Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Выявление ортексин и эндоканнабиноидных рецепторов у взрослых зебрафиш с использованием иммунопероксидаза и иммунофлуоресценции Методы

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Представлены протоколы для иммуногистохимической характеристики и локализации пептида орексина, рецепторов орексина, и эндоканнабиноидных рецепторов в кишечнике и мозге нормального и диетического ожирения (DIO) взрослых моделей зебры с использованием моделей взрослых зебры иммуноперисидаза и двойные иммунофлуоресценции методы.

Abstract

Иммуногистохимия (IHC) является высокочувствительным и специфическим методом, участвующим в обнаружении целевых антигенов в секциях тканей с помеченными антителами. Это многоступенчатый процесс, в котором оптимизация каждого шага имеет решающее значение для получения оптимального конкретного сигнала. С помощью IHC можно обнаружить распределение и локализацию конкретных биомаркеров, раскрывая информацию об эволюционной консервации. Кроме того, IHC позволяет понимать экспрессии и распределение изменений биомаркеров в патологических условиях, таких как ожирение. IHC, в основном метод иммунофлуоресценции, может быть использован во взрослых зебры для обнаружения организации и распределения филогенетически сохраненных молекул, но стандартный протокол IHC не estasblished. Orexin и эндоканнабиноид две высоко консервированные системы, участвующие в борьбе с потреблением пищи и патологии ожирения. Здесь представлены протоколы, используемые для получения информации о пептид орексина (OXA), orexin рецептор (OX-2R), и каннабиноидных рецепторов (CB1R) локализации и распределения в кишечнике и мозге нормальной и диеты индуцированной ожирением (DIO) взрослых моделей зебры. Также описаны методы иммунопероксидазы и двойной иммунофлуоресценции, а также подготовка реагентов, фиксация, парафина-встраивание, криозащита ткани зебры и подготовка к эндогенной активности-блокированию шага и фона противопоставить. Полный набор параметров получен из предыдущих экспериментов IHC, с помощью которых мы показали, как иммунофлуоресценция может помочь с пониманием OXs, OX-2R и CB1R распределения, локализации и сохранения экспрессии у взрослых зебры Тканей. Полученные изображения с высокой интенсивностью сигнала привели к подтверждению того, что зебрафиш подходит для моделей животных для иммуногистохимических исследований распределения, локализации и эволюционного сохранения конкретных биомаркеров в физиологических и патологических состояний. Представленные здесь протоколы рекомендуются для экспериментов IHC у взрослых зебры.

Introduction

Иммуногистохимия (IHC) является устоявшейся классический метод, используемый для выявления клеточных или тканевых компонентов (антигенов) антиген-антитела взаимодействия1,2. Он может быть использован для определения локализации и распределения целевых биомолекул в ткани. IHC использует иммунологические и химические реакциидля обнаружения антигенов в разделах тканей 3. Основными маркерами, используемыми для визуализации антиген-антител взаимодействия включают флуоресцентные красители (иммунофлуоресценция) и фермент-субстрат цветовых реакций (иммунопероксидаза), как сопряжены с антителами4. С помощью микроскопического наблюдения можно определить локализацию маркированной ткани, что примерно соответствует локализации целевого антигена в ткани.

Существуют два метода флуоресцентных или хромогенных реакций для обнаружения белка: метод прямого обнаружения, в котором конкретное первичное антитело прямо помечено; и косвенный метод обнаружения, в котором первичное антитело неконъюгировано, в то время как вторичное антитело носит этикетку5,6,7. Косвенный метод имеет некоторые преимущества, которые в основном его усиление сигнала. Кроме того, в отличие от других молекулярных и клеточных методов, с иммунофлуоресценцией, можно визуализироватьраспределение, локализацию и коэкспрессию двух или более белков, дифференциально выраженных в клетках и тканях 7. Выбор используемого метода обнаружения зависит от экспериментальных деталей.

На сегодняшний день IHC широко используется в фундаментальных исследованиях как мощный и важный инструмент для понимания распределения и локализации биомаркеров и общего профилирования различных белков в биологических тканях от человека до беспозвоночных8, 9 До 9 , 10 Лет , 11. Техника помогает отображать карту экспрессии белка в большом количестве нормальных и измененных органов животных и различных типов тканей, показывая возможное вниз или вверх-регуляции экспрессии индуцированных физиологических и патологических изменений. IHC является высокочувствительным методом, который требует точности и правильного выбора методов для получения оптимальных результатов12. Прежде всего, многие различные факторы, такие как фиксация, кросс-реактивность, извлечение антигена и чувствительность антител могут привести к ложноположительным и ложным негативным сигналам13. Выбор антител является одним из наиболее важных шагов в IHC и зависит от антигена специфичность и его сродство к белка и видов под следствием7.

Недавно мы оптимизировали метод IHC для обнаружения членов орексина/гипокретина и эндоканнабиноидов во взрослой ткани зебры. Мы сосредоточились главным образом на фиксации, встраивание тканей с использованием двух различных подходов, секции и монтажа (которые могут повлиять на разрешение и детализацию во время микроскопического анализа), а также блокирование (для предотвращения ложных срабатываний и уменьшения фона)14. Другими важными характеристиками являются специфика антител и избирательность и воспроизводимость отдельных протоколов IHC. Ключом к обеспечению специфики антител является использование отрицательного контроля (в том числе никаких первичных антител или тканей, которые, как известно, не выражают целевых белков), а также положительный контроль (в том числе ткани, которая, как известно, выражают целевые белки)15 . Выбор антител для IHC производится на основе их видовой специфичности (вероятность того, что они реагируют с антигеном интереса) и антиген-антитела связывающих систем обнаружения, который используется4,5,6 ,7. В случае иммунопероксидазы цвет реакции определяется отбором осажденного хромогена, обычно диаминобензидина (коричневого)16. С другой стороны, яmmunofluorescence использует антитела, конъюгированные с фторфором, чтобы визуализировать экспрессию белка в замороженных секциях тканей и позволяет легко анализировать несколько белков по отношению к системе обнаружения хромогенных 5 , 7.

В методе иммунопероксидазы вторичное антитело спрягается с биотином, молекулой связующего, способной завербовать хромогенную молекулу репортера (Avidin-biotin complex (ABC) ", что приводит к усилению сигнала окрашивания. С помощью метода репортера ABC, фермент пероксидазы реагирует с 3,3'-диаминобензидин (DAB), производя интенсивно коричневого цвета окрашивания, где фермент связывается со вторичным антителом, которые затем могут быть проанализированы с обычным световым микроскопом. ABC окрашивания, из-за высокой сродство авидина для биотина, производит быструю и оптимальную реакцию, с несколькими вторичными антителами прилагается к месту первичной реактивности антитела. Этот хромогенный метод обнаружения позволяет денситометрический анализ сигнала, обеспечивая полуколичественные данные на основе корреляции уровня коричневого сигнала с уровнями экспрессии белка18.

С иммунофлюоресценции методы, одновременное обнаружение нескольких белков возможно из-за способности различных флюорохромов излучать свет на уникальных длинах волн, но важно тщательно выбирать фторхромы, чтобы свести к минимуму спектральные перекрытия 5. Кроме того, использование первичных антител у различных видов хозяев сводит к минимуму трудности, связанные с перекрестной реактивностью. В этом случае каждый специфический вид вторичных антител распознает только один тип первичных антител. Флуоресцентные репортеры представляют собой небольшие органические молекулы, в том числе коммерческие производные, такие как красители Alexa Fluor.

Многие модели животных используются для понимания конкретных физиологических и патологических состояний. На сегодняшний день установлено, что многие метаболические пути сохраняются в течение эволюции. Таким образом, IHC исследований в модельных организмов, таких как зебрафиш может обеспечить понимание генезиса и поддержания патологических и непатологических условий17. Целью настоящего доклада является иллюстрация протоколов IHC, которые могут быть выполнены на ткани взрослых зебры и использованы для получения подробных изображений распределения и локализации OXA, OX-2R и CB1R на периферийных и центральных уровнях. Также сообщается о протоколах применения двух основных косвенных методов IHC в периферических и центральных тканях взрослых зебр. Описанный является косвенным методом, который позволяет усиливать сигнал в тех случаях, когда вторичное антитело спрягается с флуоресцентным красителем (метод иммунофлуоресценции) или ферментным репортером (метод иммунопероксидазы). Как хромогенные, так и флуоресцентные методы обнаружения обладают преимуществами и недостатками. В этом протоколе сообщается об использовании IHC, главным образом иммунофлуоресценции, у взрослых зебр, модели животных, широко используемой для изучения систем, которые эволюционно сохраняются в различных физиологических и патологических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Протокол иммунопероксидаза

ПРИМЕЧАНИЕ: Зебрафиш были получены профессором Омид Сафари (Департамент рыболовства, факультет природных ресурсов и окружающей среды, Университет Фердоуси в Мешхиде, Мешхад, Иран)10.

  1. Рассечение тканей
    1. Пожертвуйте зебрафиш путем погружения в ледяную воду (5 частей льда/1 часть воды, 4 кк); оставить их до прекращения всех движений, чтобы обеспечить смерть от гипоксии.
    2. Быстро удалить кишечник и мозг со следующим методом вскрытия:
      1. Высушите рыбу на бумажном полотенце и поместите ее sagittally на рассекающий коврик, блокируя брюшную часть глазницы и мясистой части хвоста.
      2. Для кишечника: вырезать кожу и тщательно удалить кожу и основные мышцы со стороны рыбы, пока внутренние органы видны. Удалить кишечник из полости тела растяжения его.
      3. Для мозга: удалить голову с лезвием бритвы. Удалить мягкую ткань с брюшной стороны черепа с помощью щипц. Откройте череп и удалите кость с брюшной стороны мозга. Удалите кожу и кости черепа со стороны позвоночника мозга. Удалите мозг.
  2. Фиксация тканей
    1. Исправьте рассекающие ткани путем погружения в свежий 4% параформадид (ПФА) в фосфатном буфере (PB, рН 7,4, 4 кв.с. ) на 3 ч при комнатной температуре (RT).
      1. Приготовьте 0,1 M PB, растворив 1,755 г2PO4H2O и 4,575 г Na2HPO4 в 450 мл дистиллированной воды (дГ2О), и приспособитесь к рН 7,4 с необходимым количеством NaOH 1N.
      2. Подготовка 4% PFA растворения 4 г PFA в 100 мл 0,1 М ПБ (pH 7.4) путем агитации на тепловой пластине. При температуре 60 градусов по Цельсию, добавьте 2-4 капли NaOH 1N, чтобы получить четкое решение. Левый PFA 4% на RT и контролировать рН . Отрегулируйте рН до 7,4.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация тканей для более чем 4-6 ч может привести к чрезмерному оконпошению, которое маскирует антигены, ограничивая связывание антитела-эпитопа. Время фиксации зависит от размера ткани.
  3. Ткань встраивания
    1. Промыть ткани 5раз на 5 мин каждый, путем погружения в 0,1 М ПБ (рН 7,4).
    2. Обезвоживать ткани путем последующего погружения в алкоголь 70% (6 мин), 80% (6 мин), 95% (5 мин), 95% (5 мин), 100% (1 мин) и 100% (1 мин).
    3. Уточните ткани путем погружения в 100% спирт: ксилен (1:1) в течение 10 мин, затем 2x в ксилене в течение 5 мин каждый.
    4. Проникайте в ткани с помощью парафиновой воска (56 градусов по Цельсию) дважды на 1 ч каждый путем прямого погружения в парафин.
    5. Встраивайте ткани в парафиновые блоки при комнатной температуре (RT) и храните на RT до секции.
  4. Резка тканей
    1. Нарежьте ткани на корональные или сагитальные секции толщиной 8 мкм с помощью микротома и соберите секции в альтернативной серии на клеевые стеклянные горки на воде и прогреваются при 38 градусах Цельсия.
    2. Сухие горки с разделами на 37 градусов по Цельсию на ночь.
  5. Депараффинизация и регидратация тканевых секций
    1. Dewax разделы путем погружения в ксилен в течение 5 минут с последующим погружением в ксилен в течение 3 мин.
    2. Регидратируете секции последующими слайдами погружения в алкоголь 100% II (1 мин), 100% I (1 мин), 95% (1 мин), 75% (1 мин), 50% (1 мин), затем поместите слайды в dH2O (5 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью dewax разделы перед началом реакции. Если на участках все еще есть следы парафина, выполните дополнительное погружение в ксилен в течение 5 минут или более.
  6. Извлечение антигена
    1. Лечить разделы с цитрат буфера (0,01 M, pH 6.0) путем погружения слайдов в раствор и отопления в микроволновой печи в течение 5 минут при максимальной мощности.
    2. Дайте секциям остыть.
    3. Повторите цикл 5 мин в микроволновой печи на максимальную мощность для завершения поиска антигена.
      1. Подготовка цитрат буфера (0,01 М, рН 6,0) путем растворения 2,10 г лимонной кислоты в 100 мл dH2O и 5,882 г цитрата натрия в 200 мл dH2O. Mix цитрат натрия (0,01 М) с лимонной кислотой (0,01 М) при 1:4 6 с использованием HCl 0.1N.
  7. Блокирование эндогенной пероксидаза
    1. Разграничив область ткани на слайдах с помощью ручек, устойчивых к растворителям.
    2. Промыть секции 3 раза, по 5 мин каждый, с трис-буферным сочным раствором (TBS) (0,1 М, рН 7,3).
      1. Приготовьте 0,1 М TbS, растворив 12,1 г базы trizma и 9 г NaCl в 950 мл dH2O и приспособитесь к рН 7,3 с HCl 0.1N.
    3. Блок эндогенной активности пероксидаза слайдами погружения в раствор 0,75% H2O2 в течение 5 мин на RT.
      1. Подготовьте раствор 0,75% H2O2, растворяя 5 мл 30% H2O2 в 195 мл dH2O.
        ПРИМЕЧАНИЕ: ndogenous ферменты могут вступать в реакцию с реагентами IHC и давать ложные положительные результаты. Кроме того, высоко васкуляризированные ткани выражают много эндогенной пероксидаза, что может привести к интенсивному неспецифическому окрашиванию и фоновым уровням. Лечение 0,75% H2O2 утоляет эндогенную перекистину и значительно снижает неспецифический фон.
  8. Блокировка неспецифических Бинди ng сайтов и променализции тканей
    1. Инкубировать секции тканей с TBS/0.4% Triton (TBS-T) блокирующий буфер, содержащий первичный антисыворот (NRS), в течение 30 минут на RT, чтобы блокировать неспецифические места связывания.
      1. Приготовьте 0,4% Triton путем растворения 0,4 мл Triton X-100 в 100 мл TBS.
      2. Подготовьте блокирующий буфер TBS-T растворения 1% нормальной сыворотки в TBS, содержащей 0,4% Triton X-100 (1 мл нормальной сыворотки no 8,2 мл TBS , 0,8 мл 0,48 Triton X-100).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите вид сыворотки животных в зависимости от хозяина вторичного антитела (например, при использовании козла анти-кролика вторичного антитела, используйте нормальную сыворотку козы).
  9. Инкубация тканей с первичными антителами
    1. Инкубировать секции на ночь во влажной коробке на RT с первичными антителами, разбавленными TBS-T. Пятно разделов со следующими первичными антителами:
      1. Козье антитело против OX-2R разбавлено 1:200, которое распознает C-терминал протеина.
      2. Козье антитело против OX-A разбавлено 1:200 «orexin-A», который распознает C-терминал белка.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что первичное антитело реагирует с биомолекулой интереса. Определите, с какой эпитоп биомолекулы первичное антитело реагирует с помощью выравнивания гена. Например, эпитоп OX-A был отображены между aa 50-100 человека OX-A (O43612), в то время как эпитоп OX-2R был отображены вблизи последних 50 аа на C-терминале человека.
  10. Инкубация тканей со вторичными антителами
    1. Промыть секции 3x на 5 мин каждый, с 0,1 М TBS (pH 7.3).
    2. Инкубировать секции на 1,5 ч на РТ с биотинилатированными вторичными антителами и кроличьим антикозным иммуноглобулином (H'L), спрятаемым с биотином, затем разбавьте 1:100 в TBS-T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте и найдите различные разбавления как первичных, так и вторичных антител, чтобы найти оптимальное разбавление, которое позволяет снизить фон.
  11. Реакция пероксидазы
    1. Промыть секции 3x на 5 мин каждый, с 0,1 М TBS (pH 7.3).
    2. Инкубировать секции с комплексом авидин-биотин (ABC) на 1 ч.
      1. Подготовьте решение ABC, добавив две капли компонента А с двумя каплями компонента B в 5 мл TBS.
    3. Промыть секции 3x на 5 мин каждый, с 0,1 М TBS (pH 7.3).
    4. Лечить разделы с хромогеном субстрата 3,3'-диаминобензидин-4 (DAB).
      1. Подготовьте раствор DAB, добавив одну каплю (примерно 30 л) концентрата dAB chromogen до 1 мл разбавителя DAB и перемешайте задолго до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте решение ABC по крайней мере за 30 минут перед использованием и держите комплекс при 4 градусах Цельсия до использования, чтобы обеспечить стабильную связывание авидина/биотина. Подготовьте свежее рабочее решение DAB, нанесите на секции тканей и развивайтесь до тех пор, пока цвет не будет соответствующим. Когда хромогенная реакция преобразует участки эпитопа в коричневый цвет и интенсивность сигнала подходит для визуализации, приступайте к следующему шагу. Сроки разработки DAB могут варьироваться от нескольких секунд до 10 минут. Для OX-A и OX-2R 1 достаточно 2 мин. Обработка DAB с осторожностью, так как это канцерогенные.
  12. Обезвоживание тканей и монтаж
    1. Промыть все разделы 3x для 5 мин каждый, с 0,1 М TBS (pH 7.3), чтобы остановить реакцию DAB.
    2. Обезвоживать секции последующими слайдами погружения в алкоголь 50% (2 мин), 75% (2 мин), 95% (2 мин), 100% I (2 мин), 100% II (2 мин).
    3. Уточните ломтики путем погружения 2x в ксилен 10 мин каждый.
    4. Смонтировать разделы с DPX (дибутил фталат ксилена) монтаж для гистологии, добавив две капли монтажа средств массовой информации на слайды и долива медленно с крышками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку погружение тканей в повышение концентрации алкоголя во время обезвоживания приводит к проникновению алкоголя в ткани и замене воды алкоголем, определяют точное время обезвоживания и не переваривают ткани. Выполните погружение в ксилен после обезвоживания, чтобы прояснить ткани и удалить любые излишки или оставшийся алкоголь.
  13. Элементы управления
    1. Повторите разделы 1.1-1.12, опуская первичные антитела и/или заменяя первичное антитело или вторичное антитело IgG TBS (отрицательный контроль).
    2. Повторите разделы 1.1-1.12 предварительно поглощая каждое первичное антитело с превышением относительного пептида (100 мг пептида/1 мл разбавленной антисыворотки).
    3. Повторите разделы 1.1-1.12 с использованием различных тканей в качестве положительного контроля (например, ткани мыши).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все буферы свежими, незадолго до начала. Тщательно удалите лишнюю жидкость на каждом шагу с помощью пипетки или фильтровальной бумаги вокруг секций, всегда сохраняя секции мокрыми.
  14. Приобретение и анализ изображений
    1. Приобретайте цифровые изображения под постоянным освещением света и при этом увеличении с помощью микроскопа, оснащенного цифровой камерой.
    2. Выполните полуколичественный анализ интенсивности окрашивания с помощью программного обеспечения для визуализации (см. ТаблицуМатериалов).
      1. Откройте захваченные изображения в формате .lif или .tiff для оценки индексов позитива OX-A или OX2-R.
      2. Выберите кнопку под измерением и нажмите на Руководство Countiнг. Подсчитайте количество окрашенных профилей ячейки непосредственно с экрана, поставив отметку на положительные ячейки, нажав на мышь.
      3. Выберите область интереса (ROI) области (3 х 103 мкм2)для количественной оценки плотности иммуносигнала (оптическая плотность, ОД).
      4. Определите пиксель с наивысшей интенсивностью (высокой положительной) и наименьшей интенсивностью (отрицательной) внутри анализируемого изображения, чтобы присвоить нулю значение фона (т.е. часть ткани, лишенную окрашенных клеток).
      5. Оцените ОД, работая по логарифмической шкале абсорбции. При цифровом анализе изображений интенсивность пикселей DAB варьируется от самого темного (0 значения) до самого легкого (255 значения) оттенка.
      6. Определите OD, построив гистограмму следующего: журнал10(255/I), где "I" является значением интенсивности пикселей, приведенным программой и определяемым путем вычитания фона.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянная и стабильная реакция иммунопероксидазы может быть проанализирована под ярким полевым микроскопом в любое время. Выполните подсчет помеченных ячеек на альтернативном участке, чтобы избежать двойного учета одной и той же ячейки из соседних секций.

2. Протокол иммунофлуоресценции

  1. Рассечение тканей
    1. Пожертвование и вскрыть животных, как описано в разделе 1.1.
  2. Фиксация тканей
    1. Исправить кишечник и мозг путем погружения в течение 3 ч в 4% ПФА при 4 градусах Цельсия.
      1. Подготовка ПБ и 4% PFA, как в разделе 1.2.1.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Время фиксации зависит от размера ткани. Фиксация тканей более чем на 4–6 ч может привести к чрезмерному оконпошенности, которая маскирует антигены и ограничивает связывание антител-эпитопа.
  3. Ткань встраивания
    1. Промыть ткани 3x на 5 мин каждый, с 0,1 М ПБ (рН 7,4).
    2. Для криозащиты, передача тканей на 20% сахарозы в ПБ (0,1 М, рН 7,4) и держать на ночь при 4 градусах Цельсия. Затем перенесите ткани на 30% сахарозу в 0,1 М ПБ (рН 7,4) и держите еще ночь при 4 градусах Цельсия.
    3. Встраивайте ткани в блок оптимальной температуры резки (OCT). Для этого приготовьте небольшой десаар жидкого азота, возьмите алюминиевую фольгу и разрежьте ее пополам, чтобы создать кастрюлю. Кастрюля, содержащая ткани, заполненные соединением OCT, должна быть окунута в жидкий азот до тех пор, пока соединение OCT не охладится. Замороженные ткани могут храниться при -80 градусов до сечения.
  4. Резка тканей
    1. Перенесите замороженные блоки ткани в криостат при -20 градусов по Цельсию и разрежьте в корональных или сагиттальных участках 10 мкм.
    2. Соберите ткани в альтернативных серийных секциях на клеевые стеклянные слайды, подходящие для иммуногистохимии, и храните их при -20 градусов до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить слайды между -20 и 4 кв в темной коробке слайд или слайд-книги.
  5. Блокировка неспецифических связывающих сайтов и проницаемое промежеи тканей
    1. Разграничив область ткани на слайде растворителем.
    2. Промыть секции 3x на 5 мин каждый, с 0,1 М ПБ (рН 7,4).
    3. Инкубировать разделы с 1% нормальной сыворотки осла растворяется в буфере permeabilization PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) в течение 30 мин на RT, чтобы permeabilize клеточной мембраны и блокировать неспецифические места связывания.
      1. Подготовка Triton X-100 0,3% растворения 0,3 мл Тритон X-100 в 100 мл 0,1 МП (pH 7,4).
      2. Подготовьте блокирующий растворяя 1% нормальной сыворотки осла в PB, содержащей 0,3% TritonX-100.
        ПРИМЕЧАНИЕ: виды животных сыворотки, используемые в пермячности и блокирование буферов зависят от хозяина вторичного антитела.
  6. Инкубация со смесью первичных антител
    1. Промыть секции 3x на 5 мин каждый, с 0,1 М ПБ (рН 7,4).
      1. Инкубировать разделы на ночь во влажной коробке на RT с сочетанием первичных антител, разбавленных в PB-T. Следующие смеси первичных антител могут быть использованы: козье антитело против OX-2R разбавленных 1:100/rabbit антитела против CB1R разбавленных 1:100, или козьего антитела против OX-A разбавленного 1:100/rabbit антитела против CB1R разбавленного 1:100.
  7. Инкубация со смесью вторичных антител
    1. Промыть секции 3x на 5 мин каждый, с 0,1 М ПБ (рН 7,4).
    2. Инкубировать разделы для 2 ч на RT с 1) смесь осла анти-кролик Alexa Fluor 488-конъюгированных вторичных антител и осла анти-козла Alexa Fluor 594-конъюгированных вторичных антител разбавленных 1:100 в PB-T; или 2) смесь осла антикозла Alexa Fluor 488-конъюгированных вторичных антител и осла анти-кролик Акса Флюор 594-конъюгированных вторичных антител разбавленных 1:100 в PB-T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вторичные антитела, разработанные в том же приюте. Нормальная сыворотка должна принадлежать к тому же виду вторичных антител (например, использовать вторичные антитела, разработанные у осла и осла нормальной сыворотки). Разбавить первичные и вторичные антитела блокирующим буфером, содержащим моющее средство, чтобы увеличить проникание клеток и уменьшить фон.
  8. Установка тканей
    1. Промыть секции 3x на 5 мин каждый, с 0,1 М ПБ (рН 7,4).
    2. Противокоесть разделов с ядерным краситель DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) подготовленрастворя растворения 1,5 л DAPI (1 мг/мл) в 3 мл ПБ.
    3. Слайды coverslip с монтажной средой (см. Таблицаматериалов). Эта ваквая среда крепления стабилизирует образец ткани и пятна для долгосрочного использования. Флуоресцентные образцы могут храниться в темноте при 4 градусах Цельсия. Чтобы продлить жизнь флюоософеров, используйте антифедную монтимуторную среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите хорошую среду монтажа. Одним из наиболее важных параметров монтажных агентов является рефракционный индекс (nD), который должен быть около 1,5, рефракционный индекс стекла. Используемая здесь среда крепления может быть использована особенно с образцом, подготовленным для определения ферментов и липидов (т.е. образца, который не должен быть обезвожен восходящей серией алкоголя).
  9. Элементы управления
    1. Повторите разделы 2.1-2.8, опуская первичное или вторичное антитело, или заменяя в определенном шаге первичную или вторичную антисеру с ПБ (отрицательный контроль).
    2. Повторите разделы 2.1-2.8, предварительно поглощая каждое первичное антитело с превышением относительного пептида (100 мг пептида/1 мл разбавленной антисыворотки).
    3. Повторите разделы 2.1-2.8 на ломтиках мозга мыши (положительный контроль).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все буферы свежими, незадолго до начала. Удалите избыток жидкости тщательно на каждом шагу с пипеткой или фильтровальной бумагой вокруг разделов, всегда сохраняя раздел влажным.
  10. Приобретение изображения
    1. Используйте конфокальный микроскоп, оснащенный моторизованной стадией x-y-z, цифровой камерой, а также программным обеспечением для приобретения и анализа изображений, таким как NIS-Elements C, для наблюдения и анализа иммунозапятнанных секций. Приобретайте цифровые изображения с использованием целей 5-20-40x.
    2. Возьмите изображения каждого раздела при низком увеличении (10x или 20x цель) в каждом из доступных каналов, чтобы составить низкий монтаж увеличения, обеспечивая обзор всего региона для облегчения локализации и документации OX-2R/CB1R анатомическое совместное выражение. Нормализуйте флуоресценцию изображения до максимального контраста и наложения перед анализом.
    3. Собирайте серийные изображения по всей области интереса. Приобретайте изображения с помощью шести фокусных плоскостей (я-шаг) с фокусными шагами 1-1,8 мкм, чтобы покрыть объем ткани, в котором coexpression OX-2R/CB1R визуализирован как желтая пунктуальная. Для этого сбор для каждого канала (красный, зеленый, синий) отдельно, с помощью моторизованного микроскопа.
    4. Используйте программное обеспечение для деконволюации изображений для деконволации с помощью десяти итераций и свернуть серийные изображения самолетов в одно максимальное проекционное изображение.
    5. Отрегулируйте микрографы для света и контраста с помощью Adobe Photoshop 6.01 (Adobe Systems, Сан-Хосе, Калифорния).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг деконволюции во время наблюдения для дальнейшего уменьшения фона. Ограничьте воздействие слайда на свет, чтобы предотвратить фотоотрубение.
  11. Анализ изображений
    1. Выполните количественный анализ coexpression OX-2R/CB1R на чередуемых участках толщиной 10 мкм (n - 5 животных на группу), охватывая весь регион, представляющий интерес для каждого животного.
    2. Количественное охарактеризание co-expression OX-2R/CB1R как числа желтой положительной пунктки с полуавтоматической системой анализа изображений. Программное обеспечение Imagins может обеспечить более высокий уровень детализации, с количественными данными о регионах перекрытия между различными флуоресцентными зондами.
    3. Количественно пунктуру с помощью пороговых инструментов для интенсивности сигнала в двух каналах. Откройте файл изображений .liff, .tiff или .jpg и выберите Image-Threshold. Выберите автоматическое настройки или ручной метод и регулировать порог, пока все окрашенные пунктуты выбраны. Проанализируйте распределение интенсивности пикселей в области изображения, которая не содержит никаких иммуномаркесированных объектов для получения фонового порога. Определите этот фон индивидуально для каждого изображения. Затем программа удаляет фоновый порог, устанавливая базовую линию интенсивности пикселей к фоновое значение.
    4. Выберите Анализ-Измерение и выберите параметры, которые будут измерены (интенсивность-интенсивность puncta-минимум, максимальные и средние значения; число/плотность иммуномаркировки puncta).
    5. Подсчитайте желтую пунктуру вдоль объема ткани в 4 стеки для каждого раздела, используя стеки непосредственно выше или ниже, чтобы лучший плоскости фокусировки. Из анализа исключить из анализа нефокусные регионы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните подсчет помеченных ячеек на альтернативном участке, чтобы избежать двойного учета одних и тех же ячеек из соседних секций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные данные для окрашивания иммунопероксидаза показаны на рисунке 1 и рисунке2. Иммуногистохимический анализ дистрибуции OX-A и OX-2R в кишечнике взрослых зебр ы показали различные места локализации OX-A и OX-2R и их увеличение экспрессии в клетках кишечника DIO зебры. Интенсивное коричневое окрашивание для OX-A наблюдалось в клетках медиального и переднего кишечника(рисунок 1A, A1). Иммуноэкспрессия OX-A дала четкие сигналы в различных отношениях кишечника, уменьшаясь от передней к медиальному кишечнику(рисунок 1B,B1). Отрицательный контроль был использован в качестве эталона для фона и для подтверждения специфики сигнала OX-A(рисунок 1E). Длительное воздействие хромогена DAB привело к увеличению интенсивности фона(рисунок 1D). Аналогичные результаты наблюдались для иммуноэкспрессии OX-2R в кишечнике DIO и контроля диеты зебры(рисунок 2). Повышенный сигнал OX-A у взрослых зебр DIO сопровождался переэкспрессией OX-2R в других кишечных компаниях(рисунок 2B,B1).

Использование иммунофлуоресценции, данные, полученные с помощью иммунопероксидаза анализа были подтверждены, лежащие в основе увеличения OX-A и OX-2R выражение в кишечнике взрослого DIO зебры в отношении контроля (Рисунок 3). Кроме того, с помощью двойной иммунофлуоресценции, можно было получить информацию о выражении эндоканнабиноидных рецепторов CB1R и его совместной локализации с OX-A или OX-2R в кишечнике и мозге контроля диеты и DIO взрослых зебры. Преимущество иммунофлуоресценции в том, что он дает более подробный сигнал с менее предоставленной информацией о морфологии тканей, по сравнению с иммунопероксидазой техники. Используя метод иммунофлуоресценции, мы ранее определили анатомические взаимодействия между OX-2R и CB1R как в кишечнике, так и в мозге10.

Точный анализ иммунофлуоресцентных изображений показал увеличение солокализации OX-2R/CB1R в кишечнике взрослых зебр по сравнению с контрольной диетой зебры(рисунок 3B, C). Аналогичная ситуация наблюдалась в различных областях мозга, таких как тонцеральный теленефалион, гипоталамус (боковые, вентральные и торсальные зоны), оптический тектум, торус латералис и рассеянное ядро нижней доли(рисунок 4). Отрицательный(рисунок 5A,B)и положительный (мышечный мозг)(Рисунок 5C) элементы управления были использованы в качестве ссылок для фона и для подтверждения специфики сигналов CB1R и OX-2R.

Кроме того, при двойном иммуносохранении с OX-A/CB1R, было отмечено, в orexinergic нейронов гипоталамуса, что было увеличение совместной локализации сопровождается увеличением OX-A флуоресцентный сигнал (Рисунок 6). Эти результаты показывают, как двойная иммунофлуоресценция может помочь определить физиологически сохраненную экспрессию белка, солокализацию целевых белков, а также их изменения распределения и/или экспрессии в различных патологических условиях.

Figure 1
Рисунок 1: Orexin иммунолокализации в кишечнике DIO против. контроль диеты взрослых зебры. (A) OX-Иммунореактивность в клетках медиального кишечника контроля диеты зебры. (A1) Ox-Иммунореактивность в клетках медиального кишечника dio зебры. (B) OX-Иммунореактивность в клетках передней кишки контроля диеты зебры. (B1) Ox-Иммунореактивность в клетках передней кишки dio зебры. (A1, B1) Увеличение OX-Положительные клетки в различных тканевых compartement медиального и переднего кишечника DIO зебры. (C) OX-Иммунореактивность в клетках передней кишки DIO зебры. (D) иммунопероксидаза реакции на OX-A после длительного воздействия DAB. (E) Отрицательный контроль. Шкала бар: 50 мкм (A, A1, B, B1); 100 мкм (C, D, E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Orexin 2 рецепторов иммунолокализации в кишечнике DIO против. контроль диеты взрослых зебры. (A) Ox-2R иммунореактивность в клетках медиаль ногой кишечника контроля диеты зебры. (A1) Иммунореактивность OX-2R в клетках медиального кишечника зебры DIO. (B) OX-2R иммунореактивности в клетках передней кишки контроля диеты зебры. (B1) Иммунореактивность OX-2R в клетках передней кишки зебры DIO. (A1, B1) Увеличение OX-2R положительных клеток в различных тканевых compartement медиального и переднего кишечника DIO зебры. Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Распределение OX-A (зеленый) /CB1R (красный) и OX-2R (красный) /CB1R (зеленый) и их совместное локализации с OX-2R/CB1R (желтый) в кишечнике DIO против. контроль диеты взрослых зебры. (A) OX-A/CB1R совместное выражение в кишечнике контроля диеты взрослых зебры. (B) OX-2R/CB1R совместное выражение в кишечнике контроля диеты зебры. (C) OX-2R/CB1R совместное выражение в кишечнике DIO взрослых зебры. Увеличение локализации OX-2R/CB1R (желтые точки) в кишечнике зебры DIO. Шкала бар: 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Распределение OX-2R (красный) и CB1R (зеленый) и их совместное локализации с OX-2R/CB1R (желтый) в корональных участках мозга DIO против контроля диеты взрослых зебры. (A) СО-выражение OX-2R/CB1R в теленефалионе контрольной диеты зебры. (A1) Совыражение OX-2R/CB1R в теленефалионе зебры DIO. (B) OX-2R/CB1R совместное выражение в боковой, вентральной и дорсальной зоне гипоталамуса, оптического тектума, торуса, бокового ядра нижней части контрольной диеты зебры (B1) OX-2R/CB1R совыражение в боковой, вентральной и зоны дозандра гипоталамуса, оптический тектум, торус-латерис и рассеянное ядро нижней доли зебры DIO. (C) Высшее увеличение оптического текума, показывающего совместное выражение OX-2R/CB1R (желтый) в контрольной диете зебры. (C1) Более высокое увеличение оптического тектума, показывающего совместное выражение OX-2R/CB1R (желтый) в зебры DIO. (D) Частность оптического тектума, показывающий распределение и совместное выражение OX-2R/CB1R (желтый) в dio зебры. DAPI (синий) был использован для противодействия ядрам пятна. CP: центральное заднее таламическое ядро; Dd: дорсаль; Dc: центральный; Dl: боковой; Dm: медиал; Dp: задняя часть дорсального теленефалиона; Hd: дорсальная зона перивентрикулярного гипоталамуса; Hv: брюшная зона перивентрикулярного гипоталамуса; LH: боковая часть гипоталамуса; PGl: боковые и PGm: медиальное прегломерулярное ядро; ПГЗ: перивентрикулярная серая зона оптического текума; TeO: оптический тектум; TL: торус продоловый; Vd: дорсальная часть вентрального теленефалиона. Шкала бар: 50 мкм (A, A1, C, C1); 250 мкм (Bи B 1); 25 мкм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: ВЫРАЖЕНИЕ белка OX-2R и CB1R и специфичность во взрослом мозге зебры и мышигиппокампа. (A) Отрицательный контроль OX-2R путем предварительного поглощения с относительным пептидом. (B) Отрицательный контроль CB1R путем предварительного поглощения с относительным пептидом. (C) Положительный контроль OX-2R/CB1R в гиппокампе мыши. ПГЗ: перивентрикулярная серая зона оптического текума; TeO: оптический тектум. Шкала бар: 100 мкм (A, B); 250 мкм (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Распределение OX-A (зеленый) и CB1R (красный) и их совместное локализации с OX-A/CB1R (желтый) в гипоталамических корональных разделах DIO против контрольной диеты взрослых зебры. (A) OX-A/CB1R совместное выражение в гипоталамусе контрольной диеты зебры (A1) Высшее увеличение, показывающее со-выражение OX-A/CB1R в боковом гипоталамусе. Деталь совместного выражения OX-A/CB1R, показывающая податливую смежную локализацию OX-A/CB1R или совместное локализацию и перекрытие OX-A/CB1R в одних и тех же ячейках. (B) OX-A/CB1R совместное выражение в Гипоталамусе DIO зебры (B1) Высшее увеличение, показывающее увеличение со-выражения OX-A/CB1R в боковом гипоталамусе. Деталь совместного выражения OX-A/CB1R, показывающая податливую смежную локализацию OX-A/CB1R или совместное локализацию и перекрытие OX-A/CB1R в одних и тех же ячейках. LH: боковая часть гипоталамуса. Шкала бар: 50 мкм (A, B); 25 мкм (A1, B1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Подготовка образцов

Подготовка образцов является первым критическим шагом в IHC. Надежный протокол позволяет обеспечить содержание клеточной морфологии, архитектуры тканей и антигенности. Этот шаг требует правильного сбора тканей, фиксации и секции22,23. Целью фиксации является сохранение тканей и уменьшение действия тканевых ферментов или микроорганизмов. В частности, шаг фиксации сохраняет клеточные компоненты и биомолекулы, предотвращает аутолиза и смещение клеточных компонентов (таких как антигены и ферменты), стабилизирует клеточные материалы против аверсивных эффектов следующих процедур, облегчает иммуностоирование4,7,24.

Перед секцией ткань готовится и сохраняется с помощью встраивания парафина (метод иммунопереоксидаза) или криоконсервирована (замораживание в криомедиа, в методах множественной иммунофлуоресценции). Метод сохранения связан с типом фиксации7. После фиксации и сохранения, ткани нарезаны микротомом, если встроенные в парафина, или криостат, если встроенные в криомедиа. Ткани, как правило, нарезанные в диапазоне толщины 8-10 мкм и установлены на слайдах. Для окрашивания иммунопероксидаза, образец может потребовать дополнительных шагов, чтобы разоблачить эпитопы для связывания антител, в том числе депарафафинизации и антигена retrieveal25,26. Следует иметь в виду, что чрезмерное исправление может привести к эпитопной маскировки, в то время как недофиксация может вызвать практически нет положительного сигнала с тяжелым окрашиванием края.

Блокирование и сокращение фона

В методе иммунопероксидаза, высокая сродство авидина для биотина, вероятно, отвечает за быстрое производство фонового окрашивания. Кроме того, так как реакция авидин-биотин является необратимой, фон не может быть удален18,27. Во время IHC, высокий фон может также быть произведены неспецифические связывания с биотинами эндогенной ткани. Гидрофобные и ионные взаимодействия (такие, как те, которые производятся коллагеном и другими соединительными тканями, такими как эпителий и адипоциты), а также эндогенной ферментной активностью, являются основными причинами фонового окрашивания. Эндогенный биотин или ферменты и гидрофобные связывания должны быть сведены к минимуму до окрашивания антител, которые могут быть достигнуты путем добавления моющего средства, такие как Triton X-100, в блокирующих буферов28.

Использование 0,3%-0,4% Triton X-100 в блокирующих буферах также позволяет в полной мере проникать антителами в секции тканей. Кроме того, хотя антитела преимущественно специфичны для одного эпитопа, возможна частичная связывание участков на неспецифических белках, что приводит к высокому фоновому окрашиванию29. Неспецифические привязки могут маскировать сигнал целевого антигена30. Чтобы уменьшить неспецифическое фоновое окрашивание, образцы должны быть инкубированы буфером, который блокирует неспецифические реактивные участки. Общие блокирующие буферы включают нормальную сыворотку или бычьей сыворотки альбумина30. Вид блокирующей сыворотки должен быть таким же, как у хозяина вторичного антитела. Рекомендуется определить лучшее время инкубации. Концентрация нормальной сыворотки в блокирующем буфере является еще одним важным определением31. Кроме того, для устранения фонового окрашивания, крайне важно использовать оптимальное разбавление первичных и вторичных антител. Таким образом, время инкубации должно быть выбрано тщательно, в дополнение к температуре (т.е. увеличить время при выполнении при 4 градусах Цельсия, уменьшить время, если на RT) и системы обнаружения.

Выбор антител

Выбор антител для iHC окрашивания имеет важное значение и может повлиять на экспериментальный результат32. Для обеспечения того, чтобы антитела будут реагировать соответствующим образом, эпитоп, признанный им, должен быть рассмотрен. Понимание целевого белка и его функции, локализации тканей и субклеточной ткани, а также то, претерпевает ли он посттрансляционные изменения, может помочь определить выбор антител. Другим важным шагом является тестирование различных концентраций первичных/ вторичных антител, чтобы сохранить фон и специфичность на минимальном уровне, совместимом с конкретным сигналом. Кроме того, важно проверить реактивность видов, чтобы подтвердить совместимость первичных и вторичных антител и способность первичного антитела распознавать цель антигена в ее родной конформации. Другим важным шагом для первичного выбора антитела является выравнивание генов. Это гарантирует, что первичное антитело реагирует с биомолекулой интереса и предоставляет информацию о том, какой эпитоп распознается антителами в конкретной модели животных. Выравнивание генов также обеспечивает возможность выбора антител, способных распознавать эпитопы, которые эволюционно сохраняются.

Элементы управления

Для уточнения специфики антител важным аспектом является выполнение элементов управления, что позволяет обнаруживать специфические окрашивания. Элементы управления включают в себя: i) ткани, известные, чтобы выразить антиген в качестве положительного контроля; ii) ткань, которая, как известно, не выражает антиген в качестве отрицательного контроля; iii) упущение первичного антитела или поглощение первичного антитела с конкретным пептидом, чтобы подтвердить, что вторичное антитело не перекрестно реагирует с другими компонентами ткани14,33.

В методах IHC несколько шагов могут вызвать проблемы до достижения окончательного окрашивания. Сильное фоновое окрашивание и неспецифические целевые окрашивания антигена могут быть вызваны эндогенным биотином или первичным/вторичным антителами поперечной реактивностью и плохой активностью ферментов или первичной антител, соответственно. Фоновое окрашивание и неспецифические связывания можно предотвратить, блокируя эндогенные ферменты до инкубации с первичным антителом. Использование нормальной сыворотки является лучшим способом блокировать неспецифические взаимодействия30. Выбор блокирующего буфера зависит от используемого метода обнаружения. Кроме того, ткани, как известно, не хватает выражения целевого антигена, как отрицательный контроль может выступать в качестве ссылки для определения количества фонового окрашивания34. Осаждение хромогенного или флуоресцентного сигнала в отрицательном контроле подтверждает наличие неспецифического окрашивания. Кроме того, недостаточное блокирование времени приводит к высокому фону, в то время как чрезмерная блокировка приводит к низкому сигналу35.

При окрашивании иммунопероксидаза наличие эндогенной пероксидаза в тканях является еще одной причиной осаждения коричневого фона. Лечение H2O2 до инкубации с первичными антителами блокирует эндогенную пероксидаза36,37. Напротив, в иммунофлуоресценции фиксация играет ключевую роль в генерации автофлюоресценции. Чтобы избежать аутофлуоресценции, необходимо тщательно выбрать лучший метод фиксации, время фиксации и подготовку тканей. Другим важным шагом IHC является проверка первичного антитела. Антитело считается действительным, если оно производит последовательную и специфическую картину окрашивания в конкретной ткани или клеточных/субклеточных компонентах, и если предварительное поглощение первичного антитела с конкретным пептидом не дает окрашивания38. В иммунофлуоресценции, неспецифическая связывание показывает аналогичную интенсивность флуоресцентных при трех цветных детекторах флуоресценции, в то время как сигнал переменной, так как используются различные флуоресцентные конъюгированные вторичные антитела. Эти аспекты подготовки ткани IHC и окрашивания антител должны быть решены для преодоления проблемок окрашивания.

IHC, хотя и относительно простой метод, представляет некоторые ограничения и зависит от многих факторов39. Одним из важнейших моментов является формалина фиксация, которая может изменить выражение пост-перевод модифицированных белков. С другой стороны, формалиновые парафина встроенные ткани могут храниться в долгосрочной перспективе при комнатной температуре, в то время как замороженные ткани могут храниться только в течение одного года при -80 градусов по Цельсию. Кроме того, замороженные ткани могут быть повреждены образованием кристаллов льда, которые могут повлиять на субклеточные детали, изменяющие IHC окрашивание40,41. Что касается наших исследований, наиболее сложным аспектом было найти конкретные первичные антитела против молекул зебры. Хотя зебрафиш были признаны в качестве действительной модели животных с высокой сохранившейся степенью структуры, очень мало антител были разработаны, которые могут распознавать конкретные белки и другие молекулы в зебрафиш. Чтобы преодолеть эти ограничения, важно проверить специфику антител западным анализом промотирования и выравниванием генов.

Растущий интерес к методам IHC привел к разработке высокоспецифических иммуностоинга, которые могут помочь в следственных исследованиях42. IHC используется с все более частотой для определения наличия конкретных молекулярных маркеров и их изменений в различных патологиях. Два подхода, иллюстрированные здесь, иммунопероксидаза и иммунофлуоресценция, имеют соответствующие преимущества и недостатки43. Парафин-встроенные ткани, используемые в методе иммунопероксидаза, может позволить для высокого разрешения клеток и тканей и выявить подробности о распределении и количество целевых белков44,45. Однако, парафина встроенных тканей не подходят для иммунофлуоресценции, так как парафин может маскировать антигенность и привести к неспецифической флуоресценции46. С другой стороны, криосекция ПФА-фиксированной ткани сохраняет эндогенную антигенность и приводит к снижению неспецифической флуоресценции. Даже если техническое качество криосекций намного ниже, чем у парафина встроенных тканей, они могут дать действительные результаты с помощью метода IHC47.

Кроме того, в то время как встраивание парафина лучше сохраняет морфологические детали, криоконсервация лучше сохраняет фермент и экспрессию антигена, что приводит к более детальной иммуноконсервации. Метод иммунофлуоресценции также позволяет современное обнаружение двух или трех различных биомолекул, выявление возможных взаимодействий, как показано в нашей предыдущей работе для орексина и эндоканнабиноидных систем10. Среди методов, используемых для определения распределения и уровней конкретных биомолекул, IHC позволяет не только определить специфическое морфологическое выражение и распределение молекул и белков, но и возможность выполнять количественные Анализа.

С помощью иммунофлуоресценции, сораспределения и коэкспрессии биомолекул также могут быть поняты, а также возможные взаимодействия и их изменения в случаях различных патологий48. Конфокальная микроскопия, в течение последних 20 лет, часто используется для изучения клеточного и субклеточного распределения многочисленных белков в мозге млекопитающих. Флуоресценция микроскопии также позволяет визуализации (с использованием флюорофоров или флуоресцентных красителей) конкретных структур, представляющих интерес, таких как белки, органеллы и другие биологические вещества; такие сигналы могут быть использованы как в фиксированных, так и в живых биологических системах для изображения конкретных подклеточных структур49. Потенциальная модуляторная функция биомолекул в конкретных клеточных отсеках может быть изучена с помощью визуализации их моделей выражения, в то время как роль белка, сигнализирующего в тканях, может быть раскрыта с помощью нейроанатомического распределения метаболические экспрессии ферментов или рецепторов.

Представленная техническая работа вводит IHC подходы, в основном иммунофлуоресценции, к изучению двух высоко консервированных систем, орексина и эндоканнабиноида, в модели зебры для взрослых. В частности, для определения распределения, относительного количества и анатомических взаимодействий специфических белков в тканях-мишенях могут использоваться иммунофлуоресценция. Криоконсервация ПФА-фиксированных тканей лучше сохраняет высокочувствительные белки, подверженные быстрому ухудшению. Кроме того, считается, что криоконсервация лучше сохраняет антиген и антигенность, и она позволяет изучать послеперевода модифицированных белков и ДНК.

Даже если замороженные ткани (по сравнению с парафин-встроенных разделов) толще, что затрудняет способность наблюдать морфологии тканей в деталях, конфокальная микроскопия позволяет образец визуализации в мельчайших деталях и повышает возможности визуализации. Кроме того, иммунофлуоресценция может быть использована для количественного анализа интенсивности окрашивания, а денситометрический анализ сигнала обеспечивает количественные данные. Это позволяет определить корреляции уровней сигнала флюорохрома с уровнями экспрессии белка, глядя на области совместной локализации. Эта работа описывает и иллюстрирует протоколы, которые могут быть использованы для изучения эволюционного сохранения важных белков у взрослых зебры. Использование IHC, в основном иммунофлуоресценции, у взрослых зебры может помочь подчеркнуть полезность этой модели животных в изучении морфологического выражения и распределения высоко сохраненных биомолекул, а также выявить возможные изменения по всей различные патологические состояния, коррелирующие с физиологией человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Фонди Ricerca ди Ateneo (FRA)2015-2016, Университет Саннио.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Биохимия выпуск 148 иммуногистохимия иммунопероксидаза рецептор орексина эндоканнабиноидный рецептор мозг зебры кишечник зебры
Выявление ортексин и эндоканнабиноидных рецепторов у взрослых зебрафиш с использованием иммунопероксидаза и иммунофлуоресценции Методы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imperatore, R., D'Angelo, L., De… More

Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter