1 99%
DOPC Avanti 850375P
EGTA PanReac AppliChem A0878 99%
HEPES PanReac AppliChem A1069
Methanol PanReac AppliChem A3493
PiP2 Avanti  850155P
POPC Avanti  850457P
POPS Avanti  840034P
Sodiumchloride PanReac AppliChem A1149
SDS Roth 183
Trisodium citrate PanReac AppliChem A3901
Equipment 
Extruder Liposofast Avestin
Qsense E4 Analyzer Qsense
QSense Dfind Qsense
Pump IPC 4 Ismatec ISM 930
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm Qsense QSX 303
PC Membranes 0.05μm Avanti polar lipids 610003
OriginPro OriginLab Corporation Version 8 and 9

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References

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जैव रसायन अंक १४१ Microbalance ठोस समर्थित bilayer फॉस्फोलिपिड microdomains कोलेस्ट्रॉल annexins cooperativity बाइंडिंग गतिशीलता viscoelastic गुण
अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग
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Matos, A. L. L., Grill, D., Kudruk,… More

Matos, A. L. L., Grill, D., Kudruk, S., Heitzig, N., Galla, H. J., Gerke, V., Rescher, U. Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator. J. Vis. Exp. (141), e58224, doi:10.3791/58224 (2018).

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