Summary
Мы показываем метод для некропсии и вскрытия моделей рака простаты мыши, фокусируя на рассечении опухоли простаты. Также представлен пошаговой протокол для генерации органов опухоли предстательной железы мыши.
Abstract
Методы, основанные на гомологионной рекомбинации для изменения генов, значительно способствовали биологическим исследованиям. Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются строгим методом для изучения развития млекопитающих и болезней. Наша лаборатория разработала несколько GEMMs рака предстательной железы (PCa), которые не имеют выражения одного или нескольких генов супрессора опухоли с помощью сайта конкретных Cre-loxP рекомбиназы системы и простаты конкретных промоутер. В этой статье мы описываем наш метод некропсии этих PCa GEMMs, в первую очередь упором на вскрытие опухолей простаты мыши. Новые методы, разработанные за последнее десятилетие, облегчили культуру клеток, полученных из эпителии, для моделирования систем органов в пробирке в трех измерениях. Мы также подробно 3D-метод культуры клеток для генерации опухолевых органоидов из мыши PCa GEMMs. Доклинические исследования рака были доминируют 2D-клеточной культуры и клеточной линии полученных или пациента полученных ксенотрансплантата моделей. Эти методы не хватает микроокружения опухоли, ограничение использования этих методов в доклинических исследованиях. ГЕМмы более физиологически значимы для понимания опухолевого и рака прогрессии. Опухолевая органоидная культура представляет собой систему модели in vitro, которая резюмирует архитектуру опухоли и характеристики клеточной линии. Кроме того, методы 3D-культуры клеток позволяют расти нормальных клеток для сравнения с культурами опухолевых клеток, редко возможно, используя методы 2D-клеточной культуры. В сочетании, использование GEMMs и 3D-клеточной культуры в доклинических исследованиях имеет потенциал для улучшения нашего понимания биологии рака.
Introduction
С конца 1980-х годов способность изменять гены с помощью гомологичных рекомбинаций значительно продвинула изучение биологических систем1. Индуцированные, ткани- или клеточные промоторные системы и конкретные рекомбиназы, такие как Cre-loxP, продвинули генетические исследования, облегчая контроль над генетическими модификациями как в и временно, так и пространственно2,3, 4. Сочетание этих генетических стратегий создало широкийспектр экспериментальных модельных систем 5,6,7.
Генетически модифицированные модели мыши (GEMMs) являются неотъемлемым инструментом для оценки того, как отдельные гены или группы генов влияют на развитие млекопитающих и болезни. В доклинических исследований рака, GEMMs являются наиболее физиологически релевантных и строгий метод для изучения развития рака, прогрессирование, и лечение8. Наша лаборатория специализируется на генерации и характеристике гЕММ рака.
Наиболее диагностируется некочее рак среди мужчин в Соединенных Штатах является рак простаты (PCa). Большинство пациентов с PCa имеют низкий риск заболевания и высокую вероятность выживания, но выживаемость резко снижается, когда болезнь диагностируется на поздних стадиях или если целевая гормональная терапия вызывает прогрессирование к агрессивной, неизлечимой PCa подтипы9,10. Наша лаборатория разработала GEMMs, которые используют флоксированные аллели одного или нескольких генов супрессоров опухолей. Рекомбинация и потеря экспрессии гена супрессора опухоли происходит именно в предстательной железе, потому что мы ввели трансген с рекомбиназой Cre вниз по течению пробосин промотор активирован только в эпителиальных клетках простаты11, 12. Мы также разводили наши GEMMs содержать Cre репортер трансген называется mT/mG, который вызывает томатфлуалистое выражение белка в клетках, не хватает Cre и зеленый флуоресцентный белок (GFP) выражение в клетках с Cre13. В то время как презентация этого метода и наши репрезентативные результаты показывают, что GEMMs, которые мы изучаем в нашей лаборатории, этот протокол может быть использован для генерации органов рака простаты из любой модели мыши. Однако, как подробно обсуждается в нашем разделе репрезентативных результатов, мы заметили, что определенные характеристики опухоли являются оптимальными для генерации органов орака простаты.
В последнее десятилетие, новые методы культивирования клеток из тканей эпителиального происхождения привело к значительным достижениям в нашей способности моделировать системы органов в пробирке14,15. Термин "культура 3D клеток" был отнесен к методам, участвующим в создании и поддержании органоидов, которые могут быть определены как структуры, состоящие из клеток, которые собирают вторичную архитектуру, движимую органно-специфической линией клеток характеристики16. Эти новые методы отличаются от классической 2D-клеточной культуры в том, что клетки не требуют трансформации или увековечения для долгосрочного роста; таким образом, 3D культуры нормальных клеток можно сравнить с больными клетками. Это особенно ценно в исследованиях рака, где нормальные культуры контроля клеток, как правило, не были доступны. Кроме того, органоиды спонтанно образуют вторичные архитектуры тканей с соответствующим дифференцированным типом клеток, что делает их лучшей модельной системой для понимания рака в пробирке, чем 2D-клеточные линии17. Наша лаборатория создала 3D органоидные линии из опухолевого вопроса, изолированных от наших PCa GEMM, чтобы дополнить наши данные in vivo и проводить эксперименты, которые не были бы осуществимы в GEMMs.
В этой статье мы представляем письменные и визуальные протоколы для полной некропсии PCa GEMMs, включая вскрытие различных долей простаты мыши и метастатических поражений. Мы описываем и показываем пошаговой метод генерации органоидов из опухолей простаты мыши на основе протокола, ранее опубликованного Drost et al. для получения органоидов из нормальной эпителиальной ткани простаты мыши18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры для животных, описанные здесь, были выполнены с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Департаменте лабораторных ресурсов животных, Розуэлл Парк Всеобъемлющий онкологический центр, Буффало, Нью-йорк.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей,которые должны быть вскрыты, чтобы изолировать простаты или опухоли простаты для поколения органоидов должны иметь по крайней мере достигли возраста половой зрелости - около 8-10 недель возраста. Конкретные возрасты мышей могут варьироваться среди исследований. Некоторые факторы, чтобы рассмотреть при выборе возраста включают возрастные изменения в популяциях клеток простаты, возрастно-зависимых выражение конкретных промоутер-управляемых Cre трансгенов, и скорость прогрессирования опухоли простаты в частности GEMM.
1. Рассечение и визуализация мыши простатыОпухоль и метастатические опухоли
- Препараты
- Получить необходимые стерильные инструменты вскрытия. Область рассечения сцены на чистой стерильной поверхности с 15-сантиметровой линейкой, точным балансом, аналитическим балансом, баллончиком с 70% этанолом, фосфо-буферным сольней (PBS) и бумажными полотенцами.
-
Подготовка фиксаторных растворов для висцеральных органов и костей, которые не будут использоваться для генерации органоидов
- Для висцеральных органов: Подготовка 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Для одной мыши, сделать 20 мл 4% PFA, aliquot в двух 15 мл конических труб и держать при комнатной температуре до использования.
- Для длинных костей: Aliquot 10 мл предварительно сделанного 10% нейтрального буферизированного формалина (NBF) в одной конической трубке 15 мл и держать при комнатной температуре до использования.
- Получить необработанные 10 см посуды и заполнить с нестерильной PBS - они будут служить в качестве временных контейнеров для органов во время тонкого вскрытия с помощью рассечения микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные инструменты используются для вскрытия тканей для генерации органоидов. Нестерильные инструменты используются для первоначального разреза и вскрытия задних конечностей.
- Эвтаназия и первоначальный разрез
- Эвтанизировать мышь co2 удушья с помощью 2,0 л / мин скорость потока в течение 5 мин. Удалить мышь из клетки и выполнить вывих шейки матки. Используйте точный баланс для измерения массы тела мыши и записи.
- Поместите мышь на верхней части бумажного полотенца и сориентироваться на вскрытии поверхности брюшной стороны вверх с головой мыши лицом от следователя. Прикрепите мышь к доске, протянув ее конечности и пронзив каждую из передних лап и задних лап одной одноразовой иглой.
- Используя баллончик, облить мех мыши 70% этанола. Использование нестерильных вскрытия ножницы и прямые щипцы, щепотку чуть выше пениса мыши и сделать небольшой разрез только через мех.
- Продолжить разрез средней линии до шеи мыши через мех только. Делайте двусторонние разрезы с точки первоначального разреза через вентральную плоскость мыши только через мех.
- Возьмите мех и осторожно вытащите его от кожи мыши. Прикрепите мех к доске, чтобы обеспечить доступ как к брюшной, так и к грудной полости.
- Извлечение мужской урогенитальной системы в блоке
- Используя стерильные ножницы для вскрытия и прямые щипцы, аккуратно прорежьте кожу на 0,75 см над прямой кишкой. Продолжить разрез средней линии до грудной клетки, не нарушая каких-либо органов в брюшной полости. Аккуратно вытяните кожу и прикрепите к доске, чтобы разоблачить всю брюшную полость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте этим инструментам прикасаться к внешней стороне мыши или любой поверхности в промежуточной области, так как эти ткани будут использоваться для генерации органоидов. - Вскрыть урогенитальной системы и других органов в соответствии с диаграммой на рисунке 1А, с цифрами, указывающими порядок органов будут удалены из мыши.
- Найти мочевой пузырь, а затем схватить жира площадку либо влево или вправо и потяните вверх, чтобы разоблачить яичко. Тщательно вскрыть яичко от остальной части урогенитальной области и отложить в сторону. Сделайте ту же процедуру на другой стороне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение оптимального качества тканей и детальная характеристика опухоли опухолей простаты требует, чтобы вся урогенитальная область была удалена из мыши en bloc19. Рекомендуется сначала удалить урогенитальную область(рисунок 1А). - Возьмитемо мочевой пузырь и осторожно подтяните так, чтобы урогенитальный регион поднимался вместе, обнажая уретру под ним. Во время проведения мочевого пузыря, ориентировать ножницы, чтобы они против нижней части нижней части нижней простаты и сократить уретры. Затем вся урогенитальная область высвобождена из брюшной полости.
- Положите урогенитальной области в 10 см блюдо заполнено PBS. Если все еще заполнены с мочой, слейте мочевой пузырь, сделав небольшой разрез. Используя аналитический баланс, взвесьте урогенитальную систему и записи.
- Используя стерильные ножницы для вскрытия и прямые щипцы, аккуратно прорежьте кожу на 0,75 см над прямой кишкой. Продолжить разрез средней линии до грудной клетки, не нарушая каких-либо органов в брюшной полости. Аккуратно вытяните кожу и прикрепите к доске, чтобы разоблачить всю брюшную полость.
- Удаление тазовых лимфатических узлов, селезенки, печени, почек, легких, голени и бедренной кости
- Удаление урогенитальной системы подвергает тазовых лимфатических узлов, расположенных прямо за урогенитальной системы(Рисунок 1А) и по обе стороны позвоночника. Лимфатические узлы будут видны только в том случае, если они содержат метастатические поражения или если есть местное воспаление. Ориентируйте прямые щипцпод лимфатические узлы и подтяните, чтобы удалить лимфатический узла. Сделайте ту же процедуру на другой стороне.
- Возьмитесь за прямую кишку прямыми щипками и вырежьте. Потяните на прямую кишку, чтобы разгадать всю толстую кишку и тонкий кишечник, ища метастатические поражения в мезентеричных лимфатических узлах. Когда весь илеум удаляется, продолжайте тянуть на двенадцатиперстной кишки, чтобы разоблачить желудок. Вырезать пищевод, чтобы полностью удалить желудок и отказаться. При обнаружении каких-либо метастатических поражений в лимфатических узлах тщательно вскрывайте его в кишечнике и храните в 10-сантиметровой тарелке PBS.
- Разоблачение и удаление желудка будет тянуть селезенку из стороны плечевого(Рисунок 1А). Удалить селезенку и поместить в 4% PFA. Селезенка служит в качестве контроля окрашивания для гемотоксилин, как это очень клеточной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Висцеральные ткани, которые не будут использоваться для генерации органоидов, будут фиксироваться на ночь в 4% ПФА, промывают pbS, а затем помещаются в 70% этанола. - Удалите печень в верхней части живота(рисунок 1А). На основе метастатической нагрузки в печени, отдельные доли могут быть вскрыты, или вся печень может быть удалена путем тщательного разрезания вдоль диафрагмы. (Не прорезать диафрагму в это время). Поместите печень в 10 см блюдо PBS.
- Удаление печени будет полностью подвергать почки по обе стороны от позвоночника(Рисунок 1А). Удалите почки - вместе с почечными лимфатическими узлами, если узлы имеют метастатические поражения - путем размещения прямых щипцов под почку и потянув вверх. Сделайте ту же процедуру для другой стороны.
- Чтобы разоблачить грудную полость, осторожно вырежьте диафрагму вдоль грудной клетки. Пирсинг диафрагмы выпустит отрицательное давление в грудной полости и подвергать сердца и легких(рисунок 1A).
- Возьмитесь за грудину и подтяните, чтобы открыть грудную полость дальше. Наблюдайте вентральное лицо грудной полости вдоль грудной клетки для метастатических поражений в грудных лимфатических узлах и вскрыть, если присутствует.
- В то время как все еще держа грудину, отрезать вентральную грудную клетку, чтобы получить доступ к сердцу и легким. Возьмитесь за сердце, подтяните и порежете под легки. Чтобы полностью удалить сердце и легкие ан блок, вырезать все передние кровеносные сосуды и трахеи. Поместите ткани в PBS и тщательно удалить сердце, не повреждая легочной ткани или метастатических поражений легких.
- Возьмите нестерильные прямые щипцы и рассекая ножницы и отрежьте заднюю ногу на голове бедренной кости. Аккуратно схватить бедренную кетю и удалить заднюю ногу из меха.
- Поместите заднюю ногу на бумажное полотенце и схватите заднюю лапу. Используйте одногранное лезвие бритвы, чтобы снести/ отрезать все мышцы и соединительную ткань из голени и бедренной кости. Удалите бедренную кишка из голени, разрезая заднюю к коленной чашечки и удалить голени, удалив заднюю лапу. Поместите голени и бедренной кости в 10% NBF. Сделайте ту же процедуру на другой стороне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения длинных костей мыши на метастатические поражения, малоберцовой кости не нужно нетронутыми. Длинные кости будут зафиксированы в 10% NBF в течение одной недели, а затем декалькированные с помощью нейтрального решения EDTA20. Через три недели кости будут переведены на 70% этанола. - После удаления задних конечностей, принять ухо или хвост резки для будущего генотипирования. Откажитесь от туши мыши и всей ткани, чтобы не быть фиксированной или использовать для генерации органоидов.
- Рассечение опухоли предстательной железы
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение долей простаты мыши может быть достигнуто только с помощью рассекающего микроскопа19. Тем не менее, нагрузка опухоли простаты может быть настолько высока, что отдельные доли не могут быть различимы, и вскрытие может быть проведено без микроскопа. Тем не менее, полный протокол для вскрытия отдельных долей простаты описан ниже.- Поместите урогенитальную область в 10-сантиметровую тарелку PBS под рассекающим микроскопом и ориентируйте вентральную сторону вверх с мочевым пузырем и семенными пузырьками, обращенными в сторону от следователя. Все манипуляции урогенитальной области должны быть сделаны с использованием стерильных инструментов.
- Оцените общий фенотип опухоли предстательной железы- скорее всего, либо заполненные жидкостью или твердые опухоли будут наблюдаться в PCa GEMMs(Рисунок 2A, B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Заполненные жидкостью опухоли часто расположены в передней области простаты(рисунок 2A). Заполненные жидкостью опухоли состоят в основном из соединительной ткани с скудными эпителиальными компонентами - таким образом, эти опухоли не являются оптимальными для генерации органоидов из-за низкого количества опухолевых эпителиальных клеток, как будет обсуждаться в репрезентативных результатах Разделе. - Если заполненные жидкостью опухоли присутствуют, тыкать небольшое отверстие в опухоли. Поместите урогенитальную область в новую 10-сантиметровую тарелку PBS.
- Возьмите пару прямых щипц в недоминирующей руки и изогнутые щипцвы в доминирующейрукой. Переверните урогенитальную область на его вдовое лицо. Ищите проксимальной области простаты(Рисунок 1B), которые могут быть определены розовый / красный цвет уретры. Возьмитесь за мочеиспускательный уретру и крепко удерживайте, чтобы манипулировать урогенитальной тканью с помощью изогнутых щипц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время вскрытия простаты, всегда принимать к сведению расположение мочевого пузыря, так как это самый простой способ найти отдельные доли простаты(Рисунок 1B).
- Удаление тканей непроста из урогенитальной области
- Пока еще на подошве урогенитальной области, найдите основание семенной везики. Тщательно удалите семенной везикулы и отбросьте. Выполните ту же процедуру на противоположной стороне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прокола семенной везикулы, так как это выпустит липкую и непрозрачую секреторную жидкость, которая мешает вскрытию простаты. Если семенной везикул проколот, перенесите оставшуюся урогенитальную область в новую 10-сантиметровую тарелку со свежим PBS. - Удалите и отбросьте ваз deferens и столько жирной и соединительной ткани, как это возможно, используя изогнутую сторону щипцы.
- Хотя по-прежнему твердо проведения уретры / проксимальной области простаты, использовать пару штрафа, отметил ножницы, чтобы удалить мочевой пузырь из уретры.
- Пока еще на подошве урогенитальной области, найдите основание семенной везики. Тщательно удалите семенной везикулы и отбросьте. Выполните ту же процедуру на противоположной стороне.
- Изоляция отдельных долей простаты
- Найдите переднюю проста(рисунок 1B). Убедитесь в твердом удержании проксимальной области простаты / уретры с прямыми щипками. Удалите передней области простаты, непосредственно захватывая ткани с изогнутой стороны щипки и твердо потянув его от мочевого пузыря и остальной части простаты. Поместите ткани в PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех регионов простаты, рассекающие ножницы могут потребоваться для удаления ткани, в зависимости от размера опухоли. - Найдите область брюшной простаты(рисунок 1B). Удалите область брюшной простаты так же, как и в шаге 1.5.7.
- На данный момент в вскрытии, только боковые и дорсальные области простаты должны присутствовать, в то время как проксимальная область простаты все еще захватывается прямыми щипцы. Оцените боковые и дорсальные области простаты(рисунок 1B). Если боковой регион можно отличить от области вдовне, удалите боковой область простаты, как описано в шаге 1.5.7. Сделайте ту же процедуру на противоположной стороне.
- Удалите область предстательной железы, как описано в шаге 1.5.7. Поместите проксимальную область простаты в 4% ПФА, так как его структура в мышечной ткани уретры делает его непригодным для генерации органоидов.
- Найдите переднюю проста(рисунок 1B). Убедитесь в твердом удержании проксимальной области простаты / уретры с прямыми щипками. Удалите передней области простаты, непосредственно захватывая ткани с изогнутой стороны щипки и твердо потянув его от мочевого пузыря и остальной части простаты. Поместите ткани в PBS.
2. Поколение 3D органоидов из опухолевых тканей простаты
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показано живописное описание процедуры генерации опухолевых органоидов.
- Подготовка
- Подготовка мыши простаты органоидов средств в соответствии с Drost и др.18 со следующими изменениями. Используйте кондиционированную среду вместо рекомбинантных белков для Ноггина и R-Спондина и используйте окончательную концентрацию 1% (v/v), вместо 10%, как для Noggin- и R-Spondin-кондиционированной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: HeK293 клетки заступничество трансфицируется HA-мышь Noggin-Fc или HA-мышь Rspo1-Fc используются для производства Noggin- или R-Spondin-кондиционированных среды, соответственно. Эти клеточные линии были подарком от лаборатории Кальвина Куо в Стэнфордском университете. - Приготовьте раствор пищеварения в трубке 15 мл, разбавив 20 мг/мл коллагеназы II с помощью расширенных средств DMEM/F12 (я) до конечной концентрации 5 мг/мл. Добавьте Ингибитор породы Y-27632 в раствор коллагеназы II при конечной концентрации в 10 км.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение буфера пищеварения к ткани составляет 1 мл до 50 мг, которые мы используем в соответствии с Drost et al.18.
- Подготовка мыши простаты органоидов средств в соответствии с Drost и др.18 со следующими изменениями. Используйте кондиционированную среду вместо рекомбинантных белков для Ноггина и R-Спондина и используйте окончательную концентрацию 1% (v/v), вместо 10%, как для Noggin- и R-Spondin-кондиционированной среды.
- Обрезка и переваривание опухолевых тканей
- В капюшоне клеточной культуры поместите ткани опухоли простаты в стерильное блюдо культуры 10 см, рассекайте и отбрасывайте некротические ткани.
- Фарш оставшуюся ткань опухоли простаты в 1 мм3 куба, удерживая куски ткани стерильной изогнутой щипцы и резки с вскрытием ножницами.
- Поместите кусочки рубленой опухоли в трубку 15 мл с буфером пищеварения, зачерпывая их с изогнутой стороны щипцов. Переварить опухолевую ткань при 37 градусах Цельсия при встряхивании в течение 1,5-2 ч. Проверьте прогресс пищеварения каждые 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: В это время выняйте не менее 2 мл матрицы из -20 градусов по Цельсию и оттаивайте на льду. 1 мл aliquots матрицы займет около 3 ч для оттаивания. - После переваривания ткани, центрифуга трубки на 175 х г в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию, чтобы сформировать клетку гранулы.
- Удалите супернатант, Щелкните трубку, чтобы ослабить клеточные гранулы, и повторно приостановить клеточные гранулы в 1 мл предварительно разогретого трипсина, дополненного 10 мкм Y-27632 Рок ингибитор. Положите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
- После инкубации, пипетка вверх и вниз 5 раз со стандартным p1000 отзыв. Верните трубку к водяной бане 37 градусов еще 5 минут и повторите шаг 2.2.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: В это время в процедуре, тепло стерильной 6-хорошо клеточной культуры блюдо, поставив его в инкубатор 55 градусов по Цельсию.
- Подсчет ячеек и повторная подвеска в матрице
- Вымойте клетки, добавив 9 мл холодного AdDMEM/F12 и центрифуги трубки на 175 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
- После центрифугации, удалить супернатант, Флик трубки, чтобы ослабить гранулы, и мыть клетки снова, добавив 10 мл холодного AdDMEM / F12 ( ) . Центрифуга трубки при 175 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- После центрифугации, удалить супернатант, Флик трубки, чтобы ослабить гранулы, resuspend клетки в 1 мл AdDMEM / F12 (я), и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра в соответствии со стандартной процедурой.
- Семь-восемь куполов вписываются в один колодец из 6 хорошо блюдо, когда органоиды покрываются в матрице через падение мудрым моды. Приблизительно 200 зл и матрицы будут производить 7-8 куполов. Решите, сколько скважин органоидов необходимо для будущих экспериментальных целей, и вычислите объем требуемой матрицы. Затем вычислите объем клеточного раствора, необходимого для конечной концентрации 1,0 х 106 клеток/мл матрицы.
- После подсчета клеток, центрифуга на 175 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант, щелкните трубку, чтобы ослабить гранулы, и повторное увеличение количества матрицы, рассчитанной в шаге 2.3.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица остается в жидкой форме только при 4 градусах Цельсия; держать матричных фондовых труб и матричных клеток решения на льду во все времена.
- Покрытие матричных куполов и применение средств массовой информации
- Смешайте матричные ячейки раствор с P200 пипетка равномерно распределить клетки без введения пузырьков. Удалите 6-хорошо блюдо культуры из инкубатора 55 градусов по Цельсию.
- Тщательно пипетка 200 л матричного клеточного раствора и быстро уроните раствор в колодец для создания куполов.
- Повторите шаг 2.4.2. до тех пор, пока объем раствора матричных ячеек не будет израсходован. Разрешить купола затвердеть при комнатной температуре в течение 2 мин.
- Переверните 6-хорошо блюдо вверх дном и положить блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию, чтобы продолжить затвердевание в течение 20 минут.
- После инкубации, добавить 2 мл мыши простаты органоидов средств к каждому колодцу. Добавьте синтетический андроген R1881 к каждой скважине для конечной концентрации 1 нМ и Ингибитор породы Y-27632 до конечной концентрации 10 мкм. Тщательно перемешайте и поместите тарелку в инкубатор 37 градусов по Цельсию для культивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидная культура средств массовой информации должна быть дополнена 10 ММ Y-27632 Рок ингибитор только в течение 1 недели после генерации органоидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель некропсии изображения мыши с большой заполненной жидкостью первичной опухоли простаты в передней области простаты показаны на рисунке 2A. В отличие от этого, Рисунок 2B, показывает репрезентативные изображения некропсии мыши с большой твердой первичной опухоли простаты, для которых отдельные области простаты неотличимы. Флуоресцентные изображения вскрытия показывают ту же твердую опухоль простаты из Рисунок 2 B, выражающий GFP, указывая, что опухоли клетки выражают Cre (Рисунок2C). Ткань, которая не выражает пробазина, таких как мочевой пузырь, выразить томат и, таким образом, не выражает Cre(Рисунок 2C). Печень и легкие от мыши с рисунка 2B имеют метастатические опухоли, выражающие GFP, показывая, что они возникли из первичной опухоли простаты, и окружены нормальной тканью, которая выражает томат (Рисунок 2C ). Наконец, тазового лимфатического узла из этой мыши выражает GFP, а не томат, указывая, что эта метастатическая опухоль обогнала этот орган и никаких нормальных тканей не остается (Рисунок 2C).
Мы показываем изображения на рисунке 4 органоидов, которые мы создали из твердой опухоли простаты. На 1-й день образуются небольшие органоиды, как видно на репрезентативной фазе контрастных изображений. Флуоресцентные изображения на 1-й день показывают, что как томатные, так и GFP выражающие клетки присутствуют в культуры опухолевых органоидов (стрел). Однако, к 7-му дню, когда органоиды опухоли простаты полностью сформировались, эти органоиды выражают GFP, а не томат. Эти данные свидетельствуют о том, что эти органоиды возникли из опухолевых клеток, которые выражали Cre, а не от нормальных эпителиальных клеток. Эти опухолевые органоиды по-прежнему только GFP-положительный, как мы расширяем нашу культуру для прохода 1 и 2.
На рисунке 5мы показываем изображения органоидов, которые мы создали из заполненной жидкостью опухоли простаты. На 1 день, малые органоиды формируют, и флуоресцентные изображения показывают что и томат- и GFP-выражая клетки присутствуют в культуры органоидов - подобно к нашему наблюдению на дне 1 для органоидов произведенных от твердой тумора простаты (Рисунок4). Тем не менее, органоиды из заполненных жидкостью опухоли простаты выражают либо GFP или помидор на 7-й день - о том, что органоиды сформировались из клеток, которые не выражают Cre. Эта модель продолжается в проходе 1 и проходе 2, где культура имеет как томат- и GFP-выражая органоиды. Дальнейший анализ этих органоидов сильно ограничен, потому что линия представляет собой смесь нормальных эпителиальных органоидов и опухолевых органоидов. Мы считаем, что заполненные жидкостью опухоли предстательной железы являются неоптимальными в генерации опухолевых органоидов просто потому, что есть больший процент нормальных эпителиальных клеток простаты. Поскольку как нормальные эпителиальные клетки предстательной железы, так и раковые клетки предстательной железы образуют органоиды, линии, генерируемые из заполненных жидкостью опухолей простаты, представляют собой смесь нормальных и раковых органоидов. Мы получаем чистые опухолевые органоидные линии из заполненных жидкостью опухолей простаты путем сортировки потока для GFP-положительных клеток и генерации органоидов из этой популяции клеток. Твердые опухоли простаты в основном состоят из опухолевых клеток, поэтому органоиды, генерируемые из этих опухолей, являются более чистой популяцией раковых органоидов без предварительной сортировки для GFP.
Рисунок 1 : Наш рекомендуемый порядок вскрытия рака простаты (PCa) генетически модифицированных моделей мыши (GEMMs) и анатомии мыши простаты. ()Заказ мы рекомендуем в нашем протоколе для вскрытия основных органов из PCa GEMM. 1. Урогенитальная область. 2. Тазовые лимфатические узлы. 3. Селезенка. 4. Печень. 5. Почки. 6. Легкие. 7. Тибия и Бедмур. (B) Карта урогенитальной области мыши и анатомии простаты. Флуоресцентные рассеивания изображения 12-недельной мыши, выражающей пробазин-Кре и репортерm/mG Cre transgene. Мочевой пузырь (BL), семенные пузырьки (SV), передняя простата (AP), брюшная простата (VP), боковая простата (LP), предстательная предстательная железа (DP), и простата (PP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Представитель вскрытия изображений рака простаты (PCa) генетически модифицированных моделей мыши (GEMMs). ()Брюшная полость до удаления урогенитальной области и урогенитальной области с заполненной жидкостью опухоли предстательной железы. (B) Брюшная полость до удаления урогенитальной области и урогенитальной области с твердой опухолью простаты. (C) Представитель томатных и GFP флуоресцентные изображения твердой опухоли простаты, печени, легких и тазовых лимфатических узлов от PCa GEMM, который развивает метастатические поражения. Шкала бар 5 мм. Мочевой пузырь (BL), передняя простата (AP), и дорсальной простаты (DP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Диаграмма потока протокола для генерации органов опухоли простаты. После вскрытия опухоли простаты, фарш ткани на 1 мм штук. Дайджест опухоли части в коллагенезе, собирать клетки, и переварить в трипсине, чтобы получить одну клетку подвески. После подсчета клеток, resuspend в объеме матрицы, необходимой для 1,0 х 106 клеток / мл концентрации клеток. Плита куполов в блюдо с помощью капли мудрый метод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Репрезентативные изображения из поколения органов опухоли предстательной железы мыши из твердой опухоли простаты. Представитель фазы контраста, томат, и GFP флуоресцентные изображения из день 1, День 7, Проход 1, и проход 2 органоидов, полученных от твердой опухоли простаты мыши. Шкала бар 100 мкм. Стрелки указывают отдельные клетки в флуоресцентных изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Репрезентативные изображения из поколения органов опухоли предстательной железы мыши из заполненной жидкостью опухоли. Представитель фазы контраста, томат, и GFP флуоресцентные изображения из день 1, День 7, Проход 1, и проход 2 органоидов, полученных из заполненных жидкостью опухоли простаты мыши. Шкала бар 100 мкм. Стрелки указывают отдельные клетки в флуоресцентных изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в рамках протокола для вскрытия опухоли предстательной железы и органоидного поколения
Удаление непростастовой ткани и тонкое вскрытие опухоли простаты мыши имеет решающее значение для оптимального поколения раковых органоидов, так как как непростаэпиляционные клетки и нормальные эпителиальные клетки простаты будут генерировать органоиды. Для твердых опухолей предстательной железы в частности, имеет решающее значение для изоляции областей жизнеспособной опухоли, чтобы удалить загрязнение некротической ткани, что позволит уменьшить количество жизнеспособных клеток. Во время органоидного поколения, пищеварение тканей с коллагеназой следует тщательно контролировать, так как длительное воздействие коллагеназы ограничит жизнеспособность клеток. С органоидами, полученными от рака GEMMs, очень важно полностью генотип каждой линии, чтобы убедиться, что все трансгены и модифицированные аллели, которые были разработаны в мыши присутствуют в органоидов. Повторение генотипирования после длительного прохождения также необходимо для обеспечения сохранения генетических модификаций.
Модификации и устранение неполадок вскрытия опухоли простаты и генерации органоидов
Мы наблюдали мышь мыши изменчивость в характеристиках опухоли простаты, даже среди животных с тем же генотипом. Таким образом, конкретные изменения в протоколе вскрытия простаты, описанные здесь, могут быть необходимы для каждой мыши. Кроме того, при вскрытии метастатических опухолей необходима адаптивность, так как трудно предсказать тяжесть этих поражений до начала вскрытия.
В нескольких случаях, мы наблюдали избыточное загрязнение нашей клетки гранулы с тем, что, как представляется, соединительной ткани, даже после пищеварения с коллагеназа и трипсин. Когда это происходит, мы resuspend гранулы, по крайней мере 2 мл AdDMEM F12 (я) и использовать 40 мкм ячейки ситечко для удаления соединительной ткани. Так как есть много-много изменчивости в скорости затвердевания матрицы, увеличение или уменьшение времени для затвердевания купола может быть необходимо до применения органоидных средств массовой информации.
Ограничения в использовании GEMMs
Хотя GEMMs являются наиболее строгим методом для доклинических исследований рака, этот подход требует значительного времени, расходов и подготовки кадров. Кроме того, изменчивость мыши к мыши может, как и в исследовании людей, усложнять интерпретацию данных.
Ограничения в использовании культуры 3D-клеток
По сравнению с 2D-клеточной культурой генерация и поддержание органоидных линий требует увеличения времени и затрат. Например, наши опухолевые органоидные линии проходят каждые 2-3 недели, в то время как клеточные линии могут проходят каждые 2-3 дня. Этот более медленный темп роста органоидов значительно увеличивает время, необходимое для завершения экспериментов. Органоидная культура средств массовой информации содержит несколько специализированных факторов роста и реагентов, которые могут быть дорогостоящими в зависимости от источника, таким образом, генерации и поддержания органоидов является более дорогостоящим, чем традиционные 2D клеточные линии. Наконец, наша лаборатория и другие наблюдали много много различий в матрице и других реагентов - создавая проблему для поддержания последовательности в росте органоидов для долгосрочных экспериментов.
Значение в использовании 3D-культуры клеток по отношению к существующим/альтернативным методам
Доклинические исследования рака доминируют 2D-клеточной культуры и клеточной линии полученных ксенотрансплантат моделей. Рост клеток в 2D требует трансформации/увековечения - таким образом, как in vitro, так и исследования ксенотрансплантата с использованием 2D культур, как правило, не имеют неизменных нормальных клеточных линий, чтобы служить в качестве нераковых средств контроля. Последнее десятилетие исследований в 3D органоидной культуры нормальных эпителиальных тканей в настоящее время позволило для роста нераковых эпителиальных тканей, которые могут быть использованы для сравнения с аналогичными органоидами, полученными из раковой ткани. Раковые органоиды также могут быть использованы для создания ксенотрансплантатов для дальнейшего понимания развития опухоли. Кроме того, нераковые органоиды могут быть использованы для генерации контроля ксенотрансплантатов - что было невозможно до 3D методы культуры клеток были разработаны16.
Значение в использовании 3D-клеточной культуры в исследованиях рака простаты
В недавних исследованиях, органоиды были использованы для повторения характеристики опухоли простаты GEMM. Dardenne et al. показывают, что органоиды, генерируемые с помощью опухолей простаты из ГЭМС, которые одновременно не имеют супрессора опухоли Pten и переэкспрессируют MYCN онкогена, имели больший потенциал роста, чем органоиды, генерируемые с использованием простаты из контролировать GEMMs. Кроме того, как секвенирование, так и иммуногистохимия показали, что опухолевые органоиды резюмировали экспрессионные профили опухолей предстательной железы, как не хватает Птена, так и переэкспрессирующих MYCN21. Блаттнер и др. показывают, что одновременное переэкспрессии простаты онкогенного мутанта Спеклтипа BTB/PO' Protein (SPOP) и удаление Pten увеличивает скорость опухолевого генезев в ГЕММ. Когда органоиды простаты были созданы для переэкспресса мутант SPOP, их пролиферация была увеличена по сравнению с контролем органов простаты и экспрессии маркера линии recapitulated оригинальные опухоли простаты22. Вместе эти исследования показывают, что органоиды являются оптимальной моделью для дальнейшего изучения характеристик опухоли простаты в GEMMS.
Органоидная культура также используется в качестве инструмента для оценки отдельных субпопуляций опухолевых клеток простаты. Использование опухолей GEMM, которые не хватает Pten и как Pten и Trp53 супрессоры опухоли в эпителиальных клетках простаты, Agarwal и др. фракционные клетки в базальных и светящихся прародителей, размножаются эти субпопуляции как органоиды, и далее охарактеризовал ими специфические фенотипы23. Таким образом, используя 3D-клеточной культуры, можно охарактеризовать субпопуляции опухолевых клеток, которые могут быть ограничены в изобилии в опухоли простаты себя.
Как описано выше, методы 3D-культуры клеток позволяют расти нормальным эпителиальным клеткам. Таким образом, органоиды простаты, генерируемые из GEMMs, не хватает драйвера Cre, обеспечивают уникальную модель для мониторинга опухоли в режиме реального времени путем индукции рекомбиназы Cre in vitro. Действительно, Dardenne et al. оценили, как переэкспрессия NMYC влияет на потенциал роста в контексте потери Птен с течением времени, эктопически выражая ERT2-Cre и лечения тамоксифеном21. Кроме того, влияние переэкспрессии NMYC на рецептор андрогенов (AR), основной мишенью терапии рака простаты, была оценена после индукции рекомбиназы Cre в органоидах, генерируемых из ГЭМС21. Та же индуцируемая система Cre была использована Блаттнер и др. в простаты органоидов для измерения, как переэкспрессия мутантs SPOP влияет на пролиферацию раковых клеток простаты и AR выражение22. Примечательно, что эксперименты, вызывающие cre выражение in vitro, имеют встроенный нераковый контроль с помощью обработанных автомобилем органоидов.
Конкретные ограничения в использовании 3D-клеточной культуры в исследованиях рака простаты
В то время как органоидный рост нормальных эпителиальных клеток является преимуществом использования методов 3D-клеточной культуры, способность расти нормальные органоиды также представляет собой проблему в исследованиях рака простаты. Как показано в нашем разделе репрезентативных результатов, мы наблюдали рост нормальных органов простаты в линиях, генерируемых опухолями простаты, которые являются менее агрессивными(рисунок 5). Один из способов решения этого явления заключается в том, чтобы генерировать органоиды из GEMMs, выражающих Cre репортер трансгена, таких как mT/mG. Флуоресцентная микроскопия может быть использована для оценки относительного соотношения нормальных к опухолевым органоидам, наблюдая экспрессию томата и GFP. Кроме того, выражение GFP может быть использовано для потока сортированных органоидных клеток для генерации чистых органоидных линий опухоли простаты. Agarwal et al. показывают метод сортировки для разделения нормальных эпителиальных клеток и раковых клеток от опухолей простаты GEMM без репортера Cre. Они показывают, что эпителиальная клеточная адгезия молекулярных (EpCAM) -положительных клеток от опухолей простаты не отделяется в субпопуляции при сортировке с помощью либо CD24 или Sca-1 маркеры поверхности клетки23 - таким образом, эти маркеры могут быть использованы, чтобы исключить нормальные эпителиальные клетки предстательной железы от опухолей простаты GEMM до генерации органоидов. Наша лаборатория и другие наблюдали, что условия, при которых раковые клетки простаты образуют органоиды, как представляется, либо выбрать или содействовать линии конкретных программ экспрессии генов, характерных для простаты базальных эпителиальных клеток. Это является серьезной проблемой, потому что опухоли предстательной железы у мышей и людей в первую очередь светящиеся в природе, выражая AR, CK8, и другие светящиеся маркеры, и редко выражают базальные маркеры линии, такие как p63 или CK5. Хотя это явление еще не опубликовано в деталях, иммуногистохимия анализ показывает, что AR уменьшается в Ptenf / ' органоидов по сравнению с Ptenf / ' простаты21. Рост базальных эпителиальных клеток в органоидов рака простаты ставит под сомнение, действительно ли эти линии являются точной доклинической моделью рака простаты.
Хотя органоиды рака предстательной железы были задокументированы для моделирования опухоли, из которой они получены лучше, чем традиционные 2D культуры, есть потенциал для органоидов пройти генетические изменения в культуре, особенно после нескольких проходов. В настоящее время мы не знаем о каких-либо опубликованных исследований, которые документально спонтанных генетических мутаций, генетических выгоды или потери, или эпигенетические изменения, которые являются общими после длительного прохождения органов рака простаты. Чтобы ограничить изменчивость в результате генетических или эпигенетических изменений, которые могут произойти из-за длительного прохождения, эксперименты должны быть проведены в ранних органоидов из ранних проходов (Злт;10) как можно чаще.
Будущие приложения культуры 3D-клеток
Хотя невозможно предсказать все будущие приложения, которые будут разработаны с использованием 3D-клеточной культуры в исследованиях рака, Есть несколько путей, которые, как представляется, имеют наибольший потенциал. Как и в 2D-клеточных линиях, проведение в пробирке генетической модификации относительно проста в органоидах. Изменение конкретных генов в нормальных или раковых органоидов открывает много возможностей в изучении механизмов, регулирующих опухолевое, прогрессирование рака, и лечение - особенно, когда генетически модифицированные органоиды используются для генерации органоидов ксенотрансплантаты. Генетическая модификация органоидов очень выгодна, когда GEMMs не существует для конкретного гена или создание нового GEMM выходит за рамки конкретного исследования.
Рак органоидной культуры также имеет много потенциальных приложений для клинических исследований. Библиотека соответствующих подтипов опухоли в каждой системе органов от пациентов и животных моделей может быть использована для быстрой оценки эффективности нового препарата или новой комбинации существующих препаратов. По мере того как культура 3D клетки будет mainstream и увеличивает в эффективности, производить пациента-производной organoids для цели персонализированной микстуры имеет потенциал помочь портной обработка для каждого пациента рака путем испытывать все имеющиеся снадобья и комбинации наркотиков с использованием его или ее индивидуальной органоидной линии16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют финансовых отношений раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить лабораторию Calvin Kuo в Стэнфордском университете за предоставление клеток HEK293, стабонетых либо HA-мышьNoggin-Fc или HA-mouse Rspo1-Fc. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Дина Тан за предоставленную нам доступ к флуоресцентным рассеиванием микроскопа в его лаборатории. Эта работа была поддержана CA179907 d.W.G. от Национального института рака. Общие ресурсы в Розуэлл Парк Всеобъемлющий онкологический центр были поддержаны Национальными институтами здравоохранения онкологический центр поддержки Грант CA016056.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
