Summary
Mostriamo un metodo per la necropsia e la dissezione dei modelli di cancro alla prostata del topo, concentrandosi sulla dissezione del tumore alla prostata. Viene inoltre presentato un protocollo passo-passo per la generazione di organoidi tumorali della prostata del topo.
Abstract
I metodi basati sulla ricombinazione omologa per modificare i geni hanno notevolmente favorito la ricerca biologica. I modelli murini geneticamente ingegnerizzati (GEMM) sono un metodo rigoroso per studiare lo sviluppo e la malattia dei mammiferi. Il nostro laboratorio ha sviluppato diverse GEMM di cancro alla prostata (PCa) che non sono espressione di uno o più geni soppressori tumorali utilizzando il sistema ricombinase Cre-loxP site-specific e un promotore specifico della prostata. In questo articolo, descriviamo il nostro metodo per la necropsia di questi GEMM PCa, concentrandoci principalmente sulla dissezione dei tumori della prostata del topo. Nuovi metodi sviluppati nell'ultimo decennio hanno facilitato la coltura delle cellule derivate epiteliali per modellare i sistemi di organi in vitro in tre dimensioni. Inoltre, dettagliamo un metodo di coltura cellulare 3D per generare organoidi tumorali dai GEMM PCa del topo. La ricerca pre-clinica sul cancro è stata dominata dalla coltura cellulare 2D e dai modelli di xenotrapianto derivati dalla linea cellulare o derivati dal paziente. Questi metodi mancano di microambiente tumorale, una limitazione dell'utilizzo di queste tecniche negli studi pre-clinici. Le GEMM sono più rilevanti dal livello fisiologico per comprendere la tumorigenesi e la progressione del cancro. La coltura organoide tumorale è un sistema di modelli in vitro che riassume l'architettura del tumore e le caratteristiche di lignaggio cellulare. Inoltre, i metodi di coltura cellulare 3D consentono la crescita di cellule normali per il confronto con le colture cellulari tumorali, raramente possibile utilizzando tecniche di coltura cellulare 2D. In combinazione, l'uso delle GEMM e della coltura cellulare 3D negli studi preclinici ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione della biologia del cancro.
Introduction
Dalla fine degli anni '80, la capacità di alterare i geni con la ricombinazione omologa ha notevolmente avanzato lo studio dei sistemi biologici1. Sistemi promotori inducibili, tissutali o specifici delle cellule e ricombinazioni site-specific, come Cre-loxP, ha avanzato studi genetici facilitando il controllo sulle modifiche genetiche sia dal punto di vista temporale che spaziale2,3, 4. La combinazione di queste strategie genetiche ha creato una vasta gamma di sistemi di modelli sperimentali5,6,7.
I modelli murini geneticamente progettati (GEMM) sono uno strumento integrale per valutare in che modo i singoli geni o gruppi di geni influenzano lo sviluppo e la malattia dei mammiferi. Nella ricerca pre-clinica sul cancro, le GEMM sono il metodo più fisiologicamente rilevante e rigoroso per studiare lo sviluppo, la progressione e il trattamento del cancro8. Il nostro laboratorio è specializzato nella generazione e nella caratterizzazione delle GEMM tumorali.
Il cancro non cutaneo più altamente diagnosticato tra gli uomini negli Stati Uniti è il cancro alla prostata (PCa). La maggior parte dei pazienti con PCa ha una malattia a basso rischio e un'elevata probabilità di sopravvivenza, ma i tassi di sopravvivenza diminuiscono drasticamente quando la malattia viene diagnosticata in stadi avanzati o se la terapia ormonale mirata induce la progressione a PCa aggressiva e non curabile sottotipi9,10. Il nostro laboratorio ha sviluppato GEMM che utilizzano alleli sxed di uno o più geni soppressori tumorali. La ricombinazione e la perdita dell'espressione genica del soppressore tumorale si verifica specificamente nella prostata perché abbiamo introdotto un transgene con Cre ricombinase a valle del promotore probasinattivato attivato solo nelle cellule epiteliali prostata11, 12.Abbiamo anche allevato le nostre GEMM per contenere un Transgene Cre reporter chiamato mT/mG, che induce l'espressione delle proteine fluorescenti di pomodoro in cellule prive di Cre e proteina fluorescente verde (GFP) espressione nelle cellule con Cre13. Mentre la presentazione di questo metodo e i nostri risultati rappresentativi mostrano gemm che studiamo nel nostro laboratorio, questo protocollo può essere utilizzato per generare organoidi di cancro alla prostata da qualsiasi modello murino. Tuttavia, come discusso in dettaglio nella nostra sezione dei risultati rappresentativi, abbiamo osservato che alcune caratteristiche del tumore sono ottimali per la generazione di organoidi per il cancro alla prostata.
Nell'ultimo decennio, nuovi metodi di coltura delle cellule dai tessuti di origine epiteliale hanno portato a progressi significativi nella nostra capacità di modellare i sistemi di organi in vitro14,15. Il termine "coltura cellulare 3D" è stato attribuito alle tecniche coinvolte nella definizione e manutenzione degli organoidi, che possono essere generalmente definite come strutture costituite da cellule che assemblano l'architettura secondaria guidata dal lignaggio cellulare specifico dell'organo caratteristiche16. Questi nuovi metodi sono distinti dalla cultura cellulare 2D classica in quanto le celle non richiedono trasformazione o immortalizzazione per la crescita a lungo termine; pertanto, le colture 3D delle cellule normali possono essere confrontate con le cellule malate. Ciò è particolarmente utile nella ricerca sul cancro, dove le normali colture di controllo cellulare non sono state in genere disponibili. Inoltre, gli organoidi formano spontaneamente architetture di tessuti secondari con tipi di cellule opportunamente differenziate, rendendoli un sistema modello migliore per comprendere il cancro in vitro rispetto alle linee cellulari 2D17. Il nostro laboratorio ha creato linee organoidi 3D da un problema tumorale isolato dai nostri GEMM PCa per integrare i nostri dati in vivo ed eseguire esperimenti che non sarebbero fattibili nei GEMM.
In questo articolo, presentiamo protocolli scritti e visivi per la necropsia completa delle PCa GEMMs, tra cui la dissezione di lobi della prostata del topo distinti e lesioni metastatiche. Descriviamo e mostriamo un metodo passo-passo per generare organoidi da tumori della prostata del topo sulla base di un protocollo precedentemente pubblicato da Drost et al. per la derivazione di organoidi dal normale tessuto epiteliale della prostata del topo18.
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Protocol
Le procedure sugli animali qui descritte sono state eseguite con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.
NOT: I topi maschi da sezionare per isolare prostati o tumori alla prostata per la generazione di organoidi dovrebbero aver almeno raggiunto l'età della maturità sessuale - circa 8-10 settimane di età. Età specifiche dei topi possono variare tra gli studi. Alcuni fattori da considerare quando si sceglie l'età includono cambiamenti dipendenti dall'età nelle popolazioni di cellule prostata, espressione dipendente dall'età di specifici transgeni Cre promotori, e tasso di progressione del tumore della prostata in un particolare GEMM.
1. Dissezione e imaging di tumori tumori tumorali tumorali e tumori metastatici della prostata del topo
- Preparazioni
- Ottenere gli strumenti di dissezione sterili necessari. Area di dissezione dello stadio su superficie sterile pulita con righello di 15 cm, equilibrio di precisione, equilibrio analitico, bottiglia spray con 70% etanolo, salina tampolo fosforo (PBS) e asciugamani di carta.
-
Preparazione di soluzioni fissative per organi e ossa viscerali da non utilizzare per la generazione di organiidi
- Per gli organi viscerali: Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS. Per un topo, fare 20 mL di 4% PFA, aliquota in due tubi conici 15 mL e mantenere a temperatura ambiente fino all'uso.
- Per le ossa lunghe: Aliquota 10 mL di formalina bufferterata neutra (NBF) pre-made 10% in un tubo conico da 15 mL e conservata a temperatura ambiente fino all'uso.
- Ottenere piatti non trattati da 10 cm e riempirli con PBS non sterili - questi serviranno come contenitori temporanei per gli organi durante la dissezione fine utilizzando un microscopio di dissezione.
NOT: Gli strumenti sterili sono utilizzati per sezionare i tessuti per la generazione di organoidi. Strumenti non sterili vengono utilizzati per l'incisione iniziale e la dissezione degli arti posteriori.
- Eutanasia e incisione iniziale
- Eutanasia il topo per asfissia di CO2 utilizzando una portata di 2,0 L/min per 5 min. Rimuovere il mouse dalla gabbia ed eseguire la lussazione cervicale. Utilizzare il bilanciamento di precisione per misurare il peso corporeo e la registrazione del mouse.
- Posizionare il mouse sopra un tovagliolo di carta e orientarsi sul lato ventrale di superficie dissezione verso l'alto con la testa del mouse rivolta lontano dall'investigatore. Apposto il mouse alla tavola allungando gli arti e perforando ciascuna delle zampe anteriori e zampe posteriori con un ago usa e getta.
- Utilizzando una bottiglia spray, sbottona la pelliccia del topo con il 70% di etanolo. Utilizzando forbici dissezione non sterile e pinze dritte, pizzicare appena sopra il pene del mouse e fare una piccola incisione attraverso la pelliccia solo.
- Continuare l'incisione media fino al collo del topo attraverso la pelliccia solo. Fare incisioni bilaterali dal punto dell'incisione iniziale attraverso il piano ventrale del topo solo attraverso la pelliccia.
- Afferrare la pelliccia e tirarla via con attenzione dalla pelle del topo. Pin giù la pelliccia alla scheda per consentire l'accesso sia alle cavità addominali e toraciche.
- Estrazione del sistema urogenitale maschile en blocco
- Utilizzando forbici sterili di dissezione e pinze dritte, tagliare con cura attraverso la pelle circa 0,75 cm sopra il retto. Continuare l'incisione media fino alla gabbia toracica senza disturbare alcun ostico nella cavità addominale. Tirare con attenzione la pelle e fissare la scheda per esporre l'intera cavità addominale.
NOT: Non consentire a questi strumenti di toccare l'esterno del mouse o qualsiasi superficie nell'area di sosta, in quanto questi tessuti verranno utilizzati per generare organoidi. - Dissezionare il sistema urogenitale e altri organi secondo il diagramma in Figura 1A, con numeri che indicano l'ordine in cui gli organi saranno rimossi dal mouse.
- Trova la vescica, quindi afferra il cuscinetto a base di grasso a sinistra o a destra e tira verso l'alto per esporre il testicolo. Sezionare attentamente il testicolo dal resto della regione urogenitale e mettere da parte. Eseguire la stessa procedura sull'altro lato.
NOT: Raggiungere la qualità ottimale del tessuto e la caratterizzazione del tumore dettagliata dei tumori della prostata richiede che l'intera regione urogenitale venga rimossa dal topo en blocco19. Si consiglia di rimuovere prima l'area urogenitale (Figura 1A). - Afferra la vescica e tira con attenzione in modo che la regione urogenitale si sollevata insieme, esponendo l'uretra sottostante. Tenendo la vescica, orientare le forbici in modo che siano contro la parte inferiore della prostata dorsale e tagliare l'uretra. L'intera regione urogenitale si libererà dalla cavità addominale.
- Mettere la regione urogenitale in un piatto di 10 cm pieno di PBS. Se ancora riempito con urina, scolare la vescica facendo una piccola incisione. Utilizzando l'equilibrio analitico, pesare il sistema urogenitale e registrare.
- Utilizzando forbici sterili di dissezione e pinze dritte, tagliare con cura attraverso la pelle circa 0,75 cm sopra il retto. Continuare l'incisione media fino alla gabbia toracica senza disturbare alcun ostico nella cavità addominale. Tirare con attenzione la pelle e fissare la scheda per esporre l'intera cavità addominale.
- Estrazione di linfonodi pelvici, milza, fegato, rene, polmone, tibia e femore
- La rimozione del sistema urogenitale espone i linfonodi pelvici, posizionati proprio dietro il sistema urogenitale (Figura 1A) e su entrambi i lati della colonna vertebrale. I linfonodi saranno visibili solo se contengono lesioni metastatiche o se c'è infiammazione locale. Orientare le pinze dritte sotto il linfonodo e tirare verso l'alto per rimuovere il linfonodo. Eseguire la stessa procedura sull'altro lato.
- Afferrare il retto con le pinze dritte e tagliare. Tirare sul retto per svelare l'intero colon e l'intestino tenue, alla ricerca di lesioni metastatiche nei linfonodi messentivari. Quando l'intero ileo viene rimosso, continuare a tirare sul duodenum per esporre lo stomaco. Tagliare l'esofago per rimuovere completamente lo stomaco e scartare. Se si osservano lesioni metastatiche nei linfonodi, sezionare attentamente l'intestino e conservare in un piatto di 10 cm di PBS.
- Esponendo e rimuovendo lo stomaco tirerà la milza dal lato dorsale dell'addome (Figura 1A). Rimuovere la milza e mettere in 4% PFA. La milza serve come controllo di colorazione per l'emotossia in quanto è altamente cellulare.
NOT: I tessuti viscerali che non devono essere utilizzati per la generazione di organoidi saranno fissati durante la notte nel 4% di PFA, lavati con PBS, e poi collocati nel 70 % di etanolo. - Rimuovere il fegato nella parte superiore dell'addome (Figura 1A). Sulla base del carico metastatico nel fegato, singoli lobi possono essere sezionati, o l'intero fegato può essere rimosso tagliando con attenzione lungo il diaframma. (Non tagliare il diaframma in questo momento). Mettere il fegato in un piatto di 10 cm di PBS.
- La rimozione del fegato esporrà completamente i reni su entrambi i lati della colonna vertebrale (Figura 1A). Rimuovere i reni - insieme ai linfonodi renali, se i nodi hanno lesioni metastatiche - posizionando le pinze dritte sotto il rene e tirando verso l'alto. Eseguire la stessa procedura per l'altro lato.
- Per esporre la cavità toracica, tagliare con cura il diaframma lungo la gabbia toracica. Perforare il diaframma rilascerà la pressione negativa nella cavità toracica ed esporrà il cuore e i polmoni (Figura 1A).
- Afferrare lo sterno e tirare verso l'alto per aprire ulteriormente la cavità toracica. Osservare la faccia ventrale della cavità toracica lungo la gabbia toracica per le lesioni metastatiche nei linfonodi toracici e sezionare, se presente.
- Mentre ancora tiene lo sterno, tagliare la gabbia toracica ventrale per accedere al cuore e ai polmoni. Afferra il cuore, accosta e taglia sotto i polmoni. Per rimuovere completamente il cuore e i polmoni in blocco, tagliare tutti i vasi sanguigni anteriori e la trachea. Posizionare il tessuto nella PBS e rimuovere con attenzione il cuore senza danneggiare il tessuto polmonare o le lesioni metastatiche polmonari.
- Prendere le pinze dritte non sterili e dissecicciare le forbici e tagliare la gamba posteriore alla testa del femore. Afferrare con cura il femore e rimuovere la gamba posteriore dalla pelliccia.
- Posizionare la zampa posteriore su un tovagliolo di carta e afferrare la zampa posteriore. Utilizzare la lama rasoio a bordo singolo per rottamare / tagliare via tutto il muscolo e il tessuto connettivo dalla tibia e dal femore. Rimuovere il femore dalla tibia tagliando posteriore alla rotula e rimuovere la tibia rimuovendo la zampa posteriore. Posizionare la tibia e il femore al 10% NBF. Eseguire la stessa procedura sull'altro lato.
NOT: Ai fini di esaminare le ossa lunghe del topo per le lesioni metastatiche, il perone non ha bisogno di essere intatto. Le ossa lunghe saranno fissate nel 10% NBF per una settimana, quindi decalcolate utilizzando la soluzione EDTA neutra20. Dopo tre settimane, le ossa saranno trasferite al 70% di etanolo. - Dopo aver rimosso gli arti posteriori, prendi un taglio dell'orecchio o della coda per la futura genotipizzazione. Eliminare la carcassa del topo e tutti i tessuti da non fissare o utilizzare per la generazione di organoidi.
- Dissezione del tumore alla prostata
NOT: La dissezione dei lobi della prostata del topo può essere ottenuta solo utilizzando un microscopio sezionato19. Tuttavia, il carico del tumore alla prostata può essere così alto che i singoli lobi non possono essere distinti e la dissezione può essere effettuata senza un microscopio. Tuttavia, il protocollo completo per la dissezione dei singoli lobi della prostata è descritto di seguito.- Mettere la regione urogenitale in un piatto di 10 cm di PBS sotto un microscopio dissettivo e orientare il lato ventrale con la vescica e le vescicoli seminali rivolti lontano dall'investigatore. Tutte le manipolazioni della regione urogenitale dovrebbero essere fatte utilizzando strumenti sterili.
- Valutare il fenotipo generale del tumore alla prostata- più probabile, sia un tumore pieno di liquido o solido sarà osservato in PCa GEMMs (Figura 2A, B).
NOT: I tumori pieni di liquidi si trovano spesso nella regione della prostata anteriore (Figura 2A). I tumori riempiti a liquido sono costituiti principalmente da tessuto connettivo con scarsi componenti epiteliali - quindi questi tumori non sono ottimali per la generazione di organoidi a causa del basso numero di cellule epiteliali tumorali, come verrà discusso nei risultati rappresentativi sezione f. - Se sono presenti tumori pieni di liquido, colpire un piccolo foro nel tumore. Collocare la regione urogenitale in un nuovo piatto di PBS di 10 cm.
- Prendere un paio di pinze dritte nella mano non dominante e pinze curve nella mano dominante. Capovolgere la regione urogenitale alla sua faccia dorsale. Cercare la regione della prostata prossimale (Figura 1B), che può essere identificata dal colore rosa/rosso dell'uretra. Afferrare l'uretra e tenere saldamente in modo da manipolare il tessuto urogenitale con le pinze curve.
NOT: Durante la dissezione della prostata, prendere sempre nota della posizione della vescica, in quanto questo è il modo più semplice per individuare i singoli lobi della prostata (Figura 1B).
- Rimozione del tessuto non prostatico dalla regione urogenitale
- Mentre ancora sulla faccia dorsale della regione urogenitale, trovare la base della vescica seminale. Rimuovere con attenzione la vescica seminale e scartare. Eseguire la stessa procedura sul lato opposto.
NOT: Evitare di forare la vescica seminale, in quanto rilascerà liquido secretoroso appiccicoso e opaco che interferisce con la dissezione della prostata. Se la vescicola seminale è forata, trasferire la regione urogenitale rimanente al nuovo piatto di 10 cm con PBS fresco. - Rimuovere e scartare il vas deferens e il più possibile tessuto grasso e connettivo utilizzando il lato curvo delle pinze.
- Pur mantenendo ancora saldamente la regione della prostata uretra / prossimale, utilizzare un paio di forbici sottili e appuntite per rimuovere la vescica dall'uretra.
- Mentre ancora sulla faccia dorsale della regione urogenitale, trovare la base della vescica seminale. Rimuovere con attenzione la vescica seminale e scartare. Eseguire la stessa procedura sul lato opposto.
- Isolamento dei singoli lobi della prostata
- Individuare la prostata anteriore (Figura 1B). Assicurarsi di tenere saldamente la regione/uretra prossimale della prostata con le pinze dritte. Rimuovere la regione della prostata anteriore afferrando direttamente il tessuto con il lato curvo delle pinze e tirandolo saldamente lontano dalla vescica e dal resto della prostata. Collocare il tessuto in PBS.
NOT: Per tutte le regioni della prostata, potrebbe essere necessario sezionare le forbici per rimuovere il tessuto, a seconda delle dimensioni del tumore. - Individuare la regione della prostata ventrale (Figura 1B). Rimuovere la regione della prostata ventrale nello stesso modo in cui nel punto 1.5.7.
- A questo punto della dissezione, dovrebbero essere presenti solo le regioni della prostata laterale e dorsale, mentre la regione prostata prossimale è ancora afferrata dalle pinze dritte. Valutare le regioni laterali e dorsali della prostata (Figura 1B). Se la regione laterale può essere distinta dalla regione dorsale, rimuovere la regione della prostata laterale come descritto nel passaggio 1.5.7. Eseguire la stessa procedura sul lato opposto.
- Rimuovere la regione della prostata dorsale come descritto al punto 1.5.7. Posizionare la regione della prostata prossimale nel 4% di PFA, poiché la sua struttura all'interno del tessuto muscolare dell'uretra lo rende inadatto per la generazione di organiidi.
- Individuare la prostata anteriore (Figura 1B). Assicurarsi di tenere saldamente la regione/uretra prossimale della prostata con le pinze dritte. Rimuovere la regione della prostata anteriore afferrando direttamente il tessuto con il lato curvo delle pinze e tirandolo saldamente lontano dalla vescica e dal resto della prostata. Collocare il tessuto in PBS.
2. Generazione di organoidi 3D da tessuto tumorale della prostata
NOT: Figura 3 Mostra una descrizione pittorica della procedura per la generazione di organoidi tumorali.
- preparazione
- Preparare i supporti organoidi della prostata del topo secondo Drost et al.18 con le seguenti alterazioni. Utilizzare mezzi condizionati invece di proteine ricombinanti per Noggin e R-Spondin e una concentrazione finale dell'1% (v/v), invece del 10%, sia per il mezzo con condizioni di Noggin che per R-Spondin.
NOT: Le cellule HEK293 trattate stabilmente con il topo HA Noggin-Fc o il mouse HA Rspo1-Fc vengono utilizzate per produrre rispettivamente il mezzo condizionato Noggin o R-Spondin. Queste linee cellulari erano un regalo del Calvin Kuo Laboratory della Stanford University. - Preparare la soluzione di digestione in un tubo da 15 mL diluindo 20 mg/mL collagenase II con un supporto avanzato DMEM/F12(z) ad una concentrazione finale di 5 mg/mL. Aggiungere l'inibitore della roccia Y-27632 alla soluzione collagenase II ad una concentrazione finale di 10 M.
NOT: Il rapporto tra buffer di digestione al tessuto è da 1 mL a 50 mg, che usiamo secondo Drost et al.18.
- Preparare i supporti organoidi della prostata del topo secondo Drost et al.18 con le seguenti alterazioni. Utilizzare mezzi condizionati invece di proteine ricombinanti per Noggin e R-Spondin e una concentrazione finale dell'1% (v/v), invece del 10%, sia per il mezzo con condizioni di Noggin che per R-Spondin.
- Mincing e digestione del tessuto tumorale
- Nella cappa di coltura cellulare, posizionare il tessuto tumorale della prostata in un piatto di coltura sterile di 10 cm, sezionare e scartare il tessuto necrotico.
- Tritate il tessuto tumorale della prostata rimanente in 1 mm3 cubi tenendo i pezzi di tessuto con le pinze curve sterili e tagliando con le forbici dissezione.
- Posizionare i pezzi di tumore macinati nel tubo da 15 mL con il tampone di digestione raccogliendoli con il lato curvo delle pinze. Digerire il tessuto tumorale a 37 gradi centigradi con agitazione per 1,5 a 2 h. Controllare l'avanzamento della digestione ogni 20 min.
NOT: In questo momento, estrarre almeno 2 mL di matrice da -20 s di stoccaggio e scongelare sul ghiaccio. 1 mL aliquote di matrice avrà circa 3 h per scongelare. - Dopo la digestione tissutale, il tubo di centrifuga a 175 x g per 5 min a 4 gradi centigradi per formare un pellet cellulare.
- Rimuovere il supernatante, scorrere il tubo per allentare il pellet cellulare, e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di prove pelate preriscaldate integrato con 10 Y-27632 Inibitore della roccia. Mettere il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Dopo l'incubazione, pipette su e giù 5 volte con una punta P1000 standard. Riportare il tubo a 37 gradi centigradi per altri 5 min e ripetere il passaggio 2.2.6.
NOT: In questo momento della procedura, riscaldare un piatto sterile di coltura cellulare a 6 pozzetto mettendolo in un'incubatrice di 55 gradi centigradi.
- Conteggio delle celle e sospensione nella matrice
- Lavare le cellule aggiungendo 9 mL di AdDMEM/F12 freddo (z) e centrifugare il tubo a 175 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante, far scorrere il tubo per allentare il pellet e lavare nuovamente le cellule aggiungendo 10 mL di AdDMEM/F12 freddo. Centrifugare il tubo a 175 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante, sfogliare il tubo per allentare il pellet, riattivare le cellule in 1 mL di AdDMEM/F12 ( ) e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro secondo la procedura standard.
- Sette-otto cupole si adattano in un pozzo di un 6 pozzetto quando gli organoidi sono placcati in matrice tramite una moda drop-saggio. Circa 200 - L di matrice produrrà 7-8 cupole. Decidere quanti pozzi di organoidi sono necessari per futuri scopi sperimentali e calcolare il volume della matrice necessaria. Quindi, calcolare il volume della soluzione contenente cellule necessaria per avere una concentrazione finale di 1,0 x 106 celle /mL di matrice.
- Dopo aver contato le cellule, centrifugare a 175 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere il supernatante, scorrere il tubo per allentare il pellet e risospendere le celle in volume di matrice calcolato al passo 2.3.4.
NOT: La matrice rimane in forma liquida solo a 4 gradi centigradi; mantenere i tubi a matrice e le soluzioni a matrice-cellula sul ghiaccio in ogni momento.
- Cupole matrice di placcatura e applicazione dei media
- Mescolare la soluzione a matrice con un pipet P200 per distribuire uniformemente le celle senza introdurre bolle. Togliere il piatto di coltura a 6 well dall'incubatrice di 55 gradi centigradi.
- Con attenzione pipette 200 - di soluzione a matrice e rilasciare rapidamente la soluzione in un pozzo per creare cupole.
- Ripetere il passaggio 2.4.2. fino a quando non viene speso il volume della soluzione matrice-cella. Lasciare solidificare le cupole a temperatura ambiente per 2 min.
- Capovolgere il piatto a 6 pozzetto a testa in giù e mettere il piatto in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per continuare la solidificazione per 20 min.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 2 mL di supporti organoici della prostata del topo ad ogni pozzo. Aggiungere l'androgeno sintetico R1881 ad ogni pozzo per una concentrazione finale di 1 nM e Y-27632 Rock Inhibitor ad una concentrazione finale di 10 M. Mescolare con cura e mettere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per la coltura.
NOT: I mezzi di coltura degli organiidi devono essere integrati con 10 -M Y-27632 Rock Inhibitor per solo 1 settimana dopo la generazione di organoidi.
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Representative Results
Le immagini di necropsia rappresentative di un topo con un grande tumore alla prostata primario pieno di liquidi nella regione della prostata anteriore sono mostrate nella Figura 2A. Al contrario, Figura 2B, mostra immagini necroscopia rappresentative di un topo con un grande tumore alla prostata primaria solido per il quale le singole regioni della prostata sono indistinguibili. Le immagini di dissezione fluorescente mostrano lo stesso tumore della prostata solida della Figura 2B che esprime GFP, indicando che le cellule tumorali esprimono Cre (Figura 2C). Tessuto che non esprime probasin, come la vescica, esprimere pomodoro e quindi non esprime Cre (Figura 2C). Il fegato e i polmoni del mouse della Figura 2B hanno tumori metastatici che esprimono GFP, dimostrando che hanno avuto origine dal tumore alla prostata primario, e sono circondati da tessuto normale che esprime pomodoro (Figura 2C ). Infine, il linfonodo pelvico di questo topo esprime GFP e non il pomodoro, indicando che questo tumore metastatico ha superato questo organo e non rimane alcun tessuto normale (Figura 2C).
Mostriamo le immagini in Figura 4 di organoidi che abbiamo generato da un tumore alla prostata solido. Al primo giorno si stanno formando piccoli organoidi, come si vede nelle immagini di contrasto di fase rappresentative. Le immagini fluorescenti del giorno 1 mostrano che sia il pomodoro che la GFP esprimono le cellule sono presenti nella coltura organoide tumorale (frecce). Tuttavia, entro il giorno 7, quando gli organoidi tumorali della prostata si sono completamente formati, questi organoidi stanno esprimendo GFP e non pomodoro. Questi dati suggeriscono che questi organoidi hanno avuto origine da cellule tumorali che esprimevano Cre e non da normali cellule epiteliali. Questi organoidi tumorali continuano ad essere solo GFP-positivi come espandiamo la nostra cultura al passaggio 1 e 2.
Nella Figura5, mostriamo immagini di organoidi che abbiamo generato da un tumore alla prostata pieno di liquidi. Il primo giorno si stanno formando piccole organoidi e le immagini fluorescenti mostrano che entrambe le cellule che esprimono il pomodoro e la GFP sono presenti nella coltura organoide - simile alla nostra osservazione al giorno 1 per gli organoidi generati da un solido tumore alla prostata (Figura 4). Tuttavia, gli organoidi di un tumore alla prostata pieno di liquidi esprimono GFP o pomodoro al giorno 7, indicando che gli organoidi si sono formati da cellule che non esprimono Cre. Questo schema continua al passaggio 1 e al passaggio 2, dove la cultura ha organoidi sia pomodori che GFP. Un'ulteriore analisi di questi organoidi è gravemente limitata perché la linea è una miscela di organoidi epiteliali normali e organoidi tumorali. Crediamo che i tumori della prostata riempiti di liquidi siano non ottimali nella generazione di organoidi tumorali semplicemente perché c'è una percentuale maggiore di normali cellule epiteliali della prostata. Poiché sia le normali cellule epiteliali della prostata che le cellule tumorali della prostata formano organoidi, le linee generate da tumori della prostata riempiti di liquidi sono una miscela di organoidi normali e tumorali. Otteniamo linee organoidi tumorali pure da tumori della prostata pieni di liquidi mediante lo smistamento del flusso per le cellule positive alla GFP e generando organoidi da quella popolazione di cellule. I tumori della prostata solida sono costituiti principalmente da cellule tumorali, quindi gli organoidi generati da questi tumori sono una popolazione più pura di organoidi tumorali senza aver precedentemente ordinato per la GFP.
Figura 1 : Il nostro ordine di dissezione raccomandato per i modelli murini geneticamente progettati (GEMM) e l'anatomia della prostata del topo. (A) L'ordine che raccomandiamo nel nostro protocollo per sezionare i principali organi da un GEMM PCa. 1. Regione urogenitale. 2. Linfonodi pelvici. 3. Spleen. 4. Fegato. 5. Reni. 6. Polmoni. 7. Tibia e femore. (B) Mappa della regione urogenitale del topo e anatomia della prostata. Immagini di dissezione fluorescente di un topo di 12 settimane che esprime probasin-Cre e il transgene reporter mT/mG Cre. Vescica (BL), vescicane seminali (SV), prostata anteriore (AP), prostata ventrale (VP), prostata laterale (LP), prostata dorsale (DP) e prostata prossimale (PP). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Immagini rappresentative di dissezione dei modelli murini geneticamente ingegnerizzati (GemM) del cancro alla prostata (PCa). (A) La cavità addominale prima della rimozione della regione urogenitale e della regione urogenitale con un tumore alla prostata pieno di liquido. (B) La cavità addominale prima della rimozione della regione urogenitale e della regione urogenitale con un tumore alla prostata solido. (C) Rappresentante Pomodoro e GFP immagini fluorescenti di un tumore della prostata solida, fegato, polmone, e linfonodo pelvico da un GEMM PCa che sviluppa lesioni metastatiche. Barra della scala : 5 mm. Vescica (BL), prostata anteriore (AP) e prostata dorsale (DP). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : diagramma di flusso del protocollo per la generazione di organoidi tumorali della prostata. Dopo aver sezionato il tumore alla prostata, tritare il tessuto in pezzi da 1 mm. Digerire i pezzi tumorali in collagenae, raccogliere le cellule, e digerire in trypsin per ottenere una sospensione a singola cellula. Dopo aver contato le celle, risospensione nel volume della matrice necessaria per una concentrazione di 1,0 x 106 celle/mL. Piatto cupole in piatto con un metodo drop-saggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Immagini rappresentative della generazione di organoidi tumorali della prostata del topo da un solido tumore alla prostata. Contrasto di fase rappresentativo, pomodoro e GFP immagini fluorescenti del primo giorno, giorno 7, passaggio 1 e passaggio 2 degli organoidi generati da un solido tumore alla prostata del topo. Barra di scala: 100 m. Le frecce indicano singole celle nelle immagini fluorescenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : immagini rappresentative della generazione di organoidi tumorali della prostata del topo da un tumore pieno di liquidi. Contrasto di fase rappresentativo, pomodoro e GFP immagini fluorescenti del primo giorno, giorno 7, passaggio 1 e passaggio 2 di organoidi generati da un tumore alla prostata murino pieno di liquidi. Barra di scala: 100 m. Le frecce indicano singole celle nelle immagini fluorescenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Passi critici all'interno del protocollo per la dissezione del tumore alla prostata e la generazione di organoidi
La rimozione del tessuto non prostatico e la dissezione fine del tumore alla prostata del topo è cruciale per la generazione ottimale di organoidi tumorali poiché sia le cellule epiteliali non prostata che le normali cellule epiteliali della prostata genereranno organoidi. Per i tumori della prostata solida in particolare, è fondamentale isolare aree di tumore vitale per rimuovere la contaminazione con tessuto necrotico che ridurrebbe il numero di cellule vitali. Durante la generazione di organiidi, la digestione dei tessuti con collagenasi deve essere monitorata diligentemente, poiché l'esposizione prolungata al collagenae limiterà la vitalità cellulare. Con organoidi derivati da GEMM tumorali, è fondamentale genotistare completamente ogni linea per garantire che tutti i transgeni e gli alleli modificati che sono stati progettati nel topo siano presenti negli organoidi. La ripetizione della genotipizzazione dopo un passaggio prolungato è necessaria anche per garantire che le modifiche genetiche siano mantenute.
Modifiche e risoluzione dei problemi della dissezione del tumore alla prostata e generazione di organoidi
Abbiamo osservato la variabilità del topo nel tumore della prostata, anche tra gli animali con lo stesso genotipo. Pertanto, modifiche specifiche al protocollo di dissezione della prostata descritto qui possono essere necessarie per ogni mouse. Inoltre, l'adattabilità è necessaria quando si sezionano i tumori metastatici poiché è difficile prevedere la gravità di queste lesioni prima di iniziare la dissezione.
In alcune occasioni, abbiamo osservato una contaminazione in eccesso del nostro pellet cellulare con quello che sembra essere il tessuto connettivo, anche dopo la digestione sia con collagenasi che con la trypsina. In questo caso, risospendiamo nuovamente il pellet in almeno 2 mL di AdDMEM F12(z) e usiamo un colino a 40 celle per rimuovere il tessuto connettivo. Poiché c'è variabilità lotto-lotto nel tasso di solidificazione della matrice, aumentare o diminuire il tempo per la solidificazione della cupola può essere necessario prima dell'applicazione di supporti organoidi.
Limitazioni nell'utilizzo delle GEMM
Mentre le GEMM sono il metodo più rigoroso per gli studi preclinici sul cancro, questo approccio richiede tempo, spese e formazione significativi. Inoltre, la variabilità da topo a topo può, come nello studio degli esseri umani, complicare l'interpretazione dei dati.
Limitazioni nell'uso della coltura cellulare 3D
Rispetto alla coltura cellulare 2D, la generazione e la mantenimento di linee organoidi richiedono tempi e costi maggiori. Per esempio, le nostre linee organoidi tumorali vengono passaggiogni 2-3 settimane, mentre le linee cellulari possono essere passaggiate ogni 2-3 giorni. Questo tasso di crescita più lento degli organoidi aumenta notevolmente il tempo necessario per completare gli esperimenti. I supporti di coltura degli organiidi contengono diversi fattori di crescita e reagenti specializzati, che possono essere costosi a seconda della fonte, quindi generare e mantenere organoidi è più costoso delle tradizionali linee cellulari 2D. Infine, il nostro laboratorio e altri hanno osservato molte differenze nella matrice e in altri reagenti - creando una sfida per mantenere la coerenza nella crescita organoide per esperimenti a lungo termine.
Significato nell'uso della coltura cellulare 3D rispetto ai metodi esistenti/alternativi
La ricerca pre-clinica sul cancro è stata dominata dalla coltura cellulare 2D e dai modelli di xenotrapianto derivati dalla linea cellulare. La crescita cellulare in 2D richiede trasformazione/immortalizzazione, quindi sia gli studi in vitro che di xenotrapianto che utilizzano colture 2D in genere non hanno linee cellulari normali inalterate da utilizzare come controlli non-cancro. L'ultimo decennio di ricerca nella coltura organoide 3D dei normali tessuti di derivazione epiteliale ha ora permesso la crescita di tessuti epiteliali non cancerosi che possono essere utilizzati per confrontare con organoidi analoghi derivati dal tessuto tumorale. Gli organoidi tumorali possono anche essere utilizzati per stabilire xenografi per comprendere ulteriormente lo sviluppo del tumore. Inoltre, gli organoidi non cancerosi possono essere utilizzati per generare xenografi di controllo, il che non era possibile prima che venissero sviluppati metodi di coltura cellulare 3D16.
Significato nell'utilizzo della coltura cellulare 3D nella ricerca sul cancro alla prostata
In studi recenti, gli organoidi sono stati utilizzati per ricapitolare le caratteristiche del tumore alla prostata GEMM. Dardenne et al. mostrano che gli organoidi generati utilizzando tumori della prostata da GEMM che contemporaneamente non hanno il soppressore tumorale Pten e sovraesprimono il MYCN oncogene aveva un potenziale di crescita maggiore rispetto agli organoidi generati utilizzando prostates da controllare i GEMM. Inoltre, sia il sequenziamento che l'immunostochimica hanno mostrato che gli organoidi tumorali riassumevano i profili di espressione dei tumori della prostata, sia mancando di Pten che sovraesprimendo MYCN21. Il Blattner e t al. mostra che la sovraespressione simultanea della prostata di un mutante oncogenico di Speckle Type BTB/PO, proteina SPOP (SPOP) e la delezione di Pten aumenta il tasso di tumorigenesi nei GEMM. Quando gli organoidi della prostata sono stati generati per sovraesprimere il SPOPmutante , la loro proliferazione è stata aumentata rispetto al controllo degli organoidi della prostata e all'espressione del marcatore di lignaggio ricapitolati tumori originali della prostata22. Insieme, questi studi dimostrano che gli organoidi sono un modello ottimale per un ulteriore studio delle caratteristiche del tumore alla prostata in GEMMS.
La coltura organoide è stata utilizzata anche come strumento per valutare le singole sottopopolazioni di cellule tumorali della prostata. Utilizzando tumori GEMM che non hanno Pten e sia Pten che i soppressori tumorali Pten e Trp53 nelle cellule epiteliali prostatari, Agarwal et al. frazionati in progenitori basali e luminosi, hanno propagato queste sottopopolazioni come organoidi, e hanno ulteriormente caratterizzato i loro fenotipi specifici23. Utilizzando così la coltura delle cellule 3D, è possibile caratterizzare le sottopopolazioni di cellule tumorali che possono essere limitate in abbondanza all'interno dei tumori della prostata stessi.
Come descritto in precedenza, le tecniche di coltura cellulare 3D consentono la crescita delle normali cellule epiteliali. Di conseguenza, gli organoidi della prostata generati da GEMM privi di un driver Cre forniscono un modello unico per il monitoraggio in tempo reale della tumorigenesi mediante induzione di Cre ricombinase in vitro. Infatti, Dardenne ealtri ha valutato in che modo la sovraespressione NMYC influisce sul potenziale di crescita nel contesto della perdita di Pten nel tempo esprimendo ectopicamente ERT2-Cre e trattando con tamoxifene21. Inoltre, l'effetto della sovraespressione NMYC sul recettore degli androgeni (AR), il principale obiettivo della terapia per il cancro alla prostata, è stato valutato dopo l'induzione di Cre ricombinarsi in organoidi generati dai GEMM21. Lo stesso sistema di crei inducibile è stato utilizzato da Blattner e altri negli organoid della prostata per misurare come la sovraespressione del SPOP mutante influisce sulla proliferazione delle cellule tumorali prostata e sull'espressione AR22. In particolare, gli esperimenti che inducono l'espressione Cre in vitro hanno un controllo incorporato non-cancro con organoidi trattati dal veicolo.
Limitazioni specifiche nell'uso della coltura cellulare 3D nella ricerca sul cancro alla prostata
Mentre la crescita organoide delle normali cellule epiteliali è un vantaggio dell'uso di tecniche di coltura cellulare 3D, la capacità di far crescere organoidi normali ha anche rappresentato una sfida negli studi di ricerca sul cancro alla prostata. Come mostrato nella nostra sezione risultati rappresentativi, abbiamo osservato la disoccupazione dei normali organoidi della prostata in linee generate da tumori della prostata che sono meno aggressive (Figura 5). Un modo per affrontare questo fenomeno è quello di generare organoidi da GEMM che esprimono un transgene Cre reporter, come mT/mG. La microscopia fluorescente può essere utilizzata per valutare il rapporto relativo tra organoidi normali e tumorali osservando l'espressione di pomodoro e GFP. Inoltre, espressione GFP può essere utilizzato per scorrere ordinare le cellule organoidi per generare linee organoidi tumorali della prostata pura. Agarwal et al. mostrano un metodo di ordinamento per la separazione delle normali cellule epiteliali e cellule tumorali dai tumori della prostata GEMM senza un reporter Cre. Mostrano che le cellule molecolari (EpCAM) aderenti alle cellule epiteliali da tumori della prostata non si separano in sottopopolazioni quando sono state ordinate utilizzando marcatori di superficie cellulare CD24 o Sca-123 - quindi, questi marcatori potrebbero essere impiegati per escludere la normale cellule epiteliali prostatico da tumori della prostata GEMM prima della generazione di organoidi. Il nostro laboratorio e altri hanno osservato che le condizioni in cui le cellule tumorali prostata formano organoidi sembrano selezionare o promuovere programmi di espressione genica specifici del lignaggio caratteristici delle cellule epiteliali basali prostata. Questa è una sfida significativa perché i tumori della prostata sia nei topi che negli esseri umani sono principalmente di natura luminosa, esprimendo AR, CK8 e altri marcatori luminali, e raramente esprimono marcatori di lignaggio basale come p63 o CK5. Anche se questo fenomeno deve ancora essere pubblicato in dettaglio, l'analisi immunoistochimica mostra che l'AR è diminuita negli organoidi Ptenf/ , rispetto alle prostati Ptenf/ z21. La crescita delle cellule epiteliali basali negli organoidi del cancro della prostata mette in discussione se queste linee siano veramente un modello preclinico accurato del cancro alla prostata.
Mentre gli organoidi del cancro alla prostata sono stati documentati per modellare il tumore da cui derivano meglio dalla cultura 2D tradizionale, c'è il potenziale per gli organoidi di subire cambiamenti genetici nella coltura, soprattutto dopo diversi passaggi. Attualmente, non siamo a conoscenza di studi pubblicati che hanno documentato mutazioni genetiche spontanee, guadagni o perdite genetiche o cambiamenti epigenetici che sono comuni dopo il passaggio prolungato di organoidi tumorali del cancro alla prostata. Per limitare la variabilità come risultato di cambiamenti genetici o epigenetici che possono verificarsi a causa di un prolungato passaggio, gli esperimenti dovrebbero essere eseguiti nei primi organoidi da passaggi iniziali (<10) il più spesso possibile.
Applicazioni future della coltura cellulare 3D
Mentre è impossibile prevedere tutte le applicazioni future che saranno sviluppate utilizzando la coltura cellulare 3D nella ricerca sul cancro, ci sono diverse strade che sembrano avere il maggior potenziale. Come per le linee cellulari 2D, effettuare la modificazione genetica in vitro è relativamente semplice negli organoidi. La modifica di geni specifici negli organoidi normali o tumorali apre molte possibilità nello studio dei meccanismi che regolano la tumorigenesi, la progressione del cancro e il trattamento, specialmente quando gli organoidi geneticamente modificati vengono utilizzati per generare organoidi Xenografts. La modificazione genetica degli organoidi è molto vantaggiosa quando le GEMM non esistono per un gene specifico o stabilire un nuovo GEMM non rientra nell'ambito di un particolare studio.
La coltura organoide del cancro ha anche molte potenziali applicazioni per la ricerca clinica. Una libreria di sottotipi tumorali rilevanti all'interno di ogni sistema di organi sia da pazienti che da modelli animali potrebbe essere utilizzata per valutare rapidamente l'efficacia di un nuovo farmaco o una nuova combinazione di farmaci esistenti. Come la coltura cellulare 3D diventa mainstream e aumenta in efficienza, la generazione di organoidi derivati dal paziente ai fini della medicina personalizzata ha il potenziale per aiutare a personalizzare il trattamento per ogni paziente oncologico testando tutti i farmaci e combinazioni disponibili di farmaci che utilizzano la sua linea organoide individuale16.
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Disclosures
Gli autori non hanno rapporti finanziari da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Calvin Kuo Laboratory della Stanford University per aver fornito alle cellule HEK293 catetreganti trascate sia il topo HA Noggin-Fc che l'HA-mouse Rspo1-Fc. Vorremmo anche ringraziare il dottor Dean Tang per averci permesso di accedere al microscopio di dissezione fluorescente nel suo laboratorio. Questo lavoro è stato supportato da CA179907 a D.W.G. dal National Cancer Institute. Le risorse condivise del Roswell Park Comprehensive Cancer Center sono state supportate dal National Institutes of Health Cancer Center Support Grant CA016056.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
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