Summary
前立腺腫瘍解剖に焦点を当て、マウス前立腺癌モデルの壊死および解剖の方法を示す。マウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成のためのステップバイステッププロトコルも提示される。
Abstract
遺伝子を改変するための相同組換えに基づく方法は、生物学的研究を著しく進めている。遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、哺乳類の発達と疾患を研究するための厳格な方法です。当研究室では、部位特異的Cre-loxP組換後システムと前立腺特異的プロモーターを用いて、1つまたは複数の腫瘍抑制遺伝子の発現を欠く前立腺癌(PCa)のいくつかのGEMMを開発しました。本稿では、マウス前立腺腫瘍の解剖に焦点を当てて、これらのPCa GEMMの壊死に対する我々の方法について説明する。過去10年間に開発された新しい方法は、三次元でインビトロで臓器系をモデル化する上皮由来細胞の培養を促進した。また、マウスPCa GEMMsから腫瘍オルガノイドを生成する3D細胞培養法についても詳しく述べる。前臨床癌研究は、2D細胞培養および細胞株由来または患者由来異種移植片モデルによって支配されてきた。これらの方法は腫瘍微小環境を欠き、前臨床試験でこれらの技術を使用する限界である。GEMMは、腫瘍形成と癌の進行を理解するために、より生理学的に関連しています。腫瘍オルガノイド培養は、腫瘍のアーキテクチャおよび細胞系統特性を要約するインビトロモデルシステムである。さらに、3D細胞培養法は、腫瘍細胞培養と比較して正常細胞の増殖を可能にし、2D細胞培養技術を用いてはほとんど不可能である。組み合わせて、前臨床試験におけるGEMMと3D細胞培養の使用は、がん生物学に対する理解を深める可能性を秘めています。
Introduction
1980年代後半以降、相同組換えによって遺伝子を改変する能力は、生物学的システム1の研究を大きく進めてきた。Cre-loxPのような誘導性、組織、または細胞特異的な組換えシステムおよび部位特異的組換え物は、時間的および空間的に2、3の両方の遺伝子改変に対する制御を容易にすることによって、高度な遺伝子研究を行っている。 4.これらの遺伝的戦略の組み合わせは、実験モデルシステム5、6、7の広い配列を作成しました。
遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、個々の遺伝子または遺伝子群が哺乳類の発達や疾患に与える影響を評価するための不可欠なツールです。前臨床癌研究において、GEMMは癌の発達、進行、および治療8を研究するための最も生理学的に関連する厳格な方法である。当研究室は、がんGEMMの生成と特徴付けに特化しています。
米国の男性の間で最も高く診断された非皮癌は前立腺癌(PCa)である。PCa患者の大半は、リスクの低い疾患と生存率が高いが、疾患が進行段階で診断されたり、標的ホルモン療法が積極的で治癒不可能なPCaに進行を誘導する場合、生存率は劇的に低下する。サブタイプ9,10.当研究室では、1つ以上の腫瘍抑制遺伝子の凝対性アセレルを利用したGEMMsを開発しました。前立腺上皮細胞のみで活性化されるプロバシンプロモーターの下流にクレ・レコンビネーゼを用いてトランスジーンを導入したため、腫瘍抑制遺伝子発現の組み換えおよび喪失が前立腺に特異的に起こる。12.我々はまた、Cre13を有する細胞において、Creおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)発現を欠く細胞においてトマト蛍光タンパク質発現を誘導するmT/mGと呼ばれるCreレポータートランスジーンを含むためにGEMMを飼育した。この方法の提示と我々の代表的な結果は、我々が我々の研究室で研究するGEMMを示しているが、このプロトコルは、任意のマウスモデルから前立腺癌オルガノイドを生成するために使用することができる。しかし、代表的な結果セクションで詳しく説明したように、特定の腫瘍特性が前立腺癌オルガノイド生成に最適であることを観察しました。
過去10年間で、上皮起源の組織から細胞を培養する新しい方法は、インビトロ14、15の器官系をモデル化する能力の著しい進歩をもたらした。「3D細胞培養」という用語は、オルガノイドの確立と維持に関わる技術に起因しており、一般に、臓器特異的細胞系統によって駆動される二次的なアーキテクチャを組み立てる細胞からなる構造として定義することができる。特性16.これらの新しい方法は、細胞が長期的な成長のために変換や不死化を必要としないという古典的な2D細胞培養とは異なります。したがって、正常細胞の3D培養物は、病気の細胞と比較することができる。これは、通常、正常な細胞対照培養が利用できないがん研究において特に有益です。さらに、オルガノイドは、適切に分化した細胞型を持つ二次組織アーキテクチャを自発的に形成し、2D細胞株よりもインビトロで癌を理解するより良いモデルシステムを作る17。当研究室では、PCa GEMMから分離した腫瘍問題から3Dオルガノイドラインを作成し、インビボデータを補完し、GEMMでは実現できない実験を行っています。
この記事では、明確なマウス前立腺葉と転移性病変の解剖を含む、PCa GEMMの完全な壊死のための書かれた視覚的なプロトコルを提示する。我々は、正常マウス前立腺上皮組織18からオルガノイドを導出するためのDrostらによって以前に発表されたプロトコルに基づいて、マウス前立腺腫瘍からオルガノイドを生成するためのステップバイステップの方法を説明し、示す。
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Protocol
ここに記載されている動物の手順は、ニューヨーク州バッファローのロズウェルパーク総合癌センターの実験動物資源部門で、施設動物管理および使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。
注:オルガノイドの生成のために前立腺または前立腺腫瘍を分離するために解剖される雄マウスは、少なくとも性的成熟の年齢に達している必要があります - 約8〜10週齢。マウスの特定の年齢は、研究の間で異なる場合があります。年齢を選択する際に考慮すべきいくつかの要因には、前立腺細胞集団における年齢依存的変化、特定のプロモーター主導のCreトランスジーンの年齢依存的発現、および特定のGEMMにおける前立腺腫瘍進行率が含まれる。
1. マウス前立腺腫瘍および転移性腫瘍の解剖とイメージング
- 準備
- 必要な滅菌解剖ツールを入手してください。15 cmの定規、精密バランス、分析バランス、70%のエタノール、ホスホバッファー生理生理生理物(PBS)が付いているスプレーボトル、およびペーパータオルが付いているきれいな無菌表面の段階の解剖区域。
-
オルガノイド生成に使用しない内臓や骨に対する固定ソリューションの調製
- 内臓の場合: PBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調調します。1匹のマウスの場合は、20mLの4%PFAを作り、アリコートを2本の15mL円錐管に入れ、使用するまで室温に保ちます。
- 長い骨の場合:アリコット10mLの10%中性緩衝ホルマリン(NBF)を15mL円錐管に入れ、使用するまで室温に保ちます。
- 未処理の10cmの皿を得て、非滅菌PBSで満たす - これらは解剖顕微鏡を使用して細かい解剖の間に器官のための一時的な容器として役立つ。
注:滅菌ツールは、オルガノイドを生成するための組織を解剖するために使用されます。非滅菌用具は後肢の最初の切開および解剖のために使用される。
- 安楽死と初期切開
- 2.0 L/minの流量を5分間使用してCO2窒息でマウスを安楽死させ、ケージからマウスを取り出し、頸部脱臼を行う。 精度のバランスを使用して、マウスの体重と記録を測定します。
- ペーパータオルの上にマウスを置き、解剖面の腹部側に向き、マウスの頭を調査者から離れたところに向けます。手足を伸ばし、使い捨て針で前足と後ろ足をそれぞれ突き刺して、マウスをボードに貼り付けます。
- スプレーボトルを使用して、70%のエタノールでマウスの毛皮を使用します。非滅菌解剖はさみとまっすぐな鉗子を使用して、マウスのペニスのすぐ上にピンチし、毛皮だけを通して小さな切開を行います。
- 切開の中間線を毛皮のみでマウスの首まで続けます。最初の切開の点から、毛皮を通してマウスの腹部平面を通して両側切開を行う。
- 毛皮をつかみ、慎重にマウスの皮膚から引き離します。腹部と胸部の空洞の両方へのアクセスを可能にするために板に毛皮をピン留めする。
- 男性の泌尿生殖器系の抽出
- 無菌解剖はさみと直力を用いて、直腸の上約0.75cmの皮膚を慎重に切断する。腹腔内の器官を妨げることなく、切開中線を胸部まで続けます。慎重に皮膚を引き離し、ボードにピン留めして腹腔全体を露出させます。
注:これらの組織はオルガノイドを生成するために使用されますので、これらの器械がマウスの外側またはステージング領域の任意の表面に触れることを許さ。 - 図1Aの図に従って泌尿生殖器系および他の器官を解剖し、臓器がマウスから取り除かれる順序を示す数字を付ける。
- 膀胱を見つけ、左または右のいずれかに脂肪パッドをつかみ、睾丸を露出させるために上に引っ張ります。慎重に泌尿生殖器領域の残りの部分から睾丸を解剖し、脇に置きます.反対側で同じ手順を実行します。
注:前立腺腫瘍の最適な組織品質および詳細な腫瘍特性を達成するには、尿先生殖器領域全体をマウスenブロック19から除去する必要がある。泌尿生殖器領域を最初に除去することをお勧めします(図1A)。 - 膀胱をつかみ、泌尿生殖器領域が一緒に持ち上がるように注意深く引き上げ、下の尿道を露出させる。膀胱を保持しながら、彼らは後部前立腺の下側に対して、尿道をカットできるようにはさみを向ける。その後、泌尿生殖器領域全体が腹腔から放出されます。
- PBSで満たされた10センチメートルの皿に泌尿生殖器領域を入れます。まだ尿で満たされた場合は、小さな切開を行うことによって膀胱を排出します。分析バランスを使用して、泌尿生殖器系と記録を計量する。
- 無菌解剖はさみと直力を用いて、直腸の上約0.75cmの皮膚を慎重に切断する。腹腔内の器官を妨げることなく、切開中線を胸部まで続けます。慎重に皮膚を引き離し、ボードにピン留めして腹腔全体を露出させます。
- 骨盤リンパ節、脾臓、肝臓、腎臓、肺、脛骨、大腿骨の抽出
- 泌尿生殖器系を取り外すと、骨盤リンパ節が露出し、泌尿生殖器系のすぐ後ろ(図1A)と脊椎の両側に配置される。リンパ節は転移性病変が含まれている場合、または局所的な炎症がある場合にのみ表示されます。リンパ節の下のまっすぐな鉗子を向け、引き上げてリンパ節を取り除きます。反対側で同じ手順を実行します。
- 直腸を直進し、切り取る。直腸を引っ張って、腸間膜リンパ節の転移病変を探して、結腸全体と小腸を解明する。回腸全体が取り除かれたら、十二指腸を引っ張って胃を露出させる。食道を切って胃を完全に取り除き、捨てます。リンパ節に転移病変が見られる場合は、腸から慎重に解剖し、PBSの10cm皿に保存します。
- 胃を露出して取り除くと、腹部の後部側から脾臓を引っ張ります(図1A)。脾臓を取り出し、4%のPFAに入れなさい。脾臓は、高細胞であるヘモトキシリンの染色制御として機能します。
注:オルガノイド生成に使用されない内臓組織は、4%PFAで一晩固定され、PBSで洗浄され、次いで70%エタノールに入れられる。 - 腹部の上部にある肝臓を取り除く(図1A)。肝臓の転移負荷に基づいて、個々の葉を解剖することができ、または横隔膜に沿って慎重に切断することによって肝臓全体を除去することができます。(このときダイヤフラムを切らさないで下すな)。PBSの10センチ皿に肝臓を置きます。
- 肝臓を取り除くと、脊椎の両側の腎臓が完全に露出します(図1A)。腎臓を取り除く - 腎リンパ節と一緒に、ノードに転移病変がある場合は、腎臓の下にまっすぐな鉗子を置き、引き上げる。反対側についても同じ手順を実行します。
- 胸腔を露出させるには、胸部に沿って横隔膜を慎重に切断します。横隔膜を突き刺すと胸腔内の負圧が解放され、心臓と肺が露出する(図1A)。
- 胸骨をつかみ、胸腔をさらに開くために引き上げる。胸部リンパ節の転移病変に対する肋骨ケージに沿った胸腔の腹部面を観察し、もし存在する場合は解剖する。
- 胸骨を保持しながら、心臓と肺にアクセスするために腹部肋骨ケージを切り取ります。心臓をつかみ、肺の下に引き上げて切る。心臓と肺を完全に取り除くために、すべての前血管と気管を切り取る。組織をPBSに入れ、肺組織や肺転移病変を損なうことなく心臓を慎重に取り除きます。
- 無菌のまっすぐな鉗子を取り、はさみを解剖し、大腿骨の頭部で後ろ足を切る。慎重に大腿骨をつかみ、毛皮から後ろ足を取り除きます。
- 後ろ足をペーパータオルの上に置き、後ろ足をつかみます。脛骨と大腿骨からすべての筋肉と結合組織をスクラップ/カットするために、単一のエッジカミソリブレードを使用してください。後蓋骨に後部を切断して脛骨から大腿骨を取り除き、後ろ足を取り除いて脛骨を取り除く。脛骨と大腿骨を10%NBFに入れなさい。反対側で同じ手順を実行します。
注:転移性病変のためにマウスの長い骨を調べる目的で、線維は無傷である必要はない。長い骨は1週間10%NBFで固定され、次いで中性EDTA溶液20を用いてデカールされる。3週間後、骨は70%のエタノールに移されます。 - 後肢を取り除き、将来のジェノタイピングのために耳または尾の切断を取ります。マウスの死体とすべての組織を廃棄し、オルガノイドの生成に固定または使用しないでください。
- 前立腺腫瘍の解剖
注:マウス前立腺葉の解剖は、解剖顕微鏡19を用いてのみ達成することができる。しかし、前立腺腫瘍の負荷が非常に高く、個々の葉を区別することができず、顕微鏡なしで解剖を行うことができます。それにもかかわらず、個々の前立腺葉の解剖のための完全なプロトコルを以下に説明する。- 解剖顕微鏡の下にPBSの10cm皿に泌尿生殖器領域を置き、研究者から離れて向いている膀胱と精嚢で腹部側を向ける。泌尿生殖器領域のすべての操作は、滅菌器具を使用して行われるべきです。
- 前立腺腫瘍の一般的な表現型を評価する- 最も可能性の高い、流体充填または固形腫瘍のいずれかがPCa GEMMsで観察される(図2A、B)。
注:流体で満たされた腫瘍は、多くの場合、前立腺領域に位置する(図2A)。流体充填腫瘍は、主に上皮成分がスキャンされた結合組織で構成されているため、これらの腫瘍は腫瘍上皮細胞の数が少ないため、オルガノイド生成には最適ではありません。セクション。 - 液体で満たされた腫瘍が存在する場合は、腫瘍に小さな穴を突く。PBSの新しい10センチ皿に泌尿生殖器領域を置きます。
- 非支配的な手と支配的な手で湾曲した鉗子のペアを取る.泌尿生殖器領域を背中の顔に反転します。尿道のピンク/赤色で識別できる近位前立腺領域(図1B)を探します。尿道をつかみ、湾曲した鉗子で泌尿生殖器組織を操作するようにしっかりと保持します。
注:前立腺解剖の間、これは個々の前立腺葉を見つける最も簡単な方法であるので、常に膀胱の位置に注意してください(図1B)。
- 泌尿生殖器領域からの非前立腺組織の除去
- まだ泌尿生殖器領域の後部の顔にしながら、精液小胞のベースを見つけます。精液を慎重に取り除き、廃棄します。反対側で同じ手順を実行します。
注:前立腺解剖を妨げる粘着性および不透明な分泌液を放出するように、精液を穿刺することは避けてください。精液が穿刺された場合は、残りの泌尿生殖器領域を新鮮なPBSで新しい10cmの皿に移します。 - 鉗子の湾曲した側を使用して、精管とできるだけ多くの脂肪と結合組織を取り除き、廃棄します。
- 尿道/近位前立腺領域をしっかりと保持しながら、尿道から膀胱を取り除くために、細かい尖ったはさみを使用します。
- まだ泌尿生殖器領域の後部の顔にしながら、精液小胞のベースを見つけます。精液を慎重に取り除き、廃棄します。反対側で同じ手順を実行します。
- 個々の前立腺葉の分離
- 前立腺を見つけます (図 1B)。直鉗子で近位前立腺領域/尿道をしっかりと保持するようにしてください。鉗子の湾曲した側で組織を直接つかみ、膀胱と他の前立腺からしっかりと引き離すことによって、前立腺領域を取り除きます。組織を PBS に配置します。
注:すべての前立腺領域について、解剖は、腫瘍の大きさに応じて、組織を除去するために必要な場合があります。 - 腹部前立腺領域を見つけます (図 1B)。ステップ 1.5.7 と同様に、腹部前立腺領域を削除します。
- 解剖のこの時点で、近位前立腺領域がまだまっすぐな鉗子によって把握されている間、横および後部前立腺領域だけが存在するべきである。横および後部前立腺領域を評価する(図1B)。横領域を後部領域と区別できる場合は、ステップ 1.5.7 で説明するように横前立腺領域を削除します。反対側で同じ手順を実行します。
- ステップ 1.5.7 で説明されているように、後部前立腺領域を削除します。近位前立腺領域を4%PFAに置き、尿道の筋肉組織内の構造がオルガノイド生成に不適当とされる。
- 前立腺を見つけます (図 1B)。直鉗子で近位前立腺領域/尿道をしっかりと保持するようにしてください。鉗子の湾曲した側で組織を直接つかみ、膀胱と他の前立腺からしっかりと引き離すことによって、前立腺領域を取り除きます。組織を PBS に配置します。
2. 前立腺腫瘍組織からの3Dオルガノイドの生成
注:図3は、腫瘍オルガノイドの生成手順の絵画的記述を示す。
- 準備
- Drostら18に従ってマウス前立腺オルガノイド媒体を以下の改変で調記する。ノギンとR-スポンディンの組換えタンパク質の代わりに条件付き培地を使用し、ノギンとR-スポンディン条件培地の両方に10%ではなく1%(v/v)の最終濃度を使用します。
注:HA-マウスノギンFcまたはHAマウスRspo1-Fcで安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞は、それぞれノギンまたはR-スポンディン-条件付き培地を産生するために使用される。これらの細胞株はスタンフォード大学のカルビン・クオ研究所からの贈り物でした。 - 高度なDMEM/F12(+++)メディアで20mg/mLコラゲナーゼIIを5mg/mLの最終濃度に希釈することにより、15 mLチューブで消化溶液を調作します。10 μMの最終濃度でコラゲナーゼII溶液にY-27632ロック阻害剤を添加する。
注:消化バッファーと組織の比率は1mL~50mgであり、Drost et al.18に従って使用します。
- Drostら18に従ってマウス前立腺オルガノイド媒体を以下の改変で調記する。ノギンとR-スポンディンの組換えタンパク質の代わりに条件付き培地を使用し、ノギンとR-スポンディン条件培地の両方に10%ではなく1%(v/v)の最終濃度を使用します。
- 腫瘍組織のミンチと消化
- 細胞培養フードに、前立腺腫瘍組織を無菌10cm培養皿に入れ、壊死組織を解剖して廃棄する。
- 生殖不能の湾曲した鉗子で組織片を保持し、解剖はさみで切断することにより、残りの前立腺腫瘍組織を1 mm3キューブにミンチします。
- 15 mLチューブに細かく刻んだ腫瘍片を消化バッファーで入れ、鉗子の湾曲した側でそれらをすくい上げる。1.5~2時間振って37°Cで腫瘍組織を消化し、20分ごとに消化の進行を確認します。
注:このとき、-20°Cの貯蔵から少なくとも2mLのマトリックスを取り出し、氷の上で解凍する。マトリックスの1 mLアリコートは、解凍に約3時間かかります。 - 組織消化後、遠心管を175xgで4°Cで5分間用し、細胞ペレットを形成した。
- 上清を取り出し、チューブをフリックして細胞ペレットを緩め、10μM Y-27632ロック阻害剤を補充した予め温めたトリプシンの1mLで細胞ペレットを再中断する。チューブを37°Cの水風呂に5分間入れます。
- インキュベーションの後、標準的なP1000の先端が付いている上下5回ピペット。チューブを37°Cの水風呂に戻し、さらに5分間、ステップ2.2.6を繰り返します。
注:この手順では、55°Cのインキュベーターに入れて無菌6ウェル細胞培養皿を温めます。
- マトリックス内の細胞数と再懸濁液数
- 9 mLの冷たいAdDMEM/F12(+++)を加えて細胞を洗い、チューブを175 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
- 遠心分離後、上清を取り除き、チューブをフリックしてペレットを緩め、10 mLの冷たいAdDMEM/F12(+++)を加えて再び細胞を洗浄する。4 °Cで5分間175 x gでチューブを遠心分離します。
- 遠心分離後、上清を取り除き、チューブをフリックしてペレットを緩め、AdDMEM/F12(+++)の1mLで細胞を再定置し、標準的な手順に従って血球計を用いて細胞数を数える。
- オルガノイドをドロップワイズ方形でマトリックスにメッキすると、7~8個のドームが6ウェルの1つの井戸に収まる。マトリックスの約200 μLは7-8ドームを生成します。将来の実験目的で必要なオルガノイドの井戸の数を決定し、必要なマトリックスの体積を計算します。次いで、マトリックスの最終濃度を1.0 x 106細胞/mLにするために必要な細胞含有溶液の体積を計算する。
- 細胞を数えた後、遠心分離機を4°Cで5分間175xgで行う。 上清を取り除き、チューブをフリックしてペレットを緩め、ステップ2.3.4で計算されたマトリックスの体積で細胞を再中断します。
注:マトリックスは4°Cでのみ液体の形のままです。マトリックスストックチューブとマトリックスセルソリューションを常に氷の上に保ちます。
- メッキマトリックスドームとメディアの応用
- マトリックスセル溶液とP200ピペを混ぜ合わせ、気泡を導入せずに細胞を均等に分配します。55°Cのインキュベーターから6ウェル培養皿を取り出します。
- マトリックスセル溶液の200 μLを慎重にピペットし、すぐにドームを作成するために井戸に溶液をドロップします。
- 手順 2.4.2 を繰り返します。マトリックスセル溶液の体積が費やされるまで。ドームが室温で2分間固色するようにします。
- 6ウェル皿を逆さまにひっくり返し、37°Cのインキュベーターに入れ、20分間固化を続けます。
- インキュベーション後、各ウェルにマウス前立腺オルガノイド培温の2 mLを加える。1 nM および Y-27632 ロック阻害剤の最終濃度 10 μM の最終濃度のために各ウェルに合成アンドロゲン R1881 を追加します。慎重に混合し、培養のための37 °Cインキュベーターにプレートを置きます。
注:オルガノイド培養培養剤は、オルガノイド生成後わずか1週間で10μM Y-27632ロック阻害剤を補充する必要があります。
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Representative Results
前立腺領域に大きな流体で満たされた原発性前立腺腫瘍を有するマウスの代表的な壊死画像を図2Aに示す。これに対して、図2Bは、個々の前立腺領域が区別できない大きな固体原発性前立腺腫瘍を有するマウスの代表的な壊死画像を示す。蛍光解剖画像は、GFPを発現する図2Bと同じ固体前立腺腫瘍を示し、腫瘍細胞がCreを発現することを示す(図2C)。膀胱などのプロバシンを発現しない組織は、トマトを発現し、したがってCreを発現しない(図2C)。図2Bのマウスの肝臓と肺は、GFPを発現する転移性腫瘍を有し、原発性前立腺腫瘍に由来し、トマトを発現する正常組織に囲まれていることを示す(図2C)).最後に、このマウスの骨盤リンパ節は、トマトではなくGFPを発現し、この転移性腫瘍がこの器官を追い越し、正常な組織が残っていないことを示す(図2C)。
固体前立腺腫瘍から発生したオルガノイドの画像を図4に示す。1日目には、代表的な位相コントラスト画像に見られるように、小さなオルガノイドが形成されている。1日目の蛍光画像は、トマトとGFP発現細胞の両方が腫瘍オルガノイド培養(矢印)中に存在することを示す。しかし、前立腺腫瘍オルガノイドが完全に形成された7日目までに、これらのオルガノイドはトマトではなくGFPを発現している。これらのデータは、これらのオルガノイドが正常な上皮細胞からではなくCreを発現していた腫瘍細胞に由来していることを示唆している。これらの腫瘍オルガノイドは、我々の培養を通路1および2に拡大するにつれて、GFP陽性のみであり続ける。
図5では、流体で満たされた前立腺腫瘍から発生したオルガノイドの画像を示す。1日目には小さなオルガノイドが形成され、蛍光画像はトマトとGFP発現の両方の細胞がオルガノイド培養中に存在することを示しており、固体前立腺腫瘍から生成されたオルガノイドに関する1日目の観察と同様である(図4)。しかし、流体で満たされた前立腺腫瘍からのオルガノイドは、7日目にGFPまたはトマトのいずれかを発現し、クレを発現しない細胞からオルガノイドが形成されたことを示す。このパターンは、培養がトマトとGFP発現オルガノイドの両方を有する第1および第2節で継続する。これらのオルガノイドのさらなる分析は、ラインが正常な上皮オルガノイドと腫瘍オルガノイドの混合物であるため、厳しく制限される。流体で満たされた前立腺腫瘍は、正常な前立腺上皮細胞の割合が高いからといって、腫瘍オルガノイドの生成に最適でないことが考えられています。正常な前立腺上皮細胞と前立腺癌細胞の両方がオルガノイドを形成するので、流体満たされた前立腺腫瘍から発生する線は、正常および癌オルガノイドの混合物である。GFP陽性細胞のフローソートと細胞集団からのオルガノイドの生成により、流体で満たされた前立腺腫瘍から純粋な腫瘍オルガノイドラインを得ます。固形前立腺腫瘍は主に腫瘍細胞から構成されるため、これらの腫瘍から生成されるオルガノイドは、GFPの事前選別なしに癌オルガノイドのより純粋な集団である。
図 1: 前立腺癌(PCa)遺伝子操作マウスモデル(GEMM)およびマウス前立腺の解剖に関する推奨解剖命令。(A) PCa GEMMから主要臓器を解剖するためのプロトコルでお勧めする順序。1. 泌尿生殖器地域。2. 骨盤リンパ節。3. 脾臓。4. 肝臓。5.腎臓。6. 肺。7. 脛骨と大腿骨.(B) マウスの泌尿生殖器領域と前立腺解剖学の地図。プロバシンクレおよびmT/mGクレレポータートランスジーンを発現する12週齢マウスの蛍光解剖画像。膀胱(BL)、精嚢胞(SV)、前立腺(AP)、腹部前立腺(VP)、側側前立腺(LP)、背側前立腺(DP)、および近位前立腺(PP)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 前立腺癌(PCa)遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)の代表的な解剖画像。(A) 体液で満たされた前立腺腫瘍を有する泌尿生殖器領域および泌尿生殖器領域の除去前の腹腔。(B) 固形前立腺腫瘍を有する泌尿生殖器領域および泌尿生殖器領域の除去前の腹腔。(C) 転移病変を発症するPCa GEMMからの固体前立腺腫瘍、肝臓、肺、骨盤リンパ節の代表トマトおよびGFP蛍光画像。スケールバー = 5 mm. 膀胱 (BL),前立腺 (AP), および後部前立腺 (DP) .この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 前立腺腫瘍オルガノイドを生成するためのプロトコルのフローチャート。前立腺腫瘍を解剖した後、組織を1mmの部分にミンチする。コラゲナーゼで腫瘍片を消化し、細胞を採取し、トリプシンで消化して単一の細胞懸濁液を得る。細胞を数えた後、1.0 x 106細胞/mL細胞濃度に必要なマトリックスの体積で再中断する。ドロップワイズ法を使用して皿にプレートドーム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 固形前立腺腫瘍からのマウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成からの代表的な画像。代表的な相コントラストは、トマト、およびGFP蛍光画像を、固体マウス前立腺腫瘍から生成したオルガノイドの1日目、7日目、パッセージ1、およびパッセージ2から。スケールバー = 100 μm. 矢印は蛍光画像内の個々の細胞を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 液体で満たされた腫瘍からのマウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成からの代表的な画像。代表的な相コントラストは、トマト、およびGFP蛍光画像を1日目、7日目、パッセージ1、および流体満たされたマウス前立腺腫瘍から生成したオルガノイドの通路2から。スケールバー = 100 μm. 矢印は蛍光画像内の個々の細胞を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
前立腺腫瘍解剖およびオルガノイド生成のためのプロトコル内の重要なステップ
非前立腺組織の除去とマウス前立腺腫瘍の微細な解剖は、非前立腺上皮細胞と正常前立腺上皮細胞の両方がオルガノイドを生成するので、癌オルガノイドの最適な生成のために重要である。特に固形前立腺腫瘍の場合、生存可能な細胞の数を減らす壊死組織による汚染を除去するために生存性腫瘍の領域を分離することが重要である。オルガノイド生成の間、コラゲナーゼを伴う組織消化は、コラゲナーゼへの長期暴露が細胞の生存率を制限するように、熱心に監視されるべきである。がんGEMMに由来するオルガノイドでは、マウスで設計されたすべてのトランスジーンと改変対立遺伝子がオルガノイド中に存在することを確実にするために、各行を完全に遺伝子型化することが重要です。長期の通過後のジェノタイピングの繰り返しは、遺伝子改変が維持されることを確実にするためにも必要である。
前立腺腫瘍解剖とオルガノイド生成の改変とトラブルシューティング
我々は、同じ遺伝子型を有する動物の間でも、前立腺腫瘍特性におけるマウスの可変性を観察した。したがって、ここで説明する前立腺解剖プロトコルに対する特定の変更は、各マウスに対して必要であり、かつ必要でありうる。また、転移性腫瘍を解剖する際には適応性が必要であり、解剖を開始する前にこれらの病変の重症度を予測することは困難である。
いくつかの機会に、我々はコラゲナーゼとトリプシンの両方で消化した後でも、結合組織と思われるもので私たちの細胞ペレットの過剰な汚染を観察しました。この場合、AdDMEM F12(+++)の少なくとも2 mLでペレットを再一時停止し、40μmの細胞ストレーナーを使用して結合組織を除去します。マトリックスの固化速度にはロット間変動があるため、オルガノイド培地を塗布する前にドーム固化時間の増減が必要になる場合があります。
GEMM の使用に関する制限事項
GEMMは、前臨床癌研究のための最も厳格な方法ですが、このアプローチは、かなりの時間、費用、およびトレーニングを必要とします。さらに、マウスとマウスの可変性は、ヒトの研究と同様に、データの解釈を複雑にする可能性がある。
3D細胞培養の使用上の制限
2D細胞培養と比較して、オルガノイドラインの生成と維持には、時間とコストの増加が必要です。例えば、腫瘍オルガノイドラインは2~3週間ごとに通過し、細胞株は2~3日ごとに通過することができます。オルガノイドのこの遅い成長速度は、かなり実験を完了するために必要な時間を増加させます.オルガノイド培養培養培養剤には、いくつかの特殊な成長因子および試薬が含まれており、ソースに応じてコストがかかるため、オルガノイドの生成と維持は従来の2D細胞株よりも高価です。最後に、私たちの研究室や他の人たちは、マトリックスや他の試薬の多くの違いを観察している - 長期実験のためのオルガノイド成長の一貫性を維持するための課題を作成します。
既存/代替法に関する3D細胞培養の使用における意義
前臨床癌研究は、2D細胞培養および細胞株由来異種移植片モデルによって支配されてきた。2Dにおける細胞増殖は形質転換/不死化を必要とし、したがって、2D培養を用いてインビトロおよび異種移植片の両方の研究は、通常、非癌対照として機能するために変わらない正常な細胞株を持たない。正常な上皮由来組織の3Dオルガノイド培養における最後の10年間の研究は、癌組織由来の類似オルガノイドと比較するために使用できる非癌性上皮組織の成長を可能にした。癌オルガノイドはまた、腫瘍の発達をさらに理解するために異種移植片を確立するために使用することができる。さらに、非癌オルガノイドは、3D細胞培養法が開発される前には不可能であった異種移植片の対照を生成するために使用することができる16。
前立腺癌研究における3D細胞培養の意義
最近の研究では、オルガノイドはGEMM前立腺腫瘍特性を要約するために使用されている。Dardenne et al. は、腫瘍抑制剤Ptenを欠き、MYCN腫瘍遺伝子を過剰発現するGEMMsから前立腺腫瘍を用いて生成されたオルガノイドが、前立腺を用いて生成されたオルガノイドよりも大きな成長能を有することを示している。GEMM を制御します。さらに、シーケンシングと免疫組織化学の両方は、腫瘍オルガノイドが前立腺腫瘍の発現プロファイルを要約し、Ptenを欠き、MYCN 21を過剰発現していることを示した。Blattnerらは、スペックル型BTB/POZタンパク質(SPOP)の発発性変異体の同時前立腺過剰発現とPtenの欠失がGEMMにおける腫瘍形成率を増加させることを示している。前立腺オルガノイドが変異体SPOPを過剰発現するために生成された場合、その増殖は、コントロール前立腺オルガノイドおよび系統マーカー発現に比べて増加し、元々の前立腺腫瘍22を要約した。これらの研究は、これらの研究は、オルガノイドがGEMMSにおける前立腺腫瘍特性のさらなる研究のための最適なモデルであることを示している。
オルガノイド培養はまた、前立腺腫瘍細胞の個々の亜集団を評価するためのツールとして使用されている。前立腺上皮細胞におけるPtenおよびPtenおよびTrp53腫瘍抑制剤を欠いているGEMM腫瘍を用いて、Agarwalら細胞を基底およびルミナル前駆体に分画し、これらの亜集団をオルガノイドとして伝播し、さらに彼らの特定の現象型23を特徴付けた。それにより、3D細胞培養を用いて、前立腺腫瘍自体中に存在しきであり知らない腫瘍細胞の亜集団を特徴付けすることができる。
上述したように、3D細胞培養技術は正常な上皮細胞の増殖を可能にする。それによって、Creドライバを欠くGEMMから生成された前立腺オルガノイドは、インビトロでのCre組換後の誘導による腫瘍形成のリアルタイムモニタリングのためのユニークなモデルを提供する。実際、Dardenneらは、ERT2-Creを発現し、タモキシフェン21で治療することにより、NMYC過剰発現が時間の経過とともにPten損失のコンテキストで成長可能性にどのように影響するかを評価した。 さらに、前立腺癌に対する治療の主要な標的であるアンドロゲン受容体(AR)に対するNMYC過剰発現の効果は、GEMMs21から生成されたオルガノイド中のクレ・レコンビナーゼの誘導後に評価された。同じ誘導性Creシステムは、前立腺オルガノイドでBlattnerらによって使用され、変異型SPOPの過剰発現が前立腺癌細胞増殖およびAR発現にどのように影響するかを測定した22。特に、インビトロでCre発現を誘導する実験は、車両処理されたオルガノイドを用いた非癌制御を内蔵している。
前立腺癌研究における3D細胞培養の使用における特定の限界
正常上皮細胞のオルガノイド増殖は3D細胞培養技術を用いる利点であるが、正常なオルガノイドを増殖させる能力は、前立腺癌研究においても課題となっている。代表的な結果セクションに示すように、前立腺腫瘍から発生するラインにおける正常前立腺オルガノイドの増殖が観察されています(図5)。この現象に対処する 1 つの方法は、mT/mGなどの Cre レポータートランスジーンを表す GEMM からオルガノイドを生成することです。蛍光顕微鏡は、トマトおよびGFPの発現を観察することにより、腫瘍オルガノイドに対する正常対腫瘍の相対比を評価するために使用することができる。さらに、GFP発現は、ソートオルガノイド細胞を流し、純粋な前立腺腫瘍オルガノイドラインを生成するために使用することができる。Agarwalらは、Creレポーターを用いずにGEMM前立腺腫瘍から正常上皮細胞および癌細胞を分離するためのソート方法を示す。彼らは、前立腺腫瘍からの上皮細胞接着分子(EpCAM)陽性細胞がCD24またはSca-1細胞表面マーカー23を用いてソートした場合、亜集団に分離しなかったことを示し、したがって、これらのマーカーを使用して正常を排除することができる。オルガノイド発生前のGEMM前立腺腫瘍からの前立腺上皮細胞。私たちの研究室などは、前立腺癌細胞がオルガノイドを形成する条件が、前立腺基底上皮細胞に特徴的な系統特異的遺伝子発現プログラムを選択または促進するように見えることを観察した。マウスとヒトの両方の前立腺腫瘍は、主に本質的に明光体であり、AR、CK8、および他のルミナルマーカーを発現し、p63またはCK5などの基底系統マーカーを発現することはめったにないため、これは重要な課題である。この現象はまだ詳細に発表されていないが、免疫組織化学分析は、Ptenf/+前立腺21と比較してPten f/+オルガノイドにおいてARが減少することを示している。 前立腺癌オルガノイドにおける基底上皮細胞の増殖は、これらの線が本当に前立腺癌の正確な前臨床モデルであるかどうか疑問を呼び起こす。
前立腺癌オルガノイドは、それらが従来の2D培養よりも優れた由来の腫瘍をモデル化するために文書化されているが、特にいくつかの経過後に、オルガノイドが培養中の遺伝的変化を受ける可能性がある。現在、我々は、前立腺癌オルガノイドの長期通過後に一般的な自発的な遺伝的変異、遺伝的利益または損失、またはエピジェネティックな変化を文書化した公開された研究を認識していません。長期の通過に起因する遺伝的またはエピジェネティックな変化の結果として変動性を制限するために、実験は早期通過(<10)から早期オルガノイドで可能な限り頻繁に行われるべきである。
3D細胞培養の今後の応用
がん研究において3D細胞培養を用いて開発されるすべての将来の応用を予測することは不可能ですが、最も可能性が高いと思われるいくつかの方法があります。2D細胞株と同様に、インビトロ遺伝子改変を行う場合、オルガノイドでは比較的簡単です。正常または癌オルガノイドの特定の遺伝子を改変することは、腫瘍形成、癌の進行、治療を支配するメカニズムの研究において多くの可能性を開く。異種移植片。オルガノイドの遺伝子改変は、GEMMが特定の遺伝子に存在しない場合や、特定の研究の範囲外に新しいGEMMを確立する場合に非常に有利である。
癌オルガノイド培養はまた、臨床研究のための多くの潜在的なアプリケーションを持っています。患者と動物モデルの両方から各臓器系内の関連する腫瘍サブタイプのライブラリーを使用して、新薬または既存の薬剤の新しい組み合わせの有効性を迅速に評価することができます。3D細胞培養が主流となり、効率が向上するにつれて、個別化医療を目的とした患者由来のオルガノイドの生成は、利用可能なすべての薬剤と組み合わせをテストすることにより、各がん患者の治療を調整するのに役立つ可能性を秘めています。彼または彼女の個々のオルガノイドライン16を使用する薬物.
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Disclosures
著者は開示する財政的な関係を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、HAマウスのノギンFcまたはHAマウスRspo1-Fcのいずれかで安定してトランスフェクトHEK293細胞を提供してくれたスタンフォード大学のカルビン・クオ研究所に感謝したいと思います。また、彼の研究室で蛍光解剖顕微鏡にアクセスさせてくださったディーン・タン博士に感謝します。この研究は、国立がん研究所からD.W.G.にCA179907によってサポートされました。ロズウェルパーク総合癌センターの共有リソースは、国立衛生癌センター支援助成金CA016056によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
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