Summary
Vi visar en metod för nekropsy och dissektion av mus prostatacancer modeller, med fokus på prostata tumör dissektion. Ett steg-för-steg-protokoll för generering av mus prostata tumör organoider presenteras också.
Abstract
Metoder baserade på homolog rekombination för att modifiera gener har avsevärt främat biologisk forskning. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är en rigorös metod för att studera utveckling och sjukdom hos däggdjur. Vårt laboratorium har utvecklat flera GEMMs av prostatacancer (PCa) som saknar uttryck för en eller flera tumör suppressor gener med hjälp av platsspecifika CRE-loxP driver system och en prostata-specifik promotor. I denna artikel, vi beskriver vår metod för obduktion av dessa PCa gemms, främst inriktad på dissektion av mus prostatatumörer. Nya metoder som utvecklats under det senaste decenniet har underlättat kulturen i epitelial-härledda celler för att modellera organsystem in vitro i tre dimensioner. Vi detalj också en 3D-cellkultur metod för att generera tumör organoider från mus PCa GEMMs. Preklinisk cancerforskning har dominerats av 2D-cellkultur och cellinsderived eller patient-härledda xenograft-modeller. Dessa metoder saknar tumör mikromiljö, en begränsning av att använda dessa tekniker i prekliniska studier. GEMMs är mer fysiologiskt-relevant för att förstå tumorigenes och cancer progression. Tumör Organoid kultur är en in vitro-modellsystem som recapitulates tumör arkitektur och cell härstamning egenskaper. Dessutom, 3D-cellkultur metoder möjliggör tillväxt av normala celler för jämförelse med tumör cellkulturer, sällan möjligt med hjälp av 2D cellkultur tekniker. I kombination, användning av GEMMs och 3D-cellkultur i prekliniska studier har potential att förbättra vår förståelse av cancerbiologi.
Introduction
Sedan slutet av 1980-talet har förmågan att förändra gener genom homolog rekombination kraftigt Avancerat studiet av biologiska system1. Inducerbara, vävnads-eller cellspecifika promotor system och platsspecifika rekombinaser, såsom CRE-loxP, har avancerade genetiska studier genom att underlätta kontrollen över genetiska modifikationer både temporally och rumsligt2,3, 4. Kombinationen av dessa genetiska strategier har skapat ett brett spektrum av experimentella modellsystem5,6,7.
Genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är ett integrerat verktyg för att bedöma hur enskilda gener eller grupper av gener påverkar utvecklingen av däggdjur och sjukdomar. I preklinisk cancerforskning, GEMMs är den mest fysiologiskt relevanta och rigorösa metod för att studera cancerutveckling, progression, och behandling8. Vårt laboratorium är specialiserat på att generera och karakterisera cancer GEMMs.
Den mest högt diagnostiserade icke-kutana cancer bland män i USA är prostatacancer (PCa). Majoriteten av patienter med PCa har låg risk sjukdom och hög sannolikhet för överlevnad, men överlevnaden sjunker drastiskt när sjukdomen diagnostiseras i framskridet stadium eller om riktad hormonell terapi inducerar progression till aggressiva, icke-botas PCa undertyper9,10. Vårt laboratorium har utvecklat gemms som utnyttjar floxed alleler av en eller flera tumör suppressor gener. Rekombination och förlust av tumör suppressor genuttryck förekommer specifikt i prostatan eftersom vi har infört en transgenens med CRE driver nedströms av probasin promotorn aktiveras endast i prostata epitelceller11, 12. vi har också fött upp våra gemms att innehålla en CRE reporter transgenens kallas MT/mg, som inducerar tomat fluorescerande proteinuttryck i celler som saknar CRE och grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck i celler med CRE13. Medan presentationen av denna metod och våra representativa resultat visar GEMMs vi studerar i vårt laboratorium, kan detta protokoll användas för att generera prostatacancer organoider från någon musmodell. Men, som diskuteras i detalj i vår representativa resultat avsnitt, vi har observerat att vissa tumör egenskaper är optimala för prostatacancer Organoid generation.
Under det senaste decenniet, nya metoder för odling av celler från vävnader av epitelial ursprung har lett till betydande framsteg i vår förmåga att modellera organsystem in vitro-14,15. Termen "3D cellkultur" har tillskrivits de tekniker som är involverade i att etablera och underhålla organoider, som i allmänhet kan definieras som strukturer som består av celler som monterar sekundärarkitektur som drivs av organspecifika cell härstamning egenskaper16. Dessa nya metoder skiljer sig från klassisk 2D-cellkultur i att celler inte kräver omvandling eller i för långsiktig tillväxt; Sålunda, 3D-kulturer av normala celler kan jämföras med sjuka celler. Detta är särskilt värdefullt i cancerforskning där normala cell kontrollkulturer har vanligtvis inte varit tillgängliga. Dessutom bildar organoider spontant sekundära vävnads arkitekturer med lämpligt differentierade celltyper, vilket gör dem till ett bättre modellsystem för att förstå cancer in vitro än 2D-celllinjer17. Vårt laboratorium har skapat 3D Organoid linjer från tumör frågan isolerad från våra PCa GEMMs att komplettera våra in vivo data och utföra experiment som inte skulle vara möjligt i GEMMs.
I den här artikeln presenterar vi skriftliga och visuella protokoll för fullständig nekropsy av PCa GEMMs, inklusive dissektion av distinkta mus prostata lober och metastatiska lesioner. Vi beskriver och visar en steg-för-steg-metod för att generera organoider från mus prostatatumörer baserat på ett protokoll som tidigare publicerats av Drost et al. för att härleda organoider från normal mus prostata epitelial vävnad18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök som beskrivs här utfördes med godkännande av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid Institutionen för laboratoriedjur resurser, Roswell Park omfattande Cancer Center, Buffalo, New York.
Anmärkning: Manliga möss att dissekeras för att isolera rad prostata eller prostatatumörer för generering av organoider bör ha åtminstone uppnått en ålder av sexuell mognad — om 8-10 veckors ålder. Specifika åldrar av möss kan variera mellan studierna. Vissa faktorer att tänka på när du väljer ålder inkluderar ålder-beroende förändringar i prostata cellpopulationer, åldersberoende uttryck för specifika promotorn-driven CRE transgener, och graden av prostata tumör progression i en viss GEMM.
1. dissektion och avbildning av mus ProstateTumor och metastaserande tumörer
- Preparat
- Få nödvändiga sterila dissekationsverktyg. Skede dissektion område på ren steril yta med en 15 cm linjal, precisions balans, analytisk balans, spray flaska med 70% etanol, fosfinbuffrad saltlösning (PBS), och pappershanddukar.
-
Beredning av fixativ lösningar för viscerala organ och ben som inte ska användas för Organoid generation
- För visceral organ: Förbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS. För en mus, gör 20 mL 4% PFA, alikvot till 2 15 mL koniska rör och hålla i rumstemperatur tills användning.
- För långa ben: Aliquot 10 mL färdig 10% neutral buffrad formalin (NBF) i 1 15 mL koniskt rör och håll i rumstemperatur tills den används.
- Få obehandlad 10 cm rätter och fyll med icke-sterila PBS-dessa kommer att fungera som tillfälliga behållare för organ under fin dissektion med en dissektion Mikroskop.
Anmärkning: Sterila verktyg används för dissekera vävnader för att generera organoider. Icke-sterila verktyg används för den initiala snittet och dissektion av bakbenen.
- Eutanasi och initial snitt
- Euthanize musen genom CO2 kvävning med hjälp av en 2,0 L/min flödeshastighet för 5 min. ta bort musen från buren och utföra cervikal dislokation. Använd precisions balansen för att mäta musens kroppsvikt och rekord.
- Placera musen ovanpå en pappershandduk och orientera på dissektion ytan ventrala sida upp med musens huvud vänd bort från prövaren. Fästa musen till styrelsen genom att sträcka ut sina armar och ben och piercing varje framtassarna och bakbenen med en engångs nål.
- Med hjälp av en sprayflaska, släck Musens päls med 70% etanol. Använd icke-sterila dissekera sax och raka pinpett, nypa precis ovanför musens penis och göra ett litet snitt genom pälsen bara.
- Fortsätt snittet mittlinjen upp till musens hals genom pälsen bara. Gör bilaterala snitt från den punkt i det inledande snittet genom musens ventrala plan genom pälsen bara.
- Ta tag i pälsen och dra försiktigt bort den från huden på musen. PIN ner pälsen till styrelsen för att ge tillgång till både buken och brösthålan håligheter.
- Extraktion av det manliga urogenitala systemet en Bloc
- Med hjälp av steril dissekera sax och raka tång, försiktigt skära genom huden ca 0,75 cm ovanför ändtarmen. Fortsätt snittet mittlinjen upp till bröstkorgen utan att störa några organ i bukhålan. Dra försiktigt bort huden och fäst den på brädet för att exponera hela bukhålan.
Anmärkning: Låt inte dessa instrument röra utsidan av musen eller någon yta i mellanlagringsområdet, eftersom dessa vävnader kommer att användas för att generera organoider. - Dissekera urogenitala systemet och andra organ enligt diagrammet i figur 1A, med siffror som anger ordningen organen kommer att tas bort från musen.
- Hitta blåsan, sedan ta tag i fettet pad till antingen vänster eller höger och dra uppåt för att exponera testikeln. Försiktigt dissekera bort testikeln från resten av urogenitala regionen och lägga undan. Gör samma procedur på andra sidan.
Anmärkning: Uppnå optimal vävnad kvalitet och detaljerad tumör karakterisering av prostatatumörer kräver att hela urogenitala regionen tas bort från musen en Bloc19. Det rekommenderas att den urogenitala regionen avlägsnas först (figur 1a). - Ta tag i urinblåsan och dra försiktigt upp så att den urogenitala regionen lyfter tillsammans, utsätta urinröret under. Medan du håller i urinblåsan, orientera saxen så de är mot undersidan av dorsala prostata och skär urinröret. Hela urogenitala regionen kommer då att frigöra från bukhålan.
- Sätt den urogenitala regionen i en 10 cm fat fylld med PBS. Om den fortfarande fylls med urin, dränera blåsan genom att göra ett litet snitt. Med hjälp av analys balansen, väga urogenitala systemet och rekord.
- Med hjälp av steril dissekera sax och raka tång, försiktigt skära genom huden ca 0,75 cm ovanför ändtarmen. Fortsätt snittet mittlinjen upp till bröstkorgen utan att störa några organ i bukhålan. Dra försiktigt bort huden och fäst den på brädet för att exponera hela bukhålan.
- Utvinning av bäcken lymfkörtlar, mjälte, lever, njure, lunga, Tibia, och lårbenet
- Ta bort urogenitala systemet exponerar bäcken lymfkörtlar, placerad precis bakom urogenitala systemet (figur 1A) och på vardera sidan av ryggraden. Lymfkörtlarna kommer endast att synas om de innehåller metastatiska lesioner eller om det finns lokal inflammation. Orientera den raka tång under lymfkörtel och dra upp för att ta bort lymfkörtel. Gör samma procedur på andra sidan.
- Ta tag i ändtarmen med de raka tången och skär. Dra på ändtarmen för att riva upp hela tjocktarmen och tunntarmen, letar efter metastatiska lesioner i mesenteriska lymfkörtlar. När hela ileum avlägsnas, Fortsätt att dra på tolvfingertarmen att exponera magen. Skär matstrupen för att helt ta bort magen och kassera. Om några metastatiska lesioner i lymfkörtlarna observeras, noggrant dissekera bort från tarmen och förvara i en 10 cm maträtt av PBS.
- Exponera och ta bort magen kommer att dra mjälten från ryggsidan av buken (figur 1A). Ta bort mjälten och placera i 4% PFA. Mjälten fungerar som en färgning kontroll för hemotoxylin eftersom det är mycket cellulära.
Anmärkning: Visceral vävnader som inte ska användas för Organoid generation kommer att fastställas över natten i 4% PFA, tvättas med PBS, och sedan placeras i 70% etanol. - Ta bort levern i den övre delen av buken (figur 1A). Baserat på metastaserad belastning i levern, enskilda lober kan dissekeras, eller hela levern kan avlägsnas genom att försiktigt skära längs membranet. (Klipp inte genom membranet vid denna tidpunkt). Placera levern i en 10 cm maträtt av PBS.
- Ta bort levern kommer att fullt exponera njurarna på vardera sidan av ryggraden (figur 1A). Ta bort njurarna — tillsammans med njurlymf körtlarna, om noderna har metastaserande lesioner — genom att placera den raka pinkoppar under njuren och dra upp. Gör samma procedur för den andra sidan.
- För att exponera brösthålan, försiktigt skära membranet längs ribcage. Piercing membranet kommer att frigöra det negativa trycket i brösthålan och utsätta hjärta och lungor (figur 1A).
- Ta tag i bröstbenet och dra upp för att öppna brösthålan ytterligare. Observera den ventrala ansiktet av brösthålan längs bröstkorgen för metastaserande lesioner i bröstkorg lymfkörtlar och dissekera, om närvarande.
- Medan du fortfarande håller bröstbenet, skär bort den ventrala revbenen för att komma åt hjärtat och lungorna. Ta tag i hjärtat, dra upp och skär under lungorna. För att helt ta bort hjärtat och lungorna en Bloc, klippa alla främre blodkärlen och luftstrupen. Placera vävnaden i PBS och ta försiktigt bort hjärtat utan att skada lungvävnaden eller lunga metastatiska lesioner.
- Ta de icke-sterila raka pinkben och dissekera sax och skär bakbenet på huvudet av femur. Greppa försiktigt lårbenet och ta bort bakbenen från pälsen.
- Placera bakbenet på en pappershandduk och ta tag i Hind Paw. Använd en enda kant rakblad att skrota/skära bort alla muskler och bindväv från skenbenet och lårbenet. Ta bort lårbenet från skenbenet genom att skära posteriort om patella och ta bort skenbenet genom att ta bort Hind Paw. Placera Tibia och lårbenet i 10% NBF. Gör samma procedur på andra sidan.
Anmärkning: För att undersöka de långa benen av musen för metastatiska lesioner, Fibula behöver inte vara intakt. De långa benen kommer att fastställas i 10% NBF för en vecka, sedan urkalkade permanenta med neutral EDTA lösning20. Efter tre veckor kommer benen att överföras till 70% etanol. - Efter avlägsnande av bakbenen, ta ett öra eller svans skärning för framtida genotypning. Kassera musens kadaver och all vävnad som inte ska fixeras eller användas för Organoid-generering.
- Dissektion av prostata tumör
Anmärkning: Dissektion av mus prostata lober kan endast uppnås med hjälp av en dissekera Mikroskop19. Dock kan prostata tumör belastningen vara så hög att enskilda lober inte kan särskiljas, och dissektion kan utföras utan ett mikroskop. Det fullständiga protokollet för dissektion av enskilda prostatalober beskrivs dock nedan.- Placera urogenitala regionen i en 10 cm maträtt av PBS under en dissekera Mikroskop och orientera den ventrala Sidan upp med urinblåsan och sädesblåsor vänd bort från prövaren. All manipulation av urogenitala regionen bör göras med hjälp av sterila instrument.
- Bedöma den allmänna fenotyp av prostata tumör-mest troligt, antingen en vätskefylld eller solid tumör kommer att observeras i PCa GEMMs (figur 2a, B).
Anmärkning: Vätskefyllda tumörer är ofta belägna i den främre prostata regionen (figur 2A). Vätskefyllda tumörer består av främst bindväv med knappa epitelial komponenter-alltså dessa tumörer är inte optimala för Organoid generation på grund av det låga antalet tumör epitelceller, som kommer att diskuteras i representativa resultat Avsnitt. - Om vätskefyllda tumörer är närvarande, peta ett litet hål i tumören. Placera urogenitala regionen i en ny 10 cm maträtt av PBS.
- Ta ett par raka tång i den icke-dominerande handen och böjda pinps i den dominerande handen. Vänd den urogenitala regionen till dess rygg ansikte. Leta efter den proximala prostata regionen (figur 1B), som kan identifieras genom den rosa/röda färgen på urinröret. Ta tag i urinröret och håll fast så att manipulera urogenitala vävnaden med böjda pinuper.
Anmärkning: Under prostata dissektion, alltid ta del av urinblåsan läge, eftersom detta är det enklaste sättet att lokalisera de enskilda prostatakloberna (figur 1B).
- Avlägsnande av icke-prostatavävnad från urogenitala regionen
- Medan fortfarande på dorsala ansikte av urogenitala regionen, hitta basen av sädesvesikeln. Ta försiktigt bort sädesvesikeln och kassera. Utför samma procedur på motsatt sida.
Anmärkning: Undvik att punktera sädesvesikeln, eftersom det kommer att släppa klibbiga och ogenomskinlig sekretoriska vätska som stör prostata dissektion. Om sädesvesikeln punkteras, överföra den återstående urogenitala regionen till nya 10 cm skålen med färsk PBS. - Ta bort och kassera sädesledaren och så mycket fett och bindväv som möjligt med hjälp av den böjda sidan av pinkoppar.
- Medan fortfarande stadigt håller urinröret/proximala prostata regionen, använda ett par fina, spetsiga sax för att ta bort urinblåsan från urinröret.
- Medan fortfarande på dorsala ansikte av urogenitala regionen, hitta basen av sädesvesikeln. Ta försiktigt bort sädesvesikeln och kassera. Utför samma procedur på motsatt sida.
- Isolering av enskilda prostataklober
- Lokalisera den främre prostatan (figur 1B). Se till att stadigt hålla den proximala prostata regionen/urinröret med den raka tånadtång. Ta bort den främre prostata regionen genom att direkt gripa vävnaden med den böjda sidan av pinpett och stadigt dra bort den från urinblåsan och resten av prostatan. Placera vävnaden i PBS.
Anmärkning: För alla prostata regioner, dissekera sax kan krävas för att ta bort vävnaden, beroende på storleken av tumören. - Lokalisera den ventrala prostata regionen (figur 1B). Ta bort den ventrala prostata regionen på samma sätt som i steg 1.5.7.
- Vid denna punkt i dissektion, endast den laterala och dorsala prostata regioner bör vara närvarande, medan den proximala prostata regionen fortfarande är förstått av den raka pinfär. Bedöma de laterala och dorsala prostata regionerna (figur 1B). Om den laterala regionen kan särskiljas från dorsala regionen, ta bort den laterala prostata regionen som beskrivs i steg 1.5.7. Gör samma procedur på motsatt sida.
- Ta bort den dorsala prostata regionen som beskrivs i steg 1.5.7. Placera proximala prostata regionen i 4% PFA, som dess struktur inom muskelvävnad i urinröret gör det olämpligt för Organoid generation.
- Lokalisera den främre prostatan (figur 1B). Se till att stadigt hålla den proximala prostata regionen/urinröret med den raka tånadtång. Ta bort den främre prostata regionen genom att direkt gripa vävnaden med den böjda sidan av pinpett och stadigt dra bort den från urinblåsan och resten av prostatan. Placera vävnaden i PBS.
2. generering av 3D-Organoider från prostata tumör vävnad
Anmärkning: Figur 3 visar en illustrerad beskrivning av förfarandet för generering av tumör organoider.
- Förberedelse
- Förbered mus prostata Organoid media enligt Drost et al.18 med följande ändringar. Använd konditionerat medium i stället för rekombinanta proteiner för noggin och R-Spondin och Använd en slutlig koncentration av 1% (v/v), istället för 10%, för både noggin-och R-Spondin-betingat medium.
Anmärkning: HEK293 celler som stabilt transfekterade med ha-Mouse noggin-FC eller ha-Mouse Rspo1-FC används för att framställa noggin-eller R-spondin-betingat medium, respektive. Dessa cellinjer var en gåva från Calvin Kuo Laboratory vid Stanford University. - Bered digestionslösningen i ett 15 mL-rör genom att späda 20 mg/mL kollagenase II med Advanced DMEM/F12 (+ + +)-media till en slutlig koncentration på 5 mg/mL. Tillsätt Y-27632-Stenhämmare till kollagenase II-lösningen vid en slutkoncentration på 10 μM.
Anmärkning: Förhållandet mellan digestionsbuffert till vävnad är 1 mL till 50 mg, som vi använder enligt Drost et al.18.
- Förbered mus prostata Organoid media enligt Drost et al.18 med följande ändringar. Använd konditionerat medium i stället för rekombinanta proteiner för noggin och R-Spondin och Använd en slutlig koncentration av 1% (v/v), istället för 10%, för både noggin-och R-Spondin-betingat medium.
- Mincing och nedbrytning av tumör vävnad
- I cell Culture Hood, placera prostata tumör vävnad i en steril 10 cm kultur skålen, dissekera och kassera nekrotisk vävnad.
- Finhacka den återstående prostata tumör vävnad i 1 mm3 kuber genom att hålla vävnaden bitar med steril böjda tång och skärning med dissektion sax.
- Placera de malda tumör bitarna i 15 mL-röret med digestionsbufferten genom att ösa upp dem med den böjda sidan av tång. Smälta tumörvävnad vid 37 ° c med skakning för 1,5 till 2 h. Kontrollera digestionsförloppet var 20 min.
Anmärkning: Vid denna tid, ta ut minst 2 mL matris från-20 ° c lagring och Tina på is. 1 mL-aliquoter av Matrix tar cirka 3 h till Tina. - Efter vävnadsnedbrytning, Centrifugera röret vid 175 x g i 5 min vid 4 ° c för att bilda en cellpellet.
- Ta bort supernatanten, svep röret för att lossa cellpelleten och Omsuspendera cellpelleten i 1 mL förvärmd trypsin kompletterad med 10 μM Y-27632-Stenhämmare. Sätt röret i en 37 ° c vattenbad i 5 min.
- Efter inkubering, Pipettera upp och ner 5 gånger med en standard P1000 spets. Returnera röret till 37 ° c vattenbad för ytterligare 5 min och upprepa steg 2.2.6.
Anmärkning: Vid denna tid i förfarandet, värma en steril 6-och cellkultur skålen genom att sätta den i en 55 ° c inkubator.
- Räkna celler och resuspension i matrisen
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 9 mL kall AdDMEM/F12 (+ + +) och centrifugera röret vid 175 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Efter centrifugering, avlägsna supernatanten, snärta röret för att lossa pelleten och tvätta cellerna igen genom att tillsätta 10 mL kall AdDMEM/F12 (+ + +). Centrifugera röret vid 175 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Efter centrifugering, avlägsna supernatanten, snärta röret för att lossa pelleten, Omsuspendera cellerna i 1 mL AdDMEM/F12 (+ + +), och räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometern enligt standardförfarande.
- Sju till åtta kupoler passar i en brunn av en 6 väl skålen när organoider är klädd i matris via en drop-Wise sätt. Cirka 200 μL matris kommer att producera 7-8 kupoler. Bestäm hur många brunnar av organoider som behövs för framtida experimentella ändamål och beräkna mängden matris som krävs. Beräkna sedan volymen av cell-innehållande lösning som behövs för att ha en slutlig koncentration av 1,0 x 106 celler/ml matris.
- Efter att ha räknat celler, Centrifugera vid 175 x g i 5 min vid 4 ° c. Ta bort supernatanten, svep röret för att lossa pelleten och Omsuspendera cellerna i matrisens volym beräknat i steg 2.3.4.
Anmärkning: Matrix förblir i flytande form endast vid 4 ° c; Håll matrisstock rör och Matrix-cell lösningar på is hela tiden.
- Bordläggningen matris kupoler och tillämpning av media
- Blanda Matrix-cell lösning med en P200 Pipettera att jämnt fördela cellerna utan att införa bubblor. Ta bort 6-well kultur skålen från 55 ° c inkubator.
- Pipettera försiktigt 200 μL Matrix-cell lösning och släpp snabbt lösningen i en brunn för att skapa kupoler.
- Upprepa steg 2.4.2. tills volym av Matrix-cell-lösning spenderas. Låt kupoler stelna vid rumstemperatur i 2 min.
- Vänd 6-brunnen skålen upp och ner och sätta skålen i en 37 ° c inkubator att fortsätta stelning för 20 min.
- Efter inkubering, tillsätt 2 mL mus prostata Organoid media till varje brunn. Tillsätt syntetisk androgen R1881 till varje brunn för en slutlig koncentration av 1 nM och Y-27632 rock inhibitor till en slutlig koncentration av 10 μM. Blanda försiktigt och placera plattan i en inkubator på 37 ° c för odling.
Anmärkning: Organoid kultur Media behöver kompletteras med 10 μM Y-27632 rock inhibitor för endast 1 vecka efter Organoid generation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa nekropsy bilder av en mus med en stor vätskefylld primär prostata tumör i den främre prostata regionen visas i figur 2a. I kontrast, bild 2B, visar representativa obduktion bilder av en mus med en stor solid primär prostata tumör för vilken enskilda prostata regioner är omöjlig att skilja. Fluorescerande dissektion bilder visar samma solida prostata tumör från figur 2B uttrycker GFP, vilket indikerar att tumörer cellerna uttrycker CRE (figur 2C). Vävnad som inte uttrycker probasin, såsom urinblåsan, Express tomat och därmed inte uttrycker CRE (figur 2C). Levern och lungorna från musen från figur 2B har METASTASERANDE tumörer uttrycker GFP, visar att de härstammar från den primära prostata tumör, och är omgivna av normal vävnad som uttrycker tomat (figur 2C ). Slutligen, den bäcken lymfkörtel från denna mus uttrycker GFP och inte tomat, vilket indikerar att denna metastaserande tumör har tagit över detta organ och ingen normal vävnad kvar (figur 2C).
Vi visar bilder i figur 4 av organoider vi har genererat från en solid prostata tumör. Vid dag 1 bildas små organoider, vilket ses i de representativa faskontrast bilderna. Fluorescerande bilder på dag 1 visar att både tomat och GFP uttrycker celler är närvarande i tumören Organoid kultur (pilar). Men vid dag 7 när prostata tumör organoider har fullt bildas, dessa organoider uttrycker GFP och inte tomat. Dessa data tyder på att dessa organoider har sitt ursprung från tumörceller som uttrycker CRE och inte från normala epitelceller. Dessa tumör organoider fortsätter att vara bara GFP-positiva som vi utvidga vår kultur till passage 1 och 2.
I figur 5, vi visar bilder av organoider vi har genererat från en vätskefylld prostata tumör. På dag 1, små organoider bildas, och fluorescerande bilder visar att både tomat-och GFP-uttryckande celler finns i Organoid kulturen-liknande vår observation på dag 1 för organoider som genereras från en solid prostata tumör (figur 4). Emellertid, organoider från en vätskefylld prostata tumör uttrycka antingen GFP eller tomat på dag 7-vilket indikerar att organoider har bildats från celler som inte uttrycker CRE. Detta mönster fortsätter vid passage 1 och passage 2, där kulturen har både tomat-och GFP-uttrycker organoider. Ytterligare analys av dessa organoider är starkt begränsad eftersom linjen är en blandning av normala epiteliala organoider och tumör organoider. Vi tror att vätskefyllda prostatatumörer är suboptimala att generera tumör organoider helt enkelt eftersom det finns en större andel av normala prostata epitelceller. Eftersom både normal prostata epitelceller och prostatacancerceller bildar organoider, de linjer som genereras från vätskefyllda prostatatumörer är en blandning av normala och cancer organoider. Vi erhåller ren tumör Organoid linjer från vätskefyllda prostatatumörer genom flödes sortering för GFP-positiva celler och generera organoider från den populationen av celler. Solid prostatatumörer består främst av tumörceller, därför organoider som genereras från dessa tumörer är en mer ren population av cancer organoider utan föregående sortering för GFP.
Figur 1 : Vår rekommenderade dissekera för prostatacancer (PCa) genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) och anatomi mus prostata. (A) den ordning vi rekommenderar i vårt protokoll för dissekera de viktigaste organen från ett PCA GEMM. 1. urogenitala regionen. 2. bäcken lymfkörtlar. 3. mjälte. 4. lever. 5. njurar. 6. lungor. 7. Tibia och lårbenet. (B) karta över mus urogenitala regionen och prostata anatomi. Fluorescerande dissektion bilder av en 12 veckors gammal mus uttrycker probasin-CRE och MT/mg CRE reporter Transgene. Urinblåsa (BL), sädesblåsor (SV), främre prostata (AP), ventrala prostata (VP), lateral prostata (LP), dorsala prostata (DP), och proximala prostata (PP). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa dissektion bilder av prostatacancer (PCa) genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs). (A) bukhålan före avlägsnande av urogenitala regionen och urogenitala regionen med en vätskefylld prostata tumör. (B) bukhålan före avlägsnande av urogenitala regionen och urogenitala regionen med en solid prostata tumör. (C) representativa tomat och GFP fluorescerande bilder av en solid prostata tumör, lever, lungor, och bäcken lymfkörtel från ett PCA GEMM som utvecklar metastatiska lesioner. Skalbar = 5 mm. urinblåsa (BL), främre prostata (AP), och dorsala prostata (DP). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Flödesschema av protokollet för att generera prostata tumör organoider. Efter dissekera prostata tumören, finhacka vävnaden i 1 mm bitar. Smälta tumör bitarna i kollagenase, samla in cellerna, och smälta i trypsin att få en enda cellsuspension. Efter att ha räknat celler, Omsuspendera i mängden matris som krävs för en 1,0 x 106 cell/ml cell koncentration. Plattkupoler i skålen med en drop-Wise metod. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa bilder från generering av mus prostata tumör organoider från en solid prostata tumör. Representativ faskontrast, tomat och GFP fluorescerande bilder från dag 1, dag 7, passage 1, och passage 2 av organoider som genereras från en solid mus prostata tumör. Scale bar = 100 μm. pilar indikerar enskilda celler i fluorescerande bilder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa bilder från generering av mus prostata tumör organoider från en vätskefylld tumör. Representativ faskontrast, tomat, och GFP fluorescerande bilder från dag 1, dag 7, passage 1, och passage 2 av organoider som genereras från en vätskefylld mus prostata tumör. Scale bar = 100 μm. pilar indikerar enskilda celler i fluorescerande bilder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg inom protokollet för prostata tumör dissektion och Organoid generation
Avlägsnande av icke-prostatavävnad och fin dissektion av musen prostata tumör är avgörande för den optimala generationen av cancer organoider eftersom både icke-prostata epitelceller och normal prostata epitelceller kommer att generera organoider. För solida prostatatumörer specifikt, det är viktigt att isolera områden av livskraftiga tumör för att avlägsna kontaminering med nekrotisk vävnad som skulle minska antalet livskraftiga celler. Under Organoid generation, vävnadsnedbrytning med kollagenase bör noggrant övervakas, eftersom långvarig exponering för kollagenase kommer att begränsa cellernas lönsamhet. Med organoider som härrör från cancer GEMMs, är det viktigt att helt genotyp varje rad för att säkerställa att alla transgener och modifierade alleler som var konstruerade i musen finns i organoider. Upprepning av genotypning efter långvarig passage är också nödvändigt för att säkerställa att genetiska modifieringar bibehålls.
Modifieringar och felsökning av prostata tumör dissektion och Organoid generation
Vi har observerat mus till mus variation i prostata tumör egenskaper, även bland djur med samma genotyp. Därför kan specifika modifieringar av prostatadissekeringsprotokollet som beskrivs här vara nödvändiga för varje mus. Dessutom, anpassningsförmåga är nödvändig när dissekera metastaserande tumörer eftersom det är svårt att förutsäga svårighetsgraden av dessa lesioner innan du påbörjar dissektion.
Vid ett fåtal tillfällen har vi observerat överflödig kontaminering av vår cellpellet med vad som verkar vara bindväv, även efter matsmältningen med både kollagenas och trypsin. När detta inträffar, vi Omsuspendera pelleten i minst 2 mL AdDMEM F12 (+ + +) och använda en 40 μm cell sil för att ta bort bindväv. Eftersom det finns mycket-till-Lot variation i solidifiering hastigheten av matrisen, öka eller minska tiden för kupol stelning kan vara nödvändigt innan applicering av Organoid media.
Begränsningar vid användning av GEMMs
Medan GEMMs är den mest rigorösa metoden för prekliniska cancer studier, detta tillvägagångssätt kräver betydande tid, kostnader, och utbildning. Dessutom, mus till mus variabilitet kan, som i studien av människor, försvåra tolkningen av data.
Begränsningar i att använda 3D cellkultur
Jämfört med 2D cellkultur, generera och underhålla Organoid linjer kräver ökad tid och kostnad. Till exempel, våra tumör Organoid linjer är blint varje 2-3 veckor, medan cellinjer kan blint varje 2-3 dagar. Denna långsammare tillväxttakt av organoider ökar den tid som krävs för att slutföra experiment avsevärt. Organoid kultur media innehåller flera specialiserade tillväxtfaktorer och reagenser, som kan vara kostsamma beroende på källa, vilket genererar och underhålla organoider är dyrare än traditionella 2D cellinjer. Slutligen, vårt laboratorium och andra har observerat mycket att många skillnader i matris och andra reagenser-att skapa en utmaning för att bibehålla konsekvensen i Organoid tillväxt för långsiktiga experiment.
Betydelse vid användning av 3D-cellkultur med avseende på befintliga/alternativa metoder
Preklinisk cancerforskning har dominerats av 2D-cellskultur och xenograft-modeller med cellinjer. Cell tillväxt i 2D kräver omvandling/immortalization-alltså både in vitro-och xenograft studier med 2D-kulturer vanligtvis inte har oförändrade normala cellinjer att fungera som icke-cancerkontroller. Det senaste decenniet av forskning i 3D Organoid kultur av normala epitelial-härledda vävnader har nu tillåtit för tillväxt av icke-cancerogena epitelial vävnader som kan användas för att jämföra med analoga organoider som härrör från cancervävnad. Cancer organoider kan också användas för att etablera xenograft att ytterligare förstå tumörutveckling. Dessutom kan icke-cancerorganoider användas för att generera kontroll xenograft-vilket inte var möjligt innan 3D-cellkultur metoder utvecklades16.
Betydelse i att använda 3D cellkultur i prostatacancer forskning
I nyare studier, organoider har använts för att recapitulate GEMM prostata tumör egenskaper. Dardenne et al. Visa att organoider som genereras med prostatatumörer från gemms som samtidigt saknar tumören suppressor PTEN och överuttrycker den MYCN onkogen hade större tillväxtpotential än organoider som genereras med hjälp av rad prostata från Kontrollera GEMMs. Dessutom, både sekvensering och immunohistokemi visade att tumör organoider återfått uttrycket profiler av prostatatumörer båda saknar PTEN och överuttrycker MYCN21. Blattner et al. visar att samtidig prostata överuttryck av en onkogen Mutant av speckle typ BTB/POZ protein (SPOP) och radering av PTEN ökar hastigheten på tumorigenes i gemms. När prostata organoider genererades för att överuttrycka muterade SPOP, deras spridning ökades jämfört med kontroll av prostata organoider och härstamning markör uttryck återfått ursprungliga prostatatumörer22. Tillsammans, dessa studier visar att organoider är en optimal modell för vidare studier av prostata tumör egenskaper i GEMMS.
Organoid kultur har också använts som ett verktyg för att bedöma enskilda subpopulationer av prostata tumörceller. Använda GEMM tumörer som saknar PTEN och både PTEN och Trp53 tumör suppressorer i prostata epitelceller, Agarwal et al. fraktionerade celler i basal och luminala stamceller, föröka dessa subpopulationer som organoider, och ytterligare kännetecknas deras specifika fenotyper23. Därmed använder 3D cellkultur, är det möjligt att karakterisera subpopulationer av tumörceller som kan vara begränsad i överflöd inom prostatatumörer själva.
Som beskrivits ovan, 3D cellkultur tekniker tillåter tillväxten av normala epitelceller. Därmed, prostata organoider genereras från GEMMs saknar en CRE föraren ger en unik modell för realtid övervakning av tumorigenes genom induktion av CRE driver in vitro-. I själva verket, Dardenne et al. bedömde hur Nmyc överuttryck påverkar tillväxtpotentialen i samband med PTEN förlust över tiden genom ECTOPICALLY uttrycker ERT2-CRE och behandla med tamoxifen21. Dessutom, effekten av Nmyc överuttryck på androgenreceptorn (ar), det viktigaste målet för behandling för prostatacancer, bedömdes efter induktion av CRE driver i organoider som genereras från gemms21. Samma inducerbara CRE-system användes av Blattner et al. i prostata organoider för att mäta hur överuttryck av muterade SPOP påverkar prostatacancer cellproliferation och ar Expression22. Särskilt, experiment som inducerar CRE-uttryck in vitro har en inbyggd icke-cancerkontroll med vehikel-behandlade organoider.
Specifika begränsningar i att använda 3D cellkultur i prostatacancer forskning
Även Organoid tillväxt av normala epitelceller är en fördel med att använda 3D cellkultur tekniker, kapacitet att odla normala organoider har också presenterat en utmaning i prostatacancer forskningsstudier. Som framgår av vår representativa resultat avsnitt, vi har observerat utväxt av normala prostata organoider i linjer som genereras från prostatatumörer som är mindre aggressiva (figur 5). Ett sätt att ta itu med detta fenomen är att generera organoider från GEMMs uttrycker en CRE reporter Transgene, såsom MT/mg. Fluorescerande mikroskopi kan användas för att bedöma den relativa förhållandet mellan normal till tumör organoider genom att observera uttrycket av tomat och GFP. Dessutom, GFP uttryck kan användas för att flöda sortera Organoid celler för att generera ren prostata tumör Organoid linjer. Agarwal et al. Visa en sorteringsmetod för separation av normala epitelceller och cancerceller från GEMM prostatatumörer utan en CRE reporter. De visar att epitelial cell adhesion molekylära (EpCAM)-positiva celler från prostatatumörer inte separerar i subpopulationer när sorteras med antingen CD24 eller SCA-1 cell ytan markörer23 — dessa markörer skulle således kunna användas för att utesluta normal prostata epitelceller från GEMM prostatatumörer före Organoid generation. Vårt laboratorium och andra har konstaterat att de förhållanden under vilka prostatacancerceller bildar organoider verkar antingen välja för eller främja härstamning specifika genuttryck program karakteristiska för prostata basala epitelceller. Detta är en betydande utmaning eftersom prostatatumörer i både möss och människor är främst luminala i naturen, uttrycker AR, CK8, och andra luminala markörer, och sällan uttrycka basal härstamning markörer som p63 eller CK5. Även om detta fenomen har ännu inte offentliggjorts i detalj, immunohistokemi analys visar att ar minskar i PTENf/+ organoider jämfört med PTENf/+ rad prostata21. Den utväxt av basala epitelceller i prostatacancer organoider ifrågasätter om dessa linjer är verkligen en exakt preklinisk modell av prostatacancer.
Medan prostatacancer organoider har dokumenterats för att modellera tumören som de härrör bättre än traditionell 2D-kultur, det finns potential för organoider att genomgå genetiska förändringar i kulturen, särskilt efter flera passager. För närvarande är vi inte medvetna om några publicerade studier som har dokumenterat spontana genetiska mutationer, genetiska vinster eller förluster, eller epigenetiska förändringar som är vanliga efter långvarig passaging av prostatacancer organoider. För att begränsa variationen som ett resultat av genetiska eller epigenetiska förändringar som kan inträffa på grund av långvarig passaging, bör experiment utföras i tidiga organoider från tidiga passager (< 10) så ofta som möjligt.
Framtida tillämpningar av 3D cellkultur
Även om det är omöjligt att förutsäga alla framtida tillämpningar som kommer att utvecklas med hjälp av 3D-cellkultur i cancerforskning, det finns flera vägar som verkar ha störst potential. Som med 2D cellinjer, utföra in vitro genetisk modifiering är relativt enkelt i organoider. Modifiera specifika gener i antingen normala eller cancer organoider öppnar många möjligheter i studiet av mekanismerna för tumorigenes, cancer progression, och behandling-särskilt när genetiskt modifierade organoider används för att generera Organoid xenograft. Genetisk modifiering av organoider är mycket fördelaktigt när GEMMs inte existerar för en specifik gen eller etablera en ny GEMM är utanför ramen för en viss studie.
Cancer Organoid kultur har också många potentiella tillämpningar för klinisk forskning. Ett bibliotek av relevanta tumör subtyper inom varje organsystem från både patienter och djurmodeller kan användas för att snabbt bedöma effekten av ett nytt läkemedel eller ny kombination av befintliga läkemedel. Som 3D cellkultur blir mainstream och ökar i effektivitet, generera patient-härledda organoider för personlig medicin har potential att hjälpa skräddarsy behandling för varje cancerpatient genom att testa alla tillgängliga läkemedel och kombinationer av läkemedel med hjälp av sin individuella Organoid linje16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte ekonomiska förhållanden att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Calvin Kuo Laboratory vid Stanford University för att ge HEK293 celler stabilt transfekterade med antingen ha-Mouse noggin-FC eller ha-Mouse Rspo1-FC. Vi skulle också vilja tacka Dr Dean Tang för att ge oss tillgång till fluorescerande dissektion Mikroskop i hans laboratorium. Detta arbete stöddes av CA179907 till D.W.G. från National Cancer Institute. Delade resurser på Roswell Park omfattande Cancer Center stöddes av National Institutes of Health Cancer Center support Grant CA016056.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
