Summary
Bu protokol, viskoz malzemelerin yeni bir açık kaynak otomasyon teknolojisi ile standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir şekilde karıştırılması için kapsamlı bir öğretici görevi görür. Yeni geliştirilen açık kaynaklı bir iş istasyonunun çalışması, açık kaynaklı bir protokol tasarımcısının kullanımı ve tekrarlanabilir karışımları tanımlamak için doğrulama ve doğrulama hakkında ayrıntılı talimatlar sağlanmaktadır.
Abstract
Viskoz malzemelerin mevcut karıştırma adımları, çoğunlukla düşük aktarım hızı modunda manuel olarak gerçekleştirilen tekrarlayan ve zaman alıcı görevlere dayanır. Bu sorunlar, sonuçta araştırma bulgularının geri alınamazlığına neden olabilecek iş akışlarındaki dezavantajları temsil eder. Manuel tabanlı iş akışları, biyomedikal uygulamalar için kullanılan hidrojeller gibi viskoz malzemelerin ilerlemesini ve yaygın olarak benimsenmesini daha da sınırlandırmamaktadır. Bu zorluklar, tekrarlanabilirliği artırmak için standartlaştırılmış karıştırma süreçlerine sahip otomatik iş akışları kullanılarak aşılabilir. Bu çalışmada, açık kaynaklı bir protokol tasarımcısı kullanmak, açık kaynaklı bir iş istasyonu işletmek ve tekrarlanabilir karışımları tanımlamak için adım adım talimatlar sunuyoruz. Özellikle, açık kaynak protokolü tasarımcısı kullanıcıya deneysel parametre seçiminde rehberlik eder ve iş istasyonunu çalıştırmak için kullanıma hazır bir protokol kodu oluşturur. Bu iş istasyonu, termoresponsif malzemeler için sıcaklık yuvalarının, viskoz malzemeler için pozitif deplasman pipetlerinin ve pipet ucundaki fazla malzemeyi çıkarmak için isteğe bağlı bir uçlu dokunmatik yuvanın entegrasyonu ile otomatik ve son derece güvenilir elleçleme sağlamak için viskoz malzemelerin pipetle işlenmesi için optimize edilmiştir. Karışımların doğrulanması ve doğrulanması, Turuncu G'nin hızlı ve ucuz bir absorbans ölçümü ile gerçekleştirilir. Bu protokol% 80 (v / v) gliserol karışımları, jelatin methacryloyl (GelMA) için bir seyreltme serisi ve% 5 (w / v) GelMA ve% 2 (w / v) aljinat çift ağ hidrojelleri elde etmek için sonuçlar sunar. Protokol benimsemesi olan kullanıcıları desteklemek için bir sorun giderme kılavuzu eklenmiştir. Açıklanan iş akışı, otomatik bir şekilde kullanıcı tanımlı konsantrasyonlar oluşturmak için bir dizi viskoz malzemeye yaygın olarak uygulanabilir.
Introduction
Bilimsel çalışmalarda tekrarlanabilirlik ve tekrarlanabilirlik son derece önemlidir1,2,3,4. Bununla birlikte, son kanıtlar, çevirisel araştırmaların yanı sıra temel bilimde yüksek etkili biyomedikal çalışmaların tekrarlanmasındaki önemli zorlukları vurgulamıştır4,5,6,7. Yetersiz sonuçlara katkıda bulunan faktörler, zayıf veya önyargılı çalışma tasarımı6,8, yetersiz istatistiksel güç3,9, raporlama standartlarına uyumun eksikliği7,10,11, yayınlama baskısı6 veya kullanılamayan yöntemler veya yazılım kodu6,9 gibi karmaşık ve manifolddur. . Bunlar arasında, protokoldeki ince değişiklikler ve deneylerin yürütülmesindeki insan hataları, geri dönüşü olmayan unsurların daha fazla olduğu belirlenmiştir4. Örneğin, manuel pipetleme görevleri birey içi ve birey arası imprecision12,13'ü tanıtır ve insan hata olasılığını artırır14. Ticari sıvı taşıma robotları bu dezavantajların üstesinden gelebilir ve sıvılar için artan güvenilirlik göstermiş olsa da15,16,17, önemli viskoz özelliklere sahip malzemelerin otomatik kullanımı hala zordur.
Ticari sıvı taşıma robotları genellikle hava pistonu veya hava deplasmanlı pipetler olarak da bilinen hava yastığı pipetlerini kullanır. Reaktif ve piston, dağıtım adımları sırasında küçülen ve aspirasyon adımları sırasında genişleyen bir hava yastığı ile ayrılır. Hava yastığı pipetleri kullanılarak, viskoz malzemeler sadece yavaşça ucun içine ve dışına akar ve pipetlerin rezervuardan erken çekilmesi hava kabarcıklarının aspirasyonuna neden olabilir. Dağıtım görevleri sırasında, viskoz malzeme iç uç duvarında hava tarafından zorlandığında sadece yavaşça akan veya hiç akmayan bir film bırakır. Bu sorunların üstesinden gelmek için, viskoz malzemeyi katı bir piston kullanarak ucundan aktif olarak çıkarmak için ticari olarak pozitif deplasman pipetleri tanıtıldı. Bu pozitif deplasmanlı pipetler viskoz malzemelerin doğru ve güvenilir bir şekilde işlenmesini mümkün kılsa da, pozitif deplasman pipetli otomatik çözümler akademik laboratuvar ayarları için hala çok pahalıdır ve bu nedenle viskoz malzemelere sahip çoğu iş akışı yalnızca manuel pipetleme görevlerine dayanır18.
Genel olarak, viskozite bir sıvının akışa direnci olarak tanımlanır ve viskoz malzemeler daha fazla su viskozitesine sahip malzemeler olarak tanımlanır (25 °C'de 0,89 mPa·s). Biyomedikal uygulamalar alanında, deneysel kurulumlar genellikle dimetil süloksit (DMSO; 25 °C'de 1,99 mPa·s), gliserol (%90 gliserol [v/v]) için 25 °C'de 208,1 mPa·s), Triton X-100 (25 °C'de 240 mPa·s) ve hidrojel olarak adlandırılan su şişmiş polimerler19, 20. Hidrojeller, hücre kapsülleme, ilaç teslimi ve yumuşak aktüatörler19,20,21,22 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılan fiziksel veya/ve kimyasal modda düzenlenmiş hidrofilik polimer ağlardır. Hidrojellerin viskozitesi polimer konsantrasyonuna ve moleküler ağırlığa bağlıdır19. Biyomedikal uygulamalar için rutin olarak kullanılan hidrojeller 1 ila 1000 mPa·s arasında viskozite değerleri sergilerken, 6 x 107 mPa·s19,23,24 değerlerine kadar spesifik hidrojel sistemleri bildirilmiştir. Bununla birlikte, hidrojellerin viskozite ölçümleri ölçüm protokolü ve numune hazırlama açısından standartlaştırılmayandır ve bu nedenle farklı çalışmalar arasındaki viskozite değerlerini karşılaştırmak zordur.
Hidrojeller için özel olarak tasarlanmış ticari olarak kullanılabilen otomatik çözümler eksik veya çok pahalı olduğundan, hidrojel için mevcut iş akışları manuel işlemeye bağlıdır18. Hidrojellerin pipetle işlenmesi için mevcut manuel tabanlı iş akışının sınırlamalarını anlamak için, temel işleme görevlerini anlamak önemlidir18. Örneğin, yeni bir hidrojel malzeme sentezlendikten sonra, mekanik özelliklerin daha sonraki analizi ile güvenilir sentez protokollerini ve çapraz bağlama özelliklerini tanımlamak için istenen bir konsantrasyon veya değişen konsantrasyonlara sahip bir seyreltme serisi oluşturulur25,26,27,28 . Genel olarak, bir stok çözeltisi hazırlanır veya satın alınır ve daha sonra bir karışım elde etmek için seyreltici ve / veya diğer reaktiflerle karıştırılır. Karıştırma görevleri çoğunlukla doğrudan iyi bir plakada (veya herhangi bir çıkış biçiminde) gerçekleştirilmez ve daha çok ana karışım olarak adlandırılan ayrı bir reaksiyon tüpünde gerçekleştirilir. Bu hazırlık görevleri sırasında, viskoz malzemeleri aktarmak, reaktifleri karıştırmak ve karışımı bir çıkış formatına (örneğin, 96 kuyu plakası) aktarmak için çeşitli aspirasyon ve dağıtım adımları gereklidir. Bu görevler yüksek miktarda insan emeği gerektirir18, uzun deneysel saatler ve potansiyel olarak yanlış sonuçlar olarak ortaya çıkabileceği insan hataları olasılığını arttırır. Ayrıca, manuel kullanım, ayrıntılı karakterizasyon için çeşitli parametre kombinasyonlarını taramak için yüksek numune numaralarının verimli bir şekilde hazırlanmasını önler. Manuel işleme, ilaç geliştirme sırasında umut verici bileşiklerin tanımlanması gibi yüksek verimli tarama uygulamaları için hidrojellerin kullanımını da engeller. Mevcut manuel tabanlı hazırlık adımları, binlerce ilaçla oluşan uyuşturucu kütüphanelerini taramak için mümkün değildir. Bu nedenlerle, verimli bir geliştirme süreci sağlamak ve ilaç tarama uygulamaları için hidrojellerin başarılı bir şekilde çevrilmesini sağlamak için otomatik çözümler gereklidir.
Manuel tabanlı iş akışlarından otomatik proseslere geçmek için, termoresponsif malzemeler için sıcaklık yuvalarının entegrasyonu, kılcal piston uçları kullanılarak raf dışı pozitif deplasman pipetlerinin kullanımı ve pipet ucu temizliği için isteğe bağlı uçlu bir uçlu bağlantı noktası ile viskoz malzemelerin işlenmesi için ticari bir açık kaynaklı pipetleme robotunu optimize ettik. Bu pipetleme robotu, kuruluma hazır ve özelleştirilebilir modüllerden oluşan yeni geliştirilen açık kaynaklı bir iş istasyonuna pipetleme modülü olarak daha da entegre edilmiştir18,29. Donanım ve yazılım dosyaları da dahil olmak üzere geliştirilen iş istasyonu için ayrıntılı montaj talimatlarına GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) ve Zenodo deposundan (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757) serbestçe erişilebilir. Donanım geliştirmeye ek olarak, açık kaynaklı bir protokol tasarım uygulaması, kullanıcıya parametre seçim sürecinde rehberlik etmek ve kullanıma hazır bir protokol kodu (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp) oluşturmak için programlanmış ve yayımlanmıştır. Bu kod, ticari açık kaynaklı pipetleme robotunda ve geliştirilen açık kaynaklı iş istasyonunda çalışır.
Burada, viskoz malzemeler için karıştırma görevlerini otomatikleştirmek için açık kaynaklı iş istasyonunun çalışması hakkında kapsamlı bir öğretici sağlanmaktadır (Şekil 1). Öğreticiye özel protokol adımları, geliştirilen açık kaynaklı iş istasyonunun yanı sıra ticari açık kaynaklı pipetleme robotu ile gerçekleştirilebilir. Şirket içinde geliştirilen açık kaynaklı protokol tasarım uygulaması ile desteklenen gliserol, jelatin methacryloyl (GelMA) ve aljinat için gerekli konsantrasyonların otomatik olarak karıştırılması ve hazırlanması gösterilmiştir. Gliserol bu öğreticide seçilmiştir, çünkü iyi karakterize edilmiştir30,31, ucuz ve kolayca kullanılabilir ve bu nedenle, otomatik pipetleme görevleri için viskoz referans malzemesi olarak yaygın olarak kullanılır. Biyomedikal uygulamalarda kullanılan hidrojellere örnek olarak, otomatik karıştırma deneyleri için GelMA ve aljinat hidrojel öncül çözümleri uygulanmıştır. GelMA, hücre kapsülleme çalışmaları için en sık kullanılan hidrojellerden birini sunun32,33 ve aljinat çift ağ hidrojelleri üretme yeteneğini göstermek için bu çalışmada seçildi34,35. Orange G'yi boya olarak kullanarak, karıştırma sonuçlarını bir spektrofotometre16 ile doğrulamak ve doğrulamak için hızlı ve ucuz bir prosedür uygulandı.
Ticari bir açık kaynaklı pipetleme robotu, geliştirilen açık kaynaklı iş istasyonuna pipetleme modülü olarak entegre edilmiştir (Şekil 2a) ve bu nedenle pipetleme robotını tanımlamak için 'pipetleme modülü' adı daha da kullanılmaktadır. Yüklü donanımın ayrıntılı bir açıklaması bu protokolün kapsamı dışındadır ve açık kaynak platformunun genel montajı için adım adım yönergeler de içeren sağlanan depolar aracılığıyla kullanılabilir. Pipetleme modülü, A eksenine (sağ) ve B eksenine (solda) (Şekil 2b) monte edilen iki pipet (tek veya 8 kanallı pipet) ile donatılabilir. Pipetleme modülü, Amerikan Ulusal Standartlar Enstitüsü/Laboratuvar Otomasyonu ve Taraması Derneği (ANSI/SLAS) standartlarına göre 10 güverte kapasitesi sunar ve güvertede aşağıdaki konum konumları tanımlanır: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Şekil 2c). Hidrojel çözeltilerinin foto-kaynaklı polimerizasyonunu başlatmak için ayrı bir çapraz bağlantı modülü gereklidir ve iş istasyonuna eklenmiştir. Çapraz bağlantı modülü 400 nm dalga boyunda LED'lerle donatılmıştır ve bu nedenle, lityum fenil-2,4,6 trimetilbenzoylphosphinate (LAP)36,37 gibi mevcut sistemlerle görünür bir ışık dalga boyunda heyecanlandıran maddeler kullanılabilir. LED'lerin yoğunluğu (mW/cm2 olarak) çapraz bağlama davranışını incelemek için protokol tasarım uygulamasında kullanıcı tarafından ele alınabilir38. İş istasyonu ayrıca daha fazla aktarım hızı etüdünü sağlamak için bir depolama modülü içerir; ancak, bu modül bu çalışmada kullanılmaz ve bu nedenle daha fazla açıklanmamıştır. Genel olarak, numune kirlenmesini önlemek için pipetleme modülünün biyolojik bir güvenlik kabininde çalıştırılması önerilir. Pipetleme modülünü çalıştırmak için ana güç devresi, çoğu ülkede düşük voltajlı bir uygulama olarak kabul edilen 12 V devredir. Tüm elektrik bileşenleri, kullanıcıların elektriksel tehlike kaynağıyla temas etmesini önleyen özel bir kontrol kutusuna dayanır.
Araştırmacılar, bu standartlaştırılmış karıştırma protokollerini izleyerek, viskoz ve viskoz olmayan malzemeler için güvenilir karışımları otomatik bir şekilde elde edebiliyorlar. Açık kaynak yaklaşımı, kullanıcıların karıştırma dizilerini optimize etmelerini ve yeni geliştirilen protokolleri toplulukla paylaşmalarını sağlar. Sonuç olarak, bu yaklaşım, farklı faktörler arasındaki bağımlılıkları araştırmak ve böylece biyomedikal uygulamalar için viskoz malzemelerin güvenilir uygulamasını ve geliştirilmesini hızlandırmak için birden fazla parametre kombinasyonunun taranmasını kolaylaştıracaktır.
Protocol
NOT: Protokol, (1) yazılıma ve (2) kullanıcıyı gerekli yüklemelere ve iş istasyonuna alıştırmak için donanım kurulumuna girişle başlar. (3) malzeme hazırlama ve (4) protokol tasarımcısı uygulamasının kullanımı ile ilgili bir bölümün ardından, (5) pipetleme modülünün kalibrasyonu ve (6) otomatik protokolün yürütülmesi ayrıntılı olarak vurgulanır. Son olarak, (7) absorbans okuma ve veri analizi de dahil olmak üzere doğrulama ve doğrulama prosedürleri açıklanmaktadır. Şekil 1'de tek tek görevleri içeren genel bir protokol iş akışı görüntülenir.
1. Yazılım kurulumu
NOT: Bu bölüm, uygulama programlama arabirimini (API) ve gerekli protokol tasarımcısı uygulamasını ve kalibrasyon terminalini yüklemek için ayrıntılı bir talimat içerir. Raspberry Pi (RPi) tek kartlı bilgisayar için aşağıdaki yönergeler yazılmıştır; ancak Windows 8, 10 ve macOS 10.13+ API ve uygulamalarla başarıyla kullanılmıştır.
- Bilgisayar ortamını ayarlayın.
NOT: Python39'un temellerini, Raspberry Pi40,41'i nasıl kuracağınızı ve kullanacağınızı ve internet42'ye nasıl bağlanacağınızı öğrenin. Aşağıdaki öğretici adımlar protokole özgü adımlara odaklanır ve Raspberry Pi kullanımı hakkında ek bilgiler çevrimiçi olarak kullanılabilir40.- Görev çubuğundan veya uygulama menüsünden bir terminal penceresi açın.
- Sistemin paket listesini güncelleştirin:
sudo apt-get güncelleştirmesi - Yüklü tüm paketleri yükseltin:
sudo apt-get dist-upgrade - Raspberry Pi'yı yeniden başlatın:
sudo yeniden başlatma - Yüklü Python sürümünü denetle:
python3 --sürüm
En azından Python 3.5'in yüklü olduğundan emin olun; değilse, en son sürümü yükleyin43. - Python Paket Dizini44 ile Python paketleri yayınlayan python pip'i yükleyin:
sudo apt-get python3-pip yükleme - Bağımlılıkları yükleme:
pip yükleme numpy
pip python-resize-image'ı yükleyin
NOT: Windows kullanıyorsanız, windows curses paketini şu şekilde yüklemeniz gerekir: python -m pip windows curses'i yükleyin
- Uygulama programlama arabirimini (API) yükleyin.
NOT: API, deneysel protokoller komut dosyası yazmak ve iş istasyonunu çalıştırmak için tasarlanmış basit bir Python çerçevesi sağlar. Oluşturulan iletişim kuralı kodunu başarıyla yürütmek için aşağıdaki iki API gereklidir.- İş istasyonu API'sini yükleyin:
pip yükleme açık iş istasyonu - Pipetleme modülini çalıştırmak için Opentrons API'sini yükleyin:
pip opentrons'u yükleyin==2.5.2 - API başarıyla yüklenmişse doğrulayın:
python3
>>> açık iş istasyonunu içe aktar
>>> opentronları ithal ediyor
NOT: API ve protokol tasarım uygulamasının boyutu sırasıyla 2,2 MB ve 1,2 MB'tır. Sınırlı disk alanı (200 MB) ile kullanıldığında yükleme sırasında herhangi bir sorun yaşanmadı. Ancak, disk alanı gereksinimleri işletim sistemine bağlıdır.
- İş istasyonu API'sini yükleyin:
- Dosya indirmek için bir dizin seçin (kalibrasyon terminali, protokol tasarım uygulaması vb.).
NOT: Dosyalar daha sonra kopyalanabilir ve başka bir yere yapıştırılabilir. - GitHub deposundan dosyaları klonla:
git klon https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
NOT: 'git clone' komutu klonlanır ve daha sonra tüm dosyaları şu anda terminalde açık olan dizine kaydeder. Depo derleme için donanım dosyalarını da içerdiğinden, sunulan protokolleri yürütmek için tüm depo gerekli değildir. Denemeleri çoğaltmak için gerekli tüm dosyalar Ek Dosya olarak ve GitHub deposunda "/examples/publication-JoVE" altında kullanılabilir. - İndirilen klasörü açın. Deponun tamamı indirildiyse,
cd openworkstation/examples/publication-JoVE
NOT: Bu klasör, iş istasyonunun çalışması ve protokol tasarımcısı uygulamasının ve kalibrasyon terminalinin kullanımı için gerekli dosyaları içerir.
2. Donanım kurulumu
- Numune kirlenmesini önlemek için iş istasyonunu biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin.
- Pipetleri iş istasyonuna takın.
- Deneysel kuruluma göre pipet boyutunu seçin. Genel olarak, hangi hacmin aralığın üst ucunda olduğu pipet boyutunu alın. Belirli bir kurulum için 1 mL'den büyük hacimlerle karıştırma görevleri gerekiyorsa (örneğin, 2 mL'lik epirasyon/dağıtım), pipetleme adımlarını en aza indirmek ve zamandan tasarruf etmek için 1.000 μL'lik maksimum emiş/dağıtım hacmine sahip M1000E'yi seçin.
NOT: Hava deplasmanlı pipetler için ayrıntılı bir talimat çevrimiçi olarak mevcuttur45. Geliştirilen pipetleme modülü aşağıdaki raf dışı pozitif deplasman pipetlerini entegre edebilir: M10E (1–10 μL), M25E (3–25 μL), M50E (20–50 μL), M100E (10–100 μL), M250E (50–250 μL), M1000E (100–1.000 μL). - Vidaları gevşetmek ve sıkmak için bir M4 Allen tuşu kullanın.
- İki pipet sabitleme plakasını (beyaz akrilik plakalar) alüminyum raylara takın ve M5 vidalarını gevşek bir şekilde sıkın.
- Pipeti iki pipet sabitleme plakasına yerleştirin ve pipet ergonomik kuyruğunun akrilik montaj plakasının karşı tarafında olduğundan emin olun.
- İki pipet sabitleme plakasının dört vidasını sıkıca sıkın.
- Akrilik montaj plakasına tutturulmuş iki kare sabitleme somununu z ekseninin ekstrüzyon yuvasına kaydırın ve vidaları sıkın.
NOT: Çalışma sırasında herhangi bir hareketi önlemek için pipeti sıkıca sabitleyin.
- Deneysel kuruluma göre pipet boyutunu seçin. Genel olarak, hangi hacmin aralığın üst ucunda olduğu pipet boyutunu alın. Belirli bir kurulum için 1 mL'den büyük hacimlerle karıştırma görevleri gerekiyorsa (örneğin, 2 mL'lik epirasyon/dağıtım), pipetleme adımlarını en aza indirmek ve zamandan tasarruf etmek için 1.000 μL'lik maksimum emiş/dağıtım hacmine sahip M1000E'yi seçin.
3. Malzeme hazırlama
NOT: Viskoz malzemeler (gliserol, GelMA, aljinat) bu çalışmada sunulan deneyler için kullanılır ve bu nedenle, hazırlanan hacimler ve taşıma görevleri (örneğin, 5 mL reaksiyon tüplerine 5 mL stok çözeltisi ekleyin) bu deneysel kurulum için özeldir.
- Jelatin methacryloyl (GelMA)
NOT: GelMA fonksiyonelleştirme, diyaliz ve liyofilizasyon bu makalenin kapsamı değildir ve Loessner ve ark.33'te adım adım bir protokol mevcuttur. Protokol, şirket içinde hazırlanabilen veya ticari olarak satın alınabilen lyophilized GelMA'yı kullanmaya başlar.- Denklemi kullanarak istenen nihai stok konsantrasyonuna (cGelMA) ve hacme (VGelMA) göre gerekli GelMA (mGelMA) kütlesini hesaplayın:
mGelMA = cGelMA x VGelMA
NOT: VGelMA deneysel kuruluma bağlıdır ve %20−30 fazla malzeme hazırlanması önerilir. Sunulan protokoller, stok çözümü olarak % 20'lik (w/v) GelMA'nın 5 mL'si ile başlar. - Gerekli miktarda liyofilize JelMA'yı tartın, 50 mL reaksiyon tüpüne ekleyin ve gerekli miktarda fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
- GelMA'yı bir gecede 4 °C'de çözücüye batırarak veya bir su banyosunda 6 saat boyunca 60 °C'ye ısıtarak karıştırın.
NOT: Steril GelMA çözeltileri en az altı ay boyunca 4 °C'de ışıktan korunarak saklanabilir. - 5 mL JelMA'yı 5 mL reaksiyon tüplerine doldurun.
- Denklemi kullanarak istenen nihai stok konsantrasyonuna (cGelMA) ve hacme (VGelMA) göre gerekli GelMA (mGelMA) kütlesini hesaplayın:
- Fotoinitiatör: Lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP)
NOT: LAP ışığa duyarlı olduğundan oda ışığına ek maruz kalmaktan kaçının.- Denklemi kullanarak istenen nihai stok konsantrasyonuna (cLAP) ve gerekli hacme (VLAP) bağlı olarak gerekli LAP kütlesini (mLAP) hesaplayın:
mLAP = cLAP x VLAP
NOT: %3 (w/v) stok çözümü hazırlamanız önerilir. - Gerekli miktarda LAP'yi tartın, 15 mL reaksiyon tüpüne ekleyin ve PBS ekleyin.
- Foto-kaynaklı ayrışmayı önlemek için tüpü alüminyum folyoya sarın.
- Reaksiyon tüpünü 2 saat boyunca 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirerek veya tamamen çözünene kadar LAP'yi çözün.
- 5 mL tüplerde 1 mL LAP stok çözeltisi doldurun.
- Denklemi kullanarak istenen nihai stok konsantrasyonuna (cLAP) ve gerekli hacme (VLAP) bağlı olarak gerekli LAP kütlesini (mLAP) hesaplayın:
- Alginat
- Denklemi kullanarak istenen nihai stok konsantrasyonuna (calginate) ve hacme (Valginate) bağlı olarak gerekli miktarda aljinat (malginat) hesaplayın:
maljinat = calginate x Valginate
NOT: Valginat deneysel kuruluma bağlıdır ve %20−30 fazla malzemenin hazırlanması önerilir. Sunulan protokoller, stok çözümü olarak% 4 (w / v) aljinatın 5 mL'si ile başlar. - Gerekli aljinat kütlesini tartın, 50 mL reaksiyon tüplerine ekleyin ve PBS ekleyin.
- Aljinat karışımını 4 saat boyunca 37 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
NOT: Bir girdap mikserinin kullanımı çözülme sürecini hızlandırır, aynı zamanda hava kabarcıkları oluşturur. Çözünmüş aljinat en az altı ay boyunca 4 °C'de saklanabilir. - 5 mL aljinatı 5 mL reaksiyon tüplerine doldurun.
- Denklemi kullanarak istenen nihai stok konsantrasyonuna (calginate) ve hacme (Valginate) bağlı olarak gerekli miktarda aljinat (malginat) hesaplayın:
- 5 mL reaksiyon tüplerinde 5 mL gliserol doldurun.
- Turuncu G çözümü
- 50 mL reaksiyon tüpünde 10 mg/mL'lik bir Orange G stok çözeltisi hazırlayın.
NOT: Birim, deneme sayısına bağlıdır. Seyreltici tipe bağlı olarak, stok çözeltisini ultra saf su, PBS veya uygun bir seyreltici reaktifte hazırlayın. Sunulan deneylerde, Jelserol ve PBS'nin Seyreltilmesinde GelMA ve aljinatın seyreltilmesinde ultra saf su kullanılmıştır. PBS, GelMA ve aljinat için seyreltici olarak kullanılmıştır ve tabletler kullanılarak hazırlanabilir veya raftan satın alınabilir. - Girdapla 10 sn karıştırın.
- Foto-kaynaklı ayrışmayı önlemek için tüpü alüminyum folyoya sarın.
NOT: Stok çözeltisi, Turuncu G'nin düzgün bir şekilde çözünmesini sağlamak için 24 saat sonra kullanılabilir. - Stok çözeltisini 50 mL reaksiyon tüpünde 1 mg/mL çalışma çözeltisine seyreltin.
- Deneysel kurulum için çalışma solüsyonunu uygun şişelere/tüplere aktarın.
NOT: Sunulan deneyler için çalışma çözeltisi 5 mL tüplere dolduruldu. Turuncu G stok ve çalışma çözeltisi 4 °C'de saklanabilir ve hazırlık sırasında üç ay içinde kullanılabilir. - 1 mg/mL Turuncu G çalışma solüsyonunun 5 mL'lik kısmını 5 mL reaksiyon tüplerine doldurun.
- 50 mL reaksiyon tüpünde 10 mg/mL'lik bir Orange G stok çözeltisi hazırlayın.
4. Protokol tasarımcısı uygulamasıyla protokol kodu oluşturun
NOT: 4.2−4.7 adımlarında belirtilen parametreler, malzemenin stok konsantrasyonu ve son çıkış konsantrasyonu dışında yapılan tüm deneyler için aynıdır. Bu parametreler Tablo 1'de özetlenmiştir ve aşağıdaki parametreler% 5 (w/ v) GelMA, % 2 (w / v) aljinat,% 0.15 (w / v) LAP ve PBS seyreltici olarak çift ağ hidrojelleri hazırlamak için kullanılır.
- 'ProtocolDesignApp.html' çalıştırarak protokol tasarımcısı uygulamasını açın.
NOT: "ProtocolDesignApp.html" uygulaması, parametre seçim sürecinde kullanıcıya rehberlik eder ve iş istasyonunu çalıştırmak için otomatik olarak kullanıma hazır protokolü oluşturur. Kullanıcı arayüzü yaygın olarak kullanılan her internet tarayıcısında (örneğin Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer) çalışır. - Kurulum sayfasına protokol adını (örneğin, çift ağ hidrojelleri) girin.
- Protokol adını onaylamak ve bir sonraki adıma geçin için 'Devam'ı tıklatın.
- Açılan menüden ve aşağıdaki giriş parametrelerinden '3x4 Isıtma Bloğu'nü seçerek giriş tepsisini tanımlayın:
- Açılan menüden 'Gel 1'i seçin, 'GelMA' adını girin, stok konsantrasyonunu '%20' girin, bir sütunu doldurmak için 'Örnek Sayısı'yı '3' olarak ayarlayın. Girdileri kaydetmek için '+add' öğesini tıklatın.
- Açılan menüden 'Jel 2'yi seçin, ad girin: 'Alginate', stok konsantrasyonunu '%4' girin, bir sütunu doldurmak için 'Örnek Sayısı'yı '3' olarak ayarlayın. Girdileri kaydetmek için '+add' öğesini tıklatın.
- Açılan menüden 'Photoinitiator'u seçin, ad girin: 'LAP', stok konsantrasyonunu '%3' girin, bir sütunu doldurmak için 'Örnek Sayısı'ni '3' olarak ayarlayın. Girdileri kaydetmek için '+add' öğesini tıklatın.
- Açılan menüden 'Seyreltici 1'i seçin, ad girin: 'PBS', bir sütunu doldurmak için 'Örnek Sayısı'ni '3' olarak ayarlayın. Girdileri kaydetmek için '+add' öğesini tıklatın.
NOT: '+add' tıklatıldıktan sonra giriş tepsisinin görselleştirilmesi otomatik olarak güncelleştirilir. Tepsinin kapasitesinden daha fazla giriş eklenirse, kullanıcıya 'Bu tepsi için çok fazla örnek' uyarısı gösterilir.
- 'Fotoğraf çapraz bağlama'yı kontrol ederek ve süreyi saniyeler içinde yazarak çapraz bağlama parametrelerini tanımlayın, '30' ve '2' ile W/m2 yoğunluğunu yazın.
- 'DEVAM'ı tıklatarak giriş kurulumunu tamamla.
- Kuyu plakası tipi için açılır menüden '96 kuyu plakası' seçerek çıkış tepsisi kurulumunu tanımlayın.
- Bir örnek grubu oluşturarak çıktıları tanımlamak için 'Grup1'i tıklatın.
- Her giriş için alanlara istediğiniz konsantrasyonları ve örnek hacmi girerek çıktı bileşimini belirtin: GelMA = '5', Alginate = '2', LAP = '0.15', Toplam Hacim = '60'.
- Gelişmiş karıştırma iletişim kuralını uygulamak için onay kutusunu işaretleyin.
- 'Örnek Sayısı': '96' alanına örnek sayısını girerek örnek sayısını belirtin.
NOT: '+add group' tıklatıldıktan sonra örnek tepsinin görselleştirilmesi otomatik olarak güncelleştirilir. Tepsinin kapasitesinden daha fazla örnek eklenirse, kullanıcıya 'Bu tepsi için çok fazla örnek' uyarısı gösterilir. - 'DEVAM'ı tıklatarak çıktı kurulumunu tamamla.
- Güverte düzeninde tepsi konumunu seçin ve platformu buna göre hazırlayın:
- 'SLOT A1' alanındaki onay işaretini işaretleyin ve açılır menüden 'Empty_Cell'i seçin.
- 'SLOT A2' alanındaki onay işaretini işaretleyin ve açılır menüden 'Trash_Cell'i seçin.
- 'SLOT B1' alanındaki onay işaretini işaretleyin ve açılır menüden 'Tips_Cell_100 μL'yi seçin.
- 'SLOT B2' alanındaki onay işaretini işaretleyin ve açılır menüden 'Tips_Cell_1000 μL'yi seçin.
- 'SLOT C1' alanındaki onay işaretini işaretleyin ve açılır menüden 'Input_Cell'i seçin.
- 'SLOT C2' alanındaki onay işaretini işaretleyin ve açılır menüden 'Empty_Cell'i seçin.
- 'SLOT D1' alanındaki onay işaretini işaretleyin ve açılır menüden 'Mixing_Cell'i seçin.
- 'SLOT D2' alanındaki onay işaretini işaretleyin ve açılır menüden 'Output_Cell'i seçin.
- 'Pipet Sol'u kontrol ederek, açılır menüden '10-100μL pozitif yer değiştirme' seçerek ve aspirasyon hızı = '600', dağıtım hızı = '800' ayarlayarak ilk pipetin (M100E) türünü ve özelliklerini tanımlayın.
- 'Pipet Hakkı'nın kontrol edilmesi, açılır menüden '100-1000μL pozitif yer değiştirme' öğesinin seçilmesi ve aspirasyon hızı = '800', dağıtım hızı = '1200' ayarlanarak ikinci pipet türünü ve özelliklerini tanımlayın.
- Kurulumu onaylamak ve protokol komut dosyasını oluşturmak için 'PROTOKOL OLUŞTUR'u tıklatın.
NOT: Geliştirilen protokol tasarımcısı uygulaması, yeni bir protokol oluşturulduğunda otomatik olarak yeni bir klasör oluşturur. Bu deneme ve iş istasyonunu çalıştırmak için gereken tüm dosyalar, protokol adından sonra adlandırılan bu klasöre kaydedilir. Klasör, sorunlara neden olmadan farklı dizinlere kopyalanabilir. - İletişim kuralını yürütmek için kullanılacağı için arabirimi kapatmayın (bkz. adım 6.6.).
5. Pipetleme modülünün kalibrasyonu
NOT: Konteynerler (örneğin, kuyu plakaları, uç rafı, çöp) ve pipetler (örneğin, M1000E) başlangıçta kalibre edilmelidir. Bir kap ve/veya pipet konumu değiştirilirse/değiştirilirse, yeni konum kalibre edilmelidir.
- Protokol klasörüne gidin ve 'calibrate.py' dosyasını bir terminal windox'unda çalıştırarak kalibrasyon terminalini açın (bkz. adım 1.1.1):
phython.calibrate.py
NOT: 'calibrate.py' arayüzü, deste kurulumu ve pipetlerin kalibrasyonunda kullanıcıya rehberlik eder. Dosyanın protokol dosyası ve modül dosyalarıyla aynı klasörde olduğundan emin olun. 4.10 adımında otomatik olarak oluşturulur. - Sayısal tuş takımıyla (1−8) piston,y,z hareketi için hareket artışlarını seçin: 0,1 mm için '1', 0,5 mm için '2', 1 mm için '3', 5 mm için '4', 10 mm için '5', 20 mm için '6', 40 mm için '7' ve 80 mm için '8'.
- Pipet kalibrasyon.
- Pipet boyutunu seçmek için P klavye kısayoluna basın.
- Piston kalibrasyon moduna girmek için klavye kısayolu V'ye basın.
NOT: Pipet kafasının artış boyutu ve hareket hareketi hakkında bilgi sahibi olmak için küçük artışlarla (2, 5 ve 10 mm) başlamanız önerilir. - Pozitif deplasman pipet için aşağıdaki piston konumlarını kalibre edin: T-Top = dinlenme pozisyonu; B–Bottom = piston direnç karşılanana kadar itilir; P–Pick-up = piston piston ucunun takılabileceği bir konuma itilir; E–Eject = piston, ekli bir uç çıkarılana kadar itilir. Klavyedeki yukarı ve aşağı okları kullanarak piston konumlarını değiştirin ve klavyedeki S'yi kullanarak son konumu kaydedin.
- Klavye kısayolu V'ye basarak pipet pistonu kalibrasyon modundan ayrılın.
- Pipet ucuna göre konteyner konumunu kalibre edin.
- Pipet türünü seçmek için P klavye kısayoluna basın. Bir ucun seçili pipetliye bağlı olduğundan emin olun.
- Kapsayıcı türünü seçmek için C klavye kısayoluna basın.
- Uygun bir hareket artışı seçin ve pipet ucunu aşağıdaki konumlara taşıyın. kuyu plakaları için, alttaki 'A1' kuyu konumuna kalibre edin; Uç rafı için 'A1' konumuna getirin; Çöp kutusu için, ucun çöp kutusuna atılabileceği bir konum (nokta olarak tanımlanır) seçin.
- Konumu kaydetmek için klavye kısayol s tuşuna basın.
- Seçili pipet türü için 'C' altında listelenen tüm kapsayıcılar için 5.3.1−5.3.3 adımlarını yineleyin.
- İkinci pipet tipi için 5.3.1−5.3.5'i tekrarlayın.
- Kalibrasyon komut dosyasını kapatın.
6. İş istasyonu ile protokol yürütme
NOT: Protokol dosyalarına depo üzerinden erişilebilir ve Ek Dosya olarak da mevcuttur.
- Çöp konteynerini, uç rafları, giriş tepsisini, karıştırma tepsisini ve çıkışı güverteye yerleştirin (adım 4.3'te tanımlanır).
- Bölüm 5'te tanımlandığı şekilde pipetleri ve aletleri kalibre edin.
- Gerekirse, sıcaklık yuvasını AÇIN ve giriş ve karıştırma tepsisi için sıcaklığı seçin.
NOT: Bu öğreticideki deneyler sıcaklık kontrolü olmadan ve gliserol için 40 °C'de ve GelMA ve aljinat pipetleme için 37 °C'de gerçek yapılmıştır. - Giriş reaktifli boruları seçilen kuruluma göre sıcaklık yuvalarındaki alüminyum bloklara yerleştirin.
- Giriş reaktifleri istenen sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin.
NOT: Uygun sıcaklık dağılımını sağlamak için GelMA ve aljinat için 30 dakikalık bir kuluçka süresi önerilir. - 'RUN PYTHON SCRIPT' üzerine tıklayarak protokol dosyasını yürütme
NOT: Seçili iletişim kuralı artık iş istasyonu tarafından yürütülür. Eşlik eden video, GelMA'nın otomatik olarak karıştırılması ve 60 μL'nin 96 kuyu plakasına dağılımını vurgulamaktadır. - 'Tamamlandı' görüntülendiğinde çalıştırma tamamlanır.
7. Doğrulama ve doğrulama süreci
- Kuyu plakasını iş istasyonundan çıkarın ve kuyu plakasını numunelerle birlikte bir spektrofotometreye taşıyın.
- Absorbansı 450 nm'de spektrofotometre ile okuyun. Sonuçları karşılaştırmak ve tutarlı sonuçlar elde etmek için her plakayı 2x okuyun.
- Absorbans okumalarını dışa aktarın ve kaydedin.
- Veri analizi.
NOT: Deneysel veriler, elektronik tablo yazılımı kullanılarak ortalama, standart sapma ve varyans (CV) değeri katsayısını değerlendirmek için ayrı ayrı işlenebilir veya sağlanan şablona kopyalanabilir ve yapıştırılabilir.- GitHub deposunda 'openworkstation/examples/publication-JoVE altında da vailable olan 'supplementary_template-analysis.xlsx" Ek Dosyasını açın.
- Absorbans okumalarını 'ham veri' sayfasına kopyalayın, tüm hücre başvurularının tüm tablolarda doğru tanımlandığından emin olun ve ortalama, standart sapma ve varyans (CV) değerlerinin katsayısı hakkında bilgi için 'analiz' sayfasına tıklayın.
NOT: Bir kuyu plakasındaki örnek dağılımına bağlı olarak, şablonla birlikte aşağıdaki önceden ayarlanmış değerlendirme türleri mevcuttur: 'Tekdüzen' türü tüm örnekler aynı bileşime sahip olduğunda kullanılır, farklı satırlardaki örnekler farklı bileşime sahip olduğunda 'Satırlara göre' türü kullanılır, farklı sütunlardaki örnekler farklı bileşimlere sahip olduğunda 'Sütunlara göre' türü kullanılır, ve örnek konumlar kullanıcıya özel olduğunda 'Özelleştirilmiş' türü kullanılır.
Representative Results
Bu öğretici, gliserol (Şekil 3) ve Lap ve aljinat ile GelMA ile yapılan deneyler için sonuçlar sunar (Şekil 4).
%80 (v/v) gliserol çözeltisinin üretimi ya sıcaklık kontrolü olmadan (oda sıcaklığı, 22 °C) ve uç dokunuşu olmadan (kurulum 1 olarak tanımlanır), sıcaklık kontrolü (40 °C) ve uç dokunuşu olmadan (kurulum 2) veya sıcaklık kontrolü (40 °C) ve uç dokunuşu (kurulum 3) ile araştırılmıştır (Şekil 3a-i). Bu iki sıcaklık ayarı, kullanım farkını değerlendirmek için seçildi, çünkü gliserol viskozitesi 22 °C'den (139,5 mPa·s) 40 °C'ye (46,6 mPa·s)30'a ısıtıldığında neredeyse 3 kat azalmaktadır. Gliserol'ün %85 (v/v) stok çözeltisi% 80'lik son konsantrasyona seyreltildi ve düzgün bir şekilde 96 kuyu plakasına (kurulum başına n = 96) dağıtıldı. Her malzemenin karışım tüpüne dağıtılmasını, ilgili karıştırma görevlerini ve numunenin 96 kuyu plakasına dağıtılmasını içeren deneysel süre 30 dk 42 s idi. Seyreltme karışımları arasındaki farkları belirlemek için, gliserol için seyreltici olarak ultra saf su 1 mg/ mL Turuncu G ile hazırlanmıştır. Absorbans okumaları, sıcaklık kontrolü ve uç dokunuşunun entegrasyonunun karışımları önemli ölçüde etkilediğini vurgulamaktadır (p < 0.0001). Yapılan iki yönlü varyans analizine (ANOVA) ek olarak, cv değerleri göreli standart sapmayı değerlendirmek için hesaplanmıştır. Değişim katsayısı, ortalamaya göre sapma derecesini tanımlamak için standartlaştırılmış bir göstergeyi tanımlar ve yüzde olarak ifade edilir. Örnek araçlar özellikle ilgi çekici nokta değilse, ancak ölçümlerdeki değişkenlik ise, varyasyon katsayısı tekrarlanabilir karışımları tanımlamak için ek içgörüler sağlar46. Üç farklı kurulumla yapılan bu denemede, absorbans değerleri, sıcaklık yuvasının ve uç dokunma işlevinin güvenilir sonuçlar üretme üzerindeki önemli etkisini gösteren, sırasıyla kurulum 1, kurulum 2 ve kurulum 3 için CV değerlerinin%5,6,%4,2'den %2,0'ye düştüğünü göstermiştir (Şekil 3a-ii). Kurulum 3 için örnek absorbans değerlerinin çizilme (örnek numarası #1 ila #96 bir kuyu plakasında) deneme boyunca artan veya azalan değerler oluşturmaz ve bu nedenle numune konumunun absorbans değerleri üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterir (Şekil 3a-iii). Ölçülen her kuyu plakası için verilerin ısı haritalarıyla görselleştirilmesi, belirli bir satır veya sütun için heterojenlikleri veya dağıtım görevleri boyunca değişen absorbans değerlerini belirlemek için ek içgörüler sağlar. Üç kurulum ekranı için görselleştirilmiş ısı eşlemleri, kurulum 1'den kurulum 3'e kadar tüm kuyu plakalarında heterojenlikleri azalttı (Şekil 3b). Son olarak, yapılan karıştırmanın cevaplanabilirliği, her çalıştırmanın 6 dk 57 sn sürdüğü sekiz bağımsız koşu (Şekil 3c-i,ii) içinde değerlendirildi. Tek karıştırma çalıştırmaları% 1.1 ila% 2.6 arasında düşük CV değerleri gösterdi, bu da bireysel çalıştırmalar için çok güvenilir karıştırma ve dağıtma görevlerini gösteriyor. Sekiz çalıştırmanın tüm absorbans değerleri % 3,3'lük bir CV değeri sağladı ve belirlenen karıştırma protokolünün tekrarlanabilirliğini gösterdi.
GelMA seyreltme serisi PBS ile %20 (w/v) stok çözeltisinin %14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 ve %0 (w/v) seyreltilmesi ve lap'ın toplam 55 dk 12 sn süren %0,15 (w/v) sabit konsantrasyonuna eklenmesiyle hazırlanmıştır. Deneysel protokol komut dosyasında belirtildiği gibi, hidrojel 400 nm'de 2.0 mW/ cm2 yoğunlukta 30 s için çapraz bağlantı yapıyordu. Karışımlar arasındaki farkları değerlendirmek için PBS-as GelMA ve aljinat için seyreltici 1 mg/mL Turuncu G ile hazırlanmıştır. Her konsantrasyon adımının ölçülen absorbans değerleri önemli ölçüde farklıdır (p < 0.0001) ve konsantrasyon adımları boyunca %1.2 ile % 3.4 arasında çok düşük CV değerlerine sahiptir (n = konsantrasyon adımı başına 12). Doğrusal regresyon, 0.9869 R² değeri (Şekil 4a-ii) ile yüksek uyum gösterdi ve bir ısı haritası her konsantrasyon için homojen dağılımı ve konsantrasyonlar arasındaki farkı doğruladı (Şekil 4a-iii). %5 (w/v) GelMA üretimi için dört reaktifin otomatik olarak karıştırılması, %2 (w/v) aljinat, %0,15 (w/v) LAP ve PBS, aynı çapraz bağlama parametrelerine (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm) sahip, (kurulum 2) ve (kurulum 3) dokunmatik uçlu (3) dokunmatik uçlu (n = 96) seyreltici olarak. Dört malzemenin dağıtılması, karıştırılması ve 96 kuyu plakasına dağıtılması 32 dk 22 sn sürdü. GelMA ve aljinat ile yapılan tüm deneyler, GelMA'nın pipetlenini önleyen termal jelleşmeyi önlemek için 37 °C'de yapılmıştır. uç dokunma seçeneği ile CV değeri %5,2'den %3,4'e düşürüldü ve özellikle alt bölgedeki aykırı değerler uçtan fazla malzeme çıkarılarak önlendi (Şekil 4b-i). Kurulum 2 ve kurulum 3 için 1.927 ve 1.944 ortalama değeri çok yakın olsa da, varyasyon katsayısı ortalamaya göre azalan sapmayı vurgular. 96 kuyu plakasının tek satırları, satır ve/veya sütun farklılıklarını tespit etmek için bir ısı haritası görselleştirmesi kullanılarak birbirleriyle karşılaştırılabilir (Şekil 4b-ii).
Şekil 1: Tek tek görevlerle protokol iş akışı. Açıklanan iş akışı, kurulum, hazırlık, yürütme ve çözümleme olarak ayrılmış yedi göreve ayrılmıştır. Başlangıçta, yazılım (görev 1) ve donanım (görev 2) ayarlanmalıdır. Malzemelerin hazırlanmasından (görev 3) ve protokol komut dosyasının (görev 4) üretilmesinden sonra pipet ve konteyner konumları tanımlanarak pipet modülü kalibre edilir (görev 5). Daha sonra, protokol komut dosyası iş istasyonunda (görev 6) yürütülür ve karışımları değerlendirmek için karışımların doğrulanması ve doğrulanması (görev 7) gerçekleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Pipetleme modülünün açık kaynaklı iş istasyonu ve güverte kurulumu. (a) Geliştirilen iş istasyonu, numunelerin farklı modüller aracılığıyla taşındığı bir montaj hattı yaklaşımından esinlenmiştir ve aşağıdaki modüllerden oluşur: pipetleme, çapraz bağlantı, depolama, taşıma ve hesaplama modülü. (b) Pipetleme modülünün güvertesi deneysel düzene (örneğin, kuyu plakası tipi, tüp hacmi vb.) bağlı olarak ayarlanır. Görüntülenen güverte kurulumu sunulan deneyler için kullanıldı ve 10−100 μL (M100E) ve 100−1.000 μL (M1) aralığında pozitif deplasman pipetlerinden oluşuyor000E), 100 μL (CP1000) ve 1.000 μL (CP1000) için kılcal pistonlu (CP) uç raflar, bir çöp konteyneri, bir karıştırma tepsisi, ve giriş reaktifleri için bir giriş tepsisi. (c) Mevcut güverte konumları görüntülenen sayılarla tanımlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Gliserol karışımlarının otomatik pipetlenmesi için sonuçlar. (a) Esnek iş istasyonu tasarımı, tekrarlanabilir sonuçlar için en uygun parametreleri belirlemek üzere üç farklı kurulumun (i) değerlendirilmesini sağlar. (ii) Malzemenin uç dokunuşu ve ısıtılması, varyans (CV) değerlerinin katsayısının azalmasına ve kurulum için yüksek oranda tekrarlanabilir karışımlara neden oldu 3. Her deney 96 örnekle gerçekleştirildi. (iii) Tek örnek değerlerinin çizilme pipetleme sırası üzerinde hiçbir etkisi göstermedi. (b) Her kurulumun deneysel sonuçları, ham/sütun farklılıkları, kenarlar veya ana karışım üzerindeki etkiyi belirlemek için ısı haritaları ile görselleştirildi. (c) Kurulum 3'ün tekrarlanabilirliği, (i) ortanca, standart sapma, CV değeri ve (ii) ısı haritası kullanılarak sekiz bağımsız çalıştırma içinde analiz edildi. Panellerdeki veriler a-ii (n = 96) ve b-i (n = 12) araçları ve tek veri noktaları ile birlikte sunulur. varyans (ANOVA) iki yönlü analizi kullanılarak istatistiksel anlamlılık ****p < 0.0001 olarak tanımlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Görevleri hidrojellerle karıştırma sonuçları. (a) Jelatin metakriloyl (GelMA) %20 (w/v) stok çözeltisinden, 96 kuyu plakası (konsantrasyon başına n = 12) kullanılarak bir deneysel çalışma içinde 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 ve %0 (w/v) seri seyreltme üretilmiştir. (i) Varyans (CV) değerlerinin katsayısı hazırlanan konsantrasyonlar boyunca %1,2 ile %3,4 arasında değişmiş ve (ii) doğrusal regresyon 0,9869 R² değeri ile yüksek bir uyum göstermiştir. (iii) Homojen seyreltmeler, üretilen ısı haritası ile görsel olarak doğrulandı. (b) Çift ağ hidrojelleri %5 (w/v) GelMA, %2 (w/v) aljinat ve %0,15 (w/v) LAP (i) uç dokunuşlu ve uçsuz (n = her kurulum için 96) ile üretilmiş ve 400 nm'de 2,0 mW/cm2 şiddette 30 s için çapraz bağlanır. Uç dokunuşunun entegrasyonu, CV değerlerinin %5,2'den %3,4'e düşmesine neden oldu. (ii,iii) Isı eşlemleri, uçtan fazla malzemeyi çıkarmak için uç dokunuşunu kullanırken daha az sapmayı onaylar. Panellerdeki veriler a-i ve b-i araçlar ve tek veri noktaları ile sunulur. İstatistiksel anlamlılık *p < 0.05, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001 olarak tanımlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Pipet tipi farkının özeti ve viskoz biyomalzemelerle ilgili sorunlar. (a) Reaktif ve piston, dağıtım adımları sırasında küçülen ve aspirasyon adımları sırasında genişleyen bir hava yastığı ile ayrılır. Viskoz malzemeleri epire ederken ve dağıtırken, yavaş 'akış' hava kabarcıkları ve düzensiz pipetleme davranışı gibi sorunları tanıtır. (b) Pozitif deplasmanlı pipetler, ucun içinde bir piston kullanarak viskoz malzemenin güvenilir bir şekilde emiş edilmesini ve dağıtılmasını sağlar. (c) Yüksek viskoziteli malzemelerin pipetletle (örneğin, %4 (w/v) aljinat) uçta fazla malzeme birikmesine neden olabilir ve bu da deneyler boyunca yanlışlığa yol açabilir. (d) Basit bir uç dokunmatik tepsinin uygulanması, uçtaki fazla malzemenin çıkarılmasını sağlar ve doğru aspirasyon ve dağıtım hacimleri ile sonuçlanır. Bu, bir uç raf kabına yerleştirilen kuyu plakası kapağının iç tarafı kullanılarak gerçekleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Malzeme #1 (stok konsantrasyonu) | Malzemenin son konsantrasyonu #1 | Malzeme #2 (stok konsantrasyonu) | Malzemenin son konsantrasyonu #2 | Malzemeler #3 (stok konsantrasyonu) | Malzemenin son konsantrasyonu #3 | Seyreltici (Turuncu G çalışma çözümü) | Karışımda Son Turuncu G konsantrasyonu | Şekilde görüntülenir |
| Gliserol (%85 (w/v)) | %80 (w/v) | su (1 mg/mL Turuncu G) | 0.059 mg/mL | Şekil 3a−c | ||||
| GelMA (%20 (w/v)) | %0 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 1 mg/mL | Şekil 4a | ||
| GelMA (%20 (w/v)) | %2 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 0.85 mg/mL | Şekil 4a | ||
| GelMA (%20 (w/v)) | %4 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 0.75 mg/mL | Şekil 4a | ||
| GelMA (%20 (w/v)) | %6 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 0.65 mg/mL | Şekil 4a | ||
| GelMA (%20 (w/v)) | %8 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 0,55 mg/mL | Şekil 4a | ||
| GelMA (%20 (w/v)) | %10 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 0.45 mg/mL | Şekil 4a | ||
| GelMA (%20 (w/v)) | %12 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 0.35 mg/mL | Şekil 4a | ||
| GelMA (%20 (w/v)) | %14 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 0.25 mg/mL | Şekil 4a | ||
| GelMA (%20 (w/v)) | %5 (w/v) | Aljinat (%4 (w/v)) | %2 (w/v) | LAP (%3 (w/v)) | %0,15 (w/v) | PBS (1 mg/mL Turuncu G) | 0.2 mg/mL | Şekil 4b |
Tablo 1: Yapılan deneyler için parametreye genel bakış.
| İletişim kuralı adımı | Sorun | Olası neden | Çözüm |
| 1.1 | Yazılım yüklenemiyor veya güncelleştirilemiyor | SD kartta disk alanı tükeniyor | SD kartta disk alanını denetleyin. Gerekirse, gereksiz öğeleri kaldırın, depo gözünü boşaltın veya uygun boyutta bir SD kart kullanın |
| 1.2 | API yüklenemiyor | Kullanıcıların yükleme yeteneği kısıtlandı (kök kullanıcı izni yok) | Yönetici hakları kazanmak için belirtilen komutların önünde 'sudo' komutunu kullanın. Linux'ta, bu tür bir erişim süper kullanıcı olarak bilinir. |
| 3.1 | GelMA ile ilgili sorunlar | İşlevselleştirme, diyaliz veya diofiliizasyon | Loessner ve ark.33'te bulunan sorun giderme listesi de dahil olmak üzere ayrıntılı adım adım protokol. |
| 5.1 ve 6.2 | İş istasyonu komutlara tepki vermiyor | Bağlantı sorunları | Her şeyi çevirin ve bilgisayarı kapatın. Güç kaynağını 10 sn kapatın. Güç bilgisayarı ve iş istasyonu tekrar açık. |
| 5.1 ve 6.2 | İş istasyonu komutlara tepki vermiyor | Bağlantı sorunları | Bilgisayarın USB bağlantısını tanıyıp tanımayıp tanımayıp tanımay olduğunu ve USB bağlantı noktasının doğru tanımlanıp tanımlanmadıklarını denetleyin. Güvenlik duvarının bağlantı işlemini engellemediğinden emin olun (Tablo 2'nin altındaki bağlantıya bakın). |
| 5.1 ve 6.2 | Dosya açılamıyor | Yanlış dizin | Doğru yolun kullanıldığından emin olmak için yönetmeni (klasör yolu) denetleyin. Bir dosya (örneğin, interface.py) bulunamazsa, yanlış yol kullanılıyor olabilir. |
| 6.6.2 | İpucu düzgün bağlanmamış veya hareket sırasında düşmez | Kalibrasyon sorunu | Pipet için kalibrasyon adımlarını tekrarlayın ve kılcal pistonun pipetle düzgün bağlandığından emin olun. |
| 6.6.2 | İpucu düzgün bağlanmamış veya hareket sırasında düşmez | Ek sorunu | Pipet pipet eksenine düzgün bağlanmaz ve hareket adımları sırasında hareket eder. Bunu önlemek için vidaları sıkıca sıkın. |
| 6.6.2 | İpucu malzemenin üzerinde aspirasyon yapıyor | Kalibrasyon sorunu | Yüksekliği düzgün tanımlamak için bu tepsi tipinin kalibrasyonunu tekrarlayın. |
| 6.6.2 | İpucu malzemenin üzerinde aspirasyon yapıyor | Kalibrasyon sorunu | Tüpteki birimi denetleyin ve birimin protokol tasarımcısı uygulamasında tanımlanan birime eşit olduğundan emin olun. |
| 6.6.2 | Hareket sırasında malzeme batıyor | Uçta çok fazla malzeme | İpucu dokunmatik yuva seçeneği ekleyin; isteğe bağlı olarak, uç dokunma süresi de artırılabilir. |
| 6.6.2 | Malzeme borulama için katı veya çok viskoz | Malzemenin termresponsif davranışı | Termoresponsif malzeme karakterizasyonunu kontrol edin ve sıcaklık yuvasının ısıtma/soğutma sıcaklığını buna göre ayarlayın. |
| https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting | |||
Tablo 2: Tanımlanan sorunlar, olası nedenler ve sorunları çözmek için çözümler içeren sorun giderme tablosu.
Discussion
Viskoz malzemelerin pipetletilmesi, özellikle biyomedikal uygulamalar için hidrojeller19,20,21,33,47, kullanıcı tanımlı bir konsantrasyon veya değişen konsantrasyonlara sahip bir seyreltme serisi hazırlamak için birçok araştırma laboratuvarında rutin görevlerdir. Tekrarlayan ve yürütme oldukça basit olmasına rağmen, çoğunlukla düşük örnek aktarım hızı18 ile manuel olarak gerçekleştirilir. Bu öğretici, viskoz malzemeler için özel olarak tasarlanmış açık kaynaklı bir iş istasyonunun çalışmasını tanıtarak, viskoz malzemelerin tekrarlanabilir bir şekilde üretilebilir şekilde üretilmesini sağlar. Bu iş istasyonu, termoresponsif malzemeler için sıcaklık yuvalarının, viskoz malzemeler için pozitif deplasman pipetlerinin ve uçtan fazla malzemeyi çıkarmak için isteğe bağlı bir uç dokunmatik yuvanın entegrasyonu ile otomatik ve son derece güvenilir elleçleme sağlamak için hidrojellerin pipetle işlenmesi için optimize edilmiştir. Pipetleme modülü, viskoz malzemenin standart ve otomatik bir şekilde işlenmesini sağlamak için özel olarak optimize edilmiştir. Hava yastığı pipetlerine kıyasla (Şekil 5a), pozitif deplasmanlı pipetler (Şekil 5b), uçta kalan malzemeyi bırakmadan viskoz malzemeler dağıtarak doğru aspirasyon ve dağıtım hacimleri sağlar. İsteğe bağlı uçlu dokunmatik yuva, yapışkan malzemeler (örneğin, %4 (w/v) aljinat) için yararlı olan uçtan (Şekil 5c,d) fazla numune malzemesini çıkarır.
Protokol tasarımcısı uygulaması hidrojeller için özel olarak programlanmıştır ve farklı konsantrasyonlarda ve iki seyrelticiye kadar dört reaktifin seyreltilmesine izin verir. Kullanıcılar sadece istenen konsantrasyonu veya seri seyreltme adımlarını seçtiklerinden, bu uygulamada son seyreltmelerin hesaplanmasında hata riski önlenir. Gerekli aspirasyon ve dağıtım birimleri otomatik olarak hesaplanır, ayrı bir belge metin dosyasına kaydedilir ve ardından protokol komut dosyasına doldurulur. Bu protokol tasarım uygulaması, kullanıcıya tüm deneysel parametrelerin (örneğin pipetleme hızı) tam kontrolünü sağlar ve önemli parametrelerin dahili olarak belgelenebilmesini sağlar. Protokol tasarım uygulaması, rezervuarın dolum seviyesini (örneğin, iyi) dikkate alır ve viskoz malzemelere gereksiz daldırılmayı önlemek için aspirasyon / dağıtım yüksekliğini değişir. Bu entegre özellik, ucun dış duvarında malzeme birikmesini önler ve böylece protokol boyunca güvenilir aspirasyon ve dağıtım görevleri sağlar. Protokol tasarımcısı uygulaması hidrojel seyreltme adımları için geliştirilmiş olmasına rağmen, Turuncu G boyaları gibivis pussuz sıvıların seyreltilmesi için de kullanılabilir. '/examples/publication-JoVE' altındaki depo üzerinden erişilebilen protokol tasarımcısı uygulaması, protokol bölümünde anlatılan ve videoda vurgulanan sürümdür. Bu sürüm güncelleştirilmeyecek. Ancak, protokol tasarımcısı uygulamasının güncelleştirilmiş bir sürümü ana depo sayfası aracılığıyla kullanılabilir. Kalibrasyon terminali başlangıçta Sanderson48 tarafından geliştirilmiştir ve pozitif deplasman pipetlerinin kalibrasyonu için optimize edilmiştir.
Protokol bölüm 4'te açıklandığı gibi, pipetlerin yanı sıra kaplar da başlangıçta kalibre edilmelidir. Bu kalibrasyon işlemi, daha sonra hareket artışlarını hesaplamak için kullanılan pozisyonları tanımlamak ve kaydetmek için çok önemlidir. Bu nedenle, yanlış kalibrasyon noktaları ucun bir kaba çökmesine neden olabileceğinden, başarılı protokol yürütme iyi tanımlanmış kalibrasyon konumlarına dayanır. Pipetlerin piston konumlarının manuel olarak kalibre edilmesi gerektiğinden, pipetleme doğruluğu ve hassasiyeti büyük ölçüde gerçekleştirilen kalibrasyona bağlıdır. Bu kalibrasyon prosedürleri, pipetleme modülü ile kullanıcı deneyimine bağlıdır ve bu nedenle, uygun kalibrasyon prosedürlerini sağlamak için başlangıçta deneyimli personelle eğitim önerilir. Pipetleme modülündeki manuel kalibrasyona ek olarak, pipet doğru pipetleme sağlamak için kalibre edilmelidir. Pipetlerin ISO 8655'te belirtildiği gibi kabul kriterlerine uymaları için en az 12 ayda bir kalibre edilmesi önerilir. Pipet kalibrasyonunu dahili olarak değerlendirmek için, Stangegaard ve ark.16 tarafından açıklandığı gibi doğrulama ve doğrulama mevcuttur.
Güvenilir bir veri kümesinin üretilmesi için, yüksek kalitede reaktiflerle başlamak çok önemlidir. Toplu iş varyasyonları bu protokolde oluşturulan sonuçları etkileyebileceğinden, bu özellikle hidrojel işleme görevleri için önemlidir. Toplu iş varyasyonlarına ek olarak, küçük hacimlerin hazırlanmasındaki ince değişiklikler de özellik farklılıklarına katkıda bulunabilir. Bunu önlemek için, tüm deneyler için kullanılabilecek daha büyük hacimlerin hazırlanması önerilir.
Doğrulama ve doğrulama prosedürleri, güvenilir karışımları tanımlamak için bir boya kullanımına dayanır. Sunulan protokol Turuncu G uygulamasını açıklar, ancak genel protokol ve analiz iş akışı floresan boyalara da uyarlanabilir49,50. Turuncu G kullanımı spektrofotometrenin teknik gereksinimlerini azaltır ve ışığa maruz kalındıktan sonra floresan boyaların ağartmasını önlemek için alınan önlemleri ortadan kaldırır. Boyanın çözünme davranışında veya küme oluşumunda sorunlar deneyler sırasında sunulan malzemelerle gözlenmemiştir, ancak diğer malzemelerle birlikte ortaya çıkabilir. Potansiyel küme oluşumu ve bu nedenle, boya ve malzeme arasındaki etkileşim mikroskopla kolayca tespit edilebilir.
Bu öğreticide sunulan prosedürler ve teknikler, en az insan emeğiyle son derece güvenilir görevler elde etmek için viskoz malzemeler için mevcut iş akışlarına otomasyon yeteneği ekler. Sağlanan sorun giderme tablosu (Tablo 2) tanımlanan sorunları içerir ve olası nedenlerin yanı sıra sorunları çözmek için çözümler sunar. Sunulan iş istasyonu, otomatik pipetleme görevleri için doğal (jelatin, gellan sakız, matrigel) ve sentetik (örneğin, poli(etilen glikol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polimerik malzemelere başarıyla uygulanmıştır. Özellikle, viskoz malzemeler için tasarlanmış açık kaynaklı bir iş istasyonu ve açık kaynaklı bir protokol tasarım uygulamasının kombinasyonu, biyomedikal mühendisliği, malzeme bilimi ve mikrobiyoloji alanlarında çalışan araştırmacılar için çok yararlı olacaktır.
Disclosures
CM ve DWH, Gelomics Pty Ltd.'nin kurucuları ve hissedarlarıdır. Yazarlar bu makalenin konusuyla ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir. Yazarların, açıklananlar dışında makalede tartışılan konu veya materyallerle finansal bir çıkarı veya finansal çatışması olan herhangi bir kuruluş veya kuruluşla başka bir ilgili ilişkisi veya finansal ilişkisi yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, QUT'deki Rejeneratif Tıp Merkezi üyelerini, özellikle Antonia Horst ve Pawel Mieszczanek'i yararlı önerileri ve geri bildirimleri için kabul ediyorlar. Bu çalışma, QUT'nin SE Lisansüstü Araştırma Ödülü ve Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) tarafından IC160100026 hibe anlaşması (ARC Endüstriyel Dönüşüm Eğitim Merkezi Eklemeli Biyomüstrüktür) kapsamında desteklendi. NB, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Peter Doherty Erken Kariyer Araştırma Bursu (APP1091734) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
| 5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
| 50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
| 70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
| Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
| Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
| Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
| M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
| OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
| Equipment | |||
| Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
| Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
| Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
| Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
| Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
| Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
| Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |
References
- Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
- Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
- Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712 (2011).
- Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344 (2010).
- Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
- Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
- Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
- Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
- Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
- Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
- Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
- Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
- Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
- Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002 (2019).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Zhang, Y. S., Khademhosseini, A.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018 (2018).
- Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
- Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
- Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510 (2020).
- Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
- Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
- Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75 (2018).
- Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
- Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
- Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
- Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976 (2016).
- Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
- Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
- O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
- LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
- Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
- Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
- Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
- Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
- Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
- Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
- Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).
