Summary
Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.
Abstract
Métodos baseados em recombinação homóloga para modificar genes têm promovido significativamente a pesquisa biológica. Modelos de rato geneticamente modificados (GEMMs) são um método rigoroso para estudar o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Nosso laboratório desenvolveu vários GEMMs de câncer de próstata (PCa) que não possuem expressão de um ou vários genes supressores de tumor usando o sistema de recombinase CRE-loxP específico do site e um promotor específico da próstata. Neste artigo, nós descrevemos nosso método para o necropsia destes gemms do PCA, focalizando primeiramente na dissecção de tumores da próstata do rato. Novos métodos desenvolvidos ao longo da última década facilitaram a cultura de células derivadas de epitelial para modelar sistemas de órgãos in vitro em três dimensões. Nós igualmente detalham um método da cultura da pilha 3D para gerar organóides do tumor dos gemms do PCA do rato. A pesquisa de câncer pré-clínico tem sido dominada pela cultura de células 2D e por modelos de xenoenxertos derivados de células derivadas ou derivadas de pacientes. Estes métodos não têm microambiente tumoral, uma limitação do uso dessas técnicas em estudos pré-clínicos. Os GEMMs são mais fisiologicamente relevantes para a compreensão da tumorigênese e progressão do câncer. A cultura organóide tumoral é um sistema modelo in vitro que recapitula a arquitetura tumoral e as características da linhagem celular. Além, os métodos da cultura da pilha 3D permitem o crescimento de pilhas normais para a comparação às culturas da pilha do tumor, raramente possível usando técnicas da cultura da pilha 2D. Em combinação, o uso de GEMMs e cultura de células 3D em estudos pré-clínicos tem o potencial de melhorar a nossa compreensão da biologia do câncer.
Introduction
Desde o final da década de 1980, a capacidade de alterar genes por recombinação homóloga tem avançado muito o estudo dos sistemas biológicos1. Os sistemas inducible, tissue-, ou Cell-specific do promotor e recombinases local-específicos, tais como CRE-loxp, têm estudos genéticos avançados facilitando o controle sobre modificações genéticas ambos temporally e espacialmente2,3, a 4. A combinação dessas estratégias genéticas criou uma ampla gama de sistemas experimentais de modelos5,6,7.
Modelos de mouse geneticamente modificados (GEMMs) são uma ferramenta integral para avaliar como genes individuais ou grupos de genes afetam o desenvolvimento de mamíferos e doenças. Na pesquisa pré-clínica de câncer, os GEMMs são o método mais rigoroso e fisiologicamente relevante para estudar o desenvolvimento, progressão e tratamento do câncer8. Nosso laboratório especializa-se em gerar e caracterizar GEMMs do cancro.
O câncer não-cutâneo mais altamente diagnosticado entre os homens nos Estados Unidos é o câncer de próstata (PCa). A maioria dos pacientes com PCa tem doença de baixo risco e alta probabilidade de sobrevida, mas as taxas de sobrevida diminuem drasticamente quando a doença é diagnosticada em estágios avançados ou se a terapia hormonal direcionada induz progressão a PCa agressivo, não curável subtipos9,10. Nosso laboratório desenvolveu GEMMs que utilizam alelos floxed de um ou mais genes supressores de tumor. Recombinação e perda da expressão gênica do supressor tumoral ocorre especificamente na próstata porque introduzimos um transgene com CRE recombinase downstream do promotor probasin ativado apenas em células epiteliais da próstata11, 12. We igualmente criaram nossos gemms para conter um transgene do repórter de CRE chamado MT/mg, que induz a expressão fluorescente da proteína do tomate nas pilhas que faltam CRE e a expressão fluorescente verde da proteína (GFP) nas pilhas com CRE13. Enquanto a apresentação deste método e nossos resultados representativos mostram GEMMs que estudamos em nosso laboratório, este protocolo pode ser usado para gerar organóides de câncer de próstata a partir de qualquer modelo de mouse. Entretanto, como discutido em detalhe em nossa seção representativa dos resultados, nós observamos que determinadas características do tumor são ideais para a geração do organoid do cancro de próstata.
Na última década, novos métodos de cultivo de células de tecidos de origem epitelial levaram a avanços significativos em nossa capacidade de modelar sistemas de órgãos in vitro14,15. O termo "cultura de células 3D" tem sido atribuído às técnicas envolvidas no estabelecimento e manutenção de organóides, que podem ser geralmente definidos como estruturas feitas de células que montam a arquitetura secundária impulsionada por linhagem de células específicas de órgãos características16. Estes novos métodos são distintos da cultura de células 2D clássicas em que as pilhas não necessitam de transformação ou imortalização para o crescimento a longo prazo; assim, as culturas 3D de pilhas normais podem ser comparadas às pilhas doentes. Isto é particularmente valioso na pesquisa do cancro onde as culturas normais do controle de pilha não estiveram tipicamente disponíveis. Além disso, organóides espontaneamente formam arquiteturas secundárias de tecidos com tipos de células adequadamente diferenciados, tornando-os um sistema de melhor modelo para entender o câncer in vitro do que as linhas de células 2D17. Nosso laboratório criou linhas organóides 3D da questão tumoral isolada de nossos PCa GEMMs para complementar nossos dados in vivo e realizar experimentos que não seriam viáveis em GEMMs.
Neste artigo, nós apresentamos protocolos escritos e visuais para o necropsia completo de gemms do PCA, incluindo a dissecção de lóbulos distintos da próstata do rato e de Lesões metastáticas. Nós descrevemos e mostramos um método passo a passo para gerar organóides dos tumores da próstata do rato baseados em um protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organóides do tecido epithelial da próstata do rato normal18.
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Protocol
Os procedimentos animais aqui descritos foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) no departamento de recursos de animais de laboratório, centro de câncer abrangente do Parque Roswell, Buffalo, Nova York.
Nota: Camundongos machos a serem dissecados para isolar proestados ou tumores de próstata para a geração de organóides devem ter pelo menos atingido a idade da maturidade sexual — cerca de 8-10 semanas de idade. Idades específicas de camundongos podem variar entre os estudos. Alguns fatores a considerar ao escolher a idade incluem mudanças dependentes da idade em populações da pilha da próstata, expressão idade-dependente de transgenes promotor-conduzidos específicos de CRE, e taxa de progressão do tumor da próstata em um GEMM particular.
1. dissecção e imagem latente do rato ProstateTumor e de tumores metastáticos
- Preparações
- Obtenha as ferramentas de dissecção estéreis necessárias. Área da dissecção do estágio na superfície estéril limpa com uma régua de 15 cm, contrapeso da precisão, contrapeso analítico, frasco do pulverizador com etanol 70%, salino phospho-tamponado (PBS), e toalhas de papel.
-
Preparação de soluções fixativas para órgãos e ossos viscerais que não devem ser utilizados para a geração organóide
- Para órgãos viscerais: Prepare 4% paraformaldeído (PFA) em PBS. Para um rato, fazer 20 mL de 4% PFA, alíquota em 2 15 mL tubos cônicos e manter à temperatura ambiente até o uso.
- Para ossos longos: alíquota 10 mL de formalina tamponada neutra pré-feita de 10% (NBF) em 1 15 mL de tubo cônico e manter à temperatura ambiente até o uso.
- Obtenha pratos não tratados de 10 cm e encha com PBS não estéril — estes servirão como recipientes temporários para órgãos durante a dissecção fina usando um microscópio de dissecção.
Nota: Ferramentas estéreis são usadas para dissecação de tecidos para a geração de organóides. Ferramentas não estéreis são usadas para a incisão inicial e dissecção dos membros posteriores.
- Eutanásia e incisão inicial
- Eutanizar o rato por CO2 asfixia usando um 2,0 L/min taxa de fluxo para 5 min. Retire o rato da gaiola e realize a deslocação cervical. Use o equilíbrio de precisão para medir o peso corporal e o registro do mouse.
- Coloque o mouse sobre uma toalha de papel e Oriente sobre a superfície de dissecção ventral lado acima com a cabeça do mouse voltada para longe do investigador. Afixe o rato à placa esticando para fora seus membros e perfurando cada um dos patas dianteiras e patas traseiras com uma agulha descartável.
- Usando uma garrafa de spray, apagar a pele do mouse com 70% de etanol. Usando tesouras de dissecção não estéreis e fórceps reto, aperte logo acima do pênis do mouse e faça uma pequena incisão através da pele apenas.
- Continue a incisão Midline até o pescoço do mouse através da pele apenas. Faça incisões bilaterais a partir do ponto da incisão inicial através do plano ventral do mouse através da pele apenas.
- Segure a pele e puxe-a cuidadosamente para longe da pele do rato. Fixar a pele ao tabuleiro para permitir o acesso às cavidades abdominal e torácica.
- Extração do sistema urogenital masculino en Bloc
- Usando tesouras estéreis da dissecção e fórceps reto, corte com cuidado através da pele aproximadamente 0,75 cm acima do recto. Continuar a incisão Midline até a caixa torácica sem perturbar quaisquer órgãos na cavidade abdominal. Retire cuidadosamente a pele e fixe-a na placa para expor toda a cavidade abdominal.
Nota: Não permita que esses instrumentos toquem a parte externa do mouse ou qualquer superfície na área de preparo, pois esses tecidos serão usados para gerar organóides. - Dissecar o sistema urogenital e outros órgãos de acordo com o diagrama na Figura 1a, com números indicando a ordem em que os órgãos serão removidos do mouse.
- Encontre a bexiga, em seguida, segure a almofada de gordura para a esquerda ou direita e puxe para cima para expor o testículo. Cuidadosamente dissecar o testículo do resto da região urogenital e colocar de lado. Faça o mesmo procedimento do outro lado.
Nota: Conseguir a qualidade óptima do tecido e a caracterização detalhada do tumor de tumores da próstata exigem que a região urogenital inteira esteja removida do bloco19do en do rato. Recomenda-se que a região urogenital seja removida primeiro (Figura 1a). - Segure a bexiga e puxe cuidadosamente para que a região urogenital levante em conjunto, expondo a uretra embaixo. Enquanto segurando a bexiga, orientar a tesoura para que eles estão contra a parte inferior da próstata dorsal e cortar a uretra. A região urogenital inteira liberará então da cavidade abdominal.
- Coloque a região urogenital em um prato de 10 cm preenchido com PBS. Se ainda estiver cheio de urina, drenar a bexiga fazendo uma pequena incisão. Usando o equilíbrio analítico, pesar o sistema urogenital e registro.
- Usando tesouras estéreis da dissecção e fórceps reto, corte com cuidado através da pele aproximadamente 0,75 cm acima do recto. Continuar a incisão Midline até a caixa torácica sem perturbar quaisquer órgãos na cavidade abdominal. Retire cuidadosamente a pele e fixe-a na placa para expor toda a cavidade abdominal.
- Extração de linfonodos pélvicos, baço, fígado, rim, pulmão, tíbia e fêmur
- A remoção do sistema urogenital expõe os linfonodos pélvicos, posicionados logo atrás do sistema urogenital (Figura 1a) e em ambos os lados da coluna vertebral. Os linfonodos só serão visíveis se contiverem Lesões metastáticas ou se houver inflamação local. Oriente o fórceps reto debaixo do nó de linfa e puxe-o acima para remover o nó de linfa. Faça o mesmo procedimento do outro lado.
- Segure o reto com o fórceps reto e corte. Puxe o reto para desvendar todo o cólon e intestino delgado, procurando lesões metastáticas nos linfonodos mesentéricos. Quando o íleo inteiro é removido, continue a puxar o duodeno para expor o estômago. Corte o esôfago para remover completamente o estômago e descartar. Se forem observadas lesões metastáticas nos linfonodos, dissecem-se cuidadosamente do intestino e armazenem-se em um prato de 10 cm de PBS.
- Expor e remover o estômago puxará o baço do lado dorsal do abdômen (Figura 1a). Retire o baço e coloque em 4% PFA. O baço serve como um controle de coloração para hemotoxylin como é altamente celular.
Nota: Os tecidos viscerais que não devem ser utilizados para a geração organoide serão fixados durante a noite em 4% de PFA, lavados com PBS e, em seguida, colocados em etanol a 70%. - Retire o fígado na parte superior do abdômen (Figura 1a). Baseado na carga metastática no fígado, os lóbulos individuais podem ser dissecados, ou o fígado inteiro pode ser removido cortando com cuidado ao longo do diafragma. (Não cortar através do diafragma neste momento). Coloque o fígado em um prato de 10 cm de PBS.
- A remoção do fígado irá expor totalmente os rins em ambos os lados da coluna vertebral (Figura 1a). Retire os rins — juntamente com os linfonodos renais, se os nódulos tiverem Lesões metastáticas — colocando a pinça reta embaixo do rim e puxando para cima. Faça o mesmo procedimento para o outro lado.
- Para expor a cavidade torácica, corte com cuidado o diafragma ao longo da nervgaiola. Perfurar o diafragma irá liberar a pressão negativa na cavidade torácica e expor o coração e os pulmões (Figura 1a).
- Segure o esterno e puxe para cima para abrir a cavidade torácica ainda mais. Observar a face ventral da cavidade torácica ao longo da costela para lesões metastáticas nos linfonodos torácicos e dissecar, se presente.
- Enquanto ainda segurando o esterno, cortar a caixa torácica ventral para acessar o coração e os pulmões. Segure o coração, puxe para cima e corte debaixo dos pulmões. Para remover completamente o coração e os pulmões en Bloc, corte todos os vasos sanguíneos anteriores e a traquéia. Coloque o tecido em PBS e Retire cuidadosamente o coração sem danificar o tecido pulmonar ou lesões pulmonares metastáticas.
- Tome o fórceps reto não-estéril e tesouras de dissecação e corte a perna traseira na cabeça do fêmur. Segure cuidadosamente o fêmur e retire a perna traseira da pele.
- Coloque a perna traseira em uma toalha de papel e segure a pata traseira. Use a lâmina de navalha única borda para sucata/cortar todos os músculos e tecido conjuntivo da tíbia e do fêmur. Retire o fêmur da tíbia cortando o posterior à patela e retire a tíbia removendo a pata traseira. Coloque a tíbia e o fêmur em 10% NBF. Faça o mesmo procedimento do outro lado.
Nota: Para as finalidades de examinar os ossos longos do rato para lesões metastáticas, a fíbula não precisa de estar intacta. Os ossos longos serão fixados em 10% NBF por uma semana, então descalcificados usando solução neutra de EDTA20. Após três semanas, os ossos serão transferidos para 70% de etanol. - Depois de remover os membros posteriores, tome um corte de orelha ou cauda para genotipagem futura. Descarte a carcaça do mouse e todo o tecido que não deve ser fixado ou usado para a geração organóide.
- Dissecção do tumor da próstata
Nota: A dissecção de lobos da próstata do rato pode somente ser conseguida usando um microscópio de dissecação19. Entretanto, a carga do tumor da próstata pode ser tão elevada que os lóbulos individuais não podem ser distinguidos, e a dissecção pode ser realizada sem um microscópio. Não obstante, o protocolo completo para a dissecção de lóbulos individuais da próstata é descrito abaixo.- Coloc a região urogenital em um prato de 10 cm de PBS um microscópio de dissecação e Oriente o lado ventral acima com a bexiga e as vesículas seminais que enfrentam afastado do investigador. Toda a manipulação da região urogenital deve ser feita usando instrumentos estéreis.
- Avalie o phenotype geral do tumor da próstata-mais provável, um tumor líquido-enchido ou contínuo será observado em PCa GEMMs (Figura 2a, B).
Nota: Os tumores cheios de fluidos estão frequentemente localizados na região anterior da próstata (Figura 2a). Os tumores cheios fluidos são compo do tecido primeiramente conexivo com componentes epithelial escasso-assim estes tumores não são ideais para a geração organoid por causa do baixo número de pilhas epithelial do tumor, como será discutido nos resultados representativos Seção. - Se os tumores cheios de fluido estão presentes, picar um pequeno buraco no tumor. Coloque a região urogenital em um novo prato de 10 cm de PBS.
- Pegue um par de fórceps reto na mão não dominante e fórceps curvo na mão dominante. Vire a região urogenital para a sua face dorsal. Procure a região proximal da próstata (Figura 1B), que pode ser identificada pela cor rosa/vermelha da uretra. Segure a uretra e segure firme para manipular o tecido urogenital com o fórceps curvo.
Nota: Durante a dissecção da próstata, sempre tome nota da localização da bexiga, pois esta é a maneira mais simples de localizar os lóbulos de próstata individuais (Figura 1B).
- Remoção de tecido não prostático da região urogenital
- Ainda na face dorsal da região urogenital, encontrar a base da vesícula seminal. Retire cuidadosamente a vesícula seminal e descarte. Realize o mesmo procedimento no lado oposto.
Nota: Evite perfurar o vesicle seminal, como aquele liberará o líquido secretora pegajoso e opaco que interfere com a dissecção da próstata. Se a vesícula seminal for puncionada, transfira a região urogenital remanescente para um novo prato de 10 cm com PBS fresco. - Remover e descartar o ducto deferente e tanto gorduroso e tecido conjuntivo possível usando o lado curvo do fórceps.
- Enquanto ainda segurando firmemente a uretra/região proximal da próstata, use um par de tesouras finas e pontiagudas para remover a bexiga da uretra.
- Ainda na face dorsal da região urogenital, encontrar a base da vesícula seminal. Retire cuidadosamente a vesícula seminal e descarte. Realize o mesmo procedimento no lado oposto.
- Isolação de lóbulos individuais da próstata
- Localize a próstata anterior (Figura 1B). Assegure-se de prender firmemente a região proximal da próstata/uretra com o fórceps reto. Retire a região anterior da próstata, agarrando diretamente o tecido com o lado curvo do fórceps e puxando-o firmemente para longe da bexiga e do resto da próstata. Coloque o tecido em PBS.
Nota: Para todas as regiões prostáticas, podem ser necessárias tesouras de dissecação para remover o tecido, dependendo do tamanho do tumor. - Localize a região ventral da próstata (Figura 1B). Remova a região ventral da próstata da mesma maneira que na etapa 1.5.7.
- Neste ponto da dissecção, apenas as regiões da próstata lateral e dorsal devem estar presentes, enquanto a região proximal da próstata ainda está sendo apreendido pelo fórceps reto. Avaliar as regiões da próstata lateral e dorsal (Figura 1B). Se a região lateral pode ser distinguida da região dorsal, retire a região da próstata lateral, conforme descrito na etapa 1.5.7. Faça o mesmo procedimento no lado oposto.
- Retire a região dorsal da próstata, conforme descrito no passo 1.5.7. Coloc a região proximal da próstata em 4% PFA, porque sua estrutura dentro do tecido muscular da uretra fá-la inadequada para a geração organoid.
- Localize a próstata anterior (Figura 1B). Assegure-se de prender firmemente a região proximal da próstata/uretra com o fórceps reto. Retire a região anterior da próstata, agarrando diretamente o tecido com o lado curvo do fórceps e puxando-o firmemente para longe da bexiga e do resto da próstata. Coloque o tecido em PBS.
2. geração de organóides 3D do tecido do tumor da próstata
Nota: A Figura 3 mostra uma descrição pictórica do procedimento para a geração de organóides tumorais.
- Preparação
- Prepare os meios organóides da próstata do rato de acordo com Drost et al.18 com as seguintes alterações. Use meio condicionado em vez de proteínas recombinantes para Noggin e R-Spondin e use uma concentração final de 1% (v/v), em vez de 10%, tanto para Noggin-e R-Spondin-condicionado médio.
Nota: HEK293 células estavelmente transfected com HA-mouse Noggin-FC ou HA-mouse Rspo1-FC são usados para produzir Noggin-ou R-Spondin-condicionado médio, respectivamente. Estas linhas celulares foram um presente do laboratório Calvin Kuo na Universidade de Stanford. - Prepare a solução da digestão em um tubo de 15 ml diluindo a colagenase II de 20 mg/ml com meios avançados de DMEM/F12 (+ + +) a uma concentração final de 5 mg/ml. Adicionar Y-27632 inibidor da rocha à solução de colagenase II numa concentração final de 10 μm.
Nota: A proporção de tampão de digestão para tecido é de 1 mL a 50 mg, que utilizamos de acordo com Drost et al.18.
- Prepare os meios organóides da próstata do rato de acordo com Drost et al.18 com as seguintes alterações. Use meio condicionado em vez de proteínas recombinantes para Noggin e R-Spondin e use uma concentração final de 1% (v/v), em vez de 10%, tanto para Noggin-e R-Spondin-condicionado médio.
- Mincing e digestão do tecido do tumor
- Na capa da cultura da pilha, coloque o tecido do tumor da próstata em um prato de cultura estéril de 10 cm, dissecar e descartar o tecido necrótico.
- Mince o tecido restante do tumor da próstata em 1 milímetro3 cubos prendendo as partes do tecido com o fórceps curvado estéril e cortando com tesouras da dissecção.
- Coloc as partes trituradas do tumor no tubo de 15 mL com o amortecedor da digestão escavando os acima com o lado curvado do fórceps. Digerir o tecido tumoral a 37 ° c com agitação para 1,5 a 2 h. verificar o progresso da digestão a cada 20 min.
Nota: Neste momento, tirar pelo menos 2 mL de matriz de-20 ° c de armazenamento e descongelar no gelo. 1 mL de alíquotas de matriz levará aproximadamente 3 h para descongelar. - Após a digestão do tecido, tubo de centrífuga em 175 x g para 5 min a 4 ° c para formar um pellet celular.
- Retire o sobrenadante, movimente o tubo para afrouxar o pellet celular, e ressuscitam o pellet celular em 1 mL de pré-aquecido tripsina suplementado com 10 μM Y-27632 rocha inibidor. Coloque o tubo em um banho de água de 37 ° c por 5 min.
- Após a incubação, pipeta para cima e para baixo 5 vezes com uma ponta padrão de P1000. Retorne o tubo ao banho de água de 37 ° c para um outro minuto 5 e repita a etapa 2.2.6.
Nota: Neste momento no procedimento, aqueça um prato estéril da cultura da pilha de 6 poços põr o em uma incubadora de 55 ° c.
- Contagem de células e ressuspensão em matriz
- Lave as células adicionando 9 mL de frio AdDMEM/F12 (+ + +) e Centrifugue o tubo a 175 x g por 5 min a 4 ° c.
- Após a centrifugação, retire o sobrenadante, movimente o tubo para soltar o pellet e lave as células novamente adicionando 10 mL de AdDMEM/F12 a frio (+ + +). Centrifugue o tubo a 175 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Após a centrifugação, retire o sobrenadante, deslize o tubo para afrouxar o pellet, ressuscitem as células em 1 ml de ADDMEM/F12 (+ + +), e contar o número de células usando um hemocitômetro de acordo com o procedimento padrão.
- As domos de sete a oito cabem em um poço de um prato de 6 poços quando os organóides são chapeados na matriz através de uma forma gota-sábia. Aproximadamente 200 μL de matriz produzirá 7-8 domos. Decidir quantos poços de organóides são necessários para fins experimentais futuros e calcular o volume de matriz necessária. Em seguida, calcule o volume de solução contendo células necessária para ter uma concentração final de 1,0 x 106 células/ml de matriz.
- Depois de contar as células, centrifugue a 175 x g durante 5 min a 4 ° c. Retire o sobrenadante, mexa o tubo para afrouxar o pellet, e ressuscitam as células em volume de matriz calculada na etapa 2.3.4.
Nota: A matriz permanece na forma líquida apenas a 4 ° c; manter tubos de matrizes e soluções de células-matriz no gelo em todos os momentos.
- Cúpulas da matriz do chapeamento e aplicação dos meios
- Misture a solução da matriz-pilha com um Pipet P200 distribuir uniformente as pilhas sem introduzir bolhas. Retire o prato de cultura de 6 poços da incubadora de 55 ° c.
- Cuidadosamente pipeta 200 μL de solução de célula matriz e rapidamente soltar a solução em um poço para criar domos.
- Repita o passo 2.4.2. até que o volume da solução da matriz-pilha esteja gasto. Permita que as abóbadas se solidifique à temperatura ambiente durante 2 min.
- Vire o prato de 6 poços de cabeça para baixo e coloque o prato em uma incubadora de 37 ° c para continuar a solidificação por 20 min.
- Após a incubação, adicione 2 mL de mídia organoide da próstata do mouse a cada poço. Adicione o andrógeno sintético R1881 a cada poço para uma concentração final de 1 nM e o inibidor da rocha Y-27632 a uma concentração final de 10 μM. Misture cuidadosamente e coloque a placa numa incubadora de 37 ° c para cultivo.
Nota: A mídia de cultura organóide precisa ser suplementada com 10 μM de inibidor de rocha Y-27632 por apenas 1 semana após a geração de organóides.
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Representative Results
As imagens representativas do necropsia de um rato com um grande tumor preliminar líquido-enchido da próstata na região anterior da próstata são mostradas na Figura 2a. Ao contrário, Figura 2B, mostra imagens representativas do necropsia de um rato com um grande tumor preliminar contínuo da próstata para que as regiões individuais da próstata sejam indistinguíveis. As imagens de dissecção fluorescente mostram o mesmo tumor de próstata sólido da Figura 2B expressando GFP, indicando que as células dos tumores expressam CRE (Figura 2C). Tecido que não expressa probacia, como a bexiga, expresso de tomate e, portanto, não expressa CRE (Figura 2C). O fígado e os pulmões do rato da Figura 2B têm tumores metastáticos expressando GFP, mostrando que originaram do tumor preliminar da próstata, e são cercados pelo tecido normal que expressa o tomate (Figura 2C ). Finalmente, o linfonodo pélvico deste camundongo expressa GFP e não tomate, indicando que este tumor metastático ultrapassou este órgão e nenhum tecido normal permanece (Figura 2C).
Nós mostramos imagens na Figura 4 dos organóides que nós geramos de um tumor contínuo da próstata. No dia 1, pequenos organóides estão se formando, como visto nas imagens de contraste de fase representativa. As imagens fluorescentes no dia 1 mostram que o tomate e o GFP que expressam pilhas estão atuais na cultura organoid do tumor (setas). No entanto, pelo dia 7, quando organóides do tumor da próstata formaram totalmente, estes organóides estão expressando GFP e não tomate. Estes dados sugerem que estes organóides se originaram das pilhas do tumor que expressaram CRE e não das pilhas epithelial normais. Estes organóides do tumor continuam a ser somente GFP-positivo porque nós expandimos nossa cultura à passagem 1 e 2.
Na Figura 5, mostramos imagens de organóides que geramos a partir de um tumor de próstata cheio de fluido. No dia 1, pequenos organóides estão se formando, e as imagens fluorescentes mostram que ambas as células de expressão de tomate e GFP estão presentes na cultura organóide — semelhante à nossa observação no dia 1 para organóides gerados a partir de um tumor de próstata sólido (Figura 4). No entanto, organóides de um tumor de próstata cheio de fluido expressam GFP ou tomate no dia 7 — indicando que os organóides formaram a partir de células que não expressam CRE. Esse padrão continua na passagem 1 e na passagem 2, onde a cultura tem organóides de expressão de tomate e GFP. Uma análise mais adicional destes organóides é severamente limitada porque a linha é uma mistura de organóides epithelial normais e de organóides do tumor. Nós acreditamos que os tumores fluido-cheios da próstata são suboptimal em gerar organóides do tumor simplesmente porque há uma porcentagem maior de pilhas epithelial normais da próstata. Uma vez que ambas as células epiteliais da próstata normal e células cancerosas da próstata formam organóides, as linhas geradas a partir de tumores de próstata cheios de fluido são uma mistura de organóides normais e de câncer. Nós obtemos linhas organoid do tumor puro dos tumores fluido-cheios da próstata pela classificação do fluxo para pilhas GFP-positivas e gerando organóides dessa população das pilhas. Os tumores contínuos da próstata são compreendidos primeiramente de pilhas do tumor, conseqüentemente os organóides gerados destes tumores são uma população mais pura de organóides do cancro sem classificação prévia para GFP.
Figura 1 : Nossa ordem recomendada da dissecção para o cancro da próstata (PCA) projetou genetically modelos do rato (GEMMs) e a anatomia da próstata do rato. (A) a ordem que recomendamos em nosso protocolo para dissecação dos principais órgãos de um PCA GEMM. 1. região urogenital. 2. linfonodos pélvicos. 3. baço. 4. fígado. 5. rins. 6. pulmões. 7. tíbia e fêmur. (B) mapa da região urogenital do rato e anatomia da próstata. Imagens fluorescentes da dissecção de um rato velho de 12 semanas que expressa probasin-CRE e o transgene do repórter do MT/mg CRE. Bexiga (BL), vesículas seminais (SV), próstata anterior (AP), próstata ventral (VP), próstata lateral (LP), próstata dorsal (DP) e próstata proximal (PP). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Imagens representativas da dissecção do cancro de próstata (PCA) modelos genetically projetados do rato (GEMMs). (A) a cavidade abdominal antes da remoção da região urogenital e da região urogenital com um tumor fluido-enchido da próstata. (B) a cavidade abdominal antes da remoção da região urogenital e da região urogenital com um tumor contínuo da próstata. (C) representativas de tomate e GFP imagens fluorescentes de um tumor de próstata sólido, fígado, pulmão, e linfonodo pélvico de um PCA GEMM que desenvolve Lesões metastáticas. Barra de escala = 5 mm. bexiga (BL), próstata anterior (AP) e próstata dorsal (DP). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Fluxograma do protocolo para a geração de organóides do tumor da próstata. Depois de dissecação do tumor da próstata, triturar o tecido em pedaços de 1 mm. Digerir as peças tumorais na colagenase, recolher as células, e digerir em tripsina para obter uma única suspensão celular. Após a contagem de células, ressuscitaram em volume de matriz necessária para uma concentração de células 1,0 x 106 células/ml. Cúpulas da placa no prato usando um método gota-sábio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Imagens representativas da geração de organóides do tumor da próstata do rato de um tumor contínuo da próstata. Contraste representativo da fase, tomate, e imagens fluorescentes de GFP do dia 1, dia 7, passagem 1, e passagem 2 dos organóides gerados de um tumor contínuo da próstata do rato. Barra de escala = 100 μm. as setas indicam células individuais em imagens fluorescentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Imagens representativas da geração de organóides do tumor da próstata do rato de um tumor líquido-enchido. Contraste representativo da fase, tomate, e imagens fluorescentes de GFP do dia 1, do dia 7, da passagem 1, e da passagem 2 dos organóides gerados de um tumor fluido-enchido da próstata do rato. Barra de escala = 100 μm. as setas indicam células individuais em imagens fluorescentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Etapas críticas dentro do protocolo para a dissecção do tumor da próstata e a geração organoid
A remoção do tecido da não-próstata e a dissecção fina do tumor da próstata do rato são cruciais para a geração óptima de organóides do cancro desde que as pilhas epithelial da não-próstata e as pilhas epithelial normais da próstata gerarão organóides. Para tumores de próstata sólidos especificamente, é crucial isolar áreas de tumor viável para remover a contaminação com tecido necrótico que reduziria o número de células viáveis. Durante a geração organoide, a digestão tecidual com colagenase deve ser monitorada diligentemente, pois a exposição prolongada à colagenase limitará a viabilidade celular. Com organóides derivados de câncer GEMMs, é crucial para o genótipo totalmente cada linha para garantir que todos os transgenes e alelos modificados que foram projetados no mouse estão presentes nos organóides. A repetição de genotipagem após o de prolongado é igualmente necessária para assegurar-se de que as modificações genéticas sejam mantidas.
Modificações e solução de problemas de dissecção do tumor prostático e geração organóide
Observamos variabilidade do camundongo para o camundongo nas características tumorais da próstata, mesmo entre os animais com o mesmo genótipo. Conseqüentemente, as modificações específicas ao protocolo da dissecção da próstata descritas aqui podem ser necessárias para cada rato. Além disso, a adaptabilidade é necessária na dissecação de tumores metastáticos, pois é difícil prever a gravidade dessas lesões antes de iniciar a dissecção.
Em algumas ocasiões, observamos o excesso de contaminação do nosso pellet celular com o que parece ser tecido conjuntivo, mesmo após a digestão com colagenase e tripsina. Quando isto ocorre, nós ressuscitemos a pelota em pelo menos 2 mL de AdDMEM F12 (+ + +) e usamos um filtro da pilha de 40 μm para remover o tecido conexivo. Desde que há uma variabilidade do lote-à-lote na taxa da solidificação da matriz, aumentar ou diminuir o tempo para a solidificação da abóbada pode ser necessário antes da aplicação de meios organoid.
Limitações no uso de GEMMs
Embora os GEMMs sejam o método mais rigoroso para estudos de câncer pré-clínicos, essa abordagem requer tempo, despesa e treinamento significativos. Além disso, a variabilidade do mouse para o mouse pode, como no estudo dos seres humanos, complicar a interpretação dos dados.
Limitações no uso da cultura de células 3D
Comparado à cultura de célula 2D, gerando e mantendo linhas organoid exigem o tempo e o custo aumentados. Por exemplo, nossas linhas organoid do tumor são é cada 2-3 semanas, quando as linhas de pilha podem ser é cada 2-3 dias. Esta taxa de crescimento mais lenta de organóides aumenta o tempo necessário para completar experimentos consideravelmente. Os meios de cultura organoid contêm diversos fatores e reagentes especializados do crescimento, que podem ser caros dependendo da fonte, assim gerando e manter organóides é mais caro do que linhas de pilha 2D tradicionais. Por fim, nosso laboratório e outros observaram muita diferença na matriz e outros reagentes-criando um desafio para manter a consistência no crescimento organoide para experimentos de longo prazo.
Significância na utilização da cultura de células 3D em relação aos métodos existentes/alternativos
A pesquisa de câncer pré-clínico tem sido dominada pela cultura de células 2D e modelos de xenoenxertos derivados da linhagem celular. O crescimento celular em 2D requer transformação/imortalização — assim, tanto os estudos in vitro quanto os xenoenxertos usando culturas 2D normalmente não têm linhas celulares normais inalteradas para servir como controles não-oncológicos. A última década da pesquisa na cultura organoid 3D de tecidos epithelial-derivados normais tem permitido agora para o crescimento de tecidos epithelial não-cancerosos que podem ser usados para comparar aos organóides análogos derivados do tecido do cancro. Os organóides do cancro podem igualmente ser usados para estabelecer xenoenxertos para compreender mais o desenvolvimento do tumor. Além, os organóides do não-cancro podem ser usados para gerar xenoenxertos do controle-que não era possível antes que os métodos da cultura de pilha 3D fossem desenvolvidos16.
Significância no uso da cultura de células 3D na pesquisa de câncer de próstata
Em estudos recentes, os organóides têm sido utilizados para recapitular as características do tumor prostático da GEMM. Dardenne et al. mostram que os organóides gerados usando tumores de próstata de gemms que, simultaneamente, não têm o supressor tumoral PTEN e sobre-expressão o oncogene MYCN tiveram maior potencial de crescimento do que os organóides gerados usando próstatas de controle de GEMMs. Além, arranjar em seqüência e immunohistochemistry mostraram que os organóides do tumor recapitulou os perfis da expressão de tumores da próstata que faltam PTEN e que overexpressando MYCN21. BLATTNER et al. mostram que a superexpressão simultânea da próstata de um mutante oncogênico de speckle tipo BTB/POZ protein (SPOP) e o apagamento de PTEN aumentam a taxa de tumorigênese em gemms. Quando organóides da próstata foram gerados para sobre-expressão SPOPmutante, sua proliferação foi aumentada em comparação com o controle de organóides da próstata e expressão marcador de linhagem recapitulou tumores da próstata original22. Juntos, esses estudos demonstram que os organóides são um modelo ideal para um estudo mais aprofundado das características tumorais da próstata em GEMMS.
A cultura organóide também tem sido usada como uma ferramenta para avaliar subpopulações individuais de células tumorais da próstata. Usando tumores de GEMM que faltam PTEN e supressores de tumor de PTEN e de Trp53 em pilhas epithelial da próstata, Agarwal et al. pilhas fracionada em progenitors básicos e LUMINAIS, propagaram estas subpopulações como organoids, e caracterizou mais mais seus fenótipos específicos23. Assim usando a cultura da pilha 3D, é possível caracterizar subpopulações das pilhas do tumor que podem ser limitadas na abundância dentro dos tumores da próstata elas mesmas.
Como descrito acima, as técnicas da cultura da pilha 3D permitem o crescimento de pilhas epithelial normais. Desse modo, os organóides da próstata gerados dos gemms que faltam um excitador de CRE fornecem um modelo original para a monitoração do tempo real do tumorigênese pela indução do recombinase de CRE in vitro. De fato, Dardenne et al. avaliaram como a superexpressão do Nmyc afeta o potencial de crescimento no contexto da perda de PTEN ao longo do tempo, expressando Ectopicamente ERT2-CRE e tratando com tamoxifeno21. Adicionalmente, o efeito da superexpressão de nmyc no receptor do andrógeno (ar), o alvo principal da terapia para o cancro de próstata, foi avaliado após a indução do recombinase de CRE nos organóides gerados de gemms21. O mesmo sistema induzível de CRE foi usado por Blattner e outros em organóides da próstata para medir como o superexpressão do SPOP do mutante afeta a proliferação de pilha do cancro da próstata e a expressão22do ar. Notavelmente, experimentos induzindo a expressão de CRE in vitro têm um controle não-câncer embutido com organóides tratados pelo veículo.
Limitações específicas no uso da cultura de células 3D na pesquisa de câncer de próstata
Quando o crescimento organoid de pilhas epithelial normais for uma vantagem de usar técnicas da cultura da pilha 3D, a capacidade crescer organóides normais igualmente apresentou um desafio em estudos da pesquisa do cancro da próstata. Como mostrado em nossa seção de resultados representativos, observamos o crescimento de organóides da próstata normais em linhagens geradas a partir de tumores de próstata menos agressivos (Figura 5). Uma maneira de abordar este fenômeno é gerar organóides de GEMMs expressando um transgene de repórter CRE, como MT/mg. A microscopia fluorescente pode ser usada para avaliar a relação relativa de normal aos organóides do tumor observando a expressão de tomate e de GFP. Além, a expressão de GFP pode ser usada para fluir pilhas organoid da sorte para gerar linhas organoid puras do tumor da próstata. Agarwal et al. mostram um método de triagem para separação de células epiteliais normais e células cancerosas de tumores de próstata GEMM sem um repórter CRE. Mostram que as pilhas epiteliais da adesão da pilha epithelial (EpCAM)-positivas dos tumores da próstata não se separaram em subpopulações quando classificadas usando CD24 ou os marcadores de superfície da pilha SCA-123 — assim, estes marcadores podiam ser empregados para excluir o normal pilhas epithelial da próstata dos tumores da próstata de GEMM antes da geração organoid. Nosso laboratório e outros observaram que as condições em que as células cancerosas da próstata formam organóides parecem selecionar para ou promover a linhagem específica de expressão gênica programas característicos de células epiteliais da próstata basal. Este é um desafio significativo porque os tumores da próstata em ratos e em seres humanos são primeiramente Luminal na natureza, expressando AR, CK8, e outros marcadores Luminal, e expressam raramente marcadores da linhagem básica tais como P63 ou CK5. Embora esse fenômeno ainda não tenha sido publicado em detalhes, a análise imuno-histoquímica mostra que a ar é diminuída nos organóides PTENf/+ em comparação com o PTENf/+ próstatas21. O crescimento das células epiteliais basal em organóides de câncer de próstata põe em questão se estas linhas são verdadeiramente um modelo pré-clínico exato de câncer de próstata.
Enquanto os organóides de câncer de próstata foram documentados para modelar o tumor do qual eles são derivados melhor do que a cultura 2D tradicional, há potencial para organóides para sofrer alterações genéticas na cultura, especialmente após várias passagens. Atualmente, não estamos cientes de quaisquer estudos publicados que documentaram mutações genéticas espontâneas, ganhos ou perdas genéticas, ou alterações epigenéticas que são comuns após o de prolongado de organóides do cancro da próstata. Para limitar a variabilidade como resultado de alterações genéticas ou epigenéticas que podem ocorrer devido ao passaging prolongado, os experimentos devem ser realizados em organóides precoces de passagens precoces (< 10) o mais frequentemente possível.
Aplicações futuras da cultura de células 3D
Embora seja impossível prever todas as aplicações futuras que serão desenvolvidas usando a cultura de células 3D na pesquisa de câncer, existem várias avenidas que parecem ter o maior potencial. Tal como em linhas de células 2D, a realização de modificações genéticas in vitro é relativamente simples em organóides. Modificar genes específicos em organóides normais ou de câncer abre muitas possibilidades no estudo dos mecanismos que regem a tumorigênese, a progressão do câncer e o tratamento — especialmente quando os organóides modificados geneticamente são usados para gerar organoides xenoenxertos. A modificação genética de organóides é muito vantajosa quando GEMMs não existem para um gene específico ou estabelecer uma nova GEMM está fora do escopo de um estudo específico.
A cultura organóide do câncer também tem muitas aplicações potenciais para a pesquisa clínica. Uma biblioteca de subtipos relevantes do tumor dentro de cada sistema do órgão de pacientes e de modelos animais poderia ser usada para avaliar rapidamente a eficácia de uma droga nova ou uma combinação nova de drogas existentes. Como a cultura de células 3D se torna mainstream e aumenta a eficiência, gerando organóides derivados do paciente para fins de medicina personalizada tem o potencial para ajudar a adaptar o tratamento para cada paciente oncológico, testando todas as drogas disponíveis e combinações de medicamentos que utilizam a sua linha organoide individual16.
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Disclosures
Os autores não têm relações financeiras para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao laboratório Calvin Kuo na Universidade de Stanford por fornecer HEK293 células estavelmente transfected com ou HA-mouse Noggin-FC ou HA-mouse Rspo1-FC. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Dean Tang por nos permitir acessar o microscópio de dissecção fluorescente em seu laboratório. Este trabalho foi apoiado por CA179907 a D.W.G. do Instituto Nacional do cancro. Os recursos compartilhados no centro de câncer abrangente do Roswell Park foram apoiados pelo centro de apoio ao câncer do National Institutes of Health CA016056.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
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