Summary
Este protocolo serve como um tutorial abrangente para a mistura padronizada e reprodutível de materiais viscosos com uma nova tecnologia de automação de código aberto. Instruções detalhadas são fornecidas sobre o funcionamento de uma estação de trabalho de código aberto recém-desenvolvida, o uso de um designer de protocolo de código aberto e a validação e verificação para identificar misturas reprodutíveis.
Abstract
As etapas atuais de mistura de materiais viscosos dependem de tarefas repetitivas e demoradas que são executadas principalmente manualmente em um modo de baixa produtividade. Essas questões representam desvantagens nos fluxos de trabalho que podem, em última análise, resultar em irreprodutividade dos resultados da pesquisa. Os fluxos de trabalho baseados em manual estão limitando ainda mais o avanço e a adoção generalizada de materiais viscosos, como hidrogéis usados para aplicações biomédicas. Esses desafios podem ser superados usando fluxos de trabalho automatizados com processos padronizados de mixagem para aumentar a reprodutibilidade. Neste estudo, apresentamos instruções passo a passo para usar um designer de protocolo de código aberto, operar uma estação de trabalho de código aberto e identificar misturas reprodutíveis. Especificamente, o designer de protocolo de código aberto orienta o usuário através da seleção experimental de parâmetros e gera um código de protocolo pronto para uso para operar a estação de trabalho. Esta estação de trabalho é otimizada para pipetação de materiais viscosos para permitir o manuseio automatizado e altamente confiável pela integração de docas de temperatura para materiais termoresponsivos, pipetas de deslocamento positiva para materiais viscosos e uma doca opcional de toque de ponta para remover o excesso de material da ponta da pipeta. A validação e verificação das misturas são realizadas por uma medição de absorvância rápida e barata da Laranja G. Este protocolo apresenta resultados para obter 80% (v/v) misturas de glicerol, uma série de diluição para methacryloyl de gelatina (GelMA), e hidrogéis de rede dupla de 5% (w/v) GelMA e 2% (w/v) alginato. Um guia de solução de problemas está incluído para apoiar os usuários com adoção de protocolo. O fluxo de trabalho descrito pode ser amplamente aplicado a uma série de materiais viscosos para gerar concentrações definidas pelo usuário de forma automatizada.
Introduction
A reprodutibilidade e a replicabilidade são de suma importância no trabalho científico1,2,3,4. No entanto, evidências recentes têm destacado desafios significativos na repetição de estudos biomédicos de alto impacto em ciências fundamentais, bem como pesquisas translacionais4,5,6,7. Os fatores que contribuem para resultados irreprodutíveis são complexos e múltiplos, como design de estudo ruim ou tendencioso6,8, poder estatístico insuficiente3,9, falta de conformidade com padrões de relatório7,10,11, pressão para publicar6 ou métodos indisponíveis ou código de software6,9 . Entre elas, mudanças sutis no protocolo e erros humanos na execução de experimentos foram identificados como elementos adicionais que contabilizam a irreproducibilidade4. Por exemplo, as tarefas manuais de pipetação introduzem imprecisões intra e inter-individuais12,13 e aumentam a probabilidade de erros humanos14. Embora os robôs comerciais de manuseio de líquidos sejam capazes de superar essas desvantagens e tenham demonstrado maior confiabilidade para líquidos15,16,17, o manuseio automatizado de materiais com propriedades viscosas significativas ainda é desafiador.
Robôs comerciais de manuseio de líquidos geralmente usam pipetas de almofada de ar, também conhecidas como pistão de ar ou pipetas de deslocamento de ar. O reagente e o pistão são separados por uma almofada de ar que encolhe durante as etapas de distribuição e se expande durante as etapas de aspiração. Usando pipetas de almofada de ar, materiais viscosos 'fluem' apenas lentamente para dentro e para fora da ponta, e a retirada antecipada da pipeta do reservatório pode resultar na aspiração de bolhas de ar. Durante a dispensação das tarefas, o material viscoso deixa um filme na parede da ponta interna que "flui" apenas lentamente ou não quando é forçado pelo ar. Para superar essas questões, pipetas de deslocamento positivas foram introduzidas comercialmente para extrusir ativamente o material viscoso da ponta usando um pistão sólido. Embora essas pipetas de deslocamento positivas permitam o manuseio preciso e confiável de materiais viscosos, soluções automatizadas com pipetas de deslocamento positivas ainda são muito caras para configurações acadêmicas de laboratório e, portanto, a maioria dos fluxos de trabalho com materiais viscosos dependem apenas de tarefas manuais de tubulação18.
Em geral, a viscosidade é definida como a resistência de um fluido ao fluxo, e materiais viscosos estão sendo definidos como materiais com maior viscosidade da água (0,89 mPa·s a 25 °C). No campo das aplicações biomédicas, as configurações experimentais geralmente contêm múltiplos materiais com uma viscosidade maior do que a água, como o sulfóxido de dimetil (DMSO; 1,99 mPa·s a 25 °C), glicerol (208,1 mPa·s a 25 °C para 90% glicerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s a 25 °C) e polímeros inchados pela água, chamados de hidrogéis19, Dia 20. Hidrogéis são redes de polímeros hidrofílicos dispostas em um modo físico ou/e químico usado para várias aplicações, incluindo encapsulamento celular, entrega de medicamentos e atuadores macios19,20,21,22. A viscosidade dos hidrogéis depende da concentração de polímeros e do peso molecular19. Hidrogéis usados rotineiramente para aplicações biomédicas apresentam valores de viscosidade entre 1 e 1000 mPa·s, enquanto sistemas específicos de hidrogel foram relatados com valores de até 6 x 107 mPa·s19,23,24. No entanto, as medidas de viscosidade dos hidrogéis não são padronizadas em termos de protocolo de medição e preparação de amostras, e, portanto, os valores de viscosidade entre diferentes estudos são difíceis de comparar.
Uma vez que as soluções automatizadas disponíveis comercialmente especificamente para hidrogéis estão faltando ou muito caras, os fluxos de trabalho atuais para hidrogel dependem do manuseio manual18. Para entender as limitações do fluxo de trabalho manual atual para a pipetação de hidrogéis, é importante compreender tarefas essenciais de manuseio18. Por exemplo, uma vez sintetizado um novo material de hidrogel, uma concentração desejada ou uma série de diluição com concentrações variadas é gerada para identificar protocolos de síntese confiáveis e características de crosslinking com análise subsequente das propriedades mecânicas25,26,27,28 . Em geral, uma solução de estoque é preparada ou comprada e, posteriormente, misturada com um diluído e/ou outros reagentes para obter uma mistura. As tarefas de mistura não são realizadas diretamente em uma placa de poço (ou qualquer formato de saída), e são bastante executadas em um tubo de reação separado, que é comumente referido como mix mestre. Durante essas tarefas de preparação, várias etapas de aspiração e dispensação são necessárias para transferir o material viscoso(s), misturar os reagentes e transferir a mistura para um formato de saída (por exemplo, uma placa de 96 poços). Essas tarefas requerem uma alta quantidade de trabalho humano18, longas horas experimentais e aumentam a probabilidade de erros humanos que poderiam potencialmente se manifestar como resultados imprecisos. Além disso, o manuseio manual impede a preparação eficiente de números de alta amostra para tela de várias combinações de parâmetros para caracterização detalhada. O processamento manual também impede o uso de hidrogéis para aplicações de triagem de alto rendimento, como a identificação de compostos promissores durante o desenvolvimento de medicamentos. As atuais etapas de preparação manual não são viáveis para a triagem de bibliotecas de drogas compostas por milhares de drogas. Por essas razões, soluções automatizadas são necessárias para fornecer um processo de desenvolvimento eficiente e permitir a tradução bem-sucedida de hidrogéis para aplicações de triagem de medicamentos.
Para passar de fluxos de trabalho baseados em manual para processos automatizados, otimizamos um robô comercial de pipetação de código aberto para o manuseio de materiais viscosos pela integração de docas de temperatura para materiais termoresponsivos, o uso de pipetas de deslocamento positivas fora da prateleira usando pontas de pistão capilar, e uma doca de toque de ponta opcional para limpeza de ponta de pipeta. Este robô pipetting foi ainda mais integrado como um módulo de pipetação em uma estação de trabalho de código aberto recém-desenvolvida, que consiste em módulos prontos para instalação e personalizáveis18,29. Instruções detalhadas de montagem para a estação de trabalho desenvolvida, incluindo arquivos de hardware e software, são livremente acessíveis a partir do GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) e do repositório Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Além do desenvolvimento de hardware, um aplicativo de design de protocolo de código aberto foi programado e liberado para orientar o usuário através do processo de seleção de parâmetros e gerar um código de protocolo pronto para uso (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Este código é executado no robô de tubulação de código aberto comercial, bem como na estação de trabalho de código aberto desenvolvida.
Aqui, um tutorial abrangente é fornecido sobre o funcionamento da estação de trabalho de código aberto para automatizar tarefas de mistura para materiais viscosos (Figura 1). As etapas de protocolo específicas do tutorial podem ser realizadas com a estação de trabalho de código aberto desenvolvida, bem como o robô comercial de pipetting de código aberto. Apoiado por um aplicativo de design de protocolo de código aberto desenvolvido internamente, demonstra-se a mistura automatizada e a preparação das concentrações necessárias para glicerol, gelatina methacryloyl (GelMA) e alginato. O Glicerol foi selecionado neste tutorial, uma vez que é bem caracterizado30,31, é barato e prontamente disponível, e, portanto, é comumente usado como material de referência viscoso para tarefas automatizadas de pipetação. Como exemplos para hidrogéis usados em aplicações biomédicas, soluções precursoras de gelma e hidrogel alginato têm sido aplicadas para experimentos automatizados de mistura. O GelMA apresenta um dos hidrogéis mais utilizados para estudos de encapsulamento celular32,33, e o alginato foi selecionado neste estudo para demonstrar a capacidade de fabricar hidrogéis de rede dupla34,35. Utilizando o Laranja G como corante, foi implementado um procedimento rápido e barato para validar e verificar os resultados da mistura com um espectotômetro16.
Um robô comercial de pipetação de código aberto foi integrado como um módulo de pipetação na estação de trabalho de código aberto desenvolvida (Figura 2a), e, portanto, o nome 'módulo de pipetação' é ainda usado para descrever o robô pipetting. Uma descrição detalhada do hardware instalado está além do escopo deste protocolo e está disponível através dos repositórios fornecidos, que também incluem instruções passo a passo para a assembleia geral da plataforma de código aberto. O módulo de tubulação pode ser equipado com duas pipetas (pipeta de um ou 8 canais) que são instaladas no eixo A (direita) e no eixo B (esquerda) (Figura 2b). O módulo de tubulação oferece uma capacidade de 10 decks de acordo com as normas do American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS), e as seguintes posições de localização são definidas no convés: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Figura 2c). Para iniciar a polimerização induzida por foto de soluções de hidrogel, é necessário um módulo crosslinker separado e foi adicionado à estação de trabalho. O módulo crosslinker é equipado com LEDs com um comprimento de onda de 400 nm e, portanto, substâncias que excitam em um comprimento de onda de luz visível podem ser usadas com os sistemas atuais, como fenil de lítio-2,4,6 trimetilbenzoylphosphinate (LAP)36,37. A intensidade (em mW/cm2) dos LEDs pode ser abordada pelo usuário no aplicativo de design de protocolo para estudar o comportamento de crosslinking38. A estação de trabalho inclui também um módulo de armazenamento para permitir o aumento dos estudos de throughput; no entanto, este módulo não é utilizado neste estudo e, portanto, não descrito posteriormente. Em geral, recomenda-se operar o módulo de tubulação em um armário de segurança biológica para evitar a contaminação da amostra. O principal circuito de potência para operar o módulo de tubulação é um circuito de 12 V, que é considerado como uma aplicação de baixa tensão na maioria dos países. Todos os componentes elétricos são baseados em uma caixa de controle dedicada que impede que os usuários entrem em contato com a fonte de um perigo elétrico.
Seguindo esses protocolos padronizados de mistura, os pesquisadores são capazes de alcançar misturas confiáveis para materiais viscosos e não viscosos de forma automatizada. A abordagem de código aberto permite que os usuários otimizem sequências de mixagem e compartilhem protocolos recém-desenvolvidos com a comunidade. Em última análise, essa abordagem facilitará a triagem de múltiplas combinações de parâmetros para investigar as interdependências entre diferentes fatores e, assim, acelerar a aplicação confiável e o desenvolvimento de materiais viscosos para aplicações biomédicas.
Protocol
NOTA: O protocolo começa com uma introdução ao (1) software e (2) à configuração de hardware para familiarizar o usuário com as instalações necessárias e a estação de trabalho. Após uma seção sobre (3) preparação do material e (4) o uso da aplicação do designer de protocolo, (5) a calibração do módulo de pipetação e (6) a execução do protocolo automatizado é destacada em detalhes. Por fim, (7) são descritos procedimentos de validação e verificação, incluindo leitura de absorvência e análise de dados. Um fluxo de trabalho de protocolo geral com tarefas individuais é exibido na Figura 1.
1. Configuração do software
NOTA: Esta seção inclui uma instrução detalhada para instalar a interface de programação de aplicativos (API), bem como a aplicação de designer de protocolo necessária e o terminal de calibração. As instruções a seguir são escritas para um computador de placa única Raspberry Pi (RPi); no entanto, também o Windows 8, 10 e macOS 10.13+ foram usados com sucesso com a API e os aplicativos.
- Configure o ambiente do computador.
NOTA: Conheça o básico do Python39, como configurar e usar um Raspberry Pi40,41 e como se conectar à internet42. As seguintes etapas do tutorial se concentram em etapas específicas do protocolo e informações adicionais sobre o uso de um Raspberry Pi estão disponíveis online40.- Abra uma janela de terminal na barra de tarefas ou menu de aplicativos.
- Atualize a lista de pacotes do sistema:
sudo apt-get atualização - Atualize todos os pacotes instalados:
sudo apt-get dist-upgrade - Reinicie o Raspberry Pi:
reboot de sudo - Verifique a versão do Python instalada:
python3 --versão
Certifique-se de que pelo menos o Python 3.5 esteja instalado; se não, instale a versão mais recente43. - Instale o python pip, que publica pacotes Python com o Python Package Index44:
sudo apt-get instalar python3-pip - Instale dependências:
pip instalar numpy
pip instalar python-redimensionar imagem
NOTA: Se você estiver usando o Windows, você precisa instalar o pacote de maldições do windows via: python -m pip instalar janelas-maldições
- Instale a interface de programação de aplicativos (API).
NOTA: A API fornece uma estrutura Python simples projetada para escrever protocolos experimentais script e operar a estação de trabalho. As duas APIs a seguir são necessárias para executar com sucesso o código de protocolo gerado.- Instale a API da estação de trabalho:
pip instalar estação de trabalho aberto - Instale a API opentrons para operar o módulo de tubulação:
pip instalar opentrons===2.5.2 - Verifique se a API está instalada com sucesso:
píton3
>>> importação de estação aberta
>>> importação de opentrons
NOTA: O tamanho da API e do aplicativo de design de protocolo é de 2,2 MB e 1,2 MB, respectivamente. Nenhum problema foi experimentado durante a instalação quando usado com espaço limitado em disco (200 MB). No entanto, os requisitos de espaço em disco dependem do sistema operacional.
- Instale a API da estação de trabalho:
- Selecione um diretório para download de arquivos (terminal de calibração, aplicativo de design de protocolo, etc.).
NOTA: Os arquivos podem ser copiados e colados em outros lugares posteriormente. - Arquivos de clones do repositório GitHub:
https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation do clone git
NOTA: O comando 'git clone' clona e, posteriormente, salva todos os arquivos no diretório, que está aberto no terminal neste momento. Como o repositório também inclui os arquivos de hardware para o conjunto, nem todo o repositório é necessário para executar os protocolos apresentados. Todos os arquivos necessários para replicar os experimentos estão disponíveis como Arquivo Suplementar e no repositório do GitHub em "/exemplos/publicação-JoVE". - Abra a pasta baixada. Se todo o repositório foi baixado, navegue até a pasta 'publicação-JoVE' via
cd openworkstation/exemplos/publication-JoVE
NOTA: Esta pasta inclui arquivos necessários para o funcionamento da estação de trabalho e o uso do aplicativo de designer de protocolo e do terminal de calibração.
2. Configuração de hardware
- Coloque a estação de trabalho em um armário de segurança biológica para evitar a contaminação da amostra.
- Instale pipetas na estação de trabalho.
- Selecione o tamanho da pipeta com base na configuração experimental. Em geral, pegue um tamanho de pipeta que o volume a ser aspirado está na extremidade superior da gama. Se a mistura de tarefas com volumes superiores a 1 mL for necessária para uma configuração específica (por exemplo, aspirando/dispensando 2 mL), escolha o M1000E com um volume máximo de aspiração/dispensação de 1.000 μL para minimizar as etapas de pipetação e economizar tempo.
NOTA: Uma instrução detalhada para pipetas de deslocamento de ar está disponível online45. O módulo de pipetação desenvolvido é capaz de integrar as seguintes pipetas de deslocamento positivo fora da prateleira: M10E (1-10 μL), M25E (3-25 μL), M50E (20-50 μL), M100E (10-100 μL), M250E (50-250 μl), M1000e (100-1.000 μL). - Use uma chave M4 Allen para soltar e apertar os parafusos.
- Conecte as duas placas de fixação da pipeta (placas de acrílico branco) ao trilho de alumínio e aperte os parafusos M5 livremente.
- Insira a pipeta nas duas placas de fixação da pipeta e certifique-se de que a cauda ergonômica da pipeta esteja descansando no lado oposto da placa de montagem acrílica.
- Aperte os quatro parafusos das duas placas de fixação da pipeta com firmeza.
- Deslize as duas porcas quadradas de fixação, que estão presas à placa de montagem acrílica, na ranhura de extrusão do eixo z e aperte os parafusos.
NOTA: Aperte a pipeta firmemente para evitar qualquer movimento durante a operação.
- Selecione o tamanho da pipeta com base na configuração experimental. Em geral, pegue um tamanho de pipeta que o volume a ser aspirado está na extremidade superior da gama. Se a mistura de tarefas com volumes superiores a 1 mL for necessária para uma configuração específica (por exemplo, aspirando/dispensando 2 mL), escolha o M1000E com um volume máximo de aspiração/dispensação de 1.000 μL para minimizar as etapas de pipetação e economizar tempo.
3. Preparação do material
NOTA: Os materiais viscosos (glicerol, GelMA, alginato) são utilizados para os experimentos apresentados neste estudo e, portanto, os volumes preparados e tarefas de manuseio (por exemplo, adicionar 5 mL de solução de estoque em tubos de reação de 5 mL) são especificamente para esta configuração experimental.
- Methacryloyl gelatina (GelMA)
NOTA: A funcionalização do GelMA, a diálise e a liofilização não são o escopo deste artigo, e um protocolo passo a passo está disponível em Loessner et al.33. O protocolo começa a utilizar o GelMA liofilizado, que pode ser preparado internamente ou comprado comercialmente.- Calcular a massa necessária de GelMA (mGelMA) com base na concentração final de estoque (cGelMA) e volume (VGelMA) desejada usando a equação:
mGelMA = cGelMA x VGelMA
NOTA: O VGelMA depende da configuração experimental e recomenda-se preparar 20-30% de excesso de material. Os protocolos apresentados começam com 5 mL de 20% (w/v) GelMA como solução de estoque. - Pesar a quantidade necessária de GelMA liofilizada, adicioná-lo em um tubo de reação de 50 mL e adicionar a quantidade necessária de salina tamponada de fosfato (PBS).
- Misture o GelMA, absorvendo o solvente a 4 °C durante a noite ou aquecendo até 60 °C por 6h em banho-maria.
NOTA: As soluções estéreis de GelMA podem ser armazenadas protegidas da luz a 4 °C por pelo menos seis meses. - Encha 5 mL de GelMA em tubos de reação de 5 mL.
- Calcular a massa necessária de GelMA (mGelMA) com base na concentração final de estoque (cGelMA) e volume (VGelMA) desejada usando a equação:
- Fotoinitiador: Fenil de lítio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)
NOTA: Evite exposição adicional à luz do quarto, uma vez que o LAP é sensível à luz.- Calcule a massa necessária de LAP (mLAP) com base na concentração final de estoque (cLAP) e no volume necessário (VLAP) usando a equação:
mLAP = cLAP x VLAP
NOTA: Recomenda-se preparar uma solução de estoque de 3% (w/v). - Pese a quantidade necessária de LAP, adicione-a em um tubo de reação de 15 mL e adicione PBS.
- Enrole o tubo em papel alumínio para evitar a decomposição induzida por foto.
- Dissolva a LAP colocando o tubo de reação em um banho de água a 37 °C por 2h ou até dissolver totalmente.
- Encha 1 mL de solução de estoque LAP em tubos de 5 mL.
- Calcule a massa necessária de LAP (mLAP) com base na concentração final de estoque (cLAP) e no volume necessário (VLAP) usando a equação:
- Alginato
- Calcular a quantidade necessária de alginato (malginato) com base na concentração final de estoque (calginate) e volume (Valginate) desejada usando a equação:
malginato = calginato x Valginate
NOTA: O valginato depende da configuração experimental e recomenda-se preparar 20-30% de excesso de material. Os protocolos apresentados começam com 5 mL de 4% (c/v) alginato como solução de estoque. - Pesar a massa necessária de alginato, adicione-a em tubos de reação de 50 mL e adicione PBS.
- Coloque a mistura de alginato em um banho de água a 37 °C por 4h.
NOTA: O uso de um misturador de vórtice acelerará o processo de dissolução, mas também gerará bolhas de ar. O alginato dissolvido pode ser armazenado a 4 °C por pelo menos seis meses. - Encha 5 mL de alginato em tubos de reação de 5 mL.
- Calcular a quantidade necessária de alginato (malginato) com base na concentração final de estoque (calginate) e volume (Valginate) desejada usando a equação:
- Encha 5 mL de glicerol em tubos de reação de 5 mL.
- Solução Laranja G
- Prepare uma solução de estoque de 10 mg/mL de Laranja G em um tubo de reação de 50 mL.
NOTA: O volume depende do número de experimentos. Dependendo do tipo diluído, prepare a solução de estoque em água ultrapura, PBS ou um reagente diluído adequado. Nos experimentos apresentados, a água ultrauso foi utilizada para diluir glicerol e PBS para diluir GelMA e alginato. O PBS foi usado como diluente para GelMA e alginato, e pode ser preparado usando tablets ou comprado fora da prateleira. - Misture por 10 s por vórtice.
- Enrole o tubo em papel alumínio para evitar a decomposição induzida por foto.
NOTA: A solução de estoque pode ser usada após 24 horas para garantir a dissolução adequada da Laranja G. - Solução de estoque diluído para uma solução de trabalho de 1 mg/mL em um tubo de reação de 50 mL.
- Transfira a solução de trabalho para frascos/tubos apropriados para a configuração experimental.
NOTA: Para os experimentos apresentados, a solução de trabalho foi preenchida em tubos de 5 mL. O estoque laranja G e a solução de trabalho podem ser armazenados a 4 °C e usados dentro de três meses após a preparação. - Encha 5 mL da solução de trabalho Laranja G de 1 mg/mL em tubos de reação de 5 mL.
- Prepare uma solução de estoque de 10 mg/mL de Laranja G em um tubo de reação de 50 mL.
4. Gere código de protocolo com o aplicativo de designer de protocolo
NOTA: Os parâmetros especificados nas etapas 4.2-4.7 são os mesmos para todos os experimentos conduzidos, exceto para a concentração de estoque do material e a concentração final de saída. Esses parâmetros são resumidos na Tabela 1 e, na seguinte, os parâmetros são utilizados para preparar hidrogéis de rede dupla com 5% (c/v) GelMA, 2% (w/v) alginato, 0,15% (w/v) LAP e PBS como diluente.
- Abra o aplicativo de designer de protocolo executando 'ProtocolDesignApp.html'.
NOTA: O aplicativo "ProtocolDesignApp.html" orienta o usuário através do processo de seleção de parâmetros e gera automaticamente o protocolo pronto para uso para operar a estação de trabalho. A interface do usuário é executada em todos os navegadores de internet comumente usados (ou seja, Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer). - Digite o nome do protocolo (por exemplo, hidrogéis de rede dupla) na página de configuração.
- Clique em 'Continuar' para confirmar o nome do protocolo e proceda para a próxima etapa.
- Defina a bandeja de entrada selecionando 'Bloco de aquecimento 3x4' no menu suspenso e os seguintes parâmetros de entrada:
- Selecione 'Gel 1' no menu suspenso, digite o nome 'GelMA', digite '20%', defina 'Número de Amostras' para '3' para preencher uma coluna. Clique em '+adicionar' para salvar entradas.
- Selecione 'Gel 2' no menu suspenso, digite o nome: 'Alginato', digite concentração de estoque '4%', defina 'Número de Amostras' para '3' para preencher uma coluna. Clique em '+adicionar' para salvar entradas.
- Selecione 'Fotoinitiador' no menu suspenso, digite o nome: 'LAP', digite '3%', defina 'Número de Amostras' para '3' para preencher uma coluna. Clique em '+adicionar' para salvar entradas.
- Selecione 'Diluent 1' no menu suspenso, digite o nome: 'PBS', defina 'Número de Amostras' para '3' para preencher uma coluna. Clique em '+adicionar' para salvar entradas.
NOTA: A visualização da bandeja de entrada é atualizada automaticamente, uma vez que '+add' é clicada. Se mais entradas forem adicionadas do que a capacidade da bandeja, o aviso "Muitas amostras para esta bandeja" será mostrado ao usuário.
- Defina parâmetros de crosslinking verificando 'Crosslinking de fotos' e digitando o tempo em segundos, '30' e a intensidade W/m2 com '2'.
- Finalize a configuração de entrada clicando em 'CONTINUAR'.
- Defina a configuração da bandeja de saída selecionando 'placa de 96 poços' no menu suspenso para tipo de placa de poço.
- Clique em 'Group1' para definir saídas criando um grupo de amostras.
- Especifique a composição da saída inserindo concentrações desejadas e volume de amostra nos campos para cada entrada: GelMA = '5', Alginato = '2', LAP = '0,15', Volume Total = '60'.
- Caixa de seleção para aplicar protocolo avançado de mixagem.
- Especifique o número de amostras inserindo o número de amostras no campo 'Número de Amostras': '96'.
NOTA: A visualização da bandeja de amostra é atualizada automaticamente, uma vez que '+adicionar grupo' é clicada. Se mais amostras forem adicionadas do que a capacidade da bandeja, o aviso "Muitas amostras para esta bandeja" será mostrado ao usuário. - Finalize a configuração de saída clicando em 'CONTINUAR'.
- Selecione a posição da bandeja no layout do deck e prepare a plataforma de acordo:
- Verifique a marca de verificação no campo 'SLOT A1' e selecione 'Empty_Cell' no menu suspenso.
- Verifique a marca de verificação no campo 'SLOT A2' e selecione 'Trash_Cell' no menu suspenso.
- Verifique a marca de verificação no campo 'SLOT B1' e selecione 'Tips_Cell_100 μL' no menu suspenso.
- Verifique a marca de verificação no campo 'SLOT B2' e selecione 'Tips_Cell_1000 μL' no menu suspenso.
- Verifique a marca de verificação no campo 'SLOT C1' e selecione 'Input_Cell' no menu suspenso.
- Verifique a marca de verificação no campo 'SLOT C2' e selecione 'Empty_Cell' no menu suspenso.
- Verifique a marca de verificação no campo 'SLOT D1' e selecione 'Mixing_Cell' no menu suspenso.
- Verifique a marca de verificação no campo 'SLOT D2' e selecione 'Output_Cell' no menu suspenso.
- Defina o tipo e as características da primeira pipeta (M100E) verificando 'Pipeta Esquerda', selecionando 'deslocamento positivo de 10-100μL' do menu suspenso e definindo a velocidade de aspiração = '600', velocidade de distribuição = '800'.
- Defina o tipo e as características da segunda pipeta (M1000E) verificando 'Pipette Right', selecionando 'deslocamento positivo de 100-1000μL' do menu suspenso e configurando velocidade de aspiração = '800', velocidade de distribuição = '1200'.
- Clique em 'GERAR PROTOCOLO' para confirmar a configuração e gerar o script de protocolo.
NOTA: O aplicativo de designer de protocolo desenvolvido gera automaticamente uma nova pasta sempre que um novo protocolo é gerado. Todos os arquivos necessários para este experimento e para operar a estação de trabalho são salvos nesta pasta que tem o nome do nome do protocolo. A pasta pode ser copiada em diferentes diretórios sem causar problemas. - Não feche a interface, pois ela será usada para executar o protocolo (ver passo 6.6.).
5. Calibração do módulo de tubulação
NOTA: Os recipientes (por exemplo, placas de poço, rack de ponta, lixo) e pipetas (por exemplo, M1000E) devem ser calibrados inicialmente. Se um recipiente e/ou uma posição de pipeta forem modificados/alterados, a nova posição deve ser calibrada.
- Navegue até a pasta de protocolo e abra o terminal de calibração executando o arquivo 'calibrate.py' em um windox terminal (ver passo 1.1.1):
phython.calibrate.py
NOTA: A interface 'calibrate.py' orienta o usuário através da calibração da configuração do deck e das pipetas. Certifique-se de que o arquivo está na mesma pasta que o arquivo de protocolo e os arquivos do módulo. É gerado automaticamente na etapa 4.10. - Selecione incrementos de movimento para êmbolo,y,z com o teclado numérico (1−8): '1' para 0,1 mm, '2' para 0,5 mm, '3' para 1 mm, '4' para 5 mm, '5' para 10, '6' para 20 mm, '7' para 40 mm e '8' para 80 mm.
- Calibrar a pipeta.
- Pressione o atalho do teclado P para selecionar o tamanho da pipeta.
- Pressione o atalho do teclado V para entrar no modo de calibração do êmbolo.
NOTA: Recomenda-se começar com pequenos incrementos (2, 5 e 10 mm) para se familiarizar com o tamanho de incremento e ação de movimento da cabeça da pipeta. - Calibrar as seguintes posições do êmbolo para uma pipeta de deslocamento positiva: T–Top = posição de descanso; B-Bottom = êmbolo é empurrado até que a resistência seja atingida; P-Pick-up = êmbolo é empurrado para uma posição onde uma ponta de pistão pode ser anexada; E-Eject = êmbolo é empurrado até que uma ponta anexada seja ejetada. Varie as posições do êmbolo usando as setas para cima e para baixo no teclado e salve a posição final usando S no teclado.
- Deixe o modo de calibração do êmbolo da pipeta pressionando o atalho do teclado V.
- Calibrar a posição do recipiente em relação à ponta da pipeta.
- Pressione o atalho do teclado P para selecionar o tipo de pipeta. Certifique-se de que uma ponta está conectada ao tubo selecionado.
- Pressione o atalho do teclado C para selecionar o tipo de contêiner.
- Selecione um incremento de movimento apropriado e mova a ponta da pipeta para as seguintes posições. Para placas de poço, calibrar para a posição do poço 'A1' na parte inferior; Para rack de ponta, calibrar para a posição 'A1'; Para o lixo, escolha uma posição (definida como um ponto) onde a ponta pode ser ejetada no lixo.
- Pressione o atalho do teclado S para salvar a posição.
- Repetir as etapas 5.3.1−5.3.3 para todos os recipientes listados em 'C' para o tipo de pipeta selecionada.
- Repita 5.3.1−5.3.5 para o segundo tipo de pipeta.
- Feche o script de calibração.
6. Execução protocolar com a estação de trabalho
NOTA: Os arquivos de protocolo são acessíveis através do repositório e também estão disponíveis como Arquivo Suplementar.
- Posicione o recipiente de lixo, os racks de ponta, a bandeja de entrada, a bandeja de mistura e a saída no deck (definido na etapa 4.3).
- Calibrar pipetas e instrumentos conforme definido na seção 5.
- Se necessário, ligue a doca de temperatura e selecione a temperatura para entrada e bandeja de mistura.
NOTA: Os experimentos neste tutorial foram realizados sem controle de temperatura e a 40 °C para glicerol, e 37 °C para tubos de GelMA e alginato. - Posicione tubos com reagentes de entrada nos blocos de alumínio nas docas de temperatura de acordo com a configuração selecionada.
- Aguarde até que os reagentes de entrada tenham atingido a temperatura desejada.
NOTA: Para garantir a distribuição adequada da temperatura, recomenda-se um tempo de incubação de 30 min para GelMA e alginato. - Execute o arquivo de protocolo clicando em 'RUN PYTHON SCRIPT'
NOTA: O protocolo selecionado agora é executado pela estação de trabalho. O vídeo que acompanha destaca a mistura automatizada do GelMA e a distribuição de 60 μL em uma placa de 96 poços. - A execução é concluída, quando 'Finished' for exibido.
7. Processo de validação e verificação
- Retire a placa do poço da estação de trabalho e transporte a placa do poço com as amostras para um espectrômetro.
- Leia absorvência com um espectrofotômetro a 450 nm. Leia cada placa 2x para comparar resultados e garantir resultados consistentes.
- Exportar e salvar leituras de absorvência.
- Análise de dados.
NOTA: Os dados experimentais podem ser processados individualmente ou copiados e colados no modelo fornecido para avaliar a média, o desvio padrão e o coeficiente de variância (CV) usando o software de planilha.- Abra o arquivo suplementar 'supplementary_template-analysis.xlsx", que também é vailável dentro do repositório do GitHub em "openworkstation/exemplos/publication-JoVE.
- Copie as leituras de absorvência na folha 'dados brutos', certifique-se de que todas as referências celulares sejam corretamente definidas em todas as tabelas e clique na folha de 'análise' para obter informações sobre os valores médios, desvio padrão e coeficiente de variância (CV).
NOTA: Dependendo da distribuição da amostra em uma placa de poço, os seguintes tipos de avaliação predefinidos estão disponíveis com o modelo: o tipo 'Uniforme' é usado quando todas as amostras têm a mesma composição, o tipo 'Por linhas' é usado quando amostras em diferentes linhas têm composições diferentes, o tipo 'Por colunas' é usado quando as amostras em diferentes colunas têm composições diferentes, e o tipo 'Personalizado' é usado quando as posições de amostra são específicas do usuário.
Representative Results
Este tutorial apresenta resultados para experimentos com glicerol (Figura 3) e GelMA com LAP e alginato (Figura 4).
A geração de uma solução de glicerol de 80% (v/v) foi investigada sem controle de temperatura (temperatura ambiente, 22 °C) e sem toque de ponta (definida como configuração 1), com controle de temperatura (40 °C) e sem toque de ponta (configuração 2), ou com controle de temperatura (40 °C) e com toque de ponta (configuração 3) (Figura 3a-i). Essas duas configurações de temperatura foram escolhidas para avaliar a diferença de manuseio, uma vez que a viscosidade do glicerol está diminuindo quase por um fator de 3 quando aquecido de 22 °C (139,5 mPa·s) a 40 °C (46,6 mPa·s)30. Uma solução de estoque de 85% (v/v) de glicerol foi diluída para uma concentração final de 80% e distribuída uniformemente em uma placa de 96 poços (n = 96 por configuração). O tempo experimental, que inclui a distribuição de cada material no tubo de mistura, as respectivas tarefas de mistura e distribuição de amostras em uma placa de 96 poços, foi de 30 min 42 s. Para identificar diferenças entre as misturas de diluição, a água ultrauso – como diluente para glicerol – foi preparada com 1 mg/mL laranja G. As leituras de absorvência destacam que a integração do controle de temperatura e do toque da ponta impacta significativamente as misturas (p < 0,0001). Além da análise bidirecional realizada de variância (ANOVA), os valores cv foram calculados para avaliar o desvio padrão relativo. O coeficiente de variação descreve um indicador padronizado para identificar o grau de desvio em relação à média e é expresso em percentual. Se os meios amostrais não são particularmente o ponto de interesse, mas a variabilidade dentro das medições, o coeficiente de variação fornece insights adicionais para identificar misturas reprodutíveis46. Dentro deste experimento com três configurações diferentes, os valores de absorção mostraram valores de CV decrescentes de 5,6%, 4,2%, para 2,0% para configuração 1, configuração 2 e configuração 3, respectivamente, demonstrando a influência significativa da doca de temperatura e da função de toque de ponta na produção de resultados confiáveis (Figura 3a-ii). A plotagem dos valores de absorção amostral para a configuração 3 (número de amostra #1 a #96 em uma placa de poço de 96) não produz valores crescentes ou decrescentes ao longo do experimento e, portanto, não indica influência da posição amostral sobre os valores de absorvância (Figura 3a-iii). Visualizar os dados de cada placa de poço medido com mapas de calor fornece insights adicionais para identificar heterogeneidades para uma linha ou coluna específica, ou valores de absorção variados ao longo das tarefas de dispensação. Os heatmaps visualizados para as três configurações exibiram heterogeneidades em todas as placas do poço, da configuração 1 à configuração 3 (Figura 3b). Finalmente, a replicabilidade da mixagem conduzida foi avaliada dentro de oito corridas independentes (Figura 3c-i,ii), onde cada corrida levou 6 min 57 s. As corridas de mixagem única apresentaram baixos valores de CV entre 1,1% e 2,6%, o que indica tarefas de mixagem e dispensação muito confiáveis para as corridas individuais. Os valores de absorção das oito corridas renderam um valor cv de 3,3% e demonstraram a reprodutibilidade do protocolo de mixagem estabelecido.
As séries de diluição do GelMA foram preparadas diluindo uma solução de estoque de 20% (w/v) com PBS para 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 e 0% (w/v) e adicionando LAP a uma concentração constante de 0,15% (w/v) (Figura 4a-i), que levou no total 55 min 12 s. Conforme especificado no script de protocolo experimental, o hidrogel foi cruzado para 30 s com uma intensidade de 2,0 mW/cm2 a 400 nm. Para avaliar as diferenças entre as misturas, o PBS –como diluente para GelMA e alginato–, foi preparado com 1 mg/mL Laranja G. Assim, a diferença de absorção entre amostras dentro de uma mistura, bem como entre as diluições seriais, é identificada com um espectotômetro. Os valores de absorção medidos de cada etapa de concentração são significativamente diferentes (p < 0,0001) e têm valores de CV muito baixos entre 1,2% e 3,4% ao longo das etapas de concentração (n = 12 por passo de concentração). A regressão linear demonstrou alto ajuste com um valor de R² de 0,9869 (Figura 4a-ii) e um mapa de calor confirmou a distribuição homogênea para cada concentração e a diferença entre as concentrações (Figura 4a-iii). A mistura automatizada de quatro reagentes foi realizada para a geração de 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginato, 0,15% (w/v) LAP e PBS como diluente sem (configuração 2) e com (configuração 3) ponta sensível (n = 96 para cada configuração) com os mesmos parâmetros de crosslinking (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm). A distribuição dos quatro materiais, misturando e distribuindo em uma placa de 96 poços levou 32 min 22 s. Todos os experimentos com GelMA e alginato foram realizados a 37 °C para evitar gelagem térmica que previne a tubulação de GelMA. Com a opção de toque de ponta, o valor do CV foi reduzido de 5,2% para 3,4% e, principalmente, os outliers da região inferior foram impedidos pela remoção do excesso de material da ponta (Figura 4b-i). Embora o valor médio de 1.927 e 1.944 para a configuração 2 e a configuração 3 estejam muito próximos, o coeficiente de variação destaca o desvio decrescente em relação à média. Linhas únicas da placa de 96 poços podem ser comparadas entre si usando uma visualização do mapa de calor para detectar diferenças de linha e/ou coluna (Figura 4b-ii).
Figura 1: Fluxo de trabalho de protocolo com tarefas individuais. O fluxo de trabalho descrito é dividido em sete tarefas, que são separadas em configuração, preparação, execução e análise. No início, o software (tarefa 1) bem como o hardware (tarefa 2) devem ser configurados. Após a elaboração dos materiais (tarefa 3) e a geração do script de protocolo (tarefa 4), o módulo de tubulação é calibrado definindo as posições de pipeta e recipiente (tarefa 5). Em seguida, o script de protocolo é executado na estação de trabalho (tarefa 6) e a validação e verificação (tarefa 7) de misturas são realizadas para avaliar misturas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estação de trabalho de código aberto e configuração do deck do módulo de tubulação. a A estação de trabalho desenvolvida é inspirada em uma abordagem de linha de montagem, onde as amostras estão sendo transportadas através de diferentes módulos, e consiste nos seguintes módulos: pipetting, crosslinker, armazenamento, transporte e módulo computacional. (b) O deck do módulo de tubulação está configurado dependendo do layout experimental (por exemplo, tipo de placa de poço, volume do tubo, etc.). A configuração do deck exibido foi usada para os experimentos apresentados e consiste em pipetas de deslocamento positivas com uma faixa de 10-100 μL (M100E) e 100-1.000 μL (M 1000E), os racks de ponta com pistões capilares (CP) para 100 μL (CP1000) e 1.000 μL (CP1000), um recipiente de lixo, uma bandeja de mistura, e uma bandeja de entrada para os reagentes de entrada. c As posições disponíveis do deck são definidas com os números exibidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados para pipetização automatizada de misturas de glicerol. a O design flexível da estação de trabalho permite a avaliação de três configurações diferentes (i) para identificar parâmetros ideais para resultados reprodutíveis. (ii) A adição de um toque de ponta e aquecimento do material resultou em um coeficiente reduzido de valores de variância (CV) e misturas altamente reprodutíveis para a configuração 3. Cada experimento foi realizado com 96 amostras. (iii) A plotagem dos valores amostrais únicos não mostrou influência na sequência de pipetação. b Os resultados experimentais de cada configuração foram visualizados com mapas de calor para identificar a influência nas diferenças brutas/colunas, bordas ou mistura mestre. c A reprodutibilidade da configuração 3 foi analisada dentro de oito corridas independentes utilizando (i) mediana, desvio padrão, valor cv e (ii) mapas de calor. Os dados nos painéis a-ii (n = 96) e b-i (n = 12) são apresentados com os meios e os pontos de dados únicos. A significância estatística foi definida como ****p < 0,0001 utilizando análise bidirecional de variância (ANOVA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados para a mistura de tarefas com hidrogéis. a A partir de uma solução de estoque de gelatina metacriloyl (GelMA) 20% (w/v), uma diluição serial de 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 e 0% (w/v) foi gerada dentro de uma corrida experimental usando uma placa de 96 poços (n = 12 por concentração). i O coeficiente de variância (CV) variou entre 1,2% e 3,4% ao longo das concentrações preparadas, e (ii) a regressão linear apresentou alto ajuste com um valor de R² de 0,9869. (iii) Diluições homogêneas foram confirmadas visualmente com o mapa de calor gerado. (b) Foram gerados hidrogéis de rede dupla com 5% (p/v) GelMA, 2% (w/v) alginato e 0,15% (w/v) LAP (i) com e sem toque de ponta (n = 96 para cada configuração) e cruzados para 30 s com intensidade de 2,0 mW/cm2 a 400 nm. A integração do toque de ponta resultou na diminuição dos valores de CV de 5,2% para 3,4%. (ii,iii) Os mapas de calor confirmam menos desvios ao usar o toque de ponta para remover o excesso de material da ponta. Os dados nos painéis a-i e b-i são apresentados com os meios e os pontos de dados únicos. A significância estatística foi definida como *p < 0,05, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001 utilizando análise unidirecional de variância (ANOVA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resumo da diferença do tipo pipeta e problemas com biomateriais viscosos. a O reagente e o pistão são separados por uma almofada de ar que encolhe durante as etapas de distribuição e se expande durante as etapas de aspiração. Ao aspirar e distribuir materiais viscosos, o lento 'fluxo' introduz problemas como bolhas de ar e comportamento irregular de tubulação. b As pipetas de deslocamento positivas permitem aspirar e distribuir material viscoso de forma confiável pelo uso de um pistão dentro da ponta. c A pipetação de materiais altamente viscosos (por exemplo, 4% (w/v) alginato) pode resultar no acúmulo de excesso de material na ponta, o que leva à imprecisão ao longo dos experimentos. d A implementação de uma simples bandeja de toque de ponta permite a remoção do excesso de material na ponta e resulta em volumes precisos de aspiração e dispensação. Isso é realizado usando o lado interno da tampa da placa do poço colocada sobre um recipiente de rack de ponta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Material #1 (concentração de estoque) | Concentração final do material nº 1 | Material #2 (concentração de estoque) | Concentração final do material #2 | Materiais #3 (concentração de estoque) | Concentração final do material #3 | Diluente (solução de trabalho Laranja G) | Concentração final de Laranja G na mistura | Exibido em figura |
| Glicerol (85% (w/v)) | 80% (w/v) | água (1 mg/mL Laranja G) | 0,059 mg/mL | Figura 3a−c | ||||
| GelMA (20% (w/v)) | 0% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 1 mg/mL | Figura 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 2% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 0,85 mg/mL | Figura 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 4% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 0,75 mg/mL | Figura 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 6% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 0,65 mg/mL | Figura 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 8% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 0,55 mg/mL | Figura 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 10% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 0,45 mg/mL | Figura 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 12% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 0,35 mg/mL | Figura 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 14% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 0,25 mg/mL | Figura 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 5% (w/v) | Alginato (4% (w/v)) | 2% (w/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Laranja G) | 0,2 mg/mL | Figura 4b |
Tabela 1: Visão geral do parâmetro para os experimentos conduzidos.
| Passo do protocolo | Problema | Possível razão | Solução |
| 1.1 | O software não pode ser instalado ou atualizado | Ficando sem espaço em disco no cartão SD | Verifique o espaço do disco no cartão SD. Se necessário, remova itens desnecessários, lixeira vazia ou use um cartão SD de tamanho apropriado |
| 1.2 | A API não pode ser instalada | A capacidade de instalação dos usuários é restrita (sem permissão do usuário raiz) | Use o comando 'sudo' na frente de comandos especificados para obter direitos administrativos. No Linux, esse tipo de acesso é conhecido como o superusuário. |
| 3.1 | Problemas com o GelMA | Funcionalização, diálise ou liofilização | Protocolo passo a passo detalhado, incluindo lista de solução de problemas disponível em Loessner et al.33. |
| 5.1 e 6.2 | Estação de trabalho não está reagindo a comandos | Problemas de conexão | Vire tudo e desligue o computador. Desligue a fonte de alimentação por 10 s. Computador de alimentação e estação de trabalho de volta. |
| 5.1 e 6.2 | Estação de trabalho não está reagindo a comandos | Problemas de conexão | Verifique se o computador está reconhecendo a conexão USB e a porta USB está definida corretamente. Certifique-se de que o firewall não está impedindo o processo de conexão (veja o link abaixo da Tabela 2). |
| 5.1 e 6.2 | Não é possível abrir arquivo | Diretório errado | Verifique o diretor (caminho da pasta) para garantir que o caminho certo esteja sendo usado. Se um arquivo (por exemplo, interface.py) não puder ser encontrado, é provável que o caminho errado esteja sendo usado. |
| 6.6.2 | A ponta não está devidamente presa ou cai durante o movimento | Problema de calibração | Repita as etapas de calibração da pipeta e certifique-se de que o pistão capilar esteja conectado corretamente com a pipeta. |
| 6.6.2 | A ponta não está devidamente presa ou cai durante o movimento | Problema de anexo | A pipeta não está adequadamente conectada ao eixo pipeta e se move durante as etapas de movimento. Aperte os parafusos firmemente para evitar isso. |
| 6.6.2 | Dica é aspirar acima do material | Problema de calibração | Repita a calibração deste tipo de bandeja para definir a altura corretamente. |
| 6.6.2 | Dica é aspirar acima do material | Problema de calibração | Verifique o volume no tubo e certifique-se de que o volume é igual ao volume definido na aplicação do designer de protocolo. |
| 6.6.2 | Material está mergulhando durante o movimento | Excesso de material na ponta | Adicionar opção de dock de toque de ponta; opcionalmente, também o tempo para toque de ponta pode ser aumentado. |
| 6.6.2 | O material é sólido ou viscoso demais para a pipetação | Comportamento termoresponsivo do material | Verifique a caracterização do material termoresponsivo e ajuste a temperatura de aquecimento/resfriamento do cais de temperatura de acordo. |
| https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting | |||
Tabela 2: Tabela de solução de problemas com problemas identificados, possíveis razões, bem como soluções para resolver os problemas.
Arquivo suplementar. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
A tubulação de materiais viscosos, especialmente hidrogéis para aplicações biomédicas19,20,21,33,47, são tarefas rotineiras em muitos laboratórios de pesquisa para preparar uma concentração definida pelo usuário ou uma série de diluição com concentrações variadas. Embora seja repetitivo e a execução seja bastante simples, é realizada principalmente manualmente com baixo rendimento amostral18. Este tutorial está introduzindo o funcionamento de uma estação de trabalho de código aberto, que foi especificamente projetada para materiais viscosos, para permitir a mistura automatizada de materiais viscosos para geração reprodutível de concentrações desejadas. Esta estação de trabalho é otimizada para pipetização de hidrogéis para permitir o manuseio automatizado e altamente confiável pela integração de docas de temperatura para materiais termoresponsivos, pipetas de deslocamento positivas para materiais viscosos e uma doca de toque de ponta opcional para remover o excesso de material da ponta. O módulo de pipetação foi especificamente otimizado para permitir o processamento de material viscoso de forma padronizada e automatizada. Em comparação com as pipetas de almofada de ar (Figura 5a), as pipetas de deslocamento positiva (Figura 5b) dispensam materiais viscosos sem deixar o material residual deixado na ponta, resultando em volumes precisos de aspiração e dispensação. A doca de toque de ponta opcional remove o excesso de material amostral da ponta (Figura 5c,d), que é útil para materiais colados (por exemplo, 4% (w/v) alginato).
A aplicação do designer de protocolo foi especificamente programada para hidrogéis e permite a diluição de até quatro reagentes com diferentes concentrações e até dois diluentes. O risco de erros no cálculo das diluições finais é evitado neste aplicativo, pois os usuários só escolhem a concentração desejada ou as etapas de diluição seriais. Os volumes de aspiração e dispensação necessários são calculados automaticamente, salvos em um arquivo de texto de documentação separado e, em seguida, preenchidos no script do protocolo. Este aplicativo de design de protocolo dá ao usuário controle total de todos os parâmetros experimentais (por exemplo, velocidade de pipetação) e garante a documentação interna dos parâmetros importantes. O aplicativo de design de protocolo leva em conta o nível de enchimento do reservatório (por exemplo, bem) e varia a altura de aspiração/dispensação para evitar mergulhos desnecessários nos materiais viscosos. Este recurso integrado evita o acúmulo de material na parede externa da ponta e, assim, garante tarefas confiáveis de aspiração e dispensação ao longo do protocolo. Embora a aplicação do designer de protocolo tenha sido desenvolvida para etapas de diluição de hidrogel, também pode ser usada para diluição de líquidos não-escoco, como corantes Laranja G. O aplicativo de designer de protocolo, que é acessível através do repositório em '/exemplos/publicação-JoVE', é a versão que é explicada na seção de protocolo e destacada no vídeo. Esta versão não será atualizada. No entanto, uma versão atualizada do aplicativo de designer de protocolo está disponível através da página principal do repositório. O terminal de calibração foi inicialmente desenvolvido pela Sanderson48 e foi otimizado para a calibração de pipetas de deslocamento positivas.
Conforme descrito no protocolo seção 4, as pipetas e os recipientes devem ser calibrados inicialmente. Este processo de calibração é crucial para definir e salvar as posições que são então usadas para calcular os incrementos de movimento. Portanto, a execução bem-sucedida do protocolo depende de posições de calibração bem definidas, pois pontos de calibração errados podem resultar em queda da ponta em um recipiente. Uma vez que as posições do êmbolo das pipetas devem ser calibradas manualmente, a precisão e a precisão da tubulação dependem muito da calibração realizada. Esses procedimentos de calibração dependem muito da experiência do usuário com o módulo de pipetação e, portanto, o treinamento com equipe experiente é recomendado no início para garantir os procedimentos adequados de calibração. Além da calibração manual no módulo de tubulação, a pipeta em si deve ser calibrada para garantir a pipetação precisa. Recomenda-se calibrar as pipetas pelo menos a cada 12 meses para atender aos critérios de aceitação especificados na ISO 8655. Para avaliar internamente a calibração da pipeta, a validação e a verificação estão disponíveis conforme descrito por Stangegaard et al.16.
Para a geração de um conjunto de dados confiável, é crucial começar com reagentes de alta qualidade. Isso é especialmente importante para tarefas de processamento de hidrogel, uma vez que as variações em lote a lote podem impactar os resultados gerados dentro deste protocolo. Além das variações em lote a lote, mudanças sutis na preparação de pequenos volumes também podem contribuir para as diferenças de propriedade. Para evitar isso, recomenda-se a preparação de volumes maiores, que podem ser usados para todos os experimentos.
Os procedimentos de validação e verificação dependem do uso de um corante para identificar misturas confiáveis. O protocolo apresentado descreve a aplicação do Laranja G, mas o protocolo geral e o fluxo de trabalho de análise também podem ser adaptados a corantes fluorescentes49,50. O uso de Laranja G reduz os requisitos técnicos do espectotômetro e elimina as precauções tomadas para evitar o branqueamento dos corantes fluorescentes após a exposição à luz. Problemas no comportamento dissolvido ou formação de cluster do corante não foram observados com os materiais apresentados durante os experimentos, mas podem aparecer com outros materiais. A formação potencial de aglomerados e, portanto, a interação entre corante e material poderia ser facilmente detectada com um microscópio.
Os procedimentos e técnicas apresentados neste tutorial adicionam capacidade de automação aos fluxos de trabalho atuais para materiais viscosos para alcançar tarefas altamente confiáveis com trabalho humano mínimo. A tabela de solução de problemas fornecida (Tabela 2) inclui problemas identificados e apresenta possíveis razões, bem como soluções para resolver os problemas. A estação de trabalho apresentada foi aplicada com sucesso a materiais poliméricos naturais (gelatina, gengiva de gellan, matrigel) e sintéticos (por exemplo, poli(etileno glicol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) para tarefas automatizadas de pipetação. Em particular, a combinação de uma estação de trabalho de código aberto e um aplicativo de design de protocolo de código aberto projetado para materiais viscosos será muito útil para pesquisadores que trabalham nas áreas de engenharia biomédica, ciência de materiais e microbiologia.
Disclosures
CM e DWH são fundadores e acionistas da Gelomics Pty Ltd. CM também é o Diretor da Gelomics Pty Ltd. Os autores declaram não haver conflito de interesses relevantes para o tema deste artigo. Os autores não possuem outras afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no artigo, além dos divulgados.
Acknowledgments
Os autores reconhecem os membros do Centro de Medicina Regenerativa do QUT, em particular, Antonia Horst e Pawel Mieszczanek por suas sugestões úteis e feedback. Este trabalho foi apoiado pelo QuT's Postgraduate Research Award for SE, e pelo Australian Research Council (ARC) sob contrato de subvenção IC160100026 (Centro de Treinamento de Transformação Industrial arc em Biomanaturação Aditiva). A NB foi apoiada por Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734), do National Health and Medical Research Council (NHMRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
| 5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
| 50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
| 70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
| Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
| Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
| Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
| M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
| OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
| Equipment | |||
| Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
| Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
| Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
| Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
| Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
| Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
| Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |
References
- Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
- Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
- Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712 (2011).
- Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344 (2010).
- Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
- Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
- Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
- Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
- Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
- Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
- Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
- Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
- Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
- Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002 (2019).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Zhang, Y. S., Khademhosseini, A.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018 (2018).
- Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
- Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
- Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510 (2020).
- Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
- Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
- Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75 (2018).
- Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
- Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
- Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
- Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976 (2016).
- Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
- Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
- O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
- LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
- Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
- Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
- Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
- Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
- Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
- Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
- Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).
