Summary
Mostramos un método para la necropsia y la disección de modelos de cáncer de próstata de ratón, centrándose en la disección tumoral de próstata. También se presenta un protocolo paso a paso para la generación de organoides tumorales de próstata de ratón.
Abstract
Los métodos basados en la recombinación homóloga para modificar genes han ido avanzando significativamente en la investigación biológica. Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEMM) son un método riguroso para estudiar el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. Nuestro laboratorio ha desarrollado varios GEMMs de cáncer de próstata (PCa) que carecen de la expresión de uno o múltiples genes supresores de tumores utilizando el sistema de recombinas Cre-loxP específico del sitio y un promotor específico de la próstata. En este artículo, describimos nuestro método para la necropsia de estos GEM DeP PCa, centrándose principalmente en la disección de tumores de próstata de ratón. Los nuevos métodos desarrollados en la última década han facilitado el cultivo de células derivadas del epitelial para modelar sistemas de órganos in vitro en tres dimensiones. También detallamos un método de cultivo celular 3D para generar organoides tumorales a partir de GemM PCa de ratón. La investigación preclínica del cáncer ha estado dominada por el cultivo celular 2D y los modelos de xenoinjertos derivados de la línea celular o derivados del paciente. Estos métodos carecen de microambiente tumoral, una limitación del uso de estas técnicas en estudios preclínicos. Los GEMM son más fisiológicamente relevantes para entender la tumorigenesis y la progresión del cáncer. El cultivo organoide tumoral es un sistema modelo in vitro que recapitula la arquitectura tumoral y las características del linaje celular. Además, los métodos de cultivo celular 3D permiten el crecimiento de células normales para la comparación con los cultivos celulares tumorales, rara vez es posible utilizando técnicas de cultivo de células 2D. En combinación, el uso de GEMMs y cultivo de células 3D en estudios preclínicos tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la biología del cáncer.
Introduction
Desde finales de la década de 1980, la capacidad de alterar genes mediante la recombinación homóloga ha avanzado en gran medida el estudio de los sistemas biológicos1. Los sistemas promotores inducibles, tisulares o celulares específicos y las recombinaciones específicas del sitio, como Cre-loxP, tienen estudios genéticos avanzados al facilitar el control de las modificaciones genéticas tanto temporal como espacialmente2,3, 4. La combinación de estas estrategias genéticasha creado una amplia gama de sistemas de modelos experimentales 5,6,7.
Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEM) son una herramienta integral para evaluar cómo los genes individuales o grupos de genes afectan el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. En la investigación preclínica del cáncer, los GEMM son el método más fisiológicamente relevante y riguroso para estudiar el desarrollo, progresión y tratamiento del cáncer8. Nuestro laboratorio se especializa en la generación y caracterización de GEM DeNado sin cáncer.
El cáncer no cutáneo más altamente diagnosticado entre los hombres en los Estados Unidos es el cáncer de próstata (PCa). La mayoría de los pacientes con PCa tienen enfermedad de bajo riesgo y alta probabilidad de supervivencia, pero las tasas de supervivencia disminuyen drásticamente cuando la enfermedad se diagnostica en etapas avanzadas o si la terapia hormonal dirigida induce la progresión a la PCa agresiva y no curable subtipos9,10. Nuestro laboratorio ha desarrollado GEMMs que utilizan alelos floxed de uno o más genes supresores de tumores. La recombinación y la pérdida de la expresión génica supresora tumoral se produce específicamente en la próstata porque hemos introducido un transgén con Cre recombinase aguas abajo del promotor probasin activado sólo en las células epiteliales de próstata11, 12. También hemos criado nuestros GEMMs para contener un transgén de reportero Cre llamado mT/mG, que induce la expresión de proteína fluorescente de tomate en células que carecen de Cre y proteína fluorescente verde (GFP) expresión en células con Cre13. Si bien la presentación de este método y nuestros resultados representativos muestran GEMMs que estudiamos en nuestro laboratorio, este protocolo se puede utilizar para generar organoides de cáncer de próstata a partir de cualquier modelo de ratón. Sin embargo, como se discutió en detalle en nuestra sección de resultados representativos, hemos observado que ciertas características tumorales son óptimas para la generación de organoides de cáncer de próstata.
En la última década, nuevos métodos de cultivo de células de tejidos de origen epitelial han dado lugar a avances significativos en nuestra capacidad de modelar sistemas de órganos in vitro14,15. El término "cultivo celular 3D" se ha atribuido a las técnicas involucradas en el establecimiento y mantenimiento de organoides, que generalmente pueden definirse como estructuras compuestas por células que ensamblan arquitectura secundaria impulsada por el linaje celular específico de órganos características16. Estos nuevos métodos son distintos del cultivo celular 2D clásico en que las células no requieren transformación o inmortalización para el crecimiento a largo plazo; por lo tanto, los cultivos 3D de células normales se pueden comparar con las células enfermas. Esto es particularmente valioso en la investigación del cáncer donde los cultivos normales de control celular no han estado típicamente disponibles. Además, los organoides forman espontáneamente arquitecturas de tejidos secundarios con tipos celulares adecuadamente diferenciados, lo que los convierte en un mejor sistema modelo para entender el cáncer in vitro que las líneas celulares 2D17. Nuestro laboratorio ha creado líneas organoides 3D a partir de problemas tumorales aislados de nuestros GemM PCa para complementar nuestros datos in vivo y realizar experimentos que no serían factibles en GEMMs.
En este artículo, presentamos protocolos escritos y visuales para la necropsia completa de los GEM DeP PCa, incluyendo la disección de diferentes lóbulos de la próstata del ratón y lesiones metastásicas. Describimos y mostramos un método paso a paso para generar organoides a partir de tumores de próstata de ratón basado en un protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organoides del tejido epitelial de próstata de ratón normal18.
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Protocol
Los procedimientos animales descritos aquí se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Departamento de Recursos Animales de Laboratorio, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, Nueva York.
NOTA: Los ratones machos que se diseccionen para aislar la próstata o los tumores de próstata durante la generación de organoides deben haber alcanzado al menos la edad de madurez sexual, aproximadamente 8-10 semanas de edad. Las edades específicas de los ratones pueden variar entre los estudios. Algunos factores a tener en cuenta al elegir la edad incluyen cambios dependientes de la edad en la población de células de próstata, expresión dependiente de la edad de Cre transgenes específicos impulsados por el promotor, y la tasa de progresión del tumor de próstata en un GEMM en particular.
1. Disección e imágenes de tumor de ratón y tumores metastásicos
- Preparaciones
- Obtenga las herramientas de disección estériles necesarias. Zona de disección de etapa en una superficie estéril limpia con una regla de 15 cm, equilibrio de precisión, equilibrio analítico, botella de pulverización con 70% etanol, solución salina fosfo-buffered (PBS) y toallas de papel.
-
Preparación de soluciones fijativas para órganos viscerales y huesos que no se utilizarán para la generación de organoides
- Para órganos viscerales: Preparar 4% paraformaldehyde (PFA) en PBS. Para un ratón, hacer 20 mL de 4% PFA, alícuota en dos tubos cónicos de 15 ml y mantener a temperatura ambiente hasta su uso.
- Para huesos largos: Aliquot 10 mL de formalina tamponada (NBF) prefabricada 10% neutra en un tubo cónico de 15 ml y mantener a temperatura ambiente hasta su uso.
- Obtener platos de 10 cm sin tratar y llenar con PBS no estéril - estos servirán como recipientes temporales para los órganos durante la disección fina utilizando un microscopio de disección.
NOTA: Las herramientas estériles se utilizan para diselar tejidos para generar organoides. Las herramientas no estériles se utilizan para la incisión inicial y la disección de las extremidades posteriores.
- Eutanasia e incisión inicial
- Euthanizar el ratón mediante asfixia de CO2 utilizando un caudal de 2,0 L/min durante 5 min. Retire el ratón de la jaula y realice la luxación cervical. Utilice la balanza de precisión para medir el peso corporal y el registro del ratón.
- Coloque el ratón encima de una toalla de papel y oriente sobre el lado ventral de la superficie de la disección hacia arriba con la cabeza del ratón mirando lejos del investigador. Fije el ratón al tablero estirando sus extremidades y perforando cada una de las patas delanteras y traseras con una aguja desechable.
- Con una botella de spray, douse el pelaje del ratón con 70% de etanol. Usando tijeras de disección no estériles y fórceps rectos, pellizca justo encima del pene del ratón y haz una pequeña incisión a través del pelaje solamente.
- Continúe la línea media de la incisión hasta el cuello del ratón a través del pelaje solamente. Realice incisiones bilaterales desde el punto de la incisión inicial a través del plano ventral del ratón a través del pelaje solamente.
- Sujete el pelaje y tire con cuidado de la piel del ratón. Anclar el pelaje a la tabla para permitir el acceso a las cavidades abdominal y torácica.
- Extracción del sistema urogenital masculino en bloque
- Usando tijeras de disección estériles y fórceps rectos, corte cuidadosamente a través de la piel unos 0,75 cm por encima del recto. Continúe la línea media de la incisión hasta la caja torácica sin alterar ningún órgano de la cavidad abdominal. Tire con cuidado de la piel y ancle a la tabla para exponer toda la cavidad abdominal.
NOTA: No permita que estos instrumentos toquen el exterior del ratón o cualquier superficie en el área de ensayo, ya que estos tejidos se utilizarán para generar organoides. - Diseccionar el sistema urogenital y otros órganos de acuerdo con el diagrama de la Figura 1A,con números que indican el orden en que los órganos se extraerán del ratón.
- Encuentra la vejiga, luego agarra la almohadilla de grasa hacia la izquierda o la derecha y tira hacia arriba para exponer el testículo. Diseccionar cuidadosamente el testículo del resto de la región urogenital y dejar a un lado. Haga el mismo procedimiento en el otro lado.
NOTA: Para lograr la calidad óptima del tejido y la caracterización detallada de los tumores de próstata es necesario extraer toda la región urogenital del ratón en el bloque19. Se recomienda extirpar primero la región urogenital (Figura1A). - Sujete la vejiga y tire cuidadosamente hacia arriba para que la región urogenital se levante, exponiendo la uretra debajo. Mientras sostiene la vejiga, oriente las tijeras para que estén contra la parte inferior de la próstata dorsal y corte la uretra. Toda la región urogenital se liberará de la cavidad abdominal.
- Ponga la región urogenital en un plato de 10 cm lleno de PBS. Si aún está lleno de orina, drene la vejiga haciendo una pequeña incisión. Usando la balanza analítica, sopesar el sistema urogenital y registrar.
- Usando tijeras de disección estériles y fórceps rectos, corte cuidadosamente a través de la piel unos 0,75 cm por encima del recto. Continúe la línea media de la incisión hasta la caja torácica sin alterar ningún órgano de la cavidad abdominal. Tire con cuidado de la piel y ancle a la tabla para exponer toda la cavidad abdominal.
- Extracción de ganglios linfáticos pélvicos, bazo, hígado, riñón, pulmón, tibia y fémur
- La extracción del sistema urogenital expone los ganglios linfáticos pélvicos, situados justo detrás del sistema urogenital (Figura1A) y a ambos lados de la columna vertebral. Los ganglios linfáticos solo serán visibles si contienen lesiones metastásicas o si hay inflamación local. Orienta los fórceps rectos debajo del ganglio linfático y tira hacia arriba para extirpar el ganglio linfático. Haga el mismo procedimiento en el otro lado.
- Agarre el recto con los fórceps rectos y corte. Tire del recto para desentrañar todo el colon y el intestino delgado, buscando lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos mesentéricos. Cuando se extraiga todo el íleon, continúe tirando del duodeno para exponer el estómago. Cortar el esófago para extraer completamente el estómago y desechar. Si se observan lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos, diseccione cuidadosamente del intestino y guárdela en un plato de 10 cm de PBS.
- Exponer y extirpar el estómago tirará del bazo del lado dorsal del abdomen (Figura1A). Retire el bazo y colóquelo en un 4% de PFA. El bazo sirve como un control de tinción para la hemotoxina, ya que es altamente celular.
NOTA: Los tejidos viscerales que no se utilizarán para la generación de organoides se fijarán durante la noche en 4% de PFA, se lavarán con PBS y luego se colocarán en un 70 % de etanol. - Retire el hígado en la parte superior del abdomen (Figura1A). Basado en la carga metastásica en el hígado, los lóbulos individuales se pueden diseccionar, o todo el hígado se puede eliminar cortando cuidadosamente a lo largo del diafragma. (No corte el diafragma en este momento). Coloque el hígado en un plato de 10 cm de PBS.
- Extracción del hígado expondrá completamente los riñones a ambos lados de la columna vertebral (Figura1A). Extrae los riñones, junto con los ganglios linfáticos renales, si los ganglios tienen lesiones metastásicas, colocando los fórceps rectos debajo del riñón y tirando hacia arriba. Haga el mismo procedimiento para el otro lado.
- Para exponer la cavidad torácica, corte cuidadosamente el diafragma a lo largo de la caja torácica. Perforar el diafragma liberará la presión negativa en la cavidad torácica y expondrá el corazón y los pulmones (Figura1A).
- Sujete el esternón y tire hacia arriba para abrir aún más la cavidad torácica. Observe la cara ventral de la cavidad torácica a lo largo de la caja torácica para las lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos torácicos y diseccione, si está presente.
- Mientras mantiene el esternón, corte la caja torácica ventral para acceder al corazón y a los pulmones. Sujeta el corazón, tira hacia arriba y corta debajo de los pulmones. Para eliminar completamente el corazón y los pulmones en bloque, corte todos los vasos sanguíneos anteriores y la tráquea. Coloque el tejido en PBS y retire cuidadosamente el corazón sin dañar el tejido pulmonar o las lesiones metastásicas pulmonares.
- Tome los fórceps rectos no estériles y las tijeras diselantes y corte la pata trasera en la cabeza del fémur. Sujete cuidadosamente el fémur y retire la pata trasera del pelaje.
- Coloque la pata trasera sobre una toalla de papel y agarre la pata trasera. Utilice la cuchilla de afeitar de un solo filo para desechar /cortar todo el músculo y el tejido conectivo de la tibia y el fémur. Retire el fémur de la tibia cortando posteriormente a la rótula y retire la tibia quitando la pata trasera. Coloque la tibia y el fémur en un 10% de NBF. Haga el mismo procedimiento en el otro lado.
NOTA: Para examinar los huesos largos del ratón en busca de lesiones metastásicas, el peroné no necesita estar intacto. Los huesos largos se fijarán en 10% NBF durante una semana, luego se descalcificarán utilizando la solución edástina neutra20. Después de tres semanas, los huesos serán transferidos al 70% de etanol. - Después de extraer las extremidades posteriores, tome un corte de oído o cola para el genotipado futuro. Deseche la carcasa del ratón y todo el tejido que no se fije ni se utilice para la generación de organoides.
- Disección del tumor de próstata
NOTA: La disección de los lóbulos de la próstata del ratón sólo se puede lograr con un microscopio de disección19. Sin embargo, la carga del tumor de próstata puede ser tan alta que los lóbulos individuales no se pueden distinguir, y la disección se puede llevar a cabo sin un microscopio. Sin embargo, el protocolo completo para la disección de los lóbulos de próstata individuales se describe a continuación.- Coloque la región urogenital en un plato de 10 cm de PBS bajo un microscopio de disección y oriente el lado ventral hacia arriba con la vejiga y las vesículas seminales mirando hacia fuera del investigador. Toda manipulación de la región urogenital debe hacerse utilizando instrumentos estériles.
- Evaluar el fenotipo general del tumor de próstata- muy probablemente, ya sea un tumor lleno de líquido o sólido se observará en Los GEM PCa (Figura2A, B).
NOTA: Los tumores llenos de líquido a menudo se encuentran en la región de la próstata anterior (Figura2A). Los tumores llenos de líquido se componen principalmente de tejido conectivo con componentes epiteliales escasos, por lo que estos tumores no son óptimos para la generación de organoides debido al bajo número de células epiteliales tumorales, como se discutirá en los resultados representativos Sección. - Si hay tumores llenos de líquido, haz un pequeño agujero en el tumor. Coloque la región urogenital en un nuevo plato de 10 cm de PBS.
- Tome un par de fórceps rectos en la mano no dominante y fórceps curvos en la mano dominante. Voltee la región urogenital a su cara dorsal. Busque la región prostática proximal (Figura1B), que puede ser identificada por el color rosa/rojo de la uretra. Sujete la uretra y sosténgalo firmemente para manipular el tejido urogenital con los fórceps curvos.
NOTA: Durante la disección de próstata, siempre tome nota de la ubicación de la vejiga, ya que esta es la forma más sencilla de localizar los lóbulos de la próstata individuales (Figura1B).
- Extirpación del tejido no prostático de la región urogenital
- Mientras esté en la cara dorsal de la región urogenital, encuentre la base de la vesícula seminal. Retire con cuidado la vesícula semina y deseche. Realice el mismo procedimiento en el lado opuesto.
NOTA: Evite puncturizar la vesícula seminal, ya que liberará líquido secretor pegajoso y opaco que interfiere con la disección de próstata. Si la vesícula seminal está perforada, transfiera la región urogenital restante a un plato nuevo de 10 cm con PBS fresco. - Retire y deseche el vasa deferente y tanto tejido graso y conectivo como sea posible utilizando el lado curvo de los fórceps.
- Mientras mantiene firmemente la región de la uretra/prostataria proximal, utilice un par de tijeras finas y puntiagudas para extraer la vejiga de la uretra.
- Mientras esté en la cara dorsal de la región urogenital, encuentre la base de la vesícula seminal. Retire con cuidado la vesícula semina y deseche. Realice el mismo procedimiento en el lado opuesto.
- Aislamiento de los lóbulos de próstata individuales
- Localice la próstata anterior (Figura1B). Asegúrese de mantener firmemente la región de la próstata proximal/uretra con los fórceps rectos. Retire la región prostática anterior agarrando directamente el tejido con el lado curvo de los fórceps y tirando firmemente de la vejiga y el resto de la próstata. Coloque el tejido en PBS.
NOTA: Para todas las regiones prostáticas, es posible que se requieran tijeras disefantes para extraer el tejido, dependiendo del tamaño del tumor. - Localice la región de la próstata ventral (Figura1B). Retire la región de la próstata ventral de la misma manera que en el paso 1.5.7.
- En este punto de la disección, sólo las regiones de próstata lateral y dorsal deben estar presentes, mientras que la región de la próstata proximal todavía está siendo agarrada por los fórceps rectos. Evaluar las regiones de próstata lateral y dorsal (Figura1B). Si la región lateral se puede distinguir de la región dorsal, retire la región de próstata lateral como se describe en el paso 1.5.7. Realice el mismo procedimiento en el lado opuesto.
- Retire la región de la próstata dorsal como se describe en el paso 1.5.7. Colocar la región prostática proximal en 4% PFA, ya que su estructura dentro del tejido muscular de la uretra hace que no sea adecuado para la generación de organoides.
- Localice la próstata anterior (Figura1B). Asegúrese de mantener firmemente la región de la próstata proximal/uretra con los fórceps rectos. Retire la región prostática anterior agarrando directamente el tejido con el lado curvo de los fórceps y tirando firmemente de la vejiga y el resto de la próstata. Coloque el tejido en PBS.
2. Generación de organoides 3D a partir del tejido tumoral de próstata
NOTA: La Figura 3 muestra una descripción pictórica del procedimiento para la generación de organoides tumorales.
- Preparación
- Preparar medios organoides de próstata de ratón según Drost et al.18 con las siguientes alteraciones. Utilice un medio acondicionado en lugar de proteínas recombinantes para Noggin y R-Spondin y utilice una concentración final del 1% (v/v), en lugar del 10%, tanto para el medio acondicionado por Noggin como para el medio acondicionado por R-Spondin.
NOTA: Las células HEK293, transfectó fácilmente con un medio con condición DE Noggin-Fc o Rspo1-Fc con ratón HA, respectivamente. Estas líneas celulares fueron un regalo del Laboratorio Calvin Kuo de la Universidad de Stanford. - Preparar la solución de digestión en un tubo de 15 ml diluyendo 20 mg/ml de colagenasa II con medios avanzados DMEM/F12(+++) a una concentración final de 5 mg/ml. Añadir El inhibidor de roca Y-27632 a la solución de colagenasa II a una concentración final de 10 m.
NOTA: La relación entre el tampón de digestión y el tejido es de 1 ml a 50 mg, que utilizamos según Drost et al.18.
- Preparar medios organoides de próstata de ratón según Drost et al.18 con las siguientes alteraciones. Utilice un medio acondicionado en lugar de proteínas recombinantes para Noggin y R-Spondin y utilice una concentración final del 1% (v/v), en lugar del 10%, tanto para el medio acondicionado por Noggin como para el medio acondicionado por R-Spondin.
- Picar y digestión del tejido tumoral
- En la capucha del cultivo celular, coloque el tejido tumoral de próstata en un plato de cultivo estéril de 10 cm, diseccione y deseche el tejido necrótico.
- Mice el tejido tumoral de próstata restante en 1 mm3 cubos sosteniendo las piezas de tejido con los fórceps curvos estériles y cortando con tijeras de disección.
- Coloque las piezas tumorales picadas en el tubo de 15 ml con el tampón de digestión recogiéndolas con el lado curvo de los fórceps. Digerir el tejido tumoral a 37 oC con temblordurante de 1,5 a 2 h. Compruebe el progreso de la digestión cada 20 minutos.
NOTA: En este momento, sacar al menos 2 ml de matriz de -20 oC de almacenamiento y descongelar sobre hielo. 1 mL alícuotas de matriz tomará aproximadamente 3 h para descongelar. - Después de la digestión del tejido, tubo centrífugo a 175 x g durante 5 min a 4 oC para formar un pellet celular.
- Retire el sobrenadante, deslice el tubo para aflojar el pellet celular y resuspenda el pellet celular en 1 ml de trippsina precalentada suplementada con 10 M De y-27632 Inhibidor de roca. Poner el tubo en un baño de agua de 37 oC durante 5 minutos.
- Después de la incubación, pipeta hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una punta P1000 estándar. Vuelva a bañar el tubo a 37 oC durante otros 5 minutos y repita el paso 2.2.6.
NOTA: En este momento en el procedimiento, calentar un plato de cultivo de células estéril de 6 pozos poniéndolo en una incubadora de 55 oC.
- Contar células y resuspensión en matriz
- Lavar las células añadiendo 9 ml de AdDMEM/F12(+++) frío y centrifugar el tubo a 175 x g durante 5 min a 4 oC.
- Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, deslice el tubo para aflojar el pellet y lave las células de nuevo añadiendo 10 ml de AdDMEM/F12 frío (+++). Centrifugar el tubo a 175 x g durante 5 min a 4oC.
- Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, deslice el tubo para aflojar el pellet, resuspenda las células en 1 ml de AdDMEM/F12(+++), y cuente el número de células usando un hemocitómetro de acuerdo con el procedimiento estándar.
- Siete a ocho cúpulas caben en un pozo de un plato de 6 pozos cuando los organoides están chapados en matriz a través de una manera de gota. Aproximadamente 200 l de matriz producirán 7-8 cúpulas. Decida cuántos pozos de organoides se necesitan para propósitos experimentales futuros y calcule el volumen de matriz requerido. A continuación, calcule el volumen de solución que contiene celdas necesario para tener una concentración final de 1,0 x 106 celdas/ml de matriz.
- Después de contar las células, centrífuga a 175 x g durante 5 min a 4 oC. Retire el sobrenadante, deslice el tubo para aflojar el pellet y vuelva a suspender las células en volumen de matriz calculado en el paso 2.3.4.
NOTA: La matriz permanece en forma líquida sólo a 4 oC; mantener los tubos de matriz y las soluciones de células de matriz en el hielo en todo momento.
- Cúpulas de matriz de chapado y aplicación de medios
- Mezcle la solución de células de matriz con un pipeta P200 para distribuir uniformemente las células sin introducir burbujas. Retire el plato de cultivo de 6 pozos de la incubadora de 55 oC.
- Pipetear cuidadosamente 200 l de solución de célula solución de matriz y soltar rápidamente la solución en un pozo para crear cúpulas.
- Repita el paso 2.4.2. hasta que se gaste el volumen de la solución de células de matriz. Deje que las cúpulas se solidifiquen a temperatura ambiente durante 2 min.
- Voltee el plato de 6 pozos al revés y coloque el plato en una incubadora de 37 oC para continuar la solidificación durante 20 minutos.
- Después de la incubación, añadir 2 ml de medios organoides de próstata de ratón a cada poca. Añadir andrógeno sintético R1881 a cada pocal para una concentración final de 1 nM e Inhibidor de roca Y-27632 a una concentración final de 10 m. Mezcle cuidadosamente y coloque la placa en una incubadora de 37 oC para el cultivo.
NOTA: Los medios de cultivo organoides deben complementarse con un inhibidor de roca Y-27632 de 10 M durante solo 1 semana después de la generación de organoides.
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Representative Results
Las imágenes representativas de la necropsia de un ratón con un gran tumor de próstata primario lleno de líquido en la región anterior de la próstata se muestran en la Figura 2A. Por el contrario, la Figura 2B,muestra imágenes representativas de la necropsia de un ratón con un tumor de próstata primario sólido grande para el que las regiones de próstata individuales son indistinguibles. Las imágenes de disección fluorescente muestran el mismo tumor de próstata sólido de la Figura 2B que expresa la GFP, lo que indica que las células tumorales expresan Cre (Figura2C). Tejido que no expresa probasin, como la vejiga, expresa tomate y por lo tanto no expresa Cre (Figura2C). El hígado y los pulmones del ratón de la Figura 2B tienen tumores metastásicos que expresan la PFP, mostrando que se originaron en el tumor primario de próstata, y están rodeados por tejido normal que expresa tomate (Figura2C ). Finalmente, el ganglio linfático pélvico de este ratón expresa GFP y no Tomate, lo que indica que este tumor metastásico ha superado a este órgano y no queda tejido normal (Figura2C).
Mostramos imágenes en la Figura 4 de organoides que hemos generado a partir de un tumor sólido de próstata. En el día 1, se están formando pequeños organoides, como se ve en las imágenes de contraste de fase representativa. Las imágenes fluorescentes del Día 1 muestran que las células que expresan tomate y GFP están presentes en el cultivo organoide tumoral (flechas). Sin embargo, para el día 7, cuando los organoides tumorales de próstata se han formado completamente, estos organoides están expresando GFP y no tomate. Estos datos sugieren que estos organoides se han originado a partir de células tumorales que expresaban Cre y no de células epiteliales normales. Estos organoides tumorales siguen siendo sólo GFP positivos a medida que expandimos nuestra cultura al paso 1 y 2.
En la Figura5, mostramos imágenes de organoides que hemos generado a partir de un tumor de próstata lleno de líquido. En el día 1, se están formando pequeños organoides, y las imágenes fluorescentes muestran que las células que expresan tomate y GFP están presentes en el cultivo organoide, similar a nuestra observación en el día 1 para los organoides generados a partir de un tumor sólido de próstata (Figura4). Sin embargo, los organoides de un tumor de próstata lleno de líquido expresan GFP o tomate en el día 7, lo que indica que los organoides se han formado a partir de células que no expresan Cre. Este patrón continúa en el pasaje 1 y el pasaje 2, donde el cultivo tiene organoides que expresan tomate y PFG. El análisis posterior de estos organoides es severamente limitado porque la línea es una mezcla de organoides epiteliales normales y organoides tumorales. Creemos que los tumores de próstata llenos de líquido son subóptimos en la generación de organoides tumorales simplemente porque hay un mayor porcentaje de células epiteliales de próstata normales. Dado que tanto las células epiteliales normales de próstata como las células cancerosas de próstata forman organoides, las líneas generadas a partir de tumores de próstata llenos de líquido son una mezcla de organoides normales y cancerosos. Obtenemos líneas organoides tumorales puras de tumores prostáticos llenos de líquido por clasificación de flujo para células positivas de GFP y generando organoides a partir de esa población de células. Los tumores de próstata sólidos se componen principalmente de células tumorales, por lo tanto, los organoides generados a partir de estos tumores son una población más pura de organoides oncológicos sin clasificación previa para la PFP.
Figura 1 : Nuestra orden de disección recomendada para el cáncer de próstata (PCa) modelos de ratón genéticamente diseñados (GEM) y anatomía de la próstata del ratón. (A) El orden que recomendamos en nuestro protocolo para disección de los órganos principales de un PCa GEMM. 1. Región urogenital. 2. Ganglios linfáticos pélvicos. 3. Bazo. 4. Hígado. 5. Riñón. 6. Pulmones. 7. Tibia y Fémur. (B) Mapa de la región urogenital del ratón y la anatomía de la próstata. Imágenes de disección fluorescentes de un ratón de 12 semanas que expresa probasin-Cre y el transgén de reportero mT/mG Cre. Vejiga (BL), vesículas seminales (SV), próstata anterior (AP), próstata ventral (VP), próstata lateral (LP), próstata dorsal (DP) y próstata proximal (PP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes representativas de disección de modelos de ratón de ingeniería genética (GEM) de cáncer de próstata (PCa). (A) La cavidad abdominal antes de la extirpación de la región urogenital y la región urogenital con un tumor de próstata lleno de líquido. (B) La cavidad abdominal antes de la extirpación de la región urogenital y la región urogenital con un tumor de próstata sólido. (C) Imágenes fluorescentes representativas de tomate y GFP de un tumor de próstata sólido, hígado, pulmón y ganglio linfático pélvico de un PCa GEMM que desarrolla lesiones metastásicas. Barra de escala: 5 mm. Vejiga (BL), próstata anterior (AP) y próstata dorsal (DP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Diagrama de flujo del protocolo para generar organoides tumorales de próstata. Después de disepartir el tumor de próstata, pique el tejido en trozos de 1 mm. Digerir las piezas tumorales en colagenasa, recoger las células y digerir en trippsina para obtener una suspensión de una sola célula. Después de contar las celdas, resuspende en el volumen de la matriz necesaria para una concentración de celda s/célula de 1,0 x 106 celdas/ml. Plato de cúpulas en plato usando un método de gota. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Imágenes representativas de la generación de organoides tumorales de próstata de ratón a partir de un tumor de próstata sólido. Contraste de fase representativo, imágenes fluorescentes de tomate y GFP del día 1, día 7, paso 1 y pasaje 2 de organoides generados a partir de un tumor sólido de próstata de ratón. La barra de escala es de 100 m. Las flechas indican celdas individuales en imágenes fluorescentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Imágenes representativas de la generación de organoides tumorales de próstata de ratón a partir de un tumor lleno de líquido. Contraste de fase representativo, imágenes fluorescentes de tomate y GFP del día 1, día 7, paso 1 y pasaje 2 de organoides generados a partir de un tumor de próstata de ratón lleno de líquido. La barra de escala es de 100 m. Las flechas indican celdas individuales en imágenes fluorescentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo para la disección tumoral de próstata y la generación de organoides
La extirpación del tejido no prostático y la disección fina del tumor prostático del ratón es crucial para la generación óptima de organoides cancerosos, ya que tanto las células epiteliales no prostáticas como las células epiteliales normales de próstata generarán organoides. Para los tumores de próstata sólidos específicamente, es crucial aislar áreas de tumor viable para eliminar la contaminación con tejido necrótico que reduciría el número de células viables. Durante la generación de organoides, la digestión tisular con colagenasa debe ser monitoreada diligentemente, ya que la exposición prolongada a la colagenasa limitará la viabilidad celular. Con organoides derivados de LOS GEM de cáncer, es crucial genotipo completo cada línea para asegurarse de que todos los transgenes y alelos modificados que fueron diseñados en el ratón están presentes en los organoides. La repetición del genotipado después de un transeúnte prolongado también es necesaria para garantizar que se mantengan las modificaciones genéticas.
Modificaciones y solución de problemas de disección de tumores de próstata y generación de organoides
Hemos observado variabilidad de ratón a ratón en las características del tumor de próstata, incluso entre animales con el mismo genotipo. Por lo tanto, pueden ser necesarias modificaciones específicas en el protocolo de disección de próstata descrito aquí para cada ratón. Además, la adaptabilidad es necesaria al diseccionar tumores metastásicos, ya que es difícil predecir la gravedad de estas lesiones antes de iniciar la disección.
En algunas ocasiones, hemos observado un exceso de contaminación de nuestro pellet celular con lo que parece ser tejido conectivo, incluso después de la digestión con colagenasa y trippsina. Cuando esto ocurre, resuspendemos el pellet en al menos 2 ml de AdDMEM F12(++)) y usamos un colador celular de 40 m para extraer el tejido conectivo. Dado que existe una variabilidad de lote a lote en la tasa de solidificación de la matriz, puede ser necesario aumentar o disminuir el tiempo de solidificación de la cúpula antes de la aplicación de los medios organoides.
Limitaciones en el uso de GEM
Si bien los GEM son el método más riguroso para los estudios preclínicos sobre el cáncer, este enfoque requiere tiempo, gastos y capacitación significativos. Además, la variabilidad de ratón a ratón puede, como en el estudio de los seres humanos, complicar la interpretación de los datos.
Limitaciones en el uso del cultivo celular 3D
En comparación con el cultivo celular 2D, la generación y el mantenimiento de líneas organoides requieren un mayor tiempo y costo. Por ejemplo, nuestras líneas organoides tumorales se pasan cada 2-3 semanas, mientras que las líneas celulares se pueden pasar cada 2-3 días. Esta tasa de crecimiento más lenta de los organoides aumenta el tiempo necesario para completar los experimentos considerablemente. Los medios de cultivo organoides contienen varios factores de crecimiento y reactivos especializados, que pueden ser costosos dependiendo de la fuente, por lo que generar y mantener organoides es más caro que las líneas celulares 2D tradicionales. Por último, nuestro laboratorio y otros han observado diferencias de lote a lote en la matriz y otros reactivos - creando un desafío para mantener la consistencia en el crecimiento organoide para experimentos a largo plazo.
Importancia en el uso del cultivo celular 3D con respecto a los métodos existentes/alternativos
La investigación preclínica del cáncer ha estado dominada por el cultivo celular 2D y los modelos de xenoinjerto derivados de la línea celular. El crecimiento celular en 2D requiere transformación/inmortalización, por lo que tanto los estudios in vitro como los estudios de xenoinjerto sin cultivos 2D normalmente no tienen líneas celulares normales inalteradas que sirvan como controles no cancerosos. La última década de investigación en el cultivo organoide 3D de tejidos derivados epiteliales normales ahora ha permitido el crecimiento de tejidos epiteliales no cancerosos que se pueden utilizar para comparar con organoides análogos derivados del tejido canceroso. Los organoides del cáncer también se pueden utilizar para establecer xenoinjertos para comprender mejor el desarrollo tumoral. Además, los organoides no cancerosos se pueden utilizar para generar xenoinjertos de control, lo que no era posible antes de que se desarrollaran métodos de cultivo de células 3D16.
Importancia en el uso del cultivo celular 3D en la investigación del cáncer de próstata
En estudios recientes, organoides se han utilizado para recapitular las características del tumor de próstata GEMM. Dardenne et al. muestran que los organoides generados con tumores de próstata de GEMMs que al mismo tiempo carecen del supresor tumoral Pten y sobreexpresan el oncogene de MYCN tenían un mayor potencial de crecimiento que los organoides generados con próstatas controlar los GEMM. Además, tanto la secuenciación como la inmunohistoquímica mostraron que los organoides tumorales recapitularon los perfiles de expresión de tumores de próstata tanto carentes de Pten como sobreexpresando MYCN21. Blattner et al. muestran que la sobreexpresión simultánea de próstata de un mutante oncogénico de Speckle Type BTB/POZ Protein (SPOP) y la eliminación de Pten aumenta la tasa de tumorigenesis en GEMMs. Cuando se generaron organoides prostáticos para sobreexpresar spop mutante, su proliferación aumentó en comparación con el control de organoides de próstata y la expresión del marcador de linaje recapitulado tumores de próstata originales22. Juntos, estos estudios demuestran que los organoides son un modelo óptimo para el estudio posterior de las características del tumor de próstata en GEMMS.
El cultivo organoide también se ha utilizado como una herramienta para evaluar subpoblaciones individuales de células tumorales de próstata. Utilizando tumores GEMM que carecen de Pten y los supresores de tumores Pten y Trp53 en células epiteliales de próstata, Agarwal et al. caracterizaron aún más sus fenotipos específicos23. Por lo que el uso de cultivo celular 3D, es posible caracterizar subpoblaciones de células tumorales que pueden ser limitadas en abundancia dentro de los propios tumores de próstata.
Como se describió anteriormente, las técnicas de cultivo celular 3D permiten el crecimiento de células epiteliales normales. De este lado, los organoides prostáticos generados a partir de GEMMs que carecen de un conductor Cre proporcionan un modelo único para el monitoreo en tiempo real de la tumorigenesis por inducción de Cre recombinase in vitro. De hecho, Dardenne y otros evaluaron cómo la sobreexpresión de NMYC afecta el potencial de crecimiento en el contexto de la pérdida de Pten a lo largo del tiempo expresando ectopéticamente ERT2-Cre y tratando con tamoxifeno21. Además, el efecto de la sobreexpresión de NMYC en el receptor de andrógenos (AR), el principal objetivo del tratamiento para el cáncer de próstata, se evaluó después de la inducción de Cre recombinase en organoides generados a partir de GEMMs21. El mismo sistema Cre inducible fue utilizado por Blattner et al. en organoides de próstata para medir cómo la sobreexpresión de SPOP mutante afecta la proliferación celular del cáncer de próstata y la expresión de AR22. En particular, los experimentos que inducen la expresión de Cre in vitro tienen un control incorporado de no cáncer con organoides tratados con vehículos.
Limitaciones específicas en el uso del cultivo celular 3D en la investigación del cáncer de próstata
Mientras que el crecimiento organoide de células epiteliales normales es una ventaja del uso de técnicas de cultivo celular 3D, capacidad para crecer organoides normales también ha presentado un desafío en los estudios de investigación del cáncer de próstata. Como se muestra en nuestra sección de resultados representativos, hemos observado el crecimiento de los organoides normales de próstata en líneas generadas a partir de tumores de próstata que son menos agresivos (Figura5). Una forma de abordar este fenómeno es generar organoides a partir de GEMMs que expresen un transgén reportero Cre, como mT/mG. La microscopía fluorescente se puede utilizar para evaluar la relación relativa de los organoides normales a tumorales observando la expresión de tomate y GFP. Además, la expresión gFP se puede utilizar para fluir células organoides de ordenación para generar líneas organoides tumorales de próstata puras. Agarwal et al. muestran un método de clasificación para la separación de células epiteliales normales y células cancerosas de tumores de próstata GEMM sin un reportero de Cre. Muestran que las células moleculares de adhesión de células epteilitales (EpCAM) positivas de los tumores de próstata no se separaron en subpoblaciones cuando se clasificaron utilizando marcadores de superficie celular CD24 o Sca-123 — por lo tanto, estos marcadores podrían emplearse para excluir los marcadores normales células epiteliales de próstata de tumores de próstata GEMM antes de la generación de organoides. Nuestro laboratorio y otros han observado que las condiciones bajo las cuales las células del cáncer de próstata forman organoides parecen seleccionar o promover programas específicos de expresión génica de linaje característicos de las células epiteliales basales de próstata. Este es un desafío significativo porque los tumores de próstata tanto en ratones como en humanos son principalmente de naturaleza luminal, expresando AR, CK8 y otros marcadores luminales, y rara vez expresan marcadores de linaje basal como p63 o CK5. Si bien este fenómeno aún no se ha publicado en detalle, el análisis de inmunohistoquímica muestra que la AR se reduce en los organoides Ptenf/+ en comparación con ptenf/+ prostáticos21. El crecimiento de las células epiteliales basales en los organoides del cáncer de próstata pone en tela de juicio si estas líneas son realmente un modelo preclínico preciso del cáncer de próstata.
Mientras que los organoides del cáncer de próstata se han documentado para modelar el tumor del cual se derivan mejor que el cultivo 2D tradicional, existe la posibilidad de que los organoides se sometan a cambios genéticos en la cultura, especialmente después de varios pasajes. Actualmente, no tenemos conocimiento de ningún estudio publicado que haya documentado mutaciones genéticas espontáneas, ganancias o pérdidas genéticas, o cambios epigenéticos que son comunes después del paso prolongado de los organoides del cáncer de próstata. Para limitar la variabilidad como resultado, los cambios genéticos o epigenéticos que pueden ocurrir debido al transeo prolongado, se deben realizar experimentos en organoides tempranos a partir de pasajes tempranos (<10) tan a menudo como sea posible.
Aplicaciones futuras del cultivo celular 3D
Si bien es imposible predecir todas las aplicaciones futuras que se desarrollarán utilizando el cultivo celular 3D en la investigación del cáncer, hay varias vías que parecen tener el mayor potencial. Al igual que con las líneas celulares 2D, llevar a cabo la modificación genética in vitro es relativamente sencillo en los organoides. Modificar genes específicos en organoides normales o cancerosos abre muchas posibilidades en el estudio de los mecanismos que rigen la tumorigenesis, la progresión del cáncer y el tratamiento, especialmente cuando se utilizan organoides modificados genéticamente para generar organoides xenoinjertos. La modificación genética de los organoides es muy ventajosa cuando los GEMM no existen para un gen específico o el establecimiento de un nuevo GEMM está fuera del alcance de un estudio en particular.
Cultivo organoide oncológico también tiene muchas aplicaciones potenciales para la investigación clínica. Se podría utilizar una biblioteca de subtipos tumorales relevantes dentro de cada sistema de órganos tanto de pacientes como de modelos animales para evaluar rápidamente la eficacia de un nuevo fármaco o una nueva combinación de fármacos existentes. A medida que el cultivo celular 3D se generale y aumenta en eficiencia, la generación de organoides derivados del paciente con el propósito de la medicina personalizada tiene el potencial de ayudar a adaptar el tratamiento para cada paciente de cáncer mediante la prueba de todos los medicamentos disponibles y combinaciones de medicamentos que utilizan su línea de organoides individual16.
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Disclosures
Los autores no tienen relaciones financieras que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer al Laboratorio Calvin Kuo de la Universidad de Stanford por proporcionar células HEK293 establemente infectadas con Noggin-Fc o Rspo1-Fc de ratón HA. También nos gustaría dar las gracias al Dr. Dean Tang por permitirnos acceder al microscopio de disección fluorescente en su laboratorio. Este trabajo fue apoyado por CA179907 a D.W.G. del Instituto Nacional del Cáncer. Los recursos compartidos en Roswell Park Comprehensive Cancer Center fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Apoyo al Centro de Cáncer de Salud CA016056.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
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