Summary
우리는 전립선 종양 해부에 초점을 맞춘 마우스 전립선 암 모델의 부검 및 해부를위한 방법을 보여줍니다. 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성을 위한 단계별 프로토콜도 제시된다.
Abstract
유전자를 수정하기 위해 상동 재조합에 기초한 방법은 생물학적 연구를 상당히 발전시켰습니다. 유전자 조작 마우스 모델 (GEMM)은 포유류 발달과 질병을 연구하기위한 엄격한 방법입니다. 우리의 실험실은 사이트 특이적인 Cre-loxP 재조합 시스템 및 전립선 특이적 프로모터를 사용하여 하나 또는 다중 종양 억제유전자의 발현이 결여된 전립선암(PCa)의 여러 GEMM을 개발하였다. 이 문서에서는, 우리는 주로 마우스 전립선 종양의 해부에 초점을 맞추고, 이러한 PCa GEMMs의 부검을위한 우리의 방법을 설명합니다. 지난 10년 동안 개발된 새로운 방법은 생체외에서 기관 시스템을 3차원으로 모델링하기 위해 상피 유래 세포의 배양을 촉진하였다. 우리는 또한 마우스 PCa GEMMs에서 종양 오르가노이드를 생성하는 3D 세포 배양 방법을 자세히 설명합니다. 전임상 암 연구는 2D 세포 배양 및 세포주 유래 또는 환자 유래 이종이식 모델에 의해 지배되고 있다. 이러한 방법은 종양 미세 환경이 부족하며, 전임상 연구에서 이러한 기술을 사용하는 데 제한이 있다. GEMM은 종양 발생 및 암 진행을 이해하는 데 더 생리학적으로 관련이 있습니다. 종양 오르가노이드 배양은 종양 건축 및 세포 계통 특성을 재량화하는 체외 모델 시스템입니다. 또한, 3D 세포 배양 방법은 종양 세포 배양에 비해 정상 세포의 성장을 허용하며, 2D 세포 배양 기술을 사용하는 경우는 거의 불가능합니다. 결합에서, 전 임상 연구에서 GEMM 및 3D 세포 배양을 사용하는 것은 암 생물학의 우리의 이해를 향상시킬 가능성이 있습니다.
Introduction
1980 년대 후반 이후, 상동 재조합에 의해 유전자를 변경하는 능력은크게 생물학적 시스템의 연구를 진행했다 1. 유도성, 조직 또는 세포 특이적 운동 시스템 및 Cre-loxP와 같은 부위 별 재조합제는 현적으로 및 공간적으로모두유전 적 변형에 대한 제어를 용이하게하여 유전자 연구를 진행했다 2, 3 ,3, 4. 이러한 유전 전략의 조합은 실험 모델 시스템 5,6,7의 다양한 배열을 만들었습니다.
유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)는 개별 유전자 또는 유전자 그룹이 포유류 발달과 질병에 미치는 영향을 평가하는 필수적인 도구입니다. 전 임상 암 연구에서 GEMM은 암 발병, 진행 및 치료를 연구하는 가장 생리학적으로 관련성이 있고 엄격한 방법입니다8. 우리의 실험실은 암 GEM을 생성하고 특성화하는 것을 전문으로합니다.
미국에 있는 남자 중 가장 높게 진단된 비 절단암은 전립선암입니다 (PCa). PCa를 가진 환자의 대다수는 저위험 질병 및 생존의 높은 가능성을 가지고 있습니다, 그러나 질병이 향상된 단계에서 진단될 때 또는 표적으로 한 호르몬 치료가 공격적인, 비 치료가능한 PCa에 진행을 유도하는 경우에 생존율은 급격히 감소합니다 하위 유형9,10. 우리의 실험실은 하나 이상의 종양 억제 유전자의 floxed 대틀을 이용하는 GEMM를 개발했습니다. 종양 억제 유전자 발현의 재조합 및 손실은 전립선 상피 세포에서만 활성화된 프로바신 프로모터의 Cre 재조합 하류를 가진 이식유전자를 도입했기 때문에 전립선에서 구체적으로 발생한다(11). 12. 우리는 또한 Cre 13을 가진 세포에서 Cre 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현이 결여된 세포에서 토마토 형광 단백질발현을 유도하는 mT/mG라는 Cre 리포터 이식유전자를 함유하기 위해 우리의 GEMM을 사육하였다. 이 방법의 프리젠 테이션과 우리의 대표적인 결과는 우리가 우리의 실험실에서 공부하는 GEMM을 보여주지만, 이 프로토콜은 어떤 마우스 모형든지에서 전립선암 오르가노이드를 생성하는 것을 이용될 수 있습니다. 그러나, 우리의 대표적인 결과 섹션에서 상세히 논의된 바와 같이, 우리는 특정 종양 특성이 전립선암 오르가노이드 생성에 최적이라는 것을 관찰하였다.
지난 10 년 동안, 상피 기원의 조직에서 세포를 배양하는 새로운 방법은 시험관 내 기관 시스템을 모델링하는 능력의 상당한 발전을 주도했다14,15. 용어 "3D 세포 배양"은 일반적으로 장기 특이적 세포 계보에 의해 구동 되는 이차 아키텍처를 조립 하는 세포로 구성 된 구조로 정의될 수 있는 오르가노이드를 확립 하고 유지에 관련 된 기술에 기인 했다 특성16. 이러한 새로운 방법은 세포가 장기 성장을 위해 변형 또는 불멸화를 필요로 하지 않는다는 점에서 고전적인 2D 세포 배양과 구별된다; 따라서, 정상 세포의 3D 배양은 병에 걸린 세포와 비교될 수 있다. 이것은 일반적인 세포 통제 문화가 전형적으로 유효하지 않은 암 연구에서 특히 귀중합니다. 또한, 오르가노이드는 적절하게 분화된 세포 유형을 가진 이차 조직 구조를 자발적으로 형성하여 2D 세포주(17)보다 시험관내 암을 이해하는 더 나은 모델 시스템이 다. 우리의 실험실은 우리의 생체 내 데이터를 보완하고 GEMM에서 실현 가능하지 않을 실험을 수행하기 위해 우리의 PCa GEMM에서 분리 된 종양 문제에서 3D organoid 라인을 만들었습니다.
이 문서에서는, 우리는 PCa GEMMs의 완전한 necropsy를 위한 서면및 시각적 프로토콜을 제시합니다, 명백한 마우스 전립선 엽 및 전이성 병변의 해부를 포함하여. 우리는 정상 마우스 전립선 상피 조직(18)으로부터 오르가노이드를 유도하기 위해 Drost et al.에 의해 이전에 발표된 프로토콜에 기초하여 마우스전립선 종양으로부터 오르가노이드를 생성하는 단계별 방법을 설명하고 보여준다.
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Protocol
여기에 설명된 동물 절차는 실험실 동물 자원부, 로스웰 파크 종합 암 센터, 버팔로, 뉴욕에 있는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인으로 수행되었습니다.
참고: 오르가노이드의 생성을 위해 전립선 또는 전립선 종양을 분리하기 위해 해부되는 수컷 마우스는 적어도 성숙의 나이에 도달해야 한다 - 나이의 약 8-10 주. 마우스의 특정 나이 연구 사이 다를 수 있습니다. 나이를 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 요인은 전립선 세포 집단의 연령 의존적 변화, 특정 프로모터 구동 Cre 트랜스유전자의 연령 의존적 발현, 특정 GEMM에서의 전립선 종양 진행률 을 포함한다.
1. 마우스 전립선 종양 및 전이성 종양의 해부 및 화상 진찰
- 준비
- 필요한 멸균 해부 도구를 구하십시오. 15cm 눈금자, 정밀 균형, 분석 균형, 70 % 에탄올 스프레이 병, 인광 완충 식염수 (PBS) 및 종이 타월로 깨끗한 멸균 표면에 무대 해부 영역.
-
오르가노이드 생성에 사용되지 않는 내장 장기 및 뼈를 위한 고정 용액의 준비
- 내장 기관의 경우: PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다. 한 마우스의 경우, 20 mL의 4% PFA를 만들고, 2개의 15mL 원뿔형 튜브에 aliquot를 넣고 사용할 때까지 실온에서 유지합니다.
- 긴 뼈의 경우: 15 mL 원추형 튜브에 미리 만들어진 10% 중성 완충 포르말린(NBF)의 Aliquot 10 mL을 사용 후 실온에서 보관하십시오.
- 처리되지 않은 10cm 접시를 얻고 비 멸균 PBS로 채우기 - 이들은 해부 현미경을 사용하여 미세 해부 동안 장기에 대한 임시 용기 역할을합니다.
참고: 멸균 도구는 오르가노이드 생성을 위한 조직 해부용으로 사용됩니다. 비 멸균 도구는 뒷다리의 초기 절개 및 해부에 사용됩니다.
- 안락사 및 초기 절개
- 5분 동안 2.0 L/min 유량을 사용하여CO2 질식에 의해 마우스를 안락사시키고, 케이지에서 마우스를 제거하고 자궁 경부 탈구를 수행한다. 정밀 저울을 사용하여 마우스의 체중과 기록을 측정합니다.
- 종이 타월 위에 마우스를 놓고 해부 표면 복부 쪽에 마우스의 머리를 조사관으로부터 멀리 향하게 합니다. 마우스를 팔다리를 펴고 일회용 바늘 하나로 앞발과 뒷발을 관통하여 보드에 부착합니다.
- 스프레이 병을 사용하여 마우스의 털을 70% 에탄올로 사용하십시오. 비 멸균 해부 가위와 직선 집게를 사용하여 마우스의 음경 바로 위를 꼬집고 모피를 통해서만 작은 절개를합니다.
- 절개 미드라인을 모피를 통해서만 마우스 목까지 계속합니다. 모피를 통해 마우스의 복부 평면을 통해 초기 절개 지점에서 양측 절개를합니다.
- 모피를 잡고 조심스럽게 마우스의 피부에서 멀리 당깁니다. 모피를 보드에 고정하여 복부 및 흉강 구멍에 모두 접근할 수 있도록 합니다.
- 남성 비뇨 생식기 시스템 en bloc의 추출
- 멸균 해부 가위와 직선 집게를 사용하여 직장 위 약 0.75cm의 피부를 조심스럽게 잘라냅니다. 복강 내 장기를 방해하지 않고 흉곽까지 절개 중간선을 계속하십시오. 조심스럽게 피부를 멀리 당기고 보드전체에 핀을 고정하여 복강 전체를 노출시하십시오.
참고: 이러한 조직이 오르가노이드를 생성하는 데 사용되기 때문에 이러한 기구가 마우스의 외부 또는 스테이징 영역의 표면을 만지지 않도록하십시오. - 그림 1A의다이어그램에 따라 비뇨 생식기 시스템 및 기타 장기를 해부하고 기관이 마우스에서 제거 될 순서를 나타내는 숫자로 합니다.
- 방광을 찾아서, 그 때 왼쪽 또는 오른쪽으로 지방 패드를 잡고 고환을 드러내기 위하여 위로 당깁니다. 조심스럽게 비뇨 생식기 지역의 나머지 부분에서 고환을 해부하고 옆으로 두십시오. 다른 쪽에서도 동일한 절차를 수행하십시오.
참고: 전립선 종양의 최적 조직 품질 및 상세한 종양 특성화를 달성하려면 마우스 엔블록(19)으로부터 전체 비뇨생식기 부위를 제거해야 한다. 비뇨 생식기 부위를 먼저 제거하는 것이 좋습니다 (그림1A). - 방광을 잡고 조심스럽게 위로 당겨 비뇨 생식기 부위가 함께 들어 올려 아래 요도를 노출시다. 방광을 들고 있는 동안, 가위를 동양에 두어 등쪽 전립선의 밑면에 대고 요도를 잘라냅니다. 전체 비뇨 생식기 지역은 그 때 복강에서 풀어 놓일 것입니다.
- 비뇨 생식기 부위를 PBS로 채워진 10cm 접시에 넣습니다. 여전히 소변으로 가득 차있으면 작은 절개를하여 방광을 배출하십시오. 분석 저울을 사용하여 비뇨 생식기 시스템 및 기록을 계량합니다.
- 멸균 해부 가위와 직선 집게를 사용하여 직장 위 약 0.75cm의 피부를 조심스럽게 잘라냅니다. 복강 내 장기를 방해하지 않고 흉곽까지 절개 중간선을 계속하십시오. 조심스럽게 피부를 멀리 당기고 보드전체에 핀을 고정하여 복강 전체를 노출시하십시오.
- 골반 림프절, 비장, 간, 신장, 폐, 경골 및 대퇴골 추출
- 비뇨 생식기 시스템을 제거하면 비뇨 생식기 시스템 바로 뒤에 위치한 골반 림프절이 노출됩니다 (그림1A)및 척추 양쪽에 위치합니다. 림프절은 전이성 병변을 포함하거나 국소 염증이있는 경우에만 볼 수 있습니다. 림프절 아래 직선 집게의 방향을 잡아 당기고 림프절을 제거하기 위해 위로 당깁니다. 다른 쪽에서도 동일한 절차를 수행하십시오.
- 직선 집게로 직장을 잡고 잘라냅니다. 장부 림프절의 전이성 병변을 찾고, 전체 결장과 소장을 해명하기 위해 직장에 당겨. 장막 전체가 제거되면 십이지장에서 계속 당겨 위를 노출시십시오. 식도를 잘라 위장을 완전히 제거하고 폐기하십시오. 림프절의 전이성 병변이 관찰되면 조심스럽게 장에서 해부하고 PBS의 10cm 접시에 보관하십시오.
- 위를 노출하고 제거하면 복부의 등쪽에서 비장을 당깁니다 (그림1A). 비장을 제거하고 4 % PFA에 배치합니다. 비장 은 세포가 높기 때문에 헤모톡실린에 대한 염색 제어 역할을합니다.
참고: 오르가노이드 생성에 사용되지 않는 내장 조직은 4% PFA에서 하룻밤 동안 고정되고, PBS로 세척한 다음, 70% 에탄올에 놓일 것이다. - 복부의 상부에서 간을 제거하십시오 (그림1A). 간에서 전이성 부하에 따라 개별 엽을 해부 할 수 있습니다, 또는 전체 간은 신중하게 횡격막을 따라 절단하여 제거 할 수 있습니다. (지금은 다이어프램을 잘라내지 마십시오). 간을 PBS 의 10cm 접시에 놓습니다.
- 간을 제거하면 척추 양쪽의 신장이 완전히 노출됩니다 (그림1A). 신장 림프절과 함께, 노드가 전이성 병변이있는 경우 - 신장 아래에 직선 집게를 배치하고 위로 당겨서 신장을 제거하십시오. 다른 쪽에 대해동일한 절차를 수행합니다.
- 흉강을 노출하려면 흉곽을 따라 격막을 조심스럽게 잘라냅니다. 횡격막을 관통하면 흉강에서 음압이 방출되고 심장과 폐가 노출됩니다 (그림1A).
- 흉골을 잡고 위로 당겨 흉강을 더 엽니다. 흉부 림프절의 전이성 병변에 대한 흉곽을 따라 흉강의 복부 면을 관찰하고 존재하는 경우 해부하십시오.
- 흉골을 들고 있는 동안 복부 흉곽을 잘라 심장과 폐에 접근하십시오. 심장을 잡고, 당겨 서 폐 아래 잘라. 심장과 폐를 완전히 제거하려면 모든 전방 혈관과 기관을 잘라냅니다. PBS에 조직을 놓고 조심스럽게 폐 조직이나 폐 전이성 병변을 손상시키지 않고 심장을 제거합니다.
- 비 멸균 직선 집게와 해부 가위를 가지고 대퇴골의 머리에 뒷다리를 잘라. 조심스럽게 대퇴골을 잡고 털에서 뒷다리를 제거하십시오.
- 뒷다리를 종이 타월에 놓고 뒷발을 잡습니다. 단일 가장자리 면도날을 사용하여 경골과 대퇴골에서 모든 근육과 결합 조직을 폐기 / 잘라냅니다. 슬개골에 후방을 절단하여 경골에서 대퇴골을 제거하고 뒷발을 제거하여 경골을 제거합니다. 경골과 대퇴골을 10 % NBF에 놓습니다. 다른 쪽에서도 동일한 절차를 수행하십시오.
참고: 전이성 병변에 대한 마우스의 긴 뼈를 검사하기 위해 비골은 손상되지 않아도됩니다. 긴 뼈는 1주일 동안 10% NBF로 고정된 다음 중성 EDTA 용액20을사용하여 decalcified화됩니다. 3 주 후, 뼈는 70 % 에탄올로 옮겨질 것입니다. - 뒷다리를 제거 한 후, 미래의 지질 형질 이음제에 대한 귀 또는 꼬리 절단을. 마우스 시체와 모든 조직을 폐기하여 고정하거나 오르가노이드 생성에 사용하지 않도록 한다.
- 전립선 종양의 해부
참고: 마우스 전립선 엽의 해부는 해부현미경(19)을사용하여서만 달성될 수 있다. 그러나, 전립선 종양 부하는 개별적인 로브가 구별될 수 없을 정도로 높을 수 있고, 해부는 현미경 없이 수행될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 개별 전립선 엽의 해부를 위한 전체 프로토콜은 아래에 기재되어 있다.- 비뇨 생식기 영역을 해부 현미경 아래에 PBS의 10cm 접시에 놓고 조사자로부터 멀리 향하는 방광 및 정액 소포로 복부 쪽을 향하게합니다. 비뇨 생식기 부위의 모든 조작은 멸균 기구를 사용하여 수행해야합니다.
- 전립선 종양의 일반적인 표현형을 평가- 가장 가능성이 높으며, 유체 충진 또는 고형 종양은 PCa GEMMs에서 관찰될 것이다(도2A, B).
참고: 유체 충전 종양은 종종 전방 전립선 부위에 위치한다 (그림2A). 유체 채워진 종양은 주로 부족한 상피 성분을 가진 결합 조직으로 위로 위로 위로 만듭니다 - 따라서 이 종양은 대표적인 결과에서 토론될 것과 같이 종양 상피 세포의 낮은 수 때문에 유기체 생성을 위해 최적이지 않습니다 섹션. - 액체 채워진 종양이 존재하는 경우에, 종양에 있는 작은 구멍을 찌르. 비뇨 생식기 부위를 PBS의 새로운 10cm 접시에 놓습니다.
- 지배적인 손에 직선 집게 한 쌍을 가지고 지배적 인 손에 곡선 집게. 비뇨 생식기 부위를 등지 얼굴로 뒤집습니다. 요도의 분홍색/붉은 색으로 식별 할 수있는 근위 전립선 영역 (그림1B)을 찾습니다. 요도를 잡고 곡면 집게로 비뇨 생식기 조직을 조작할 수 있도록 단단히 잡으하십시오.
참고: 전립선 해부 하는 동안, 항상 방광의 위치를 주의, 이것은 개별 전립선 엽을 찾을 수 있는 가장 간단한 방법으로 (그림1B).
- 비뇨 생식기 지역에서 비 전립선 조직의 제거
- 비뇨 생식기 지역의 등가 얼굴에 여전히있는 동안 정액 소포의 기초를 찾으십시오. 조심스럽게 정액 소포를 제거하고 폐기하십시오. 반대쪽에서도 동일한 절차를 수행합니다.
참고: 정액 소포를 뚫지 마십시오, 그 전립선 해부를 방해 끈적하고 불투명 분비 유체를 해제로. 정액 소포가 뚫린 경우, 신선한 PBS와 새로운 10cm 접시에 남아있는 비뇨 생식기 영역을 전송합니다. - 집게의 구부러진 면을 사용하여 가능한 한 많은 지방 및 결합 조직을 제거하고 폐기하십시오.
- 요도/근위 전립선 부위를 여전히 단단히 잡고 있는 동안, 요도에서 방광을 제거하기 위하여 미세한 뾰족한 가위를 한 쌍을 이용하십시오.
- 비뇨 생식기 지역의 등가 얼굴에 여전히있는 동안 정액 소포의 기초를 찾으십시오. 조심스럽게 정액 소포를 제거하고 폐기하십시오. 반대쪽에서도 동일한 절차를 수행합니다.
- 개별 전립선 엽의 격리
- 전방 전립선을 찾습니다(그림1B). 직선 집게로 근위 전립선 영역 / 요도를 단단히 유지하십시오. 집게의 구부러진 쪽으로 조직을 직접 잡고 방광과 전립선의 나머지 부분에서 단단히 당겨서 전방 전립선 부위를 제거하십시오. 조직을 PBS에 놓습니다.
참고: 모든 전립선 부위의 경우 종양의 크기에 따라 조직을 제거하기 위해 해부가 필요할 수 있습니다. - 복부 전립선 영역을 찾습니다(그림1B). 1.5.7단계에서와 동일한 방식으로 복부 전립선 영역을 제거한다.
- 해부에서이 시점에서, 근위 전립선 영역은 여전히 직선 집게에 의해 파악되는 동안, 측면 및 등쪽 전립선 영역만 존재해야한다. 측면 및 등측 전립선 영역을 평가한다(그림1B). 횡선 영역이 등쪽 영역과 구별될 수 있는 경우, 단계 1.5.7에 기재된 바와 같이 측면 전립선 영역을 제거한다. 반대쪽에서도 동일한 절차를 수행합니다.
- 1.5.7단계에서 기재된 대로 등쪽 전립선 영역을 제거한다. 요도의 근육 조직 내의 구조가 오르가노이드 생성에 적합하지 않기 때문에 근위 전립선 부위를 4 % PFA에 배치하십시오.
- 전방 전립선을 찾습니다(그림1B). 직선 집게로 근위 전립선 영역 / 요도를 단단히 유지하십시오. 집게의 구부러진 쪽으로 조직을 직접 잡고 방광과 전립선의 나머지 부분에서 단단히 당겨서 전방 전립선 부위를 제거하십시오. 조직을 PBS에 놓습니다.
2. 전립선 종양 조직에서 3D 오르노이드 생성
참고: 도 3은 종양 오르가노이드의 생성을 위한 절차에 대한 그림 적 설명을 나타낸다.
- 준비
- Drost et al.18에 따라 마우스 전립선 오르가노이드 매체를 준비하십시오. 노긴과 R-스폰딘에 재조합 단백질 대신 컨디셔닝된 배지를 사용하고 노긴 과 R-스폰딘 컨디셔닝 배지에 10% 대신 최종 농도를 1% (v/v)로 사용하십시오.
참고: HEK293 세포는 HA-마우스 노긴-Fc 또는 HA-마우스 Rspo1-Fc로 안정적으로 형질감염되어 각각 노긴-또는 R-스폰딘-컨디셔닝 배지를 생성하는데 사용된다. 이 세포주 스탠포드 대학에 있는 Calvin Kuo 실험실에서 선물이었습니다. - 고급 DMEM/F12(++++) 매체로 20 mg/mL 콜라게나아제 II를 5 mg/mL의 최종 농도로 희석하여 15 mL 튜브에 소화 용액을 준비합니다. 콜라게나제 II 용액에 Y-27632 암석 억제제10 μM의 최종 농도를 첨가하십시오.
참고: 조직에 소화 버퍼의 비율은 1 mL 에 50 mg, 우리는 Drost 외에 따라 사용.18.
- Drost et al.18에 따라 마우스 전립선 오르가노이드 매체를 준비하십시오. 노긴과 R-스폰딘에 재조합 단백질 대신 컨디셔닝된 배지를 사용하고 노긴 과 R-스폰딘 컨디셔닝 배지에 10% 대신 최종 농도를 1% (v/v)로 사용하십시오.
- 종양 조직의 다진 및 소화
- 세포 배양 후드에서, 전립선 종양 조직을 멸균 된 10cm 배양 접시에 놓고, 해부하고 괴사 조직을 버린다.
- 나머지 전립선 종양 조직을 멸균 된 곡면 집게로 조직 조각을 잡고 해부 가위로 절단하여 1mm3 큐브로 다진다.
- 다진 종양 조각을 15 mL 튜브에 소화 완충제에 놓고 집게의 구부러진 면으로 스푸핑합니다. 37°C에서 종양 조직을 1.5 내지 2시간 동안 흔들어 소화합니다. 20분마다 소화진행을 확인합니다.
참고: 이때, -20°C 저장에서 적어도 2 mL의 매트릭스를 꺼내 얼음 위에 해동한다. 매트릭스의 1 mL aliquots해동하는 데 약 3시간이 소요됩니다. - 조직 소화 후, 원심분리튜브를 175 x g에서 5분 동안 4°C에서 세포 펠릿을 형성한다.
- 상류를 제거하고 튜브를 쓸어 내고 세포 펠릿을 풀고 10 μM Y-27632 암석 억제제로 보충된 미리 데운 트립신 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 튜브를 37°C 수조에 넣고 5분 동안 넣습니다.
- 배양 후, 표준 P1000 팁으로 5회 위아래로 파이펫을 제작하십시오. 튜브를 37°C 수조로 다시 5분 간 되돌리고 2.2.6단계를 반복합니다.
참고: 이때, 55°C 인큐베이터에 넣어 멸균6웰 세포 배양접시를 따뜻하게 한다.
- 매트릭스에서 셀 및 재서스펜션 계수
- 차가운 AdDMEM/F12(+++)의 9mL를 추가하여 세포를 세척하고 튜브를 4°C에서 5분 동안 175 x g으로 원심분리합니다.
- 원심 분리 후, 상층부를 제거하고 튜브를 쓸어 내고 펠릿을 풀고 차가운 AdDMEM /F12 (+++)의 10 mL를 추가하여 세포를 다시 씻으십시오. 4 °C에서 5 분 동안 175 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
- 원심 분리 후, 상층부를 제거하고, 튜브를 쓸어 내고, 펠릿을 풀고, AdDMEM/F12 (++++)의 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단하고, 표준 절차에 따라 혈독계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
- 오가노이드가 드롭 와이즈 방식으로 매트릭스로 도금될 때 7-8개의 돔은 6개의 우물 요리 중 하나에 들어맞습니다. 매트릭스의 약 200 μL은 7-8 돔을 생성합니다. 향후 실험 목적으로 필요한 오르가노이드의 수의 우물을 결정하고 필요한 매트릭스의 부피를 계산합니다. 그런 다음, 매트릭스의 최종 농도가 1.0 x 106 세포/mL인 데 필요한 세포 함유 용액의 부피를 계산한다.
- 세포를 계수한 후, 175 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를. 상급체를 제거하고 튜브를 쓸어 넘기면 펠릿을 풀고 2.3.4 단계에서 계산된 매트릭스 볼륨으로 셀을 다시 일시 중단합니다.
참고: 매트릭스는 4 °C에서만 액체 형태로 남아; 항상 얼음에 매트릭스 스톡 튜브와 매트릭스 셀 솔루션을 유지합니다.
- 도금 매트릭스 돔 및 용지 의 응용 프로그램
- 매트릭스 셀 솔루션을 P200 파이펫과 혼합하여 기포를 도입하지 않고 셀을 고르게 분배합니다. 55°C 인큐베이터에서 6웰 배양 접시를 제거한다.
- 매트릭스 셀 용액의 200 μL을 조심스럽게 파이펫하고 신속하게 돔을 만들기 위해 우물에 솔루션을 떨어 뜨립니다.
- 2.4.2단계를 반복합니다. 매트릭스 셀 용액의 양이 소비 될 때까지. 돔이 실온에서 2분 동안 굳어지도록 합니다.
- 6웰 접시를 거꾸로 뒤집어 37°C 인큐베이터에 넣고 20분 동안 응고를 계속합니다.
- 배양 후, 각 우물에 마우스 전립선 오르가노이드 제중 2 mL를 첨가합니다. 합성 안드로겐 R1881을 각 우물에 추가하여 1 nM 및 Y-27632 암석 억제제의 최종 농도를 10 μM의 최종 농도로 측정합니다. 조심스럽게 혼합하고 배양을 위해 37 °C 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
참고: 오르가노이드 배양 배지는 오르가노이드 생성 후 1주일 동안 10 μM Y-27632 암석 억제제로 보충되어야 합니다.
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Representative Results
전방 전립선 영역에서 큰 유체 충전 원발성 전립선 종양을 가진 마우스의 대표적인 부검 이미지는 도 2A에나타내고 있다. 대조적으로, 도 2B는, 개별 전립선 영역이 구별할 수 없는 큰 고체 원발성 전립선 종양을 가진 마우스의 대표적인 부검 이미지를 나타낸다. 형광 해부 이미지는 GFP를 발현하는 도 2B로부터 동일한 고형 전립선 종양을 나타내며, 종양 세포가 Cre를 발현한다는 것을 나타낸다(도2C). 방광과 같은 프로바신을 발현하지 않는 조직은 토마토를 발현하고 따라서 Cre를 발현하지 않는다(도2C). 그림 2 B에서 마우스에서 간 및 폐는 GFP를 발현하는 전이성 종양을 가지고, 그들은 원발성 전립선 종양에서 유래것을 보여주는, 토마토를 표현하는 정상 조직에 의해 포위된다 (그림2C ). 마지막으로,이 마우스에서 골반 림프절은 GFP가 아닌 토마토를 표현, 이 전이성 종양이 장기를 추월하고 정상 조직이 남아 있지 있음을 나타내는 (그림2C).
우리는 우리가 고형 전립선 종양에서 생성 한 오르가노이드의 그림 4에서 이미지를 보여줍니다. 1일째에는 대표적인 위상 대비 이미지에서 볼 수 있듯이 작은 오르가노이드가 형성되고 있습니다. 1일째에 형광 이미지는 토마토 와 GFP 발현 세포가 종양 오르가노이드 배양(화살표)에 존재한다는 것을 보여준다. 그러나, 7일째까지 전립선 종양 오르가노이드가 완전히 형성되었을 때, 이 오르가노이드는 토마토가 아닌 GFP를 발현하고 있다. 이 데이터는 이 오르가노이드가 일반적인 상피 세포에서 그리고 Cre를 표현하고 있던 종양 세포에서 유래했다는 것을 건의합니다. 이 종양 오르가노이드는 우리가 통로 1과 2에 우리의 문화를 확장하는 때 단지 GFP 양성일 것을 계속합니다.
그림5에서, 우리는 우리가 유체 채워진 전립선 종양에서 생성 한 오르가노이드의 이미지를 보여줍니다. 1일째에, 작은 오르가노이드가 형성되고, 형광 이미지는 토마토-및 GFP 발현 세포가 모두 오르가노이드 배양에 존재한다는 것을 보여준다 - 고형전립선 종양에서 생성된 오르가노이드에 대한 1일째관찰과 유사). 그러나, 유체 채워진 전립선 종양에서 organoids 는 7 일째에 GFP 또는 토마토를 표현합니다 - 오르가노이드가 Cre를 표현하지 않는 세포에서 형성되었음을 나타냅니다. 이 패턴은 1절과 2절에서 계속되며, 여기서 문화는 토마토- 및 GFP 표현 오르가노이드를 모두 가지고 있다. 이러한 오르가노이드의 추가 분석은 라인이 정상 상피 오르가노이드와 종양 오르가노이드의 혼합물이기 때문에 심각하게 제한된다. 우리는 유동성 채워진 전립선 종양이 일반적인 전립선 상피 세포의 더 중대한 비율이 있기 때문에 단순히 종양 오르가노이드를 생성에 최적이 없다고 믿습니다. 정상 전립선 상피 세포와 전립선 암 세포가 오르가노이드를 형성하기 때문에 유체가 채워진 전립선 종양에서 생성 된 선은 정상 및 암 오르가노이드의 혼합물입니다. 우리는 GFP 양성 세포를 위한 유동 선별 및 세포의 그 인구에서 organoids를 생성해서 유동성 채워진 전립선 종양에서 순수한 종양 organoid 선을 얻습니다. 고형 전립선 종양은 주로 종양 세포로 구성되므로 이러한 종양에서 생성된 오르가노이드는 GFP에 대한 사전 분류 없이 암 오르가노이드의 보다 순수한 집단이다.
그림 1 : 전립선암(PCa) 유전자 조작 마우스 모델(GEMM) 및 마우스 전립선 해부학에 대한 권장 해부 주문. (A) PCa GEMM에서 주요 장기를 해부하기 위해 프로토콜에서 권장하는 순서입니다. 1. 비뇨 생식기 지역. 2. 골반 림프절. 3. 비장. 4. 간. 5. 신장. 6. 폐. 7. 티비아와 대퇴골. (B) 마우스 비뇨생식기 부위 및 전립선 해부학의 지도. 12주 령 마우스의 형광해부 영상과 mT/mG 크레 리포터 이식유전자를 발현하였다. 방광 (BL), 정액 소포 (SV), 전방 전립선 (AP), 복부 전립선 (VP), 측면 전립선 (LP), 등대 전립선 (DP), 및 근위 전립선 (PP). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 전립선암(PCa)의 대표적인 해부 이미지(GEMM). (a) 유체가 채워진 전립선 종양을 가진 비뇨 생식기 지역 및 비뇨 생식기 영역을 제거하기 전에 복강. (B) 고형 전립선 종양을 가진 비뇨생식기 영역 및 비뇨생식기 부위를 제거하기 전에 복강. (C) 전이성 병변을 개발하는 PCa GEMM으로부터 고형 전립선 종양, 간, 폐 및 골반 림프절의 대표적인 토마토 및 GFP 형광 이미지. 스케일 바 = 5 mm. 방광 (BL), 전방 전립선 (AP), 등대 전립선 (DP). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 전립선 종양 오르가노이드 생성을 위한 프로토콜의 플로우 차트. 전립선 종양을 해부 한 후 조직을 1mm 조각으로 잘라냅니다. 콜라게나아제에서 종양 조각을 소화하고, 세포를 수집하고, 트립신에서 소화하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 셀을 계수한 후, 1.0 x 106 세포/mL 세포 농도에 필요한 매트릭스 의 부피를 다시 중단하십시오. 드롭 와이즈 방법을 사용하여 접시 돔. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 고형 전립선 종양에서 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성에서 대표적인 이미지. 대표적인 상 대조, 토마토, 및 GFP 형광 영상은 고형 마우스 전립선 종양으로부터 생성된 1일째, 7일째, 통로 1 및 통로 2로부터의 형광증이다. 배율 막대 = 100 μm. 화살표는 형광 이미지의 개별 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 유체가 채워진 종양에서 마우스 전립선 종양 오르가노이드의 생성에서 대표적인 이미지. 대표적인 상 대조, 토마토, 및 GFP 형광 영상은 유체 충전 마우스 전립선 종양으로부터 생성된 1일째, 7일째, 통로 1 및 통로 2에서 생성된 오르가노이드이다. 배율 막대 = 100 μm. 화살표는 형광 이미지의 개별 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전립선 종양 해부 및 오르가노이드 생성을 위한 프로토콜 내의 중요한 단계
비 전립선 조직의 제거 및 마우스 전립선 종양의 미세 해부는 비 전립선 상피 세포와 정상 전립선 상피 세포 모두 오르가노이드를 생성하기 때문에 암 오르가노이드의 최적 생성에 매우 중요합니다. 특히 고형 전립선 종양의 경우, 생존 가능한 세포의 수를 줄일 괴사 조직오염을 제거하기 위해 실행 가능한 종양의 영역을 분리하는 것이 중요합니다. 오르가노이드 생성 도중, 콜라게나아제에 장기간 노출되면 세포 생존을 제한하기 때문에 콜라게나아제로 조직 소화를 부지런히 모니터링해야 합니다. 암 GEMM에서 파생된 오르가노이드의 경우, 마우스에서 설계된 모든 전형 및 변형된 대중 유전자가 오르가노이드에 존재하도록 각 라인을 완전히 유전자형화하는 것이 중요합니다. 유전 형질 변형이 유지되도록 하기 위해 장기간 통과 한 후 유전 형질 티핑을 반복하는 것도 필요합니다.
전립선 종양 해부 및 오르가노이드 생성의 수정 및 문제 해결
우리는 전립선 종양 특성에 있는 마우스 가변성을, 동일 유전자형을 가진 동물 사이에서조차 관찰했습니다. 따라서, 여기에 기술된 전립선 해부 프로토콜에 대한 구체적인 변형은 각 마우스에 필요할 수 있다. 또한, 전이성 종양을 해부할 때 적응성이 필요하며, 이는 해부를 시작하기 전에 이들 병변의 중증도를 예측하기 어렵기 때문에 필요하다.
몇 가지 경우에, 우리는 결합 조직 으로 보이는 것과 우리의 세포 펠 릿의 과잉 오염을 관찰 했습니다., 콜라게 나아제와 트립신 모두 소화 후. 이 경우, 우리는 AdDMEM F12 (++++)의 적어도 2 mL에 펠릿을 다시 중단하고 결합 조직을 제거하기 위해 40 μm 세포 스트레이너를 사용합니다. 매트릭스의 응고 속도에 로트 간 가변성이 있기 때문에, 오르가노이드 매체를 적용하기 전에 돔 응고시간을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
GEMM 사용의 제한 사항
GEMM은 전임상 암 연구를 위한 가장 엄격한 방법이지만, 이 접근법은 상당한 시간, 비용 및 훈련이 필요합니다. 또한 마우스 대 마우스 의 가변성은 인간 연구에서와 같이 데이터의 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다.
3D 세포 배양 사용의 제한 사항
2D 세포 배양에 비해, 유기체 라인을 생성하고 유지하는 것은 증가된 시간과 비용을 요구합니다. 예를 들면, 우리의 종양 오르가노이드 선은 매 2-3 주마다 통과되고, 세포주는 매 2-3 일마다 통과될 수 있는 동안. 오르가노이드의 이 느린 성장 속도는 실험을 완료하는 데 필요한 시간을 상당히 증가시킵니다. 오가노이드 배양 배지는 소스에 따라 비용이 많이 들 수 있는 여러 가지 특수 성장 인자 및 시약을 함유하고 있으며, 따라서 기존의 2D 세포주보다 유기노이드를 생성하고 유지하는 것이 더 비쌉니다. 마지막으로, 우리의 실험실 및 그 외는 매트릭스와 그밖 시약에 있는 많은 다름을 관찰했습니다 - 장기 적인 실험을 위한 organoid 성장에 있는 일관성을 유지하기위한 도전을 만들기.
기존/대체 방법에 대한 3D 세포 배양 사용의 중요성
전임상 암 연구는 2D 세포 배양 및 세포주 유래 이종이식 모델에 의해 지배되고 있다. 2D에 있는 세포 성장은 변환/불멸을 요구합니다 - 그러므로 2D 문화를 이용한 시험관내 및 이종이식 연구 결과는 일반적으로 비암 통제로 봉사하기 위하여 변경되지 않은 정상 세포주를 갖지 않습니다. 정상 상피 유래 조직의 3D 오르가노이드 문화에 있는 연구의 마지막 십년간은 지금 암 조직에서 파생된 유사한 organoids와 비교하기 위하여 이용될 수 있는 비암상피 조직의 성장을 허용했습니다. 암 오르가노이드는 또한 종양 발달을 더 이해하기 위하여 이종이식을 설치하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한, 비암 오르가노이드는 대조군 이종이식을 생성하는데 사용될 수 있다-이는 3D 세포 배양 방법이 개발되기 전에는 불가능했다16.
전립선암 연구에서 3D 세포 배양 사용에 의의
최근 연구에서, 오르가노이드는 GEMM 전립선 종양 특성을 재량화하는 데 사용되어 왔다. Dardenne 등은 동시에 종양 억제Pten부족과 MYCN 종양 유전자를 과발현하는 GEMM에서 전립선 종양을 사용하여 생성된 오르가노이드가 전립선을 사용하여 생성된 오르가노이드보다 더 큰 성장 잠재력을 가졌다는 것을 보여줍니다. GemMs를 제어할 수 있습니다. 또한, 시퀀싱 및 면역 조직화학 모두 종양 오르가노이드가 Pten이 결여된 전립선 종양의 발현 프로파일을 재량화하고 MYCN21을과발현하는 것으로 나타났다. Blattner 등은 반점 형 BTB/POZ 단백질(SPOP)의 종양 발생 돌연변이체의동시 전립선 과발현이 유전자에서 종양 발생의 속도를 증가시킨다는 것을 보여준다. 전립선 오르가노이드가 과발현 돌연변이 SPOP로생성되었을 때, 이들의 증식은 대조군 전립선 오르가노이드 및 계보 마커 발현재발된 본래 전립선종양(22)에비해 증가하였다. 함께, 이러한 연구는 오르가노이드가 GEMMS에 있는 전립선 종양 특성의 추가 연구를 위한 최적 모델이다는 것을 보여줍니다.
오르가노이드 배양은 또한 전립선 종양 세포의 개별 적인 소집단을 평가하는 공구로 이용되었습니다. 전립선 상피 세포에서 Pten 및 Pten 및 Trp53 종양 억제제가 결여된 GEMM 종양을 사용하여, Agarwal 등. 분별된 세포를 기저 및 발조 전구로 분획하여, 이러한 하위 집단을 오르가노이드로 전파하고, 또한 그들의 특정 표현형23을특징으로한다. 이를 통해 3D 세포 배양, 전립선 종양 자체 내에서 풍부하게 제한될 수 있는 종양 세포의 하위 집단을 특성화할 수 있다.
전술한 바와 같이, 3D 세포 배양 기술은 정상 상피 세포의 성장을 허용한다. 이에 따라, Cre 드라이버가 결여된 GEMM으로부터 생성된 전립선 오르가노이드는 시험관내 크레재콤비나제의 유도에 의한 종양발생의 실시간 모니터링을 위한 독특한 모델을 제공한다. 실제로, Dardenne 외. NMYC 과발현이 ECTOPICALLY ERT2-Cre를 표현하고 타목시펜(21)으로 취급함으로써시간이 지남에 따라 Pten 손실의 맥락에서 성장 잠재력에 미치는 영향을 평가했다. 추가적으로, 전립선암 치료의 주요 표적인 안드로겐 수용체(AR)에 대한 NMYC 과발현의 효과는 GEMMs21에서생성된 오르가노이드에서 크레재콤나제의 유도 후 평가되었다. 동일한 유도성 Cre 시스템은 Blattner et al.에 의해 전립선 오르가노이드에 의해 사용되었으며, 돌연변이 SPOP의 과발현이 전립선암 세포 증식 및 AR 발현에 미치는 영향을 측정하기 위해22. 특히, 시험관 내에서 Cre 발현을 유도하는 실험은 비히클 처리 된 오르가노이드와 함께 비 암 조절제를 내장합니다.
전립선암 연구에서 3D 세포 배양 사용에 대한 구체적인 제한 사항
정상 상피 세포의 오르가노이드 성장은 3D 세포 배양 기술을 사용하는 장점이 있지만, 정상 오르가노이드를 성장시키는 능력은 또한 전립선암 연구 연구에서 도전을 제시했다. 우리의 대표적인 결과 섹션에 도시된 바와 같이, 우리는 덜 공격적인 전립선 종양에서 생성된 선에서 정상 전립선 오르가노이드의 성장을 관찰하였다(그림5). 이 현상을 해결하는 한 가지 방법은 mT/mG와같은 Cre 리포터 이식유전자를 표현하는 GEMM에서 오르가노이드를 생성하는 것입니다. 형광 현미경 검사법은 토마토와 GFP의 발현을 관찰하여 종양 오르가노이드에 정상의 상대적 비율을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, GFP 발현은 순수한 전립선 종양 오르가노이드 라인을 생성하기 위해 소노노이드 세포를 정렬하는데 사용될 수 있다. Agarwal 외. Cre 리포터 없이 GEMM 전립선 종양으로부터 정상 상피 세포 및 암세포를 분리하는 선별 방법을 보여준다. 그(것)들은 전립선 종양에서 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 양성 세포가 CD24 또는 Sca-1 세포 표면 마커23를 사용하여 분류될 때 하위 집단으로 분리되지 않았다는 것을 보여줍니다 - 따라서, 이 마커는 정상을 제외하기 위하여 이용될 수 있었습니다 GEMM 전립선 종양에서 전립선 상피 세포 는 유기 체 생성 하기 전에. 우리의 실험실 및 그 외는 전립선 암 세포가 오르가노이드를 형성하는 조건이 전립선 기저 상피 세포의 특징적인 계보 특정 유전자 발현 프로그램을 선택하거나 승진시키는 것처럼 보인다는 것을 관찰했습니다. 이것은 마우스와 인간 둘 다에 있는 전립선 종양이 AR, CK8 및 그밖 발광 마커를 표현하고, p63 또는 CK5와 같은 기저 계보 마커를 거의 표현하지 않는 자연에서 1 차적으로 발광이기 때문에 중요한 도전입니다. 이 현상은 아직 상세히 간행되지 않았지만, 면역 조직 화학 분석은 AR이 Ptenf /+ 전립선21에비해 Ptenf / + 오르가노이드에서 감소한다는 것을 보여줍니다. 전립선암 오르가노이드에 있는 기저 상피 세포의 파생은 이 선이 전립선암의 참으로 정확한 전임상 모형인지 의문을 불러오릅니다.
전립선암 오르가노이드는 전통적인 2D 문화보다는 파생되는 종양을 모델링하기 위하여 문서화되었지만, 오르가노이드가 문화에 있는 유전 변경을 겪기 위하여, 특히 몇몇 통로 후에. 현재, 우리는 자발적인 유전 돌연변이, 유전 이득 또는 손실, 또는 전립선암 오르가노이드의 머리말을 붙인 후에 일반적인 후생유전학 변경을 문서화한 어떤 간행된 연구 결과든지 인식하지 않습니다. 장기간 의한 통과로 인해 발생할 수있는 결과 유전 적 또는 후생 유전학적 변화로 변동성을 제한하기 위해, 실험은 가능한 한 자주 초기 통로 (&10)에서 초기 오르가노이드에서 수행되어야한다.
3D 세포 배양의 미래 응용
암 연구에서 3D 세포 배양을 사용하여 개발 될 모든 미래의 응용 프로그램을 예측하는 것은 불가능하지만, 가장 잠재력을 가진 것으로 보이는 몇 가지 방법이 있습니다. 2D 세포주와 마찬가지로, 시험관 내 유전자 변형을 수행하는 것은 오르가노이드에서 비교적 간단합니다. 정상 또는 암 오르가노이드에서 특정 유전자를 수정하면 종양 발생, 암 진행 및 치료를 지배하는 메커니즘의 연구에서 많은 가능성을 열어줍니다 - 특히 유전자 변형 오르가노이드가 오르가노이드를 생성하는 데 사용될 때 이종이식. 유기노이드의 유전자 변형은 GEMM이 특정 유전자에 대해 존재하지 않거나 새로운 GEMM을 확립하는 것이 특정 연구의 범위를 벗어날 때 매우 유리하다.
암 오르가노이드 문화는 또한 임상 연구를 위한 많은 잠재적인 응용이 있습니다. 환자와 동물 모델 모두에서 각 장기 시스템 내의 관련 종양 특수형의 라이브러리는 새로운 약물 또는 기존 약물의 새로운 조합의 효능을 신속하게 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 3D 세포 배양이 주류화되고 효율성이 증가함에 따라, 맞춤 의학을 목적으로 환자 유래 오르가노이드를 생성하는 것은 사용 가능한 모든 약물과 조합을 테스트하여 각 암 환자에 대한 맞춤형 치료를 도울 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 자신의 개별 오르가노이드 라인을 사용하여 약물16.
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Disclosures
저자는 공개 할 재정적 인 관계가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 HEK293 세포가 HA 마우스 Noggin-Fc 또는 HA 마우스 Rspo1-Fc로 안정적으로 형질감염된 것을 제공한 스탠포드 대학의 캘빈 쿠오 연구소에 감사드립니다. 우리는 또한 우리가 그의 실험실에 있는 형광 해부 현미경에 접근할 수 있게 해 준 딘 탕 박사에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 국립 암 연구소에서 D.W.G.에 CA179907에 의해 지원되었다. 로스웰 파크 종합 암 센터의 공유 자원은 국립 보건원 암 센터 지원 보조금 CA016056에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
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