Summary
Denne protokol fungerer som en omfattende tutorial til standardiseret og reproducerbar blanding af viskøse materialer med en ny open source-automatiseringsteknologi. Der gives detaljerede instruktioner om driften af en nyudviklet open source-arbejdsstation, brugen af en open source-protokoldesigner og validering og verifikation for at identificere reproducerbare blandinger.
Abstract
Nuværende blandingstrin af viskøse materialer er afhængige af gentagne og tidskrævende opgaver, der hovedsageligt udføres manuelt i en tilstand med lav gennemstrømning. Disse problemer repræsenterer ulemper i arbejdsgange, der i sidste ende kan resultere i irreproducerbarhed af forskningsresultater. Manuelt baserede arbejdsgange begrænser yderligere fremskridt og udbredt vedtagelse af viskøse materialer, såsom hydrogeler, der anvendes til biomedicinske applikationer. Disse udfordringer kan overvindes ved at bruge automatiserede arbejdsgange med standardiserede blandingsprocesser for at øge reproducerbarheden. I denne undersøgelse præsenterer vi trinvise instruktioner til at bruge en open source-protokoldesigner, til at drive en open source-arbejdsstation og til at identificere reproducerbare blandinger. Specifikt guider open source-protokoldesigneren brugeren gennem det eksperimentelle parametervalg og genererer en klar til brug protokolkode til betjening af arbejdsstationen. Denne arbejdsstation er optimeret til pipettering af viskøse materialer for at muliggøre automatiseret og yderst pålidelig håndtering ved integration af temperaturdokker til termoresponsive materialer, positive forskydningspipetter til viskøse materialer og en valgfri tipberøringsdock for at fjerne overskydende materiale fra pipettespidsen. Validering og verifikation af blandinger udføres ved en hurtig og billig absorbensmåling af Orange G. Denne protokol præsenterer resultater for at opnå 80% (v / v) glycerolblandinger, en fortyndingsserie for gelatinemethacyloyl (GelMA) og dobbeltnetværkshydrogeler på 5% (w / v) GelMA og 2% (w / v) alginat. Der medfølger en fejlfindingsvejledning, der hjælper brugerne med at vedtage protokoller. Den beskrevne arbejdsgang kan anvendes bredt på en række viskøse materialer for at generere brugerdefinerede koncentrationer på en automatiseret måde.
Introduction
Reproducerbarhed og replikabilitet er af afgørende betydning i videnskabeligt arbejde1,2,3,4. Nylige beviser har imidlertid fremhævet betydelige udfordringer med at gentage biomedicinske undersøgelser med stor effekt inden for grundlæggende videnskab såvel som translationel forskning4,5,6,7. Faktorer, der bidrager til irreproducerbare resultater, er komplekse og mangfoldige, såsom dårligt eller forudindtaget undersøgelsesdesign6,8, utilstrækkelig statistisk effekt3,9, manglende overholdelse af rapporteringsstandarder7,10,11, pres for at offentliggøre6 eller utilgængelige metoder eller softwarekode6,9 . Blandt dem er subtile ændringer i protokollen og menneskelige fejl i udførelsen af eksperimenter blevet identificeret som yderligere elementer, der tegner sig for irreproducerbarhed4. F.eks. indfører manuelle pipetteringsopgaver intra- og interpersonlig unøjagtighed12,13 og øger sandsynligheden for menneskelige fejl14. Mens kommercielle væskehåndteringsrobotter er i stand til at overvinde disse ulemper og har vist øget pålidelighed for væsker15,16,17, er automatiseret håndtering af materialer med betydelige viskøse egenskaber stadig udfordrende.
Kommercielle væskehåndteringsrobotter bruger almindeligvis luftpudepipetter, også kendt som luftstempel eller luftfortrængningspipetter. Reagenset og stemplet adskilles af en luftpude, der krymper under dispenseringstrin og udvider sig under aspirerende trin. Ved hjælp af luftpudepipetter 'flyder' viskøse materialer kun langsomt ind og ud af spidsen, og tidlig tilbagetrækning af pipetten fra reservoiret kan resultere i aspiration af luftbobler. Under dispenseringsopgaver efterlader det tyktflydende materiale en film på den indvendige spidsvæg, som kun 'flyder' langsomt eller slet ikke, når det tvinges af luft. For at overvinde disse problemer blev positive forskydningspipetter introduceret kommercielt for aktivt at ekstrudere det viskøse materiale ud af spidsen ved hjælp af et solidt stempel. Selv om disse positive fortrængningspipetter muliggør nøjagtig og pålidelig håndtering af viskøse materialer, er automatiserede løsninger med positive fortrængningspipetter stadig for dyre til akademiske laboratorieindstillinger, og derfor er de fleste arbejdsgange med tyktflydende materialer udelukkende afhængige af manuelle pipetteringsopgaver18.
Generelt defineres viskositet som en væskes modstandsdygtighed over for strømning, og viskøse materialer defineres yderligere som materialer med større viskositet af vand (0,89 mPa·s ved 25 °C). Inden for biomedicinske anvendelser indeholder eksperimentelle opsætninger ofte flere materialer med en større viskositet end vand, såsom dimethylsulfoxid (DMSO; 1,99 mPa·s ved 25 °C), glycerol (208,1 mPa·s ved 25 °C for 90 % glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s ved 25 °C) og vandsvulmede polymerer, benævnt hydrogeler19 20. Hydrogeler er hydrofile polymernetværk arrangeret i en fysisk eller / og kemisk tilstand, der anvendes til forskellige anvendelser, herunder celleindkapsling, lægemiddelafgivelse og bløde aktuatorer19,20,21,22. Hydrogelernes viskositet afhænger af polymerkoncentrationen og molekylvægten19. Rutinemæssigt anvendte hydrogeler til biomedicinske anvendelser udviser viskositetsværdier mellem 1 og 1000 mPa·s, mens specifikke hydrogelsystemer er blevet rapporteret med værdier på op til 6 x 107 mPa·s19,23,24. Viskositetsmålinger af hydrogeler er imidlertid ikke standardiseret med hensyn til måleprotokol og prøveforberedelse, og derfor er viskositetsværdier mellem forskellige undersøgelser vanskelige at sammenligne.
Da kommercielt tilgængelige automatiserede løsninger, der er specielt designet til hydrogeler, enten mangler eller er for dyre, afhænger de nuværende arbejdsgange for hydrogel af manuel håndtering18. For at forstå begrænsningerne i den nuværende manuelle arbejdsgang for pipettering af hydrogeler er det vigtigt at forstå vigtige håndteringsopgaver18. For eksempel, når et nyt hydrogelmateriale er blevet syntetiseret, genereres en ønsket koncentration eller en fortyndingsserie med varierende koncentrationer for at identificere pålidelige synteseprotokoller og tværbindingsegenskaber med efterfølgende analyse af de mekaniske egenskaber25,26,27,28 . Generelt fremstilles eller købes en stamopløsning og blandes derefter med et fortyndingsmiddel og/eller andre reagenser for at opnå en blanding. Blandingsopgaverne udføres for det meste ikke direkte i en brøndplade (eller noget outputformat) og udføres snarere i et separat reaktionsrør, der almindeligvis betegnes som mastermix. Under disse forberedelsesopgaver kræves forskellige aspirerings- og dispenseringstrin for at overføre det eller de viskøse materialer, blande reagenserne og overføre blandingen til et udgangsformat (f.eks. En 96 brøndplade). Disse opgaver kræver en stor mængde menneskeligt arbejde18, lange eksperimentelle timer og øger sandsynligheden for menneskelige fejl, der potentielt kan manifestere sig som unøjagtige resultater. Desuden forhindrer manuel håndtering effektiv forberedelse af høje prøvenumre til at screene forskellige parameterkombinationer for detaljeret karakterisering. Den manuelle behandling hindrer også brugen af hydrogeler til screeningsapplikationer med høj kapacitet, såsom identifikation af lovende forbindelser under lægemiddeludvikling. De nuværende manuelle forberedelsestrin er ikke mulige at screene lægemiddelbiblioteker, der består af tusindvis af lægemidler. Af disse grunde er automatiserede løsninger nødvendige for at tilvejebringe en effektiv udviklingsproces og muliggøre en vellykket oversættelse af hydrogeler til lægemiddelscreeningsapplikationer.
For at gå fra manuelt baserede arbejdsgange til automatiserede processer har vi optimeret en kommerciel open source-pipetteringsrobot til håndtering af viskøse materialer ved at integrere temperaturdokker til termoresponsive materialer, brugen af hylden positive fortrængningspipetter ved hjælp af kapillære stempelspidser og en valgfri tipberøringsdock til rengøring af pipettespidser. Denne pipetteringsrobot er blevet yderligere integreret som pipetteringsmodul i en nyudviklet open source-arbejdsstation, som består af moduler, der er klar til installation og kan tilpasses18,29. Detaljerede monteringsinstruktioner til den udviklede arbejdsstation, herunder hardware- og softwarefiler, er frit tilgængelige fra GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) og Zenodo-lageret (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Ud over hardwareudviklingen er en open source-protokoldesignapplikation blevet programmeret og frigivet til at guide brugeren gennem parametervalgsprocessen og generere en klar til brug protokolkode (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Denne kode kører på den kommercielle open source pipetteringsrobot såvel som på den udviklede open source-arbejdsstation.
Heri gives en omfattende tutorial om driften af open source-arbejdsstationen til automatisering af blandingsopgaver for viskøse materialer (figur 1). De tutorial-specifikke protokoltrin kan udføres med den udviklede open source-arbejdsstation såvel som den kommercielle open source pipetteringsrobot. Understøttet af en internt udviklet open source-protokoldesignapplikation demonstreres automatiseret blanding og forberedelse af krævede koncentrationer for glycerol, gelatinemethacyloyl (GelMA) og alginat. Glycerol er valgt i denne vejledning, da den er godt karakteriseret30,31, den er billig og let tilgængelig, og derfor bruges den almindeligvis som viskøst referencemateriale til automatiserede pipetteringsopgaver. Som eksempler på hydrogeler, der anvendes i biomedicinske anvendelser, er GelMA og alginathydrogelprækursoropløsninger blevet anvendt til automatiserede blandingsforsøg. GelMA præsenterer en af de mest almindeligt anvendte hydrogeler til celleindkapslingsundersøgelser32,33, og alginat blev udvalgt i denne undersøgelse for at demonstrere evnen til at fremstille dobbeltnetværkshydrogeler34,35. Ved hjælp af Orange G som farvestof blev der implementeret en hurtig og billig procedure for at validere og verificere blandingsresultaterne med et spektrofotometer16.
En kommerciel open source pipetteringsrobot er blevet integreret som pipetteringsmodul i den udviklede open source-arbejdsstation (figur 2a), og derfor bruges navnet 'pipetteringsmodul' yderligere til at beskrive pipetteringsrobotten. En detaljeret beskrivelse af den installerede hardware ligger uden for denne protokols anvendelsesområde og er tilgængelig via de medfølgende lagre, som også indeholder trinvise instruktioner til generalforsamlingen af open source-platformen. Pipetteringsmodulet kan udstyres med to pipetter (enkelt- eller 8-kanals pipette), som er monteret på akse A (højre) og akse B (venstre) (figur 2b). Pipetteringsmodulet tilbyder en kapacitet på 10 dæk i henhold til American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS) standarder, og følgende placeringspositioner er defineret på dækket: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figur 2c). For at starte fotoinduceret polymerisation af hydrogelopløsninger kræves et separat tværbindingsmodul og er blevet tilføjet til arbejdsstationen. Tværbindingsmodulet er udstyret med lysdioder med en bølgelængde på 400 nm, og derfor kan stoffer, der ophidser ved en synlig lysbølgelængde, anvendes med de nuværende systemer, såsom lithiumphenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP)36,37. Intensiteten (i mW/cm2) af lysdioderne kan adresseres af brugeren i protokoldesignapplikationen for at studere tværbindingsadfærden38. Arbejdsstationen indeholder også et lagermodul, der muliggør øgede gennemløbsundersøgelser; Dette modul anvendes imidlertid ikke i denne undersøgelse og er derfor ikke yderligere beskrevet. Generelt anbefales det at betjene pipetteringsmodulet i et biologisk sikkerhedsskab for at undgå prøvekontaminering. Det vigtigste strømkredsløb til betjening af pipetteringsmodulet er et 12 V kredsløb, der betragtes som en lavspændingsapplikation i de fleste lande. Alle elektriske komponenter er baseret på en dedikeret kontrolboks, der forhindrer brugere i at komme i kontakt med kilden til en elektrisk fare.
Ved at følge disse standardiserede blandingsprotokoller er forskere i stand til at opnå pålidelige blandinger til viskøse såvel som ikke-viskøse materialer på en automatiseret måde. Open source-tilgangen giver brugerne mulighed for at optimere blandingssekvenser og dele nyudviklede protokoller med samfundet. I sidste ende vil denne tilgang lette screeningen af flere parameterkombinationer for at undersøge den indbyrdes afhængighed mellem forskellige faktorer og dermed fremskynde den pålidelige anvendelse og udvikling af viskøse materialer til biomedicinske anvendelser.
Protocol
BEMÆRK: Protokollen starter med en introduktion til (1) softwaren og (2) hardwareopsætningen for at gøre brugeren bekendt med de nødvendige installationer og arbejdsstationen. Efter et afsnit om (3) materialeforberedelse og (4) brugen af protokoldesignerapplikationen, (5) kalibreringen af pipetteringsmodulet og (6) udførelsen af den automatiserede protokol fremhæves detaljeret. Endelig beskrives (7) validerings- og verifikationsprocedurer, herunder absorbansaflæsning og dataanalyse. En generel protokolarbejdsgang med individuelle opgaver vises i figur 1.
1. Opsætning af software
BEMÆRK: Dette afsnit indeholder en detaljeret instruktion til installation af applikationsprogrammeringsgrænsefladen (API) samt det krævede protokoldesignerprogram og kalibreringsterminalen. Følgende instruktioner er skrevet til en Raspberry Pi (RPi) single-board computer; dog også Windows 8, 10 og macOS 10.13+ er blevet brugt med succes med API'en og applikationerne.
- Konfigurer computermiljøet.
BEMÆRK: Vær fortrolig med det grundlæggende i Python39, hvordan du konfigurerer og bruger en Raspberry Pi40,41, og hvordan du opretter forbindelse til internettet42. Følgende vejledningstrin fokuserer på protokolspecifikke trin, og yderligere oplysninger om brugen af en Raspberry Pi er tilgængelig online40.- Åbn et terminalvindue fra proceslinjen eller programmenuen.
- Opdater systemets pakkeliste:
sudo apt-get opdatering - Opgrader alle de installerede pakker:
sudo apt-get dist-upgrade - Genstart Raspberry Pi:
sudo genstart - Kontroller installeret Python-version:
python3 --version
Sørg for, at mindst Python 3.5 er installeret; Hvis ikke, skal du installere den nyeste version43. - Installer python pip, som udgiver Python-pakker med Python Package Index44:
sudo apt-get install python3-pip - Installer afhængigheder:
pip installere numpy
pip installer python-resize-image
BEMÆRK: Hvis du bruger Windows, skal du installere Windows-forbandelsespakken via: python -m pip installer windows-forbandelser
- Installer applikationsprogrammeringsgrænsefladen (API).
BEMÆRK: API'en giver en simpel Python-ramme designet til at skrive eksperimentelle protokoller script og betjene arbejdsstationen. Følgende to API'er er nødvendige for at kunne udføre den genererede protokolkode.- Installer arbejdsstations-API:
pip installer openworkstation - Installer Opentrons API for at betjene pipetteringsmodulet:
pip install opentrons==2.5.2 - Kontrollér, om API'en er installeret:
python3
>>> importerer openworkstation
>>> importere opentrons
BEMÆRK: Størrelsen på API'en og protokoldesignapplikationen er henholdsvis 2,2 MB og 1,2 MB. Der blev ikke oplevet nogen problemer under installationen, når den blev brugt med begrænset diskplads (200 MB). Diskpladskravene afhænger dog af operativsystemet.
- Installer arbejdsstations-API:
- Vælg en mappe til download af filer (kalibreringsterminal, protokoldesignprogram osv.).
BEMÆRK: Filer kan kopieres og indsættes andre steder bagefter. - Klon filer fra GitHub-lageret:
git klon https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
BEMÆRK: Kommandoen 'git-klon' kloner og gemmer efterfølgende alle filer i mappen, som er åben i terminalen på dette tidspunkt. Da lageret også indeholder hardwarefilerne til samlingen, er det ikke nødvendigt med hele lageret for at udføre de præsenterede protokoller. Alle nødvendige filer til at replikere eksperimenterne er tilgængelige som supplerende fil og i GitHub-lageret under "/examples/publication-JoVE". - Åbn den downloadede mappe. Hvis hele lageret blev downloadet, skal du navigere til mappen 'publikation-JoVE' via
cd openworkstation/eksempler/publikation-JoVE
BEMÆRK: Denne mappe indeholder filer, der kræves til driften af arbejdsstationen og brugen af protokoldesignerprogrammet og kalibreringsterminalen.
2. Opsætning af hardware
- Anbring arbejdsstationen i et biologisk sikkerhedsskab for at undgå prøvekontaminering.
- Installer pipetter på arbejdsstationen.
- Vælg pipettestørrelsen baseret på forsøgsopsætningen. Generelt skal du tage en pipettestørrelse, hvilket volumen, der skal aspireres, er i den højere ende af området. Hvis der kræves blandingsopgaver med volumener større end 1 ml til en bestemt opsætning (f.eks. Aspirering/dispensering på 2 ml), skal du vælge M1000E med et maksimalt aspirerings-/dispenseringsvolumen på 1.000 μL for at minimere pipetteringstrin og spare tid.
BEMÆRK: En detaljeret instruktion til luftfortrængningspipetter er tilgængelig online45. Det udviklede pipetteringsmodul er i stand til at integrere følgende hyldeklare positive forskydningspipetter: M10E (1-10 μL), M25E (3-25 μL), M50E (20-50 μL), M100E (10-100 μL), M250E (50-250 μL), M1000E (100-1.000 μL). - Brug en M4 unbrakonøgle til at løsne og stramme skruerne.
- Fastgør de to pipettefikseringsplader (hvide akrylplader) til aluminiumsskinnen, og stram M5-skruerne løst.
- Indsæt pipetten i de to pipettefikseringsplader, og sørg for, at pipettens ergonomiske hale hviler på den modsatte side af akrylmonteringspladen.
- Stram de fire skruer på de to pipettefikseringsplader fast.
- Skub de to firkantede fastgørelsesmøtrikker, der er fastgjort til akrylmonteringspladen, ind i ekstruderingsåbningen på z-aksen, og stram skruerne.
BEMÆRK: Fastgør pipetten tæt for at undgå bevægelse under drift.
- Vælg pipettestørrelsen baseret på forsøgsopsætningen. Generelt skal du tage en pipettestørrelse, hvilket volumen, der skal aspireres, er i den højere ende af området. Hvis der kræves blandingsopgaver med volumener større end 1 ml til en bestemt opsætning (f.eks. Aspirering/dispensering på 2 ml), skal du vælge M1000E med et maksimalt aspirerings-/dispenseringsvolumen på 1.000 μL for at minimere pipetteringstrin og spare tid.
3. Forberedelse af materiale
BEMÆRK: De viskøse materialer (glycerol, GelMA, alginat) anvendes til de eksperimenter, der præsenteres i denne undersøgelse, og derfor er forberedte volumener og håndteringsopgaver (f.eks. Tilsæt 5 ml stamopløsning i 5 ml reaktionsrør) specifikt til denne eksperimentelle opsætning.
- Gelatine methacryloyl (GelMA)
BEMÆRK: GelMA-funktionalisering, dialyse og lyofilisering er ikke omfanget af dette papir, og en trinvis protokol er tilgængelig i Loessner et al.33. Protokollen begynder at bruge lyofiliseret GelMA, som kan fremstilles internt eller købes kommercielt.- Beregn den krævede masse af GelMA (mGelMA) baseret på den ønskede endelige lagerkoncentration (cGelMA) og volumen (VGelMA) ved hjælp af ligningen:
mGelMA = cGelMA x VGelMA
BEMÆRK: VGelMA afhænger af forsøgsopstillingen, og det anbefales at forberede 20-30% overskydende materiale. De præsenterede protokoller starter med 5 ml 20% (w/v) GelMA som stamopløsning. - Vej den nødvendige mængde lyofiliseret GelMA, tilsæt den i et 50 ml reaktionsrør og tilsæt den nødvendige mængde fosfatbufret saltvand (PBS).
- GelMA blandes enten ved at lægge det i blød i opløsningsmidlet ved 4 °C natten over eller ved opvarmning til 60 °C i 6 timer i et vandbad.
BEMÆRK: Sterile GelMA-opløsninger kan opbevares beskyttet mod lys ved 4 °C i mindst seks måneder. - Fyld 5 ml GelMA i 5 ml reaktionsrør.
- Beregn den krævede masse af GelMA (mGelMA) baseret på den ønskede endelige lagerkoncentration (cGelMA) og volumen (VGelMA) ved hjælp af ligningen:
- Fotoinitiator: Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)
BEMÆRK: Undgå yderligere eksponering for rumlys, da LAP er lysfølsom.- Beregn den krævede masse af LAP (mLAP) baseret på den ønskede endelige lagerkoncentration (cLAP) og det krævede volumen (VLAP) ved hjælp af ligningen:
mLAP = cLAP x VLAP
BEMÆRK: Det anbefales at fremstille en 3% (w/v) stamopløsning. - Vej den nødvendige mængde LAP, tilsæt den i et 15 ml reaktionsrør og tilsæt PBS.
- Pak røret ind i aluminiumsfolie for at forhindre fotoinduceret nedbrydning.
- LAP opløses ved at anbringe reaktionsrøret i et vandbad ved 37 °C i 2 timer eller indtil det er helt opløst.
- Fyld 1 ml LAP-stamopløsning i 5 ml rør.
- Beregn den krævede masse af LAP (mLAP) baseret på den ønskede endelige lagerkoncentration (cLAP) og det krævede volumen (VLAP) ved hjælp af ligningen:
- Alginat
- Beregn den krævede mængde alginat (malginat) baseret på den ønskede endelige lagerkoncentration (calginat) og volumen (Valginat) ved hjælp af ligningen:
malginat = calginat x Valginat
BEMÆRK: Valginate afhænger af forsøgsopstillingen, og det anbefales at forberede 20-30% overskydende materiale. De præsenterede protokoller starter med 5 ml 4% (w/v) alginat som stamopløsning. - Vej den krævede masse alginat, tilsæt det i et 50 ml reaktionsrør, og tilsæt PBS.
- Alginatblandingen anbringes i et vandbad ved 37 °C i 4 timer.
BEMÆRK: Brugen af en hvirvelblander vil fremskynde opløsningsprocessen, men også generere luftbobler. Opløst alginat kan opbevares ved 4 °C i mindst seks måneder. - Fyld 5 ml alginat i 5 ml reaktionsrør.
- Beregn den krævede mængde alginat (malginat) baseret på den ønskede endelige lagerkoncentration (calginat) og volumen (Valginat) ved hjælp af ligningen:
- Fyld 5 ml glycerol i 5 ml reaktionsrør.
- Orange G-opløsning
- Forbered en 10 mg / ml stamopløsning af Orange G i et 50 ml reaktionsrør.
BEMÆRK: Lydstyrken afhænger af antallet af eksperimenter. Afhængigt af fortyndingstypen fremstilles stamopløsning enten i ultrarent vand, PBS eller et egnet fortyndingsreagens. I de præsenterede eksperimenter blev ultrarent vand anvendt til fortynding af glycerol og PBS til fortynding af GelMA og alginat. PBS blev brugt som fortyndingsstof til GelMA og alginat og kan enten fremstilles ved hjælp af tabletter eller købes fra hylden. - Bland i 10 s ved hvirvel.
- Pak røret ind i aluminiumsfolie for at forhindre fotoinduceret nedbrydning.
BEMÆRK: Stamopløsning kan anvendes efter 24 timer for at sikre korrekt opløsning af Orange G. - Fortynd stamopløsningen til en 1 mg/ml arbejdsløsning i et 50 ml reaktionsrør.
- Arbejdsløsningen overføres til passende kolber/rør til forsøgsopstillingen.
BEMÆRK: Til de præsenterede eksperimenter blev arbejdsløsningen fyldt i 5 ml rør. Orange G-stam- og arbejdsløsning kan opbevares ved 4 °C og anvendes inden for tre måneder efter tilberedning. - Fyld 5 ml af 1 mg/ml Orange G-arbejdsløsningen i 5 ml reaktionsrør.
- Forbered en 10 mg / ml stamopløsning af Orange G i et 50 ml reaktionsrør.
4. Generer protokolkode med protokoldesignerprogrammet
BEMÆRK: De specificerede parametre i trin 4.2-4.7 er de samme for alle udførte forsøg, bortset fra materialets lagerkoncentration og den endelige outputkoncentration. Disse parametre er opsummeret i tabel 1 , og i det følgende anvendes parametre til fremstilling af dobbeltnetværkshydrogeler med 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginat, 0,15% (w/v) LAP og PBS som fortyndingsstof.
- Åbn protokoldesignerprogrammet ved at køre 'ProtocolDesignApp.html'.
BEMÆRK: Appen "ProtocolDesignApp.html" guider brugeren gennem parametervalgsprocessen og genererer automatisk den brugsklare protokol til betjening af arbejdsstationen. Brugergrænsefladen kører på alle almindeligt anvendte internetbrowsere (dvs. Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer). - Indtast protokolnavn (f.eks. dobbeltnetværkshydrogeler) på opsætningssiden.
- Klik på 'Fortsæt' for at bekræfte protokolnavnet og fortsætte til næste trin.
- Definer inputbakke ved at vælge '3x4 varmeblok' i rullemenuen og følgende inputparametre:
- Vælg 'Gel 1' i rullemenuen, indtast navnet 'GelMA', indtast lagerkoncentrationen '20%', indstil 'Antal prøver' til '3' for at udfylde en kolonne. Klik på '+tilføj' for at gemme poster.
- Vælg 'Gel 2' i rullemenuen, indtast navn: 'Alginat', indtast lagerkoncentration '4%', indstil 'Antal prøver' til '3' for at udfylde en kolonne. Klik på '+tilføj' for at gemme poster.
- Vælg 'Photoinitiator' i rullemenuen, indtast navn: 'LAP', indtast lagerkoncentration '3%', indstil 'Antal prøver' til '3' for at udfylde en kolonne. Klik på '+tilføj' for at gemme poster.
- Vælg 'Fortyndingsstof 1' i rullemenuen, indtast navn: 'PBS', indstil 'Antal prøver' til '3' for at udfylde en kolonne. Klik på '+tilføj' for at gemme poster.
BEMÆRK: Visualiseringen af inputbakken opdateres automatisk, når der klikkes på '+add'. Hvis der tilføjes flere indgange end bakkens kapacitet, vises advarslen "For mange prøver til denne bakke" for brugeren.
- Definer tværbindingsparametre ved at markere 'Fotokrydslinking' og skrive tiden i sekunder, '30' og intensiteten W/m2 med '2'.
- Afslut inputopsætningen ved at klikke på 'FORTSÆT'.
- Definer opsætning af outputbakke ved at vælge '96 brøndplade' i rullemenuen for brøndpladetype.
- Klik på 'Group1' for at definere output ved at oprette en gruppe prøver.
- Angiv outputsammensætningen ved at indtaste de ønskede koncentrationer og prøvevolumen i felterne for hver indgang: GelMA = '5', Alginat = '2', LAP = '0,15', Total Volume = '60'.
- Afkrydsningsfelt for at anvende avanceret blandingsprotokol.
- Angiv antallet af prøver ved at indtaste antallet af prøver i feltet »Antal prøver«: »96«.
BEMÆRK: Visualiseringen af prøvebakken opdateres automatisk, når der klikkes på '+tilføj gruppe'. Hvis der tilføjes flere prøver end bakkens kapacitet, vises advarslen "For mange prøver til denne bakke" til brugeren. - Afslut outputopsætningen ved at klikke på 'FORTSÆT'.
- Vælg bakkeposition på dækkets layout, og forbered platformen i overensstemmelse hermed:
- Marker afkrydsningsfeltet i feltet 'SLOT A1', og vælg 'Empty_Cell' i rullemenuen.
- Marker afkrydsningsfeltet i feltet 'SLOT A2', og vælg 'Trash_Cell' i rullemenuen.
- Marker afkrydsningsfeltet i feltet 'SLOT B1', og vælg 'Tips_Cell_100 μL' i rullemenuen.
- Marker afkrydsningsfeltet i feltet 'SLOT B2', og vælg 'Tips_Cell_1000 μL' i rullemenuen.
- Marker afkrydsningsfeltet i feltet 'SLOT C1', og vælg 'Input_Cell' i rullemenuen.
- Marker afkrydsningsfeltet i feltet 'SLOT C2', og vælg 'Empty_Cell' i rullemenuen.
- Marker afkrydsningsfeltet i feltet 'SLOT D1', og vælg 'Mixing_Cell' i rullemenuen.
- Marker afkrydsningsfeltet i feltet 'SLOT D2', og vælg 'Output_Cell' i rullemenuen.
- Definer type og karakteristika for første pipette (M100E) ved at markere 'Pipette Left', vælge '10-100μL positiv forskydning' i rullemenuen og indstille aspirerende hastighed = '600', dispenseringshastighed = '800'.
- Definer type og karakteristika for anden pipette (M1000E) ved at markere 'Pipette Right', vælge '100-1000μL positiv forskydning' i rullemenuen og indstille aspirerende hastighed = '800', dispenseringshastighed = '1200'.
- Klik på 'GENERER PROTOKOL' for at bekræfte opsætningen og generere protokolscriptet.
BEMÆRK: Den udviklede protokoldesigner-app genererer automatisk en ny mappe, hver gang der genereres en ny protokol. Alle filer, der kræves til dette eksperiment og til at betjene arbejdsstationen, gemmes i denne mappe, der er opkaldt efter protokolnavnet. Mappen kan kopieres til forskellige mapper uden at forårsage problemer. - Luk ikke grænsefladen, da den vil blive brugt til at udføre protokollen (se trin 6.6.).
5. Kalibrering af pipetteringsmodulet
BEMÆRK: Beholdere (f.eks. brøndplader, tipholder, skraldespand) og pipetter (f.eks. M1000E) skal kalibreres i første omgang. Hvis en beholder og/eller en pipetteposition ændres/ændres, skal den nye position kalibreres.
- Naviger til protokolmappen, og åbn kalibreringsterminalen ved at udføre filen 'calibrate.py' i en terminal windox (se trin 1.1.1):
phython.calibrate.py
BEMÆRK: Grænsefladen 'calibrate.py' guider brugeren gennem kalibreringen af dækopsætningen og pipetterne. Sørg for, at filen er i samme mappe som protokolfilen og modulfilerne. Det genereres automatisk i trin 4.10. - Vælg bevægelsesintervaller for stempelx,y,z-bevægelse med det numeriske tastatur (1-8): »1« for 0,1 mm, »2« for 0,5 mm, »3« for 1 mm, »4« for 5 mm, »5« for 10, »6« for 20 mm, »7« for 40 mm og »8« for 80 mm.
- Kalibrer pipetten.
- Tryk på tastaturgenvej P for at vælge pipettestørrelse.
- Tryk på tastaturgenvej V for at gå ind i stempelkalibreringstilstand.
BEMÆRK: Det anbefales at starte med små trin (2, 5 og 10 mm) for at blive fortrolig med pipettehovedets forøgelsesstørrelse og bevægelsesvirkning. - Kalibrer følgende stempelpositioner for en positiv forskydningspipette: T–Top = hvileposition; B-Bottom = stempel skubbes, indtil modstand er opfyldt; P–Pick-up = stempel skubbes til en position, hvor en stempelspids kan fastgøres; E–Skub ud = stempel skubbes, indtil en fastgjort spids skubbes ud. Varier stempelpositionerne ved hjælp af pil opad og nedad på tastaturet, og gem den endelige position ved hjælp af S på tastaturet.
- Forlad pipettestekalibreringstilstanden ved at trykke på tastaturgenvej V.
- Kalibrer beholderens position i forhold til pipettespidsen.
- Tryk på tastaturgenvej P for at vælge pipettetype. Sørg for, at en spids er forbundet til den valgte pipetted.
- Tryk på tastaturgenvej C for at vælge containertype.
- Vælg en passende bevægelsesforøgelse, og flyt pipettespidsen til følgende positioner. For brøndplader kalibreres til »A1«-brøndpositionen i bunden. For spidsholderen kalibreres til positionen »A1«. For papirkurven skal du vælge en position (defineret som et punkt), hvor spidsen kan skubbes ud i papirkurven.
- Tryk på tastaturgenvej S for at gemme position.
- Gentag trin 5.3.1-5.3.3 for alle beholdere, der er anført under »C« for den valgte pipettetype.
- Gentag 5.3.1-5.3.5 for den anden pipettetype.
- Luk kalibreringsscriptet.
6. Protokoludførelse med arbejdsstationen
BEMÆRK: Protokolfiler er tilgængelige via lageret og er også tilgængelige som supplerende fil.
- Anbring affaldsbeholderen, tipholdere, inputbakken, blandebakken og udgangen på dækket (defineret i trin 4.3).
- Kalibrer pipetter og instrumenter som defineret i punkt 5.
- Hvis det er nødvendigt, skal du tænde for temperaturdocken og vælge temperaturen for indgang og blandebakke.
BEMÆRK: Eksperimenterne i denne vejledning blev udført uden temperaturkontrol og ved 40 ° C for glycerol og 37 ° C for GelMA og alginatpipettering. - Placer rør med indgangsreagenser i aluminiumsblokkene på temperaturdokkerne i henhold til den valgte opsætning.
- Vent, indtil indgangsreagenser har nået den ønskede temperatur.
BEMÆRK: For at sikre korrekt temperaturfordeling anbefales en inkubationstid på 30 minutter for GelMA og alginat. - Udfør protokolfilen ved at klikke på 'KØR PYTHON SCRIPT'
BEMÆRK: Den valgte protokol udføres nu af arbejdsstationen. Den ledsagende video fremhæver automatiseret blanding af GelMA og fordelingen af 60 μL i en 96 brøndplade. - Kør er afsluttet, når 'Færdig' vises.
7. Validerings- og verifikationsproces
- Fjern brøndpladen fra arbejdsstationen, og transporter brøndpladen med prøverne til et spektrofotometer.
- Læs absorbans med et spektrofotometer ved 450 nm. Læs hver plade 2x for at sammenligne resultater og sikre ensartede resultater.
- Eksporter og gem absorbansaflæsninger.
- Dataanalyse.
BEMÆRK: Eksperimentelle data kan behandles individuelt eller kopieres og indsættes i den medfølgende skabelon for at evaluere middelværdien, standardafvigelsen og varianskoefficienten (CV) ved hjælp af regnearkssoftware.- Åbn den supplerende fil 'supplementary_template-analysis.xlsx', som også er tilgængelig i GitHub-lageret under 'openworkstation/examples/publication-JoVE.
- Kopiér absorbansaflæsninger i arket med »rådata«, sørg for, at alle cellereferencer er korrekt defineret i alle tabeller, og klik på analysearket for at få oplysninger om værdierne for gennemsnit, standardafvigelse og varianskoefficient (CV).
BEMÆRK: Afhængigt af prøvefordelingen på en brøndplade er følgende forudindstillede evalueringstyper tilgængelige med skabelonen: Typen 'Ensartet' anvendes, når alle prøver har samme sammensætning, typen 'Efter rækker' anvendes, når prøver i forskellige rækker har forskellige sammensætninger, typen 'Efter kolonner' bruges, når prøver i forskellige kolonner har forskellige sammensætninger, og typen 'Tilpasset' bruges, når eksempelpositionerne er brugerspecifikke.
Representative Results
Denne vejledning præsenterer resultater for eksperimenter med glycerol (figur 3) og GelMA med LAP og alginat (figur 4).
Frembringelsen af en 80 % (v/v) glycerolopløsning blev undersøgt enten uden temperaturregulering (stuetemperatur, 22 °C) og uden spidsberøring (defineret som opsætning 1), med temperaturregulering (40 °C) og uden spidsberøring (opsætning 2) eller med temperaturregulering (40 °C) og med spidsberøring (opsætning 3) (figur 3a-i). Disse to temperaturindstillinger blev valgt for at evaluere håndteringsforskellen, da glycerols viskositet falder næsten med en faktor 3 ved opvarmning fra 22 °C (139,5 mPa·s) til 40 °C (46,6 mPa·s)30. En 85% (v / v) stamopløsning af glycerol blev fortyndet til en endelig koncentration på 80% og ensartet fordelt i en 96 brøndplade (n = 96 pr. Opsætning). Forsøgstiden, som omfatter dispensering af hvert materiale i blandingsrøret, de respektive blandingsopgaver og prøvefordeling i en 96 brøndplade, var 30 min 42 s. For at identificere forskelle mellem fortyndingsblandinger blev ultrarent vand - som fortyndingsmiddel for glycerol - fremstillet med 1 mg/ml Orange G. Absorbansaflæsningerne fremhæver, at integrationen af temperaturreguleringen og spidsberømningerne påvirker blandingerne betydeligt (p < 0,0001). Ud over den udførte tovejsanalyse af varians (ANOVA) blev CV-værdierne beregnet for at evaluere den relative standardafvigelse. Variationskoefficienten beskriver en standardiseret indikator til identifikation af graden af afvigelse i forhold til gennemsnittet og udtrykkes som en procentdel. Hvis prøvemidlerne ikke er særlig interessante, men variabiliteten inden for målingerne, giver variationskoefficienten yderligere indsigt med henblik på at identificere reproducerbare blandinger46. Inden for dette eksperiment med tre forskellige opsætninger viste absorbansværdierne faldende CV-værdier fra 5,6%, 4,2% til 2,0% for henholdsvis opsætning 1, opsætning 2 og opsætning 3, hvilket demonstrerede den signifikante indflydelse af temperaturdokken og tipberøringsfunktionen på at producere pålidelige resultater (figur 3a-ii). Afbildning af prøveabsorbansværdier for opsætning 3 (prøvenummer #1 til #96 i en 96 brøndplade) giver ingen stigende eller faldende værdier under hele forsøget og indikerer derfor ingen indflydelse af prøvepositionen på absorbansværdierne (figur 3a-iii). Visualisering af dataene for hver målt brøndplade med varmekort giver yderligere indsigt i at identificere heterogeniteter for en bestemt række eller kolonne eller varierende absorbansværdier gennem dispenseringsopgaverne. De visualiserede heatmaps for de tre opsætninger viser nedsat heterogenitet på tværs af hele brøndpladerne fra opsætning 1 til opsætning 3 (figur 3b). Endelig blev replikabiliteten af den gennemførte blanding evalueret inden for otte uafhængige kørsler (figur 3c-i,ii), hvor hvert løb tog 6 min 57 s. Enkeltblandingskørsler viste lave CV-værdier mellem 1,1% og 2,6%, hvilket indikerer meget pålidelige blandings- og dispenseringsopgaver for de enkelte kørsler. Absorbansværdier for alle otte kørsler gav en CV-værdi på 3,3% og demonstrerede reproducerbarheden af den etablerede blandingsprotokol.
GelMA-fortyndingsserien blev fremstillet ved at fortynde en 20 % (w/v) stamopløsning med PBS til 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 og 0 % (w/v) og tilsætte LAP til en konstant koncentration på 0,15 % (w/v) (figur 4a-i), hvilket i alt tog 55 minutter 12 s. Som specificeret i det eksperimentelle protokolscript var hydrogelen tværbinding i 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 ved 400 nm. For at evaluere forskellene mellem blandingerne blev PBS - som fortyndingsstof for GelMA og alginat - fremstillet med 1 mg/ml Orange G. Derfor identificeres absorbansforskellen mellem prøver inden for en blanding såvel som mellem de serielle fortyndinger med et spektrofotometer. Målte absorbansværdier for hvert koncentrationstrin er signifikant forskellige (p < 0,0001) og har meget lave CV-værdier mellem 1,2% og 3,4% i hele koncentrationstrinnene (n = 12 pr. Koncentrationstrin). Lineær regression viste høj pasform med en R²-værdi på 0,9869 (figur 4a-ii), og et varmekort bekræftede den homogene fordeling for hver koncentration og forskellen mellem koncentrationerne (figur 4a-iii). Automatiseret blanding af fire reagenser blev udført til generering af 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginat, 0,15% (w/v) LAP og PBS som fortyndingsstof uden (opsætning 2) og med (opsætning 3) berøringsspids (n = 96 for hver opsætning) med de samme tværbindingsparametre (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm). Dispensering af de fire materialer, blanding og distribution i en 96 brøndplade tog 32 min 22 s. Alle forsøg med GelMA og alginat blev udført ved 37 °C for at forhindre termisk gelering, som forhindrer pipettering af GelMA. Med tip touch-indstillingen blev CV-værdien reduceret fra 5,2% til 3,4%, og især outliers i det nedre område blev forhindret ved at fjerne overskydende materiale fra spidsen (figur 4b-i). Selvom middelværdien på 1.927 og 1.944 for opsætning 2 og opsætning 3 er meget tætte, fremhæver variationskoefficienten den faldende afvigelse i forhold til middelværdien. Enkelte rækker af 96 brøndpladen kan sammenlignes med hinanden ved hjælp af en heatmapvisualisering til at detektere række- og/eller kolonneforskelle (figur 4b-ii).
Figur 1: Protokolarbejdsgang med individuelle opgaver. Den beskrevne arbejdsgang er opdelt i syv opgaver, som er opdelt i opsætning, forberedelse, udførelse og analyse. I starten skal softwaren (opgave 1) samt hardwaren (opgave 2) sættes op. Efter forberedelsen af materialerne (opgave 3) og genereringen af protokolscriptet (opgave 4) kalibreres pipetteringsmodulet ved at definere pipettens og beholderpositionerne (opgave 5). Derefter udføres protokolscriptet på arbejdsstationen (opgave 6), og validering og verifikation (opgave 7) af blandinger udføres for at evaluere blandinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Open source arbejdsstation og dæk opsætning af pipetteringsmodulet. a) Den udviklede arbejdsstation er inspireret af en samlebåndstilgang, hvor prøver transporteres gennem forskellige moduler, og består af følgende moduler: pipettering, tværbinding, opbevaring, transport og beregningsmodul. b) Pipetteringsmodulets dæk opstilles afhængigt af forsøgslayoutet (f.eks. brøndpladetype, rørvolumen osv.). Den viste dækopsætning blev brugt til de præsenterede eksperimenter og består af positive forskydningspipetter med et interval fra 10-100 μL (M100E) og 100-1.000 μL (M1000E), spidsstativerne med kapillære stempler (CP) til 100 μL (CP1000) og 1.000 μL (CP1000), en skraldespand, en blandebakke og en indgangsbakke til indgangsreagenserne. c) De tilgængelige dækpositioner defineres med de viste numre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Resultater for automatiseret pipettering af glycerolblandinger. a) Det fleksible arbejdsstationsdesign gør det muligt at evaluere tre forskellige opsætninger (i) for at identificere optimale parametre for reproducerbare resultater. (ii) Tilsætningen af en spidsberøring og opvarmning af materialet resulterede i en reduceret varianskoefficient (CV) værdier og meget reproducerbare blandinger til opsætning 3. Hvert forsøg blev udført med 96 prøver. iii) Afbildning af enkelte prøveværdier viste ingen indflydelse på pipetteringssekvensen. (b) Eksperimentelle resultater af hver opsætning blev visualiseret med varmekort for at identificere indflydelsen på rå/kolonne forskelle, kanter eller masterblanding. (c) Reproducerbarheden af opsætning 3 blev analyseret inden for otte uafhængige kørsler ved hjælp af (i) median, standardafvigelse, CV-værdi og (ii) heatmaps. Data i panelerne a-ii (n = 96) og b-i (n = 12) præsenteres med midlerne og de enkelte datapunkter. Statistisk signifikans blev defineret som ****p < 0,0001 ved hjælp af tovejs variansanalyse (ANOVA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Resultater for blanding af opgaver med hydrogeler. a) Fra en gelatinemetacryloylopløsning (GelMA) med 20 % (w/v) blev der inden for en forsøgskørsel genereret en seriel fortynding på 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 og 0 % (w/v) inden for en forsøgskørsel under anvendelse af en 96 brøndplade (n = 12 pr. koncentration). i) Varianskoefficientværdierne (CV) varierede mellem 1,2 % og 3,4 % i de forberedte koncentrationer, og ii) lineær regression viste en høj tilpasning med en R²-værdi på 0,9869. iii) Homogene fortyndinger blev bekræftet visuelt med det genererede heatmap. b) Dobbeltnetværkshydrogeler blev genereret med 5 % (w/v) GelMA, 2 % (w/v)alginat og 0,15 % (w/v) LAP (i) med og uden spidsberøring (n = 96 for hver opsætning) og tværbundet i 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 ved 400 nm. Integrationen af tip touch resulterede i faldende CV-værdier fra 5,2% til 3,4%. (ii,iii) Heatmaps bekræfter færre afvigelser, når du bruger tip touch til at fjerne overskydende materiale fra spidsen. Data i panelerne a-i og b-i præsenteres med midlerne og de enkelte datapunkter. Statistisk signifikans blev defineret som *p < 0,05, ***p < 0,001 og ****p < 0,0001 ved hjælp af envejsanalyse af varians (ANOVA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Oversigt over forskellen i pipettetype og problemer med viskøse biomaterialer. a) Reagenset og stemplet adskilles af en luftpude, der krymper under dispenseringstrin og udvider sig under aspirerende trin. Ved aspirering og dispensering af viskøse materialer introducerer den langsomme 'strømning' problemer som luftbobler og uregelmæssig pipetteringsadfærd. b) Pipetter med positiv forskydning muliggør pålidelig opsugelse og dispensering af tyktflydende materiale ved hjælp af et stempel inde i spidsen. c) Pipettering af meget tyktflydende materialer (f.eks. 4 % alginat (w/v)) kan resultere i ophobning af overskydende materiale på spidsen, hvilket fører til unøjagtighed under forsøgene. d) Implementeringen af en simpel spidsberøringsbakke gør det muligt at fjerne det overskydende materiale på spidsen og resulterer i nøjagtige aspirerings- og dispenseringsvolumener. Dette realiseres ved at bruge indersiden af brøndpladelåget placeret på en tip rackbeholder. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Materiale nr. 1 (lagerkoncentration) | Endelig koncentration af materiale nr. 1 | Materiale nr. 2 (lagerkoncentration) | Endelig koncentration af materiale nr. 2 | Materialer nr. 3 (lagerkoncentration) | Endelig koncentration af materiale nr. 3 | Fortyndingsmiddel (Orange G-arbejdsløsning) | Endelig orange G-koncentration i blanding | Vist i figur |
| Glycerol (85% (w/v)) | 80% (w/v) | vand (1 mg/ml Orange G) | 0,059 mg/ml | Figur 3a-c | ||||
| GelMA (20% (w/v)) | 0% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 1 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 2% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,85 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 4% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,75 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 6% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,65 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 8% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,55 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 10% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,45 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 12% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,35 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 14% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,25 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20% (w/v)) | 5% (m/v) | Alginat (4% (w/v)) | 2% (m/v) | LAP (3% (w/v)) | 0,15% (w/v) | PBS (1 mg/mL Orange G) | 0,2 mg/ml | Figur 4b |
Tabel 1: Parameteroversigt for de udførte forsøg.
| Protokol trin | Problem | Mulig årsag | Opløsning |
| 1.1 | Software kan ikke installeres eller opdateres | Løber tør for diskplads på SD-kort | Kontroller diskplads på SD-kort. Fjern om nødvendigt unødvendige genstande, tøm papirkurven eller brug et SD-kort i passende størrelse |
| 1.2 | API kan ikke installeres | Brugernes mulighed for installation er begrænset (ingen root-brugertilladelse) | Brug kommandoen 'sudo' foran specificerede kommandoer for at få administratorrettigheder. I Linux er denne form for adgang kendt som superbrugeren. |
| 3.1 | Problemer med GelMA | Funktionalisering, dialyse eller lyofilisering | Detaljeret trin-for-trin protokol inklusive fejlfindingsliste tilgængelig i Loessner et al.33. |
| 5.1 og 6.2 | Arbejdsstationen reagerer ikke på kommandoer | Problemer med forbindelsen | Drej af alt og luk computeren. Sluk for strømforsyningen i 10 s. Tænd computeren og arbejdsstationen igen. |
| 5.1 og 6.2 | Arbejdsstationen reagerer ikke på kommandoer | Problemer med forbindelsen | Kontroller, om computeren genkender USB-forbindelsen, og USB-porten er defineret korrekt. Sørg for, at firewall ikke forhindrer forbindelsesprocessen (se linket under tabel 2). |
| 5.1 og 6.2 | Kan ikke åbne filen | Forkert mappe | Kontroller direktør (mappesti) for at sikre, at den rigtige sti bruges. Hvis en fil (f.eks. interface.py) ikke kan findes, er det sandsynligt, at den forkerte sti bruges. |
| 6.6.2 | Spidsen er ikke korrekt fastgjort eller falder under bevægelse | Kalibreringsproblem | Gentag kalibreringstrinnene for pipetten, og sørg for, at kapillærstemplet er forbundet korrekt med pipetten. |
| 6.6.2 | Spidsen er ikke korrekt fastgjort eller falder under bevægelse | Problem med vedhæftede filer | Pipetten er ikke korrekt forbundet til pipetteaksen og bevæger sig under bevægelsestrinnene. Spænd skruerne fast for at forhindre dette. |
| 6.6.2 | Tip aspirerer over materiale | Kalibreringsproblem | Gentag kalibreringen af denne bakketype for at definere højden korrekt. |
| 6.6.2 | Tip aspirerer over materiale | Kalibreringsproblem | Kontroller lydstyrken i røret, og sørg for, at lydstyrken er lig med den lydstyrke, der er defineret i protokoldesignerprogrammet. |
| 6.6.2 | Materialet dyppes under bevægelse | For meget overskydende materiale på spidsen | Tilføj tip touch dock mulighed; eventuelt kan også tiden for tip touch øges. |
| 6.6.2 | Materialet er fast eller for tyktflydende til pipettering | Materialets termoresponsive opførsel | Kontroller termoresponsiv materialekarakterisering, og juster opvarmnings- / køletemperaturen for temperaturdocken i overensstemmelse hermed. |
| https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting | |||
Tabel 2: Fejlfindingstabel med identificerede problemer, mulige årsager samt løsninger til løsning af problemerne.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Pipettering af viskøse materialer, især hydrogeler til biomedicinske anvendelser19,20,21,33,47, er rutinemæssige opgaver i mange forskningslaboratorier for at forberede en brugerdefineret koncentration eller en fortyndingsserie med varierende koncentrationer. Selvom det er gentagende, og udførelsen er ret enkel, udføres den for det meste manuelt med lav prøvegennemstrømning18. Denne vejledning introducerer driften af en open source-arbejdsstation, der er specielt designet til viskøse materialer, for at muliggøre automatiseret blanding af viskøse materialer til reproducerbar generering af ønskede koncentrationer. Denne arbejdsstation er optimeret til pipettering af hydrogeler for at muliggøre automatiseret og yderst pålidelig håndtering ved integration af temperaturdokker til termoresponsive materialer, positive forskydningspipetter til viskøse materialer og en valgfri tipberøringsdock for at fjerne overskydende materiale fra spidsen. Pipetteringsmodulet er specifikt optimeret til at muliggøre behandling af tyktflydende materiale på en standardiseret og automatiseret måde. Sammenlignet med luftpudepipetter (figur 5a) dispenserer positive fortrængningspipetter (figur 5b) viskøse materialer uden at efterlade restmateriale tilbage i spidsen, hvilket resulterer i nøjagtige aspirerings- og dispenseringsvolumener. Den valgfri spidsberøringsdock fjerner overskydende prøvemateriale fra spidsen (figur 5c,d), hvilket er nyttigt til limmaterialer (f.eks. 4% (w/v) alginat).
Protokoldesignerapplikationen er specielt programmeret til hydrogeler og tillader fortynding af op til fire reagenser med forskellige koncentrationer og op til to fortyndingsmidler. Risikoen for fejl i beregningen af endelige fortyndinger forhindres i denne applikation, da brugerne kun vælger den ønskede koncentration eller de serielle fortyndingstrin. Påkrævede aspirerings- og dispenseringsenheder beregnes automatisk, gemmes i en separat dokumentationstekstfil og udfyldes derefter i protokolscriptet. Denne protokoldesignapplikation giver brugeren fuld kontrol over alle eksperimentelle parametre (f.eks. Pipetteringshastighed) og sikrer intern dokumentation af de vigtige parametre. Protokoldesignappen tager højde for reservoirets påfyldningsniveau (f.eks. Brønd) og varierer aspirerings-/dispenseringshøjden for at forhindre unødvendig dypning i de viskøse materialer. Denne integrerede funktion undgår materialeakkumulering på spidsens ydervæg og sikrer derved pålidelige aspirerings- og dispenseringsopgaver i hele protokollen. Selvom protokoldesignerapplikationen er udviklet til hydrogelfortyndingstrin, kan den også bruges til fortynding af ikke-viskøse væsker, såsom Orange G-farvestoffer. Protokoldesignerapplikationen, som er tilgængelig via lageret under »/examples/publication-JoVE«, er den version, der forklares i protokolafsnittet og fremhæves i videoen. Denne version opdateres ikke. En opdateret version af protokoldesignerprogrammet er dog tilgængelig via hovedlagersiden. Kalibreringsterminalen blev oprindeligt udviklet af Sanderson48 og er optimeret til kalibrering af positive fortrængningspipetter.
Som beskrevet i protokolafsnit 4 skal pipetter såvel som beholdere kalibreres i første omgang. Denne kalibreringsproces er afgørende for at definere og gemme de positioner, som derefter bruges til at beregne bevægelsesintervallerne. Derfor er en vellykket protokoludførelse afhængig af veldefinerede kalibreringspositioner, da forkerte kalibreringspunkter kan resultere i, at spidsen styrter ned i en beholder. Da pipetternes stempelpositioner skal kalibreres manuelt, afhænger pipetteringsnøjagtigheden og -præcisionen i høj grad af den udførte kalibrering. Disse kalibreringsprocedurer afhænger i høj grad af brugeroplevelsen med pipetteringsmodulet, og derfor anbefales uddannelse med erfarent personale i begyndelsen for at sikre korrekte kalibreringsprocedurer. Ud over den manuelle kalibrering på pipetteringsmodulet skal selve pipetten kalibreres for at sikre nøjagtig pipettering. Det anbefales at kalibrere pipetterne mindst hver 12. måned for at opfylde acceptkriterierne som specificeret i ISO 8655. For at evaluere pipettekalibreringen internt er validering og verifikation tilgængelig som beskrevet af Stangegaard et al.16.
For at kunne frembringe et pålideligt datasæt er det afgørende at starte med reagenser af høj kvalitet. Dette er især vigtigt for hydrogelbehandlingsopgaver, da batch-til-batch-variationer kan påvirke de genererede resultater inden for denne protokol. Ud over batch-til-batch-variationer kan subtile ændringer i fremstillingen af små mængder også bidrage til egenskabsforskelle. For at forhindre dette anbefales fremstilling af større mængder, som kan bruges til hele forsøgene.
Validerings- og verifikationsprocedurerne er afhængige af brugen af et farvestof til at identificere pålidelige blandinger. Den præsenterede protokol beskriver anvendelsen af Orange G, men den generelle protokol- og analysearbejdsgang kan også tilpasses fluorescerende farvestoffer49,50. Brugen af Orange G reducerer spektrofotometerets tekniske krav og eliminerer forholdsregler, der træffes for at forhindre blegning af de fluorescerende farvestoffer efter udsættelse for lys. Problemer i opløsningsadfærd eller klyngedannelse af farvestoffet er ikke blevet observeret med de præsenterede materialer under forsøg, men kan forekomme med andre materialer. Potentiel klyngedannelse og dermed interaktionen mellem farvestof og materiale kunne let detekteres med et mikroskop.
De procedurer og teknikker, der præsenteres i denne vejledning, tilføjer automatiseringskapacitet til aktuelle arbejdsgange for viskøse materialer for at opnå meget pålidelige opgaver med minimal menneskelig arbejdskraft. Den medfølgende fejlfindingstabel (tabel 2) indeholder identificerede problemer og præsenterer mulige årsager samt løsninger til løsning af problemerne. Den præsenterede arbejdsstation er blevet anvendt med succes på naturlige (gelatine, gellangummi, matrigel) og syntetiske (f.eks. Poly(ethylenglycol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymere materialer til automatiserede pipetteringsopgaver. Især vil kombinationen af en open source-arbejdsstation og en open source-protokoldesignapplikation designet til viskøse materialer være meget nyttig for forskere, der arbejder inden for biomedicinsk teknik, materialevidenskab og mikrobiologi.
Disclosures
CM og DWH er grundlæggere og aktionærer i Gelomics Pty Ltd. CM er også direktør for Gelomics Pty Ltd. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter, der er relevante for emnet for denne artikel. Forfatterne har ingen andre relevante tilknytninger eller økonomisk involvering med nogen organisation eller enhed med en økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materialerne, der diskuteres i artiklen, bortset fra dem, der er beskrevet.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender medlemmerne af Center i Regenerativ Medicin ved QUT, især Antonia Horst og Pawel Mieszczanek for deres nyttige forslag og feedback. Dette arbejde blev støttet af QUT's Postgraduate Research Award for SE og af Australian Research Council (ARC) under tilskudsaftale IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB blev støttet af et National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
| 5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
| 50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
| 70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
| Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
| Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
| Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
| M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
| OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
| Equipment | |||
| Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
| Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
| Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
| Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
| Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
| Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
| Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |
References
- Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
- Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
- Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712 (2011).
- Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344 (2010).
- Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
- Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
- Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
- Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
- Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
- Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
- Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
- Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
- Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
- Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002 (2019).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Zhang, Y. S., Khademhosseini, A.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018 (2018).
- Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
- Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
- Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510 (2020).
- Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
- Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
- Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75 (2018).
- Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
- Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
- Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
- Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976 (2016).
- Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
- Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
- O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
- LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
- Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
- Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
- Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
- Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
- Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
- Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
- Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).
